Summary
ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.
Abstract
ploidinin Manipülasyon gibi diploidlerin için tetraploids için diploidlerin veya haploidlerden gibi yararlı dönüşümler için izin verir. Tek bir heterozigot anneden homozigot doğrudan üretimini sağlar, çünkü zebra balığı Danio rerio olarak, özellikle homozigot jinogenetik diploid nesil genetik analizinde yararlıdır. Bu makalede, ilk hücre döngüsü, Isı Şok 2 (HS2) sırasında ısı nabız dayalı ploidi çoğaltma için modifiye edilmiş bir protokol tanımlamaktadır. centriole çoğaltılması inhibisyonu yoluyla, bu yöntem, ikinci bir hücre döngüsü sırasında hassas hücre bölünmesi durak ile sonuçlanır. etkilenmemiş DNA çoğaltılması ile birlikte hassas bir döngüsü bölümü durak, tüm genom çoğaltılması sonuçlanır. Bu yöntem ile ilgili protokoller tek hücre döngüsü bölünmesi gecikme ve Ploidi tekrarını neden yumurta ve sperm toplama, sperm UV tedavisi, in vitro fertilizasyon ve ısı darbesi bulunmaktadır. Bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu uygulanabilirDiğer hayvan türleri ploid değişikliğine neden.
Introduction
Bu protokol, jinogenetik haploidlerin (Şekil 1) ya da tetraploids üretimi homozigot jinogenetik diploid üretimi gibi zebra balığı embriyolar bölgesi ploidinin işleme izin verir. Bu tam bir hücre döngüsü (Şekil 2A, 2B) karşılık gelen sitokinez bir gecikme uyarılması ile elde edilir. sitokinez önemli bir döngü gecikmesi ısı şoku ile muamele ile elde edilmektedir. Orijinal olarak Streisinger ve arkadaşları tarafından tarif Isı Shock (HS) standart protokol ilk hücre döngüsü 1 sırasında bir döngüsü hücre bölünmesi durak sonuçlanan dönem 13-15 MPF'e sırasında sıcaklık darbe yer. Bu protokolün etkinliği son zamanlarda ısı şok tedavi kayan zamansal pencere ile erken hücre döngüleri tarayarak geliştirilmiştir. Bu tarama, hala ilk hücre döngüsünün (22-24 mpf) içinde, bir ısı şok daha sonraki bir zaman noktası tespit olduğunu EMBR daha yüksek bir oranda sonuçlarıBu durumda, ikinci bir hücre döngüsü 2 etkileyen bir döngüsü hücre bölünmesi durak ile yo. İlk hücre döngüsü sırasında deneysel manipülasyonlar ikinci hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesi ile müdahale ve DNA içeriği tekrarını neden gözlem diğer balık türlerinin 3,4 rapor edilmiştir. terimi "2" ısı darbesinin, standart HS yöntemi daha sonraki bir zaman noktasında meydana gelmesi ve HS2 neden olduğu hücre döngüsü gecikmesi ikinci bir hücre döngüsü sırasında meydana yansıtır - Biz Isı Şoku 2 (HS2 olarak tadil edilmiş protokole bakınız ). Bu çalışmalar, ısı şokundan sonra sitokinez tutuklama temeli aşağıdaki hücre döngüsünde iğ oluşumunu ve karık indüksiyon etkileyen ısı darbesi sırasında centriole çoğaltılması engellenmesi olduğunu göstermiştir. HS2% 100 yaklaşıyor hücre döngüsü tutuklama verimleri sonuçları ve standart HS 2'den 4 kez daha yüksek Ploidi çoğaltılması up oranları.
Embriyolar tedavi zekâha blastomer hücresi devir esnasında ısı şoku birçok zararlı etkileri gösterirler, bu ısı şoku düşündüren hücre bölünmesi 2 için gerekli çoklu süreçleri etkiler. Isı şok hücre bisiklet (süre 0-30 mpf) başlamadan önce uygulandığında Öte yandan, centriole çoğaltılması ile özel girişim ile tutarlı etkilere sahip görünüyor ve diğer temel hücre süreçlerini 2 etkileyecek gibi görünmüyor . Bu çalışmalar blastomer bölünme başlamadan önce zaman özellikle centriole inhibisyonu yoluyla ploidi işlemek için bir araç olarak ısı şok kullanarak mükellef bir gelişimsel dönem gibi görünüyor gösterdi. Centriole çoğaltılması ısı şok belirgin bir seçicilik altında yatan nedeni bilinmemektedir, ancak örneğin lökositler 5 gibi bazı hücre tiplerinde, ısı stresi altında gözlenen sentrozom alt yapılar, seçici bir bozulma ile ilişkili olabilir.
embriyonik de zamansal senkronizasyonuvelopment in vitro fertilizasyon (IVF) ile elde edilir. üzerine tetraploid hale tek döngüsü sitokinez durak HS2 kaynaklı diploid embriyolar gübreleme sonuçları sırasında işlenmemiş sperm kullanımı. DNA'sını inaktive çapraz bağlantılar, bir döngü sitokinez durma jinogenetik diploitler 2 olur HSII kaynaklı üzerine jinogenetik haploid embriyolar 6, sonuçlar taşıyan UV ile muamele edilmiş sperm, kullanımı. Çünkü ortaya çıkan tüm genom çoğaltılması, ikincisi jinogenetik diploitler genom boyunca her loküsündeki homozigot bulunmaktadır. özlülük için, biz "haploidlerden" ve "homozigot diploid" olarak homozigot jinogenetik diploid embriyolar olarak haploit embriyolar jinogenetik bakın. yaşayabilir ve fertil ise, homozigot diploitler steril ve ölümcül içermeyen hatları başlatmak için kullanılabilir. HS2 tarafından uyarılan doğrudan homozigotlu¤u de kolayca mut heterozigot taşıyıcısı olan kadınlarda homozigot diploidlerin beri, genetik analiz veya genetik ekranlar dahil edilmelidiryüksek ve sabit (% 50) oranlarında 2 de homozigotluğu ve ations sergi oranları.
Aşağıdaki protokol HS2 gerçekleştirmek ve tam homozigotluğu ile Ploidi tekrarını ikna etmek için gereken adımları açıklar. tetraploid üretimi için, spermin çözeltisi muamele edilmemiş olmalıdır. homozigot diploid üretimi için, spermin, UV muamele ile inaktive edilmelidir. Tartışmada tarif edildiği gibi ek olarak, gözle görülebilir pigment belirteçler homozigot diploid belirlenmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. En iyi sonuçlar için IVF işlemi bu süre içinde meydana gelmelidir yüzden öncelikle ışık döngüsüne 7 ve hem yetişkinler hem de yumurta inisiyasyon ilk 3 saat boyunca balığı arkadaşı, sirkadiyen ritimler 8 duyarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Madison ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların (University of Wisconsin - - Madison Güvence numarası A3368-01) Tüm hayvan deneyleri Wisconsin Üniversitesi göre yapılmıştır.
1. Interrupted Çiftteşme aracılığıyla Yumurta Toplama için Females seçme
NOT: IVF-tabanlı protokoller manuel basınç ile 9 arasındaki kadınlarda olgun yumurta ekstrüzyon güveniyor. Önceki protokoller yumurta bırakma davranışı geçiren kadınlarda olmadan tankları veya çift çiftleşmelerin doğrudan kadın kullanmış, ancak (zebra balığı hatta bağlı olarak yaklaşık% 20 ya da daha az), bu kadınların sadece küçük bir bölümü manuel basınç üzerine haddelenmiş ve yetkili yumurta verim. geliştirilmiş bir prosedürde, dişiler önceden sıralanmış doğrudan görsel gözlem ile yumurtlama için, çiftleşme anında kesinti takip etmektedir. Bu prosedür olarak neredeyse tüm kadın haddelenmiş ve yetkili yumurta bu kesintiye çiftleşme adımı verimi ile önceden seçilmiş, çok etkilidirelle bastırılarak.
- deneyden önce öğleden sonra, standart zebrabalıkları çiftleşme kutularında istenen Zebra balığı gerginlik çiftleşme çiftleri kurdu. Bir çiftleşme kutusu bölünme yoluyla ya da yumurtlama insert altında erkek ve insert içinde kadın yerleştirerek ya henüz fiziksel olarak onlardan ayrı kadın aynı odasında erkek tutun.
- Bu çiftleşme başlar böylece deney sabahı, aynı yumurtlama insert içinde erkek ve kadın hem de yerleştirme, fiziksel bölümü çıkarın.
- Görme doğal çiftleşme sırasında yumurta ekstrüzyon tespit etmek için çiftleşme çiftlerini içeren tanklar inceleyin. Yumurta ekstrüzyon, ayrı erkek ve dişi ilk belirtileri de üreme kesmek için. Erkeklerde ayrılmasının ardından, önceden seçilmiş kadın ayrı ayrı ya da aynı tanka toplanmış tutun. (Tipik 50-150 yumurta / dişi) istenen embriyo sayısına bağlı olarak birden fazla kadın kullanın.
2. Sperm Çözüm hazırlanması
NOT: IVF rBir sperm çözüm olgun yumurta maruz Elies. Bu çözüm (HS2 tedavisi üzerine homozigot diploid embriyo haline) haploid zigot oluşturmak için, ya da (HS2 tedavi haline tetraploid embriyolar üzerinde olan) UV-işlenmiş diploid zigot oluşturmak için, işlenmemiş olabilir. Önceki sperm hazırlama protokolleri canlı erkeklerin anal bölge arasında Milt toplamak için kılcal tüpler kullanımı önerilen, ancak erkek sadece küçük bir bölümü Milt 9 vermiştir olarak etkisiz bir süreçtir. Aşağıda sunulan protokol daha güvenilir sonuçlar verir makaslanmış disseke testislerden sperm hazırlama, yerine dayanır.
- (Çözümler, 1, 2, 4 ve 5) tüm bileşenlerin içeren öncesinde Hank ön-karışım çözeltisi olarak zaman Hank çözeltisi hazırlayın sodyum bikarbonat çözeltisi (dışında Çözelti 6). Deneyin (Tablo 1) sabah Çözüm 6 taze hazırlayın ve karışıma ekleyin. Hanks solüsyonu (nihai solüsyon yapmak için, sabahı hazırlamakIVF işlemi), Hank Premix 990 ul ve taze yapılmış Çözüm 6 10 ul birleştirir.
- Klimalı suda bir 0.016% çözüm olarak tricaine overexposure tarafından erkekleri euthanize.
- su içinde% 0.2 Stok çözelti olarak tricaine hazırlama (1 M Tris pH 9.0 ile pH 7.0 değerine tampon A) ve 4 ° C'de tutun. Bir beher içinde, 100 ml su başına tricaine stok çözeltisi 8 ml ilave edilir, ve tricaine çözeltisine erkek aktarmak için bir ağ yerleştirin.
- (100 ul / kavrama 10 kavrama dölleme, 1 mi Hank çözeltisi içinde toplanan 10 erkek örn testis) erkek başına 100 ul karşılık gelen Hank çözeltisi hacminde döllenmesi için gerekli kavrama için bir erkek Testislere eşdeğer kullanın.
- 15 dakika boyunca solungaç hareketlerinin durdurulması ile ötenazi onaylayın. Ötenazi sonra, bir kaşıkla kaptan erkekleri kaldırın. koşullandırılmış su ile kısaca erkekleri durulayın ve bir kaç yerle ilgili kısaca yerleştirerek onları hafifçe kurulayınkağıt havlu.
- testisler, diseksiyon makas veya jilet kullanarak ilk başını kesmek ötenazi erkek kaldırmak ve yansıyan ışık kaynağı ile scissors.Under bir mikroskop diseksiyon ile karın boyunca uzunlamasına kesim yapmak, diseksiyon forseps ile iç organları çıkartmak için. forseps ile testisler kitlelerin her çekin ve Hank'in çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüp içine koyun.
Not: Testis cloaca çevresinde birbirlerine iki uzatılmış gövde duvarları yanında bulunan saydam görünüş yapıları ve her şekilde tespit edilebilir. Testis diseksiyonu sonrası bir petri plakası yüzeyinde ve Hank çözeltisi koymadan önce 2-3 dakika kalabilirler. - dar bir spatula ile testislerin kesme ve / veya hafifçe hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek, yukarı pipetleme ve 1000 ul ucu mikropipet ile çözelti içinde aşağı 5-6 kez testisler tarafından solüsyon içine sperm bırakın. testisler enkaz yerleşmek edelim.
- o kadar 2-3 saat boyunca onun kudret tutabilir buz, sperm çözümü saklayın. Sperm çözeltisi UV tedaviye başlamadan halinde geride testislerin parçalar bırakarak temiz bir mikrosantrfuj tübüne solüsyonu aktarın.
3. UV Tedavi
Not: UV muamelesi embriyoda etkin olmayan hale getirilmesi için sperm DNA çapraz bağlanması için kullanılır. jinogenetik haploid veya homozigot jinogenetik diploid embriyo üreten Bu adım yalnızca kullanılır. UV tedavisi için sperm çözüm testis (adım 2.4) parçalarından ayrılması gerektiğini, gibi büyük parçalar UV tedavisi sperm kalkan olabilir.
- Bir buz yatakta oturmuş bir depresyon cam levha temiz, kuru bir kuyuda (bir petri plakası içinde örneğin buz) sperm çözüm aktarın. de cam plaka başına sperma çözeltisi 1 ml kadar kullanın.
- UV lamba altında buz yatakta depresyon cam plaka koyarak UV sperm çözüm Açığa. 115 V (60 Hz ile 90 saniye boyunca sperm çözüm tedavi, 0.68A) 19 cm (7.5 inç) mesafe UV-lamba. Bir pipet ucu ile hafifçe UV tedavisi sırasında her 30 saniyede (temiz pipet her 30 saniye kullanın) çözümü karıştırın.
- Temiz bir pipet ucu ile mikropipet kullanılarak, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne tedavi sperm çözeltisi aktarın. (Ekstraksiyon 2-3 saat daha uzun) IVF için gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın.
Olgun Yumurta 4. Manuel eldesi
NOT: kolayca anestezi ve manuel basınç altında yumurta verecektir doğal çiftleşmelerin kesintiye elde Dişiler. Bu işlem sırasında, tricaine tedavi dikkatli bir şekilde kadın kurtarma engelleyebilir aşırı maruz önlemek için kontrol edilmelidir.
- tricaine çözüm ışığa maruz kalma ile kadın uyutmak: şartlandırılmış su çözümü tricaine net transfer kadın balık durana kadar, yaklaşık 2-5 dakika boyunca (klimalı balık suyun 8 Tricaine% 0.2 stok solüsyonu 100 ml ekleyerek yapılan) solungaç hareketi. <li> En kısa zamanda bir kadın solungaç hareketi durur, onu toplamak ve kısaca koşullandırılmış suyla durulayın için bir kaşık kullanın. Yine, balık taşımak bir kağıt havlu birkaç yerle ilgili kısaca ve tekrar tekrar yerleştirerek hafifçe kurulayın, sonra temiz, kuru bir 10 cm çapında petri tabak aktarmak kaşık kullanarak. Potansiyel solungaç kapakçık zarar vermemek için, arka yöne anterior kaşıkla balık yaklaşın.
- erken su ile aktif hale gelen herhangi bir serbest yumurta önlemek için, yavaşça ileri anal yüzgeç bölgeyi kurutmak için laboratuvar mendil veya yumuşak doku kullanın. parmaklarını Nemlendirme hafifçe su ile (onlara balık pulları yapışmasını önlemek için) destek olarak dişinin sırtına bir elin bir parmağı koyun ve yumurta haddelenmiş hale gelene kadar, diğer elinin bir parmağı ile dişinin karın boyunca hafif basınç uygulayın.
- kadın bedeni yumurta uzaklaşmaya dar bir spatula kullanın. kurtarma için koşullu su ile bir tanka geri kadın yerleştirin.
- (Su maruziyeti ile) etkinleştirin ve ekstrüzyon sonra eş zamanlı olarak 90 saniye içinde (sperm çözüm ilavesi ile) yumurta döllemek (bkz bölüm 5).
Tüp Bebek 5.
NOT: Doğal melezlerde Zebra balığı gübreleme, dış çiftleşme sırasında yumurta, su ve sperm ile eşzamanlı serbest bırakılması ve aktivasyon bağlıdır. suyun mevcudiyetinde sperm çözeltisi yumurta maruz bırakılarak vitro fertilizasyon taklit bu işlem. Su hacmi etkili bir sperm arttırmak için (1 mi), ilk küçüktür. Sperm tarafından bağlayıcı 15-20 sn 10 <içinde gerçekleşir/ Sup> ve su miktarı daha sonra arttırılabilir. Koryon sperm 11,12 bağlanması için yetki penceresi sınırlayarak debriyajın yakın senkronizasyon daha katkıda bulunur kaldırma. Elde edilen embriyolar için erken klevaj aşamalarında büyük ölçüde eş zamanlı olarak hücre bölünme döngüsü sergiler.
- (Bir erkek itibaren testislerin eşdeğerine karşılık gelen - Bölüm 2 bakınız) sperm çözeltinin 100 ul ekleyin bir petri tabakta ekstrüde yumurta debriyaja. Yavaşça yumurta zarar görmemesi için petri tabak yüzeyinden ucu kaldırmayın emin olmak birlikte sperm ve yumurta karıştırmak için yumurta arasında sperm çözümü eklemek için kullanılan pipet girdap.
- Hemen embriyonik orta (E3) solüsyonu 1 ml ekleyerek yumurta aktive hafifçe pipet ile dönen tarafından ve yine hafifçe yumurtaları karıştırın ve sperm (klimalı su da bir Parça 5 ile 7 E3 için yedek olarak kabul edilir). Döllenme için zamanlama göreli başlatmak için bir zamanlayıcı başlatın. 1 ml hacminde 1 MPF'e anda, E3 ile plaka sel. Devam etmeden önce, tam koryon genişleme de dahil olmak üzere yumurta aktivasyonu, izin 10-12 MPF'e kadar rahatsız bırakın.
6. Isı Şoku Tedavisi
NOT: Erken embriyo uygulanan bir ısı şoku sonraki hücre döngüsü 2 sırasında iğ oluşumunu sürücü Sentriyoller tamamlanmamış bir tamamlayıcısı sonuçlanan centriole çoğaltılması engeller. Karık oluşumu 13 eksikliği dönüş sonuçlarında iğ olmaması.
- chorions genişlemesi (10-12 mpf) sonra, bir çay süzgeci içine petri tabak embriyolar dökün. çay süzgeci içinde kalan embriyolar toplamak için E3 ile yıkama şişesi kullanılarak petri tabak durulayın.
- 28.5 ° C 'de E3 önceden ısıtılmış bir banyoda bir beher içinde embriyolar çay süzgeci yerleştirin. su banyosu sıcaklığına Beheri ve E3 öncesi denge ve yeterli E3 olduğundan emin olmak ve böylece çay tüm embriyolarsüzgeç ortamına maruz kalmaktadır.
- 22 MPF'e at, kısaca, 28.5 ° C su banyosunda çay süzgeci kaldırmak aşırı nemi ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerine kurulayın ve 41.4 ° C'de ısı banyosunda benzer önceden ısıtılmış E3 beher içine yerleştirin.
- 24 MPF'e anda, kısa blot sonra 28.5 ° C su banyosunda geri E3 çay süzgeci aktarın. 29 MPF az 10 cm Petri levhaya çay süzgeci embriyolar aktarmak E3 ile yıkama şişesi kullanın.
One-döngüsü Sitokinez Stall ile Embriyolar 7. Seçim
- süresi 35-45 MPF'e sırasında iletilen bir ışık kaynağı ile bir mikroskop altında, 2-hücreli aşamaya simetrik bölünme geçiren ve olan bu embriyolar, bu nedenle döllenir seçin. Hücre bölünmesini geçiren olmayan embriyolar çıkarın.
- İlk hücre döngüsü sırasında normal hücre bölünmesi için seçilen döllenmiş embriyolar, gözlemleyerek devam edin ve sn boyuncakinci hücre döngüsü (50-65 mpf).
- 4 hücreleri ( "No durak", 2: 4 hücreli embriyonun 2 düzeneği standart) aşağıdaki kategoriler (Şekil 2C) 'ye göre Sıralama embriyolar; 3 hücreleri (bir sapkın 2 küçük hücrelerde "kısmi durak", 1 büyük hücreli düzenlemesi); 2 hücreleri (: 2 hücreli embriyo özdeş 1 düzenleme embriyo 1 bir tek hücre döngüsü gecikmesi sergileyen, "durdu"). taze petri tabak içine durdu embriyolar sıralayın.
NOT: Bu aşamada, 2 embriyolar: 2 düzenleme de blastomere hücre bölünmesi durak yapılan ikinci bir hücre döngüsü sırasında hangi karşılık gelir; bir sapkın 2 küçük hücrelerde embriyolar: 1 büyük hücreli düzenlemesi ısı şoku bir blastomere ikinci hücre döngüsü sırasında bir hücre döngüsü durak neden ancak diğer burada karşılık gelir; ve embriyolar 1 "durdu": 1 düzenlemenin ikinci hücre döngüsü sırasında her iki blastomer istenilen hücre bölünmesini yapılan bu nereye tekabülahır. Durduruldu embriyolar sonraki hücre döngüsü döneminde (65-80 mpf) sırasında hücre bölünmesini devam etmesi gerekir. Blastomer düzenleme mili 2,14 stabilize nedeniyle önceki hücre döngüsü eksik ipuçlarına, değişken olabilir, ancak çoğu embriyolar normal gelişim geçirebilen bir nispeten normal blastula oluşturacaktır. - Embriyolar 10 cm plaka başına 80 embriyo limitli, Petri plakasında geliştirmeye olanak sağlar. 24 HPF, onlar indirgenmiş ekseni uzantısı aksine, diploid veya homozigot diploid embriyolar 6 (eksen uzantısı (Şekil 3A, 3C) normal ölçüde) normal morfoloji özelliği ve haploidlerin artan vücut kalınlığı, karakteristik olup olmadığını belirlemek için embriyolar gözlemlemek (Şekil 3B)), ve / veya altın veya albino ve bu deneyler 36 MPF, (Şekil 3 ve aşağıya bakınız) 2,6,9 genetik pigment işaretlerini kullanarak diploidization değerlendirmek. haploid morfoloji var, ya da parçalanmış olan veya diğer fena halde anormal kusurları sergilemek görünen herhangi bir embriyolar çıkarın.
NOT: İstenirse, günlük olarak parçalanmış ya da fena halde anormal embriyolar kaldırmak için devam eden ve orta yenilemek için taze E3 eklerken embriyolar, 5 gün sonra döllenme kadar geliştirmeye olanak sağlar. Not: Hayatta kalan embriyolar da kuluçka sistemine aktarılması ve standart koşullar altında beslenerek 5. günde swimbladder şişirildikten sonra yetiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir hücre döngüsü sitokinez durak rağmen, DNA replikasyon embriyo (Şekil 1) DNA içeriğinin tekrarlardan sonuçlanan, embriyolar, normal olarak ortaya çıkar. Streisinger Isı Şok protokolü (standart HS) dönemi 13-15 dakika sonra döllenme (mpf) sırasında ısı nabız içerir ve türetilmiş bir yöntem burada açıklanan ise 35 mpf 1,2 ilk embriyonik hücre bölünmesi sırasında öncelikle sitokinez tutuklama indükler, Isı Şok 2 (HS2), dönem 22-24 MPF'e sırasında ısı şok kullanır ve 50 (MPF; 2,3,4 Şekil 2) ikinci embriyonik hücre bölünmesi sırasında sitokinezi tutuklama indükler olarak anılacaktır. 24 hpf, embriyoların gözlem onlar diploid veya homozigot diploid embriyo normal morfoloji özelliği, ya da haploid embriyoların morfolojisi karakteristik ekseni kısa ve geniş bir vücuda sahip olmadığının belirlenmesi izin (Şekil 3)
Şekil 1: Gübreleme türleri. (A) Doğal çiftleşme. Erkek ve dişi gametlerin doğal diploid sonuçlanan tedavi edilmemektedir. (B), sperm baba DNA ve haploid zigot üretimi yok sonuçlanan UV ile muamele edilmektedir. Eğer tedavi edilmezse, bu tür haploids geçen gün gelişme 2-3 hayatta yoktur. Isı İle Şok 2 (HS2) ile haploid zigot (C) tedavisi, erken embriyo mitoz sitokinez bir devir inhibe eder. Bu hücre döngüsü durak, çiftetkilenmemiş DNA replikasyonu d, uygulanabilir ve verimli yetişkin olabilir homozigot diploidlerin üretir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: HS2 ikinci hücre döngüsünü durdurduklarını tarafından tüm genom çoğaltılması teşvik etmektedir. 2-, 4- ve 8 hücreli embriyolar tekabül eden ilk üç hücre döngüsü sırasında bir muamele edilmemiş embriyo (A) Celi klivaj paterni. İkinci hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesinin bir döngüsü durak (B) HS2 tedavi sonuçları. tetraploid için - (> 2n n) ya da diploid (2n -> 4n) (metne bakınız) haploid diploid ya gelen durak sırasında, embriyoların devam eden DNA sentezi sonuçları, diploidization geçiyor. Bu durak sonra embriyo KD ile, hücre bölünmesini sürdürürWLY ploidi satın aldı. (C) HS2 ile tedavi edilen embriyolar Blastomer düzenlemeler blastomerler ikinci bir hücre döngüsü boyunca hücre bölünmesi geciktiren olmasına bağlı olarak, çeşitli sergileyebilir: i) "herhangi bir durak": Ne Blastomer sergiler bir gecikme, 2 sonuçlanan: 2 düzeneği karakteristiği 4 hücreli aşamada embriyolar, ii) "kısmi durak" 1 düzenleme ve iii) "durdu": iki blastomerlerin tek bir sapkın 2 ile sonuçlanan bir erteleme gösteren ve 1: Her iki blastomerler 1 ile sonuçlanan bir gecikme sergilerken 2-hücreli dönem embriyoların düzenlenmesi karakteristiği. (A - C), çekirdekleri nükleer büyüklükte bir genişleme tarafından temsil diploidization olay ile, mavi daireler olarak temsil edilir. Hücre bölünmesi durak için önerilen temel olarak centriolar davranışı gösteren bir diyagram için referans 2'ye bakınız. Daha büyük bir Versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.
Şekil 3: Doğal diploitler, haploidlerden ve gynogenotes morfolojisi. (A) Doğal haç aracılığıyla elde edilen bir diploid Normal embriyonik morfolojisi. (B) Haploid embriyolar daha kısa ve daha geniş gövde ekseni sergilerler. (C) Homozigot diploitler normal vücut morfolojisi vardır. Embriyolar ayrıca ebeveyn DNA miras izleme kolaylaştırmak için pigmentasyon geni golden bir resesif mutasyon: anneler homozigot altın bir mutasyon taşıyıcıları ve babalar bu gen için yaban tip vardır. Böylece, heterozigot doğal diploitler, altın için, mutant pigmentasyon sergiler, hem haploidlerden ise (altın için hemizygous) ve (altın için homozigot) homozigot diploidlerin yabani tip pigmentasyon sergiler. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Paneller yeniden modifiyeFerence 2, izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Çözüm | Bileşenler | Depolama koşulları |
| Hanks 'Çözüm 1 | 8.0 g NaCl, ve 0.4 g KCI 100 mi GKD 2 O | 4 o C'de saklayın |
| Hanks 'Çözüm 2 | 0.358 g susuz Na 2 HPO 4 ve 0.6 g KH 2 PO 4 ml GKD 2 O 100'de | 4 o C'de saklayın |
| Hanks 'Çözüm 4 | 0.72 g CaCI2 50 mi GKD 2 O | 4 o C'de saklayın |
| Hanks 'Çözüm 5 | 1.23 g kadar 4 ∙ 7H 2 O MgSO 50 mi GKD 2 O | 4 o C'de saklayın |
| Hank'in Premix | Aşağıdaki sırayla, ekleyin: 10.0 mL Çözelti 1, 1.0 mi Çözelti 2, 1.0 ml solüsyon, 4, 86.0 mi ddH2O ve 1.0 mi Çözüm 5 | 4 o C'de saklayın |
| Hanks 'Çözüm 6 | 0.33 g NaHCO 3 10 mi GKD 2 O | IVF prosedürünün sabah taze hazırlayın |
Tablo Hank çözümleri 1. hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritik adımlar
In vitro fertilizasyon etkili koşullar altında çalışmak için çok önemlidir. olgun yumurta (adım 1) iyi bir tedarik sigortalamak için dişiler çiftleşmek için ayarlanmış en az 5 gün süreyle çiftleşme haç kurulmuş olmamalıdır ve gebe görünmelidir. ıslahının kesinti sırasında, bir gözlemci doğal yumurta ekstrüzyon ilk görünüm için yeterli 15-30 tankları izleyebilirsiniz. İlk yumurtalar çoğu yumurta IVF işlemi için kadın iç kalmasını sağlamak amacıyla, doğal çiftleşmelerin yoluyla serbest zaman çiftleşme kesinti mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Şimdi olgun yumurta manuel ekstrüzyon için hazır olan bu kadın, sonraki yumurta sürümü üzerinde belirgin bir etkisi olmadan en fazla 2 saat süreyle ayrı tutulur edilebilir. Etkili bir sperm çözüm (adım 2) hazırlamak için, erkekler sağlam ve ideal zebrabalıkları erkek üreme özelliği olan bir kırmızımsı bir renk tonu ile görünmelidir. Temiz bir diseksiyon genellikle remo içerirVücudun posterior ve anterior çekerek yüzmek mesane doğru çekerek bağırsak parça Ving. Merkezi, iç organların çıkarılmasından sonra, testis, iç gövde duvarının her iki tarafında yan yana olarak saydam uzunlamasına kitleleri kalır. İstenmeyen organlara sperm çözeltisi içine (örneğin bağırsaklar dahil) kaçının; Gerekirse Hank çözeltisi içine yerleştirilmeden önce kuru bir petri plakası yüzeyi üzerinde çalışarak testis bu ayırın. IVF (adım 4) sırasında yüksek fertilizasyon oranları elde etmek için, ekstrüde yumurta sperm ek kadar yetkili tutulur esastır. hafif san ton gübreleme sergi için yetkili Yumurta ve saydam bulunmaktadır. Su gübreleme engel olacaktır yumurta aktivasyonu ve erken aktivasyon tetikleyecek çünkü sperm eklenmesinden önce su ile herhangi bir temas olan yumurta kaçının. Su aktivasyonu ve döllenme hangi irade, yumurta dehidratasyon önlemek amacıyla kadından ekstrüzyon 90 saniye içinde meydana gelmelidirbunların bozulmaya yol açar. Gerekirse, haddelenmiş yumurtalar ile takviye edilmiş Hank çözeltisi 100-200 ul (1.5 saat veya daha fazla) daha uzun bir süre muhafaza edilebilir,% 0.5 Sığır Serum Albumin (BSA) 17 (bu özel amaç için Hank çözeltisi hazırlanırken, hazırlama premix BSA takviyesi sırasında eklenen su içeriği) düzeltmek için. Yumurta Hank BSA çözeltisi yardımı ile yetkili tutulduğu takdirde, bir mikropipet kullanarak yumurta aşırı Hank'in BSA kaldırmak ve 1 dakika içinde döller.
HS2 kullanarak diploidization başarısı için kritik bir adım durdu embriyolar (adım 7) ve sıralama olduğunu. simetrik 2 hücreli embriyolar bölebilen ilk ayrım döllenmenin ve (- bu embriyolar atılmalıdır doğrudan 1- 4-hücreleri de 35-50 MPF geçiş embriyolar IVF sonuç sırasında zaman zaman dispermy) hücre bölünmesini başlar embriyolar seçilir. Hücre döngüsü bu erken embriyonik st sırasında her 15 dakikada gerçekleşirböylece her hücre döngüsünün ilk 10 dakika boyunca embriyoların yaran sıralama yaşları (böylece 35-50 ilk hücre döngüsü için mpf, ikinci hücre döngüsü için 50-65 mpf, ve benzeri), döngüleri ve doğru arasındaki örtüşme yokluğunu sigortalanır bir hücre bölünmesi durak tanımlanması.
Değişiklikler ve sorun giderme
İlk fertilizasyon oranları yanı sıra daha sonraki HSII tedavi yokluğunda haploidlerin sıklığını test ederek gerekirse 3. adımda UV tedavi gücü (örneğin pozlama süresi, lamba gücü, lamba mesafe) ayarlanabilir: Doğru miktarda haploid embriyoların% 100 ile sonuçlanan süre UV ışınlarına maruz kalma fertilizasyon oranları üzerinde belirgin bir etkisi olmadığı (diploid embriyolardan haploid ayırt etmek Temsilcisi Sonuçlar bakınız). yetersiz UV ışınlarına maruz kalma nedeniyle t diploid embriyolar üretirken çok fazla UV ışınlarına maruz kalma, sperm fonksiyonu üzerinde zararlı etkileri muhtemelen nedeniyle azalmış fertilizasyon oranları nedenSperm DNA o eksik inaktivasyonu.
Embriyolar, hücre bölünme yeniden başlaması (adım 7) sonra gelişimsel kusurlar veya ölümcül sergilemek durumunda, adım 6'da ısı şok sıcaklığı embriyo hayatta artırmak için (örneğin 41.0 ° C) hafifçe azalabilir; anormal 3-hücresinin hemen hemen eşit miktarda neden olabilir ve, ikinci hücre döngüsü sırasında 2 hücreli embriyolar durdu (ve centriolar çoğaltılması üzerine etkisi eşik yakın bu nedenle) minimum bir sonraki gelişimsel bozukluklar neden ve hücre döngüsü yeniden başlatılması sonra hayatta kalma oranına koşullar .
Onlar geliştirmek gibi HS2 yöntemi çeşitli hücre döngüsünü izlemeye olanak sağlar embriyoların doğrudan gözlem beri, hücre bölünmesi stall (ve dolayısıyla tüm genom tekrarından) değerlendirmek için uygun ve içsel mekanizma içermektedir. tek hücre döngüsü bölünmesi durak geçirmiş embriyoların Manuel seçim diploidized embriyo düzgün bir nüfusa üreten sağlars. HS2 DNA kopyalama teyit etmek için bir iç mekanizma olarak bir hücre bölünme durak eylemler olarak, herhangi bir zebra balığı genetik türünün (örneğin, AB, Tübingen, WIK) içinde gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, hücreye dahil görebilir genetik işaretler diploidized embriyolar (Şekil 3) belirlenmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, bu tür, altın ve albino gibi pigmentasyon genlerindeki çekinik mutasyonları için homozigot olan kadınlarda yumurta kullanımı aynı pigmentasyon gen için, normal alelleri taşıyan yabani tipte türlerinden türetilmiş sperm ile birleştirilebilir. UV ile muamele edilmiş, sperm, vahşi tip bir pigment alelleri, katkı, çünkü, bu durumda, haploid, diploid ve homozigoz embriyolar çekinik pigment mutasyon sergilemektedir. Buna ek olarak, homozigot diploitler az genişletilmiş haploid morfoloji tezat, 24 hpf vahşi tip morfolojisi sergilerler. anne resesif ve genel Embry görünüm kombinasyonuo morfoloji başarılı ploidi tekrarını doğrular. Başka bir onay da, işlenmiş ve işlenmemiş embriyoların kromozom sayıları yoluyla elde edilebilir.
resesif görebilir genetik markerlerin göre yukarıda tarif edilen gen işaretleme sistemi, aynı zamanda elde edilen embriyolar, sperm, tam UV muamele ile inaktive edilmemiş olması durumunda, vahşi tip pigmentasyon sergiler, çünkü döl sperm türetilmiş DNA yokluğunu teyit sağlar . genetik işaret sisteminin yokluğunda, embriyo numune tüm embriyolar 24 hpf haploid morfoloji onaylamak için ısı şoku yokluğunda gelişmeye bırakıldı ve böylece sperm DNA'sı inaktivasyonu tamamlandıktan edilebilir. tam inaktive sperm ile birlikte, bu aynı genetik markalama sistemi aynı zamanda potansiyel spontan kutup vücut arızası tespit sağlar. Böyle bir olay, bir diploidization tedavisiz diploid morfolojiye sahip resesif işaretlenmiş embriyoların görünüme neden olur. Spontan kutup body başarısızlık zebrafish gözlenmemiştir ancak Xenopus tropicalis 18 bildirilmiştir. Belirli bir sistemde mevcut ise, bu kendiliğinden olay optimal Ploidi manipülasyon uygulamak için azaltılmış veya kontrollü gerekirdi.
tekniğin sınırlamaları
canlı gynogenotes üretme kabiliyeti homozigot zararlı olan arka plan gen varyantı yokluğunda dayanmaktadır. Bu nedenle, işlemin başarısı kullanılan genetik suşuna bağlı olarak değişecektir. Jinojenez birden fazla kuşak yoluyla genetik soyların seçimi canlılığını 1 geliştirmek için gösterilmiştir.
Diploid embriyolar üretme muamele edilmemiş sperm ile birlikte kullanıldığında HS2 yöntem olup, aynı zamanda bir yüksek frekansta tetraploid embriyo üretimine olanak tanır. Bununla birlikte, bu durumda, tetraploid dönüşüm diploid nedeniyle, genetik markerler kolaylıkla tüm genomunun onay izin vermeze çoğaltma. Bu durumda, durmuş embriyolar senkronize embriyolar bir hücre döngüsü durak gözlenmesi ve seçim tetraploid noktası sigortalamalısınız, kromozom sayısı daha ploidi teyit etmek için kullanılabilir.
Mevcut / alternatif yöntemlere göre Önemi
40 yıl önce 1 üzerinde Streisinger tarafından açıklanan, ancak standart HS yöntemi yaygın zayıf verim için kullanılan olmamıştır. Bunun yerine, Ploidi manipülasyon neredeyse sadece alternatif ve ikinci mayoz bölünme inhibe ederek Ploidi çoğaltılması sonuçlanır Erken Basınç, nispeten daha verimli bir yöntem güvendi. Ancak, genetik bir araç olarak değerini azaltır gen homozigotluğu 9,19, değişken oranlarda Erken Basınç sonuçları. Son çalışmalar göstermektedir ki HS2 standart HS protokolü, birinci hücre döngüsü sırasında farklı bir zamanda ısı darbesinin, yani uygulamanın değişik bir (22-24Standart HS 12-14 MPF'e göre HS2 içinde mpf dönem) homozigot diploid yapımları kadar 4 kat arttı verim ile sonuçlanır.
Isı pulsunun etkisi sonuç olarak mil oluşturur ve aracılık uygun tamamlayıcı yoksun (ilk hücre döngüsü sırasında 22-24 MPF) ısı şoku zamanında sırasında centriole çoğaltılması inhibisyonu sayesinde oluştuğu anlaşılmaktadır olabilir (ikinci hücre döngüsü tekabül eden 50-65 MPF'e) aşağıdaki hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesi. Centriole çoğaltılması kesin bir hücre döngüsü durak sonra devam etmek gelişimini sağlayacak, daha sonraki hücre döngüsü sırasında ısı şok yokluğunda devam edebilirsiniz. Centriole çoğaltma ve DNA replikasyonu döngüleri birbirine bağlıdır, çünkü 20, DNA replikasyonu hatta ikinci hücre döngüsünde durdu bölünme sırasında normal olarak devam eder. Bu hassas tüm genom çoğaltma ve tam homozygosis sonuçlanır.
gelecekteki uygulamalar
21 gibi birden çok alleller, ilgili olanlar da dahil birden fazla nesiller gerektirecek olanlar özellikle bu tür genetik ekranlar gibi genetik şemaları, kolaylaştırabilir.
HS2 benzer dış gübreleme ile diğer türlere uygulanabilir yaklaşımlar, hatta henüz genetik sistemler olarak kullanılmadığından. Bu methodözellikle de, bir ısı darbesinin zararlı gelişim etkilere yol açmadan hassas hücre bölünmesi kabini ve tüm genom tekrarından centriole tekrarını etkileyebilir üretebilir blastomerli bisiklet başlatılmasından yoluyla döllenmeden bir süre yararlanır. Böylece, bu erken süresi diğer hayvan sistemlerinde Ploidi manipülasyon dayalı genetik yöntemler geliştirmek ısı şok hassasiyet için keşfedilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
