Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

יישומים של Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54487
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Virginia

Abstract

למרות יכולת ההתחדשות של שרירי שלד, גירעונות תפקודיים ו / או קוסמטיים קבעו (למשל, אובדן שריר נפחים (VML) כתוצאה מפגיעה טראומטית, מחלות שונות תנאים מולדים, גנטיים רכשו נפוץ למדי. הנדסת רקמות וטכנולוגיות רפואת רגנרטיבית יש עצומות פוטנציאל לתת מענה טיפולי. עם זאת, הניצול של מודלים של בעלי חיים רלוונטיים ביולוגי בשילוב עם ערכות אורכות של פעולות פונקציונליות רלוונטיות הוא קריטי פיתוח תרופות משובי משופרת לטיפול פציעות VML הדמויות. מבחינה זו, מערכת מנוף מסחרית שריר ניתן להשתמש כדי למדוד אורך, מתח, כוח ופרמטרים מהירות בשרירי השלד. השתמשנו במערכת זו, בשילוב עם מתח גבוה, ממריץ דו-פאזי, למדוד בייצור כוח vivo בתגובה הפעלה של תא crural הקדמי של hindlimb חולדה. יש לנו previמבישה השתמש בציוד זה להעריך את ההשפעה הפונקציונלית של פגיעת VML על קדמי tibialis (ת"א) השרירים, כמו גם את מידת ההתאוששות תפקודית לאחר טיפול של שריר ת"א נפגע עם תיקון רקמות שריר הרקמות המהונדסות שלנו (TEMR) טכנולוגיה. ללימודים כאלה, רגל שמאל של עכברוש מורדם מעוגנת היטב על אדן מקושר סרוו, ואת העצב peroneal המשותף הוא מגורה על ידי שתי אלקטרודות מחט מלעורית לעורר התכווצות שרירים dorsiflexion של כף הרגל. התכווצות השרירים הנגרמים גירוי עצב peroneal נמדדת על פני טווח של תדרי גירוי (1-200 הרץ), כדי להבטיח רמה סופית בייצור כוח המאפשרת קביעה מדויקת של כוח tetanic שיא. בנוסף הערכה של היקף הפגיעה VML וכן מידת התאוששות תפקודית לאחר הטיפול, מתודולוגיה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד היבטים מגוונים של הפיזיולוגיה השריר והפתופיזיולוגיה. כזו sho גישהULD לסייע בפיתוח רציונלי יותר של הרפוי משופרת לגבי תיקון רקמות השריר ואת התחדשות.

Introduction

יש שריר שלד קיבולת מהותית מדהימה לתיקון בתגובת 1,2 פציעה או מחלה. לשם ניסוי, על חוסנו של תגובת משובים זה תועד היטב במודלים של בעלי חיים על ידי לימוד, למשל, את מהלך הזמן של ניזק שרירי שלד, תיקון והתחדשות לאחר היישום של myotoxins (למשל, cardiotoxin) 3-7. באופן ספציפי יותר, בעקבות נזק לשרירים נרחב הנגרמת cardiotoxin (38-67% של סיבי שריר 8), התחדשות מתווכת על ידי תאי לווין, תאי הגזע אותו תושב להתבגר ובסופו של דבר להפוך סיבי השריר תפקודית 4,9-13. התוצאה הסופית היא הגדילה שלאחר נזק התחדשות תפקודית של רקמת שריר בריא, מייצרי כוח 14-16. למרות הפרטים הם הרבה מעבר להיקף של דו"ח זה, בסיס מכניסטי התחדשות שריר משקף את האירועים מתוזמרים בקפידה של סוגי תאים רבים משורות רבות המשתמשות canoniקאל איתות מסלולים חיוניים למדינת התפתחות הרקמה ומורפוגנזה 5,17-21. חשוב לציין, התחדשות נגרמת myotoxin מופעלת על ידי העובדה כי תאי מטריקס, העצבוב עצבי זלוף כלי דם להישאר מבני שלמים הבאים ניזק לשרירים נגרמים cardiotoxin 3,8,22. בניגוד גמור, מבני רקמות מפתח אלה רכיבים הם, מעצם הגדרתו, נעדר לחלוטין בהקשר של פגיעת VML; שם לאיבוד רקמת פרנק, בשל מגוון סיבות, תוצאות בגירעונות פונקציונליים קוסמטיים קבעו 23-25.

לא משנה של אתגרים נוספים הקשורים תיקון רקמות השריר ואת התחדשות בעקבות פציעה VML בהשוואה נזק לשרירים הנגרמת myotoxin, הבנה משופרת של בסיס מכניסטי התחדשות שרירי השלד ותיקון, במגוון של הקשרים, יהיה גם שימש ידי ניצול של ביולוגית במודלים של בעלי חיים רלוונטיים בשילוב עם אורךssessments של פעולות פונקציונליות רלוונטיות. כפי שנאמר כאן, מחקרים של hindlimb העכברוש לספק מערכת מודל מצוינת למטרה זו. באופן ספציפי יותר, שרירי תא crural הקדמי (שוקה הקדמית, longus digitorum פושטים (EDL) ו longus hallicus (HL)), אשר אחראים dorsiflexion של כף הרגל, מזוהה בקלות מניפולציות. יתר על כן, הם מוגשים על ידי כלי דם גדולים (כסל וענפים), ו מעוצבבים על ידי עצבים (הנשה וענפים, כולל peroneal) המשתרעים לכל אורך הרגל 26-28. ככזה, אפשר להשתמש במודל hindlimb העכברוש להעריך פונקציה / פתולוגיה שרירי שלד ישירות in vivo, או להעריך את ההשפעה עקיפה יותר של שינויים הקשורים פתולוגיה בכלי דם או עצבים על המקביל תפקוד שרירי שלד. בכל אחד מהתרחישים הנ"ל, חומרת המחלה, כמו גם את יעילות הטיפול ניתן לקבוע כפונקציה של ייצור כוח השריר (מומנט) ו- m רגל המקביליםovement 29-34.

באופן אידיאלי, מדידות כוח מלוות מחקרים היסטולוגית ו ביטוי גנים מנתח ליותר בקפדנות להעריך את המצב המובנה ומולקולרית של שרירי השלד. בסיס היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה, למשל, מסוגלת לענות על שאלות על גודל השריר, יישור סיבי שריר, רכב תאי מטריקס, מיקום של גרעינים, מספר תאים, ולוקליזציה חלבון. ג'ין ניתוח ביטוי, בתורו, יש צורך לזיהוי המנגנונים המולקולריים העשויים להשפיע / לווסת את מידת הבשלות של סיבי שריר, מצבי מחלה, ופעילות מטבולית. בעוד שיטות אלה מספקים מידע חיוני, הם מייצגים נקודות קצה מסוף בדרך כלל, והכי חשוב, הם לא מצליחים להתמודד עם יכולת תפקודית של שרירי השלד באופן ישיר, ובכך, הם גומל ולא סיבתי. עם זאת, כאשר מחקרים היסטולוגית וניתוחי ביטוי גנים מוערכים בשיתוף עם measur הפונקציונליes, אם כן, מנגנוני ייצור כוח והתחדשות פונקציונלית ניתן לזהות בצורה המדויקת ביותר.

בהקשר זה, הכוח לייצר יכולות של שריר ניתן למדוד במבחנה, באתרו, או in vivo. כל שלוש הגישות יתרונות ומגבלות. בניסוי במבחנה, למשל, את השריר הוא מבודד לחלוטין מגופתו של החיה. לאחר הסרת ההשפעה של כלי הדם והעצבים המספקים את השריר, את יכולת ההתכווצות של הרקמה ניתן נמדדה בסביבות העבודה חיצוניות לפיקוח הדוק 35. בבדיקת שריר באתרו מאפשרת לשריר להיות מבודדת, כמו בהכנות במבחנה, אולם , עצבוב ואספקת הדם נותרו על כנן. היתרון של המודל באתרו הניסיוני הוא שהיא מאפשרת שריר בודד להיחקר בעוד העצבוב ואת אספקת דם מוטרד מינימאלי 36. בשניהםבמבחנה בניסויים באתרו, ניתן להחיל טיפולים תרופתיים באופן ישיר יותר מבלי לתת דין וחשבון על ההשפעות של כל רקמות סובבות או את ההשפעה של מערכת הדם על תגובות התכווצות נמדדות 37. עם זאת, בבדיקת תפקוד vivo, כפי שתואר לעיל, היא הטכניקה פולשנית לפחות להערכת תפקוד שריר בסביבתו יליד 38, והוא יכול להתבצע שוב ושוב לאורך זמן (כלומר, אורכים). ככזה, הוא יהיה מוקד הדיון שלהלן.

בהקשר זה, אלקטרודות מלעורית מוכנסת ליד השריר של עניין, או העצב המוטורי המשרת אותו, לספק אות חשמלית אל השריר. מתמר ואז מודד את השינויים אורכים או כוח כתוצאה בשריר מופעל על פי הנחיות פרוטוקול תוכנה קבועה מראש, מותאם אישית. מנתונים אלו, את התכונות הפיסיקליות של השריר ניתן לקבוע. אלה כוללים עבורce-תדר, טטנוס מקסימאלי, כוח-מהירות, נוקשות, מתח אורך, ועייפות. אורך או כוח שרירים יכול להיות גם קבוע כך חוזי שרירי isometrically או isotonically. חשוב לציין, פרוטוקולי ניסוי אלה יכולים להתבצע במהירות, חזרו בקלות, customized- כל בעוד החיה מורדמת ועם תקופת החלמה של שעות עד ימים. חיה אחת יכולה לעבור בתוקף vivo בדיקות מספר פעמים, ובכך לאפשר מחקרים ארוכי טווח של מודלים המחלה או הערכה של פלטפורמות / טכנולוגיות טיפוליות.

כפי שיתואר בהמשך, מערכת מנוף מסחרית שרירים בשילוב עם מתח גבוה, דו-פאזי ממריץ משמשת לביצוע בדיקות תפקוד שרירי vivo להעריך את התרומה של השריר הקדמי tibialis של hindlimb חולדת dorsiflexion של כף הרגל באמצעות גירוי של עצב peroneal. פיתחנו פרוטוקול אשר נועד במיוחד כדי לבדוק רפואה רגנרטיבית / tiטכנולוגיות הנדסת ssue לגבי תיקון רקמות שריר בעקבות פציעת VML הטראומתית של שריר עכברוש ת"א. זה ראוי לציון; אדי ו HL צריך להיות גזור מתוך תא crural הקדמי על מנת להעריך את השריר ת"א במיוחד (הם מהווים כ 15-20% של מומנט הקדמי tibialis הכולל נמדד בעקבות גירוי עצב peroneal (Corona et al., 2013) ). בגלל גישה זו מספקת ניתוח אורך מקיף של שריר פיזיולוגיה / פונקציה, זה יכול לשפוך תובנה מכניסטית חשוב על סוגים אחרים רבים של חקירות פיסיולוגיות כמו גם מגוון רחב של מחלות או תחומי טיפול 39. לדוגמה, בבדיקת תפקוד השרירים vivo ישימה מחקרים של תרגיל פיזיולוגיה, איסכמיה / מחקר reperfusion, מיופתיה, עצב נזק / נוירופתיה ו vasculopathy, sarcopenia, ו בניוון שרירים 40.

Protocol

כל בעלי החיים היו ליחס אנושי כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה IACUC.

1. הכנת ציוד

  1. ודא כי כל המכונות מחוברות כראוי.
  2. הפעל את המחשב, ואחריו ממריץ דו-פאזי הספק גבוה ומערכת מנוף מצב כפול.
  3. בשלב זה, למקם את בעל החיים לתוך תא ההרדמה מסופק עם 2% isoflurane, ולהדליק את גוף החימום כך הפלטפורמה מחוממת ל -37 מעלות צלזיוס.
  4. הנח את האלקטרודות באתנול 70% כך טיפים מצופים polytetrafluoroethylene (PTFE) שקועים ויהיה לחטא בעת הגדרת המכשיר ותוכנה.
  5. אתר ופתח את תוכנת בקרת מערכת המנופים על שולחן העבודה.
    הערה: זו תהיה התוכנה המאפשרת לבצע בדיקות תפקודיות.

2. התקנת תוכנה

  1. לאחר התוכנית נפתחת (איור 1 א), לשנות את הפרמטרים לצפיית Stim תחת תפריט הגדרת הערכים הרצויים.
    הערה: בפרוטוקול זה, כל הפרמטרים להישאר ברמות המוגדרות מראש למעט "Run Time (הים)", אשר השתנה ל -180 שניות (איור 1B).
  2. צור תיקיית שמירה אוטומטית תחת תפריט Setup.
  3. אתר חלון מסוג מסוגל שכותרתו "Base השמירה האוטומטי". הזן את השם של המדגם, למשל "Rat1 עדכני-timepoint". ישירות השמאלי של החלון "מאגר שמירה אוטומטית" סוג-מסוגל, לחץ על התיבה "אפשר שמירה אוטומטית."
  4. בחלק העליון של מסך הבקרה, בחר באפשרות "ברצף". חלון חדש ייפתח. על החלק התחתון של החלון החדש, בחר "רצף פתוח". חלון חדש ייפתח. בחר את רצף premade ולחץ על אישור. רשימת פרוטוקול עם פרמטרי רצף כולל תדירות, משך הגירויים, וזמן מנוחה תפתח בחלון בשם: עורך רצף (איור 1 ג). לחץ על "רצף טען" -> & #34; סגור חלון ".
  5. כדי לראות בזמן אמת הנוכחי וגירוי, בחר "קובץ" -> "צג נתונים חי". חלון חדש ייפתח.
  6. בחלון נתוני Live החדש, מסך בפורמט לבדיקה על ידי שימוש בפונקציית autoscale, או להזין באופן ידני את מינימום והמקסימום y-ערכים המוצג על המסך.

3. בעלי החיים קמים

הערה: כל מדידות כוח הם אלה של 11 שבועות בן לואיס חולדה. קיים מתאם ליניארי בין מסת שריר וייצור כוח (ניוטון). לכן, ככל שהגיל עולה העכברוש, ערכי הכח הנוצר על ידי הרגל צריכים להגדיל גם כן.

  1. להבטיח כי בעל החיים הוא במישור התקין של הרדמה לפני הסרתו מאולם ההרדמה. להסיר לחלוטין את כל השיער בצד לרוחב בין הקרסול והאגן של הרגל ניסיון באמצעות גוזז שיער חשמלי.
    ההערה: המטוס התקין של הרדמה מושג כאשר אני חייתיזה ללא תגובה קמצוץ הבוהן. יש צורך לעקוב אחר ההנחיות נקבעו על-ידי כל הטיפול בבעלי החיים של מוסד ועדת שימוש.
  2. מניח את החיה במצב שכיבה, הבטחת האף של החיה הוא מאובטח בחרוט אף הרדמה כך שהוא נשאר בעומק של הרדמה מספיק.
  3. להסדיר את מעמדה של מנגנון הדוושה ידי שלוש ידיות עצמאיות (איור 2). באמצעות הידיות (A ו- B) כדי להתאים את דוושת הרגל, להציב מנגנון הדוושה ב עמדתה שמאל הקיצוני והנמוך ביותר, בהתאמה. דבר זה יאפשר את המיקום הנכון של כף הרגל של החיה תוך השארת מקום מניפולציות מאוחר יותר. בעמדה זו, השתמש הידית בצד השמאל של המסלול כדי להזיז את המנגנון גם כלפי או הרחק הנסיין כך שרגל החיה טמונה מטוס ישר.
  4. נקה את הרגל עם שלושה שינויים של יוד ואלכוהול. היוד צריך להישאר על הרגל למשך 30 שניות.
  5. התאם את החיה או פלטפורמה(איור 2 א ', ד') כך שהרגל המורחבת מבטיחה מגע מלא בין סוליית כף הרגל על דוושת הרגל.
  6. באמצעות קלטת רפואית, לאבטח את הרגל של החיה נגד צלחת כף הרגל (איור 2 ד). זה חיוני כי העקב הוא סומק נגד התחתונה של דוושת כף הרגל כולה הוא שטוח ולא לעקור מהצלחת במהלך בדיקה.
  7. אתר את מנגנון clamping כדי לייצב את הרגל. לדחוף את הסיכה המייצבת רחוק מספיק כדי להפחית תנועה של הרגל ולנעול אותו במקום על ידי סיבוב מפתח ברגי אלן.
  8. בעמדה זו, השתמש ידית C כדי להזיז את המנגנון או פנימה או החוצה הנסיין כך הקרסול, השוקה, ולשכב הירך בקו ישר (איור 2 ג). ודאו הרגל מקביל עם דוושת הרגל. לבצע התאמות על המהלך וידיות בסדר מצאו בגב המכשיר, כדי להזיז את הקרסול לאט כך שכף הרגל לבין השוקה נמצאת בעמדה 90 °.
  9. continuדואר להזיז את הרגל כך את עצם הירך לבין השוקה היא בזווית אנכית של 90 מעלות (איור 2 ב). בנקודה זו, החיה מוכנה האלקטרודות.

4. מיקום האלקטרודות

  1. הפעל "Stim המיידי" על ידי לחיצה על הכפתור הכתום שכותרתו "Stim המיידי".
  2. מניחים שתי אלקטרודות באופן שטחי על הקצה הפרוקסימלי של הקדמי tibialis ולעבור טיפים אלקטרודה סביב עד קוצים נראים על המסך בזמן אמת. באופן אידיאלי, הקוצים צריכים להיות סביב 0.4 נ
    הערה: האלקטרודות צריך להיות ממוקם סמוך מאונך ו למישור של עצב peroneal, אשר בתורו, פועל רוחבי מהברך וניצבת השוקה.
  3. הכנס מחט אחד רחוק מספיק כדי הדרמיס פירס, ובקושי לתוך שכבת השרירים. הזז את האלקטרודה האחר ברחבי עד קוצים נראים על המסך בזמן האמת סביב 0.6 מחטי נ הכנס מהדק אותם למקומם באמצעות מלחציים תחביב או קלטת רפואית.
  4. אdjust התאמות גסות ועדינות למצוא פלט כוח מקסימאלי.
  5. על הממריץ דו-פאזי בהספק הגבוה, תהיינה שתי ידיות במרכז. אחת מתויג "RANGE" והשני "להתאים". סובבו את כפתור "RANGE" כדי amperage המירבית הרצויה.
    הערה: הפסגות תגדלנה לאט מבחינת היקפו, ואת amperage המרבי נקבע כפי הרמה שבה שלושה גירויים רצופים לגרום לתגובות התכווצות זהות. הימנעי הפיכת amperage גבוה מהנדרש; amperage מקסימלית יעודד את השריר כולו להתכווץ, אבל השום נוכחי גבוה יגרום גיוס השרירים שכנים ואפשרות יריבה גם כן.
  6. סובב את הכפתור "להתאים" כדי להגדיר את האחוז של "RANGE" אשר ישמש כדי לעורר את השריר. בשלב זה, כוח צריך לקרוא סביב 1.0 נ זו עשויה לדרוש גידול או קיטון הנוכחי.
  7. בדוק שוב את האלקטרודות לוודא כי הם בטוחים. תפסיקStim מידיים.
  8. בחלון 'נתונים עדכניים ", לחץ על" התחל רצף. "
  9. המשך לעקוב אחר העקומות ידי חזרה למסך הבקרה ולאחר הלחיצה על כפתור ה "הניתוח" הממוקמת מעל הכתום "Stim המיידי" כפתור. עקומת tetanic צריך להתחיל להתגבש סביב גירוי 60 הרץ.

5. גימור גירוי ולנקות

  1. לאחר הרצף נגמר, להסיר אלקטרודות לנגב לנקות עם אלכוהול 70%. הנח את האלקטרודות מעל השמיכות.
  2. להתיר את מהדק הברך לכבות הרדמה. הסר את החיה מגז ההרדמה והמקום חי במצב נוטה, עדיין על כרית החימום. שמירה על העכברוש על 100% O 2 במשך כמה דקות לאחר גז isoflurane כובה לשמור החולדה מחומצן. החיה עשויה לעבור בתחילה, אבל לא להחזיר את החיה חזרה לכלוב עד שהחיה להכרתו. אם כאבי שרירים הוא שם לבעל התאוששות, מנה של NSAID צריכה להינתן כפי שצוינה על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים שלך.
  3. כבה את כל הציוד המפורט בשלב 1.2, לסגור את התוכנה, ולהמשיך ניתוח נתונים.
  4. נגב את דוושת הפלטפורמה ורגל.

6. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח נתונים מתבצע כדי להתאים רצף שעצב במעבדה זה ועל פי פרוטוקולי מעבדה. ערכי ניתוח, נקודות נתונים בעלי חשיבות, והיבטים אחרים של ההליך ישתנו בהתאם את כוונת המשתמש.

  1. פתח את תוכנת ניתוח נתונים.
  2. הקש על תפריט התפוקה הגבוה כדי לאפשר ניתוח של קבצי נתונים מרובים (דגימות) בכל פעם. בחר ניתוח "תדר חיל".
  3. לחץ על הכפתור "בחר קבצים" ולפתוח קבצים רבים נתונים שנשמרו המועדפים.
  4. בחר "ידני" בתיבת שיטת מיקום הסמן.
    הערה: זה יאפשר למשתמש לנתח כל datבתוך חותמת רצויה, בניגוד לתכנית לבחור את מיקום הניתוח אוטומטי.
  5. שנה את הערך החותם הסמן קץ 2. לחץ על כפתור ה "נתח" (1D איור).
  6. כדי לשמור את הטבלה ולנתח את הנתונים באמצעות גיליון אלקטרוני, לחץ על "הלוח השמור ACSII כפתור. זה יחסוך את הקובץ, והוא ניתן לפתוח באמצעות גיליון אלקטרוני במועד מאוחר יותר.
  7. פתח את קובץ הנתונים שנשמרו גיליון אלקטרוני.
  8. צור עמודה נוספת שכותרתה "Absolute מקסימום", ולקבוע את ההבדל בין קו הבסיס ואת ערכי מקסימום עבור כל דגימה. זה יספק את הכח המקסימאלי הכולל המיוצר על כל תדר.
  9. כדי לקבוע מומנט, להכפיל כל ערך כוח לפי אורך זרוע המנוף.
    הערה: במקרה זה, כי יהיה מיוצג על ידי אורך הרגל של החיה. פרוטוקול זה משתמש השווי שנקבע הממוצע ניסיוני של 30 מ"מ. משתמש חברה קבע את הערכים עבור maמומנט ximum מיוצר בכל תדר.
  10. גרף ערכים אלה כמו עקומת תדר מומנט, או, המומנט המרבי המיוצר על ידי בעלי החיים על פני כל תדרי הגירוי.
    הערה: זה יכול להיות מזוהה ושמש נקודה אחת של השוואה בין דגימות.

Representative Results

עקומת tetanic יכול לשמש כדי להבדיל בין תוצאות אופטימליות מתוצאות תת אופטימלית. עקומה זו בדרך כלל מתחיל להיווצר בתדר של 60 הרץ. גורם המפתח להשגת תוצאות טובות הוא היכולת לעורר את השריר, כך שהוא מייצר מקסימום הכח שלה ושומר כוח במהלך טטנוס. העקומה האידיאלית צריכה בעלייה רצופה, חדה, אנכית בעת הגירוי, ואחריו שלב מפנה שטוח עם תנודות מינימאליות, תקופת ירידה אנכית רצופה, בדיוק בשעת סיום הגירוי (איור 4). סטיות מעקום אידיאלי אינדיקציות לכך השריר עייף (5D איור) או שהשריר אינו מגורה כמו שצריך כדי לייצר מקסימום כוח (איור 5 ב - C). האחרון נובע בדרך כלל מן מיקום האלקטרודה שגוי מובילים לכישלון של גיוס המקסימאלי של סיבי שריר במהלך stimulation. נתון מבחין כי מאפשר לחוקר לקבוע אם עקומה הלא אידיאלית היא התוצאה של מיקום האלקטרודה שגוי או שינויים פתולוגיים לשריר הוא האם או לא העקום tetanic יושלם (התמזג) או לא שלם (unfused). עקומת tetanic unfused, שלמה עולה כי האלקטרודות במקומה, וכתוצאה מכך השריר לא חווה התכווצות מקסימלי. דוגמא שינוי פתולוגי בשריר ניתן לצפות כפי ירד התכווצות מקסימלי כפי לעומת השליטה, או תגובת התכווצות שיותר מעייפת במהירות.

השלושה הסוגים השונים של פסגות שהושגו במהלך הליך זה מייצגים עמדות אלקטרודה ורגל שונות וניתן לראות באיור 3. הפסגה הראשונה תהיה סביב 0.4N ו להתרחש כאשר מיקום האלקטרודה הנכון נקבע באופן שטחי על העור (האיור 3A). יש הסט השני של פסגות חמשרעת igher, בדרך כלל סביב 0.5-0.6N (איור 3B) ומקורן האלקטרודות לחדור מבעד הדרמיס. לאחר מתקבלים אלה, הרגל וכף הרגל מותאמת למקסם את תפוקת כוח, אשר מושגת כאשר העליות משרעת שיא 1N או יותר כ (איור 3 ג). בשלב זה, מיידית Stim יכולה להיות כבויה ואת הרצף עשוי להתחיל. הנחיות אלו להבטיח תוצאות מדויקות לשחזור והם מחסומים מרכזיים ברחבי הפרוטוקול.

התוצאות הסופיות יכולות להיות מיוצגות בכמה דרכים שונות, תלוי המידע שמשתמש חילוץ ממבחן הכח ואת מערך הניסוי. בפרוטוקול זה, הכח המרבי נמדד בכל התדרים של גירוי, לעומת זאת נקודות נתונים אחרות עשויות להיות חשובות עבור חוקר או יישום מסוים. דוגמה אחת היא לתדר הגירויים שבו עקומת tetanic מתחיל לקרום עור וגידים. Tנתונים הוא ניתן להשוות תוצאות אחרות שהושגו מניסוי קודם או מאוחר יותר על אותה חיה, או להשוואה בין קבוצות הטיפול השונות. ייצור כוח יכול להיות מנורמל על ידי מסת גוף לחשב כוח איזומטרי ולספק הערכה משוחדת יותר להשפעת גיל על ההתכווצות המקסימלי ציינה. למרות חיות של משקל וגיל גוף שונים יצרו כוחות מקסימלית שונים, את הצורה של עקומת tetanic צריכה להיות עקבית בין כל הקבוצות כאשר ההליך מבוצע כהלכה.

איור 1
איור 1: סקירה כללית של מערכת בקרת מנוף ותוכנת ניתוח נתונים עבור ניתוח (א) סקירה של תוכנות שליטה בעת פתיחת התכנית.. (ב) פרמטרים "מיידי Stim." (C) רצף דוגמה לגירוי כוח בתדר. (D אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: היבטים קריטיים עבור מיקום של עכברוש והשמה של פוט במנגנון (א) החולדה נמצאת במצב שכיבה עם רגל שמאל מחובר היטב אל אדן.. את הזוויות הישרות שנעשו על ידי כף הרגל, הרגל, והירך מוקפת בעיגול. (ב) הזווית הנכונה שיצרה הקרסול מודגש. (ג) הרגל צריך להיות מתואם במטוס ישר מרגל הגוף. (ד) מיקום האלקטרודה הוא מקבילים מאונך למישור של עצב peroneal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: פסגות נציג מדגימות את החשיבות של מיקום האלקטרודה נכון ייצור כוח מקסימאלי (א) תגובות tetanic שיא Baseline ציינו עם אלקטרודות המונחות מדי שטחי.. (ב) מוגדלת פסגות עם אלקטרודות הוכנס למקום הנכון. (ג) מעבר מ פסגה גדולה איתות מיקום האלקטרודה נכון המשרעת שיא מראש רצף אופטימלית כמו עמדות הרגל וכף רגל מותאמות באופן אופטימלי./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. Curve האופטימלית Tetanic ב 100 הרץ זה עולה עקום יורד בחדות ויש לו שלב מפנה שטוח. דוגמא זו מציינת מיקום האלקטרודה נכון וגירוי מקסימום כוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. דוגמאות מייצגות של Curves תת-אופטימלית Tetanic שהושגו ב 100 הרץ (א) בעקבות הרפיה, עקום זה יורד מתחת לקו הבסיס. זה מעיד על גירוישל יריבים. (B - D) גרפים אלו הם התוצאה של מיקום האלקטרודה פסול וגיוס שוויוני של סיבי שריר. שלבי הרמה להפגין תנודות גדולות (B), מדרון כלפי מעלה (C), או שיפוע כלפי מטה (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה יחסית לביצוע בדיקות תפקוד שרירי vivo על תא crural הקדמי של hindlimb החולדה. צורות אחרות של בדיקות תפקוד השרירים, כולל לשעבר vivo ו פרוטוקולים באתרו, גם יכול לספק מידע חשוב לגבי פיזיולוגיה שריר. עם זאת, המשמעות של בדיקת תפקודי vivo טמונה באופיו פולשנית, והעובדה שזה בצורה המדויקת ביותר משחזר מנגנונים אנדוגניים של גירוי השריר. עבור שתי לשעבר vivo ו בדיקות באתרו, הגיד ו / או שריר חשופים, ועל כן, חייב להישמר לחה או שקוע 41,42. בדיקות בשנת vivo מסיר משתנים מבלבלים של טראומה ודלקת שעלול להיגרם על ידי ניתוחים הנדרשים עבור בדיקות תפקוד השרירים באתרו; זה חשוב במיוחד אם מטרת הניסוי היא לחקור תהליכים דלקתיים הסלולר in vivo בדיקות דורש מיומנות כירורגית קטנה כמו השריר אינו מבודד מסביבתה ואינו דורש קשרים מדויקים להפחית החלקת שריר / גיד (כפי שקורה עבור באתרו או לשעבר בדיקות vivo) 41. בנוסף, עם תרגול מספיק, את המהירות של מיקום האלקטרודה הנכון ואת היכולת לבצע התאמות במהירות כדי להשיג ייצור כוח מקסימאלי של השריר יבטיח השלמת הפרוטוקול היא מהירה reproducible- הוא בתוך חיות בין משתמשים שונים של אותו הציוד 39 . זה מועיל להתחיל עם הערכה של הרכיב crural הקדמי כולו כפי שמודגם, לפני כריתה של שרירי סינרגיסטי פחות נגיש (EDL ו HL) לחקירה ישירה יותר של השריר ת"א. בגישה זו, אפשר די מהר להשיג שליטה של ​​הטכניקה. בעוד ההליך המתואר במסמך זה מדגים ומדגיש את התועלת של fr כוחפרוטוקול equency לגרום טטנוס לקבוע את הכח המקסימאלי המיוצר על ידי שרירים, המשתמשים צריכים לקבוע את הסוג (ים) של בדיקות פונקציונליות כי ילשין טובת הניסוי הספציפי שלהם (ים) ו מטרות מחקר.

ישנם מספר שלבים קריטיים כי צריכה להתבצע בזהירות על מנת להבטיח תוצאות ניסוי אופטימליות לשחזור, כלומר, ייצור כוח מקסימאלי עקבי על ידי השריר למגוון פרמטרי גירוי. כמה מן התכונות העיקריות מתוארים באיור 2. עם זאת, מיקום נכון ויציבות של אלקטרודה מגרה הוא תנאי מוקדם והכרחי עבור גירוי מקסימאלי לשחזור של עצב peroneal. בהקשר זה, האלקטרודות צריך להיות ממוקם באופן שטחי. כלומר, אם מיקום האלקטרודה הוא עמוק מדי, אחד סיכוני גירוי חשמלי ישיר של שרירי אנטגוניסט, ובכך מצמצם את עוצמת תגובת ההתכווצות הנצפית של תא crural הקדמי. יתר על כן,שתי אלקטרודות צריכות להיות ממוקמות בסמיכות כמו זה לזה ככל האפשר כדי להפחית את ההתנגדות החשמלית של העור שמסביב ורקמות חיבור. באופן כללי, מיצוב אלקטרודה קרוב הברך המדיאלי רגל התחקות הקצה ישירות של קדמי tibialis למקום שבו הוא פוגש את הגסטרוקנמיוס לעתים קרובות מניב ייצור כוח נאות. זה גם מבטיח כי האלקטרודות ממוקמות סמוכות מאונכות ו למישור של עצב peroneal, אשר בתורו, פועל בניצב הטיביה הרוחבית לאורך הרגל מהברך. עם זאת, השונות הטבעית באנטומיה בין בעלי חיים דורש ערנות מתמדת כדי להבטיח כי מיקום האלקטרודה הוא מותאם על בסיס כל מקרה לגופו. ככזה, יש רמה מסוימת של ניסוי וטעייה הקשורים מיקום האלקטרודה כי היא פחתה באופן משמעותי על ידי החוויה של המשתמש. מספר הפעמים האלקטרודות לחדור את העור צריך להיות ממוזער כדי להפחית את הנפיחות והדלקת, אשר מקטין אותיייצור כוח asured. זה תלוי איפה את המחטים ממוקמות בתחילה, אך מומלץ להעביר את שתי המחטים פעמים או פחות במיוחד באזור סביב פיקת הברך. לבסוף, לאחר האלקטרודות ממוקמות ברגלו של החיה, שינויים קלים ניתן לבצע את המיצוב של הרגל ואת הנוכחית מועברת דרך אלקטרודות. זה צריך להיעשות תוך מעקב אחר הכח בו זמנית המופק עווית יחידה. בנוסף מיקום האלקטרודה, התאמות יכולות להתבצע גם על המתח המוצג בכל אלקטרודות. עם זאת, ההתקנה המתוארת כאן, חשוב לנקוט באמצעי זהירות כאשר הם מגבירים את המתח כדרך להגדיל את תפוקת כוח בגלל המתח גדל יעודד עצבי שרירי אנטגוניסט innervate.

ישנם שלוש בעיות טכניות מפתח מצריך השגחה על מנת להבטיח כי מיקום האלקטרודה נשאר אופטימלי. ראשית, למרגלות החיה הרדימה חייבות להיות מאובטחתמעוגן למנגנון דוושת רגל, אשר מודד את ייצור כוח השריר (איור 2). אם הרגל אינה מעוגנת היטב, את כוחה האמיתי המיוצר על ידי השריר עשוי להיות מתורגם באופן חלקי כדי מתמר הכח. קיבוע רגל יציב גם מציג את הסיכון לאבד את המיקום האופטימלי של אלקטרודות כמו תנועה מעבר התכווצות שרירים נורמלית (כלומר כף הרגל מתרחקת המדרגת) יכולה לגרום לעקירה של אלקטרודות מהעמדה השטחית שלהם או לסלק אותם לחלוטין. כך או תרחיש יקטין את כוח מדוד. שנית, הגוף של בעל החיים צריך להיות פרקדן לגמרי מיושר במטוס ישר (איור 2). מיצוב הנכון של גוף החיות מונע תנועות קלות של הרגל בשל נשימה, וגם ממזער פיתול של הרגל ואגן, מה שמאפשר מיקום וקשר רציף טובים יותר של אלקטרודות הגירוי. מיצוב עיגון שלישי, נכונים של הברך הוא critiקאל על מנת להבטיח כי הרגל נשארת יציבה, ובכך, עוזר לייצב את המיקום האופטימלי של אלקטרודות הגירוי להתיר הפעלה עקבית של עצב peroneal.

ישנן כמה נקודות נוספות יודגש. ראשית, המערכת המסחרית מנוף שריר נועדה לבצע בדיקות על רגל השמאל, אולם ההתקנה עשויה להיות שונה כדי לבצע בדיקות על הרגל ימין גם כן. שנית, מערכות מנוף שרירות עלולות להיבחר בהתבסס על הגודל של החיה, כך שמשתמשים צריכים להבטיח כי הפלטפורמה ששמשה מספיקה כדי למדוד ולתמוך הכח הנוצר על ידי במודל החיה של בחירה. שרירים לבדיקה עבור פלטפורמת הציוד מוגבלים לאלה משרים רחבים plantar או dorsiflexion של כף הרגל. שלישית, צריך שוב להדגיש כי מיקום האלקטרודה יכול להיות מאתגר ודורש סבלנות לתרגל להשתלט על הטכניקה. אלקטרודות גם להיות משעממות מהר עם שימוש קבוע, אז זה מועיל כדי לקבל כמה s חילוףETS לשם שינוי הוא הופך להיות קשה לדקור את העור באופן שטחי. שלישית, הפרוטוקול המתואר בדוח זה מנצל רצפי גירוי ונהלים ספציפיים ניתוח נתונים. תוכנת שליטת מערכת מנופי שרירי נתוני התוכנה לניתוח הנתונים שהוא מספק יכול לענות על שאלות ניסיוניות רבות אחרות ולכן, השירות שלה הם מעבר למה שמתואר במסמך זה. ככזה, משתמשים מעודד לחקור מעבר לגבולות של פרוטוקול התוכנה (ים) המוצג במאמר זה. למרות מגבלות הזניחות אלה, בדיקות תפקוד שרירי vivo היא גישה חזקה כדי לקבוע את יכולת בריאות התכווצות של שרירי שלד כי זה פולשנית וניתן לבצעו בהזדמנויות מרובות, על פני פרק זמן ממושך, על אותה החיה. בקיצור, זה סוג של כלי שמיש הופך את המערכת מיומנת במיוחד לבדיקת ההשפעות של טיפולים חדשניים עבור פציעה בשריר שלד או מחל hindlimb החולדה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
  2. Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
  3. Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
  5. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
  6. Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
  7. d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
  8. Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
  9. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  10. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  12. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
  13. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
  14. Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
  15. Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
  16. Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
  17. Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
  18. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  19. von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
  20. Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
  21. Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
  22. Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
  23. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
  24. Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
  25. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
  26. Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
  27. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
  28. Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
  29. Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
  30. Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
  31. Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
  32. Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
  33. Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
  34. Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
  35. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
  36. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
  37. Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
  38. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
  39. Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
  40. Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
  41. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
  42. Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
  43. Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).

Tags

Bioengineering גיליון 116, ייצור כוח שריר גירוי עצב peroneal השוקה הקדמי dorsiflexion הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית התחדשות שרירי השלד אובדן שריר נפח מחלות שרירים פתולוגיה
יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mintz, E. L., Passipieri, J. A.,… More

Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter