Abstract
זיהומי foodborne בארה"ב נגרמת על ידי מיני Vibrio הראו מגמת עלייה. בשנת מהמין Vibrio, parahaemolyticus V. אחראי רוב דלקות -associated Vibrio. לפיכך, בידול מדויק בין spp Vibrio. וזיהוי של V. parahaemolyticus יש חשיבות קריטית כדי להבטיח את שלומם של אספקת המזון שלנו. למרות בטכניקות מולקולריות נפוצות יותר ויותר, שיטות-תלוי תרבות עדיין נעשות באופן שיגרתי והם נחשבים שיטות סטנדרטיות בנסיבות מסוימות. לפיכך, מדיום אגר chromogenic רומן נבדק במטרה לספק שיטה טובה יותר עבור בידוד ובידול של spp Vibrio משמעות קלינית. הפרוטוקול משווה את הרגישות, סגולי וזיהוי הגבול לצורך זיהוי של V. parahaemolyticus בין מדיום chromogenic החדש מדיום קונבנציונלי. V. השונה זני parahaemolyticus (n = 22) מחדשהצגת קפסיד ומקור מגוונים של מקורות ששמשו. הם זוהו בעבר על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), ומאומת נוספת במעבדה שלנו על ידי tlh -PCR. לפחות ארבעה ניסויים נפרדים, זנים אלה היו מחוסנים על מלחי סוכרוז chromogenic אגר thiosulfate-ציטראט-מרה (TCBS) אגר, המהווה את המדיום המומלץ culturing מין זה, ואחריו דגירה על 35-37 מעלות צלזיוס למשך 24 hr -96. שלושה V. זני parahaemolyticus (13.6%) לא גדלו באופן אופטימלי על TCBS, בכל זאת הציגו מושבות ירוקות אם יש צמיחה. שני זנים (9.1%) לא הניב המושבות ציאן הצפויות על אגר chromogenic. V. אי זני parahaemolyticus (n = 32) נבדקו גם כדי לקבוע את הספציפיות של אגר chromogenic. בין זנים אלה, 31 לא גדלו ולא הפגינו שום מורפולוגיה מושבה אחרות. ההתאוששות הממוצעת של V. parahaemolyticus על chromogenic אגר היה ~ 96.4% ביחס ל אגר סויה tryptic בתוספת 2% NaCl. לסיכום, אגר chromogenic החדש הוא מדיום יעיל לגילוי V. parahaemolyticus וכדי להבחין בינו vibrios האחר.
Introduction
כחבר של סוג Vibrio, V. parahaemolyticus הוא גראם שלילי, שאינם יוצרי נבגים, מעוקל, חיידק דמוי מוט. הוא מציג תנועתיות גבוהה בשתי סביבות נוזלות חצי מוצק. רוב V. זני parahaemolyticus הם פתוגניים לבני אדם, אך תת פתוגניים גרמו מגיפות מגפות, ומכאן מין זה נחשב פתוגן foodborne חשוב במדינות רבות 1,2. השכיחות של זיהום Vibrio בארה"ב הוכיחה מגמת עלייה מאז 2000 3. בין spp Vibrio., V. parahaemolyticus הוא המין הנפוץ ביותר בגרימת מחלות בארצות הברית 4,5. מינים אחרים רלוונטיים קליני כוללים V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae ועוד אחוז קטן של המחלות נגרם על ידי מינים רבים בו זמנית.
Parahaemolyticus V. הוא i טבעיnhabitant מים ימיים ולכן התפוצה הרחבה ביותר במי אוקיינוס ברחבי העולם כולל שפכי נהרות. המין התגלה בשנת 1950 לאחר התפרצות של הרעלת מזון ביפן. בארה"ב, המין בודד לראשונה במי ים, משקעים, סרטנים וצדפות באזור Puget Sound 6,7. ניזונים מסנן בבתי גידול ימי, כגון צדפות צדפה, עשויים להכיל סוגי V. parahaemolyticus כחלק פלורה 8 הטבעית שלהם. ככזה, V. זיהומים parahaemolyticus ב האנושי לעיתים קרובות קשור לצריכה של פירות ים מזוהמים, במיוחד צדפות נא או שלא בושל. מסלול משותף פחות כניסה מתרחש כאשר פצע פתוח חשוף מי ים, מוביל לזיהום עור. רוב V. זני parahaemolyticus אינם גורם למחל אדם, אך תת מסוימים מחסה גורמים ארסיים כמו המוליזין ישיר thermostable (TDH) הם פתוגניים. התסמינים הנפוצים ביותר של V. foodborne parahaemolyticus זיהום הנושלשולים וכאבי בטן, ואחריו בחילות, הקאות וחום. כאבי ראש וצמרמורות גם מדווחות. תקופת הדגירה החציוני הוא 15 שעות, אבל יכול להיות עד 96 שעות לאחר צריכת כמות מספקת של זנים פתוגניים 9. המחלה נמשכת בין יומיים לשלושה ימים. הסימפטומים גסטרואנטריטיס הנגרמת על ידי V. parahaemolyticus הם בעיקר מעצמם ולכן טיפול מיוחד אין צורך. מקרים קלים של גסטרואנטריטיס ניתן לטפל ביעילות על ידי למקרה של התייבשות. עוד מחלות קשות ניתן לטפל על ידי אנטיביוטיקה כגון טטרציקלין או ציפרופלוקסצין 10. שיעור תמותה הוא כ -2% למקרי גסטרו, אך הוא עשוי להיות גבוה ככל 29% למי לפתח זיהום או הרעלת דם דם. כל אדם אשר צורכת פירות ים או יש פצע פתוח חשופים מי ים נמצא בסיכון של V. זיהום parahaemolyticus. הצורה חמורה יותר של מחלות, הרעלת דם מסכני חיים, נפוצה יותר בתוך תת-אוכלוסייה עם שיתוף רפואי בסיסיnditions 11, הכולל אלכוהוליזם, מחלות כבדות, סוכרת, מחלת כליות, ממאירות, ומצבים אחרים מובילים לתגובה חיסונית מוחלשת. יש לציין, קבוצה זו של אנשים היא גם בסיכון גבוה יותר לחלות במחלות קשות שנגרם על ידי V. vulnificus, אשר ניתן למצוא בבתי גידול טבעי דומה V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus מבודדת באופן שגרתי באמצעות thiosulfate-ציטראט מרה מלחי סוכרוז (TCBS) אגר כמדיום סלקטיבית ההפרש. עשרה במי peptone אלקליין עלולים להקדים בידוד על אגר TCBS. מושבות משוערות על TCBS אז נבדקים נוספים מערך של בדיקות ביוכימיות / או מבחנים מולקולריים מיקוד הנוכחות של גנים ספציפי מינים. בשיטות מבוססות PCR משמשים לעתים קרובות כדי לאשר את זהותם של V. parahaemolyticus ידי הגברת גן המוליזין thermolabile, tlh 12.
לא משנה של chOICE של שיטות אישור, חשוב שיהיה מדיום יעיל לבודד ולהבחין V. parahaemolyticus מ vibrios הימי אחר מלכתחילה. TCBS נעשה שימוש בדרך כלל להבדיל מינים בתוך הסוג Vibrio לפי היכולות שלהם כדי להתסיס סוכרוז 12. תגובת תסיסה חיובית מלווה בשינוי בצבע הכחול Bromothymol אינדיקטור pH. V. מושבות parahaemolyticus הן די מובחנות TCBS, מפגין כחול לצבע ירוק. עם זאת, המדיום הזה לא יכול בקלות להבחין V. alginolyticus ו V. cholerae. תסיסת סוכרוז מינים פרוטאוס עשויים לייצר מושבות צהובות דומות V. cholerae או V. alginolyticus 13. על בידוד ראשוני על TCBS, V. parahaemolyticus יכול להיות גם בטעות כמפר Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, ו Pseudomonas spp 14. זנים עם Ferm סוכרוז מתעכבentation עלול להתבלבל עם סוכרוז אחר nonfermenting 13 Vibrio, הכולל V. parahaemolyticus. TCBS נמצאה להיות רגישים לא נגד Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, בין היתר. מינים אחרים כמה להניב ירוק מושבות אפורות אשר מבולבלות פוטנציאלי עם V. parahaemolyticus או V. vulnificus 15. כתוצאה מכך, רצוי לפתח תקשורת תרבות האלטרנטיבית ברגישות טובה יותר וספציפי כלפי גילוי ובידוד V. parahaemolyticus ומינים אחרים קשורים זה לזה.
חלופות מדיה פותחו מספר לאחרונה. בנוסף להכללת סוכנים סלקטיבית, רוב לשלב מצעים chromogenic להבדיל מבוסס מינים על פעילות אנזימטית ההפרש שלהם. לדוגמה, indoxyl-β-glucoside ו indoxyl-β-galactoside שימשו מצעים chromogenic להבדיל V. פסקתימושבות haemolyticus (אשר מופיעים בצבע ירוק כחלחל) מאלו של V. cholerae (סגול) בשל היכולות ההפרש שלהם לייצר-glucosidase β ו β-galactosidase 16. ניסוחים שונים של אגר chromogenic שפותחו על ידי מספר קבוצות הוערכו ו דווחו לבצע דומה ל- או יותר טוב 17,18,19 TCBS. יתרון של שימוש בינוני chromogenic הוא כי והצביעה סביב המדיום היא מינימאלית ובכך מקלות על הבידוד של מושבות בפרט. במחקר זה, החוקרים העריכו את היכולת של מדיום chromogenic שעוצבה זה מקרוב כדי לזהות ולבודד V. cholerae, V. parahaemolyticus, ו V. vulnificus; עם דגש מיוחד על יכולתה להבחין V. parahaemolyticus ממינים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מדיה Culturing של זנים מיקרוביאלית
הערה: טכניקות ספטית השתמש בכל הניסויים. להשתמש בחומרים סטריליים. לעקר את כל המכולות, הכלים מגיבים לפני השימוש. חיטוי כל החומרים פסולת לפני הסילוק משום שהם נחשבים ביולוגיים מסוכנים. טמפרטורת חיטוי שילוב זמן היא ≥121 ° C x ≥15 דקות לכל מההליכים הבאים.
- כדי להפוך ~ 1-L אגר סויה tryptic (TSA), הראשון להוסיף 1 ליטר deionized מים בבקבוק 2-L Erlenmeyer המכיל בר ומערבבים מגנטי. השתמש בבקבוק כי הוא לפחות פי שתיים גדול יותר הנפח הסופי. להוסיף 30 גרם של אבקת מרק סויה tryptic ו -20 גרם אגר גרגירים לתוך הבקבוק.
הערה: השתמש 2% אגר במקום 1.5% להגביל ומסחף כמה spp Vibrio.- מערבבים היטב על ידי הפעלת בוחש. תוך ערבוב, להפעיל את החימום כדי להרתיח את התערובת. הסר את הבקבוק מן התנור ברגע שהתערובת מתחילה לרתוח. רופף לכסות הבקבוק דואר עם נייר אלומיניום. קלטת רדיד כדי לאבטח אותו אל הבקבוק לפני החיטוי.
- כדי להפוך מרק סויה tryptic (TSB), להשמיט את אגר מן המתכון בשלב 1.1.
הערה: אפשר להשתמש בקבוקים במקום בקבוק Erlenmeyer. - כדי להפוך אגר סויה tryptic בתוספת נתרן כלורי 2% או NaCl (TSAS), להוסיף 20 גרם של NaCl בתערובת לפני ערבוב וחימום. כדי להפוך מרק סויה tryptic בתוספת 2% NaCl (TSBS), להשמיט את אגר, להוסיף 20 גרם של NaCl בתערובת לפני ערבוב וחימום.
- כדי להפוך מוח לב עירוי (BHI) אגר, להשעות 37 גרם של אבקת BHI ו -15 גרגרי גרם אגר ב 1 ליטר של מים מטוהרים. חום עם תסיסה תכופה לפזר את האבקה. חיטוי. השמט אגר לעשות מרק BHI.
- כדי להפוך אגר TCBS, להשעות 89 גרם של אבקת TCBS ב 1 ליטר של מים מטוהרים. חום עם תסיסה ומרתיחים תכופים עבור 1 דקות כדי לפזר את האבקה לחלוטין. אל חיטוי.
- עבור כל מדיה אגרה, לקרר את אגר החם 45-50 ° צלזיוס באמבט מים. מסדרים צלחות פטרי ריקות בערימות של חמש עד שש צלחות. החל בתחתית הערימה, לשפוך אגר מותך לתוך כל צלחת פטרי להגיע כחצי מלא. סגור את מכסת צלחת פטרי לאחר המזיגה. אפשר אגר כדי לחזק על ידי נותן צלחות לשבת בטמפרטורת החדר.
- השתמש הצלחות אגרו למחרת או אחרי 12 שעות. אחסן צלחות בשימוש במקרר עד שבועיים. לפני השימוש, להסיר צלחות מהמקרר לאזן אותם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות.
הערה: אגר אחת ליטר עושה ~ 45 צלחות אגר. אפשר הצלחות אגרו להתייבש מספיק ביום הכנה, לאזן אותם לטמפרטורת חדר לאחר בקירור כדי להפחית ביעילות את התפשטות המושבות.
- השתמש הצלחות אגרו למחרת או אחרי 12 שעות. אחסן צלחות בשימוש במקרר עד שבועיים. לפני השימוש, להסיר צלחות מהמקרר לאזן אותם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות.
- השג צלחות אגר שוקולד chromogenic לאזן אותם בטמפרטורת החדר לפני כל ניסוי.
- תת כל 54 זני חיידקים שניתן לראות בטבלה 1 כל כמה days.
- השתמש לולאת inoculating סטרילי להעביר תרבויות ממלאי קפוא או שקבוצה קודמת למדיה nonselective כגון BHI, TSB / TSA או אגרו שוקולד. לגדול spp Vibrio halophilic. על TSBS / TSAS.
- כדי לבדוק את טוהר התרבות, פס כל הזנים בתבנית שתאפשר תצפית של מושבות מבודדות. לדוגמה, להשתמש בדפוס פסים תלת פאזיים לדלל כמות גדולה של חיידקים כמות קטנה יותר, בסופו של דבר מניב מושבות מבודדות.
- הדגירה ההפוכה הצלחות ב 35-37 מעלות צלזיוס עד 48 שעות. לקבלת spp קמפילובקטר., דגירה צינורות או צלחות בצנצנת סגורה המכסה המכיל כיס גז לייצר סביבה microaerophilic. שים מורפולוגיה מושבה לאחר דגירה. תרבויות טהורות אמורות להניב מושבות כי תערוכת מורפולוגיה מושבה דומה.
הערה: דגירה כל הצלחות הפוכות כדי למנוע טיפות מים דחוסות נוצרו על החלק התחתון של המכסה מלנפול על colonies.
2. קביעת מיני PCR
- לנהל tlh -PCR כדי לוודא את זהותו של V. זני parahaemolyticus. השתמש פריימרים tlh -f (5 'AAA מהפקולטה לרוקחות אוכלים גת TAT GCA GAA GCA CTG 3') ו -R tlh (5 'GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') כדי להגביר שבר 450 נ"ב של הגן thermolabile המוליזין 20 .
- השתמש לולאת inoculating סטרילי להעביר כמה מושבות מבודדות של כל V. זן parahaemolyticus מ TSAS עד 5 מ"ל של TSBS. לדגור על 35-37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
- תרבויות צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1. הסר supernatant לשטוף את הכדור פעמיים עם בופר פוספט (PBS). מרתיחים את ההשעיה למשך 3 דקות להניב lysate התא.
הערה: V. parahaemolyticus קל להיות lysed. לכן מגיב תמוגה אינו נדרש. כמו כן ניתן להשתמש קצת המושבה ישירות כתבנית. - בצע PCR בתוך נ התגובה 25-μlolume. הכינו תערובת התגובה המכיל ריכוז סופי של חיץ 1x PCR, 1.5 מ"מ MgCl 2, 100 מיקרומטר של כל dNTP, 1 מיקרומטר של כל צבע יסוד, 1 U תקי פולימראז ו 1 μl של lysate התא. לאחר preincubation ב 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לרוץ 35 מחזורי הגברה של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 ° C למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות 21.
- aliquots טען של amplicon 5 μl ג'ל agarose 1.5%. הפעל אספקת החשמל להתחיל אלקטרופורזה. דמיינו את קיומו או אי קיומו של amplicons תחת תאורה UV לאחר מכתים ברומיד ethidium.
צמיחה 3. על סלקטיב דיפרנציאל מדיה
- שניים עד ארבעה ימים לפני הניסוי, פס כל זני חיידקים שניתן לראות בטבלה 1 על מדיום סלקטיבי (TSAS, BHI או אגר שוקולד) לבידוד המושבה. דגירת צלחות על 35-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. בדוק את הטוהר של התרבויות על ידי התבוננות מורפולוגיה מושבה לאחר דגירה. תרבויות טהורות אמורות להניב מושבות כי תערוכת מורפולוגיה מושבה דומה.
- העבר כמה מושבות מבודדות שלב 3.1 ל -5 מיליליטר של מרק. דגירת צינורות ב 35-37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
הערה: מושבות צעירות השתמש, שהן פחות מארבעה ימים ישנים, להכין תרבויות לילה בכל הניסויים. - Streak loopful של תרבויות לילה על תקשורת סלקטיבית הפרש (TCBS אגר chromogenic) לבידוד מושבה. דגירה צלחות על 35-37 מעלות צלזיוס עד 96 שעות.
- רשום את הצמיחה הכוללת של כל הזנים על ידי בדיקת צפיפות התרבות על הצלחת ואת הגודל של מושבות מבודדות. רשום את הצבע של מושבות תחת אור סביבה ו / או UV. הערת מאפיינים אחרים של מושבה המבודדת כגון הגובה, שולי וצורה.
Assay Recovery 4.
- בחר קבוצת משנה נציג V. זני parahaemolyticus (n = 14), שיכילו קפסיד ומקורותיה השונים של בידוד
- לנהל שיטת רוזן פלייט התקן של תרבויות הלילה כמתוארת להלן.
- וורטקס לערבב את תרבויות לילה טוב. ערכו של פי 10 או 10 -1 דילול ידי העברת 100 μl של תרבות הלילה לתוך צינור המכיל 900 μl PBS. וורטקס לערבב היטב.
- השתמש טיפ pipet חדש להעביר 100 μl מהצינור 10 -1 דילול למשנהו שפופרת המכילה 900 μl PBS. וורטקס לערבב היטב. זה מהווה 10 -2 דילול. חזור על התהליך ברצף כדי לקבל 10 -7 דילול.
- באמצעות צינורות דילול 4- עד 10 -7 10, צלחת 100 μl כל על צלחות אגר chromogenic, TCBS ו TSAS.
הערה: גורם לדילול (DF) על הצלחת הופך 10 -5 עד 10 -8, בהתאמה. - מורחים את aliquots שווה על tהוא אגר משטח.
הערה: זה בסדר להשתמש באותו מפזר לכל זן על המדיום הזהה, כל עוד aliquot המדולל ביותר היא התפשטה ראשונה (כלומר, מ 10 -8 עד 10 -5). אין להשתמש באותו המפזר עבור מדיה שונה. - דגירה צלחות על 35-37 מעלות צלזיוס עד 96 שעות. רוזן מושב על הצלחות. התעלם צלחות נושאות מושבות כי הם רבים מספור (tntc) או פחות מ 25. חישוב CFU / mL לפי הפירוט הבא:
איפה
N = מספר תאים בצינור החי, כפי שבא לידי ביטוי CFU / ml או CFU / g
C = המספר הכולל של מושבות נספרות על צלחות נושאות 25-300 מושבות
n 1 = מספר לוחית (ים) שבו מושבות נספרות הם מן DF הנמוך
n 2 = מספר לוחית (ים) שבו מושבות נספרות הן מהדילול פי 10 עוקב
דf = גורם לדילול נמוך (כלומר, דילול מרוכז יותר)
- השוואת CFU / ml בקרב מדיה שונה. השתמש CFU / ml על TSAS כמו 100%, לחשב את התאוששות% של V. parahaemolyticus גדל על אגר chromogenic ו TCBS.
- לנהל שיטת רוזן פלייט התקן של תרבויות הלילה כמתוארת להלן.
Assay תחרות 5.
- בחר קבוצת משנה של זנים כי תערוכת מורפולוגיה מושבה שונות על אגר chromogenic ו TCBS.
הערה: בדרך זו, ניתן יהיה לספור מושבות שמקורה V. parahaemolyticus בלבד, למרות נוכחותם של מינים אחרים הבידוד.- בחר V. זן parahaemolyticus מניב מושבות טורקיז ציאן הצפויות על TCBS ואת אגר chromogenic, בהתאמה.
- בחר V. אי parahaemolyticus וכן מיני Vibrio הלא שאינו גדלים משני של כלי התקשורת הללו, או שהם משקפים צבע מושבה שונה.
הערה: לדוגמה, V. metschnikovii גדל מאוד חלש on TCBS ולא גדל על אגר chromogenic. Shigella sonnei לא צומח על TCBS אבל מניב מושבות מגנטו על אגר chromogenic.
- לאחר הבחירה של הזנים לעיל, להכין תרבויות מרק לילה באמצעות מושבות מבודדות גדלו על תקשורת לא סלקטיבי.
- הפוך תרבויות לילה של V. parahaemolyticus ו V. metschnikovii ידי העברה כמה מושבות מבודדות מן TSAS עד 5 מיליליטר של TSBS. לדגור על 35-37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
- הפוך תרבויות לילה של Shigella sonnei ידי העברת כמה מושבות מבודדות מן אגר BHI עד 5 מ"ל של מרק BHI. לדגור על 35-37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
- עבור כל זן, לבצע שורת דילול דומה שלבי 4.2.1 ו 4.2.2. דילולי צלחת מתאימים על TSAS או BHI לקבוע CFU / מיליליטר של התרבות לילה, באמצעות המשוואה מוצגת שלב 4.2.5.
הערה: בדרך כלל, 100 μl מן 10 -5 עד 10 -7 דילולצינורות עובדים ברוב התרבויות. השתמש בערכי CFU / ml לגבות לחשב את הסכום המדויק של תאים המשמשים לשלב הבא. הערכים מחושבים CFU / ml מתקבלים לאחר דגירה, אם כי השלבים הבאים מבוצעים באותו התאריך כמו שלב 5.3. - שימוש תרבויות הלילה וצינורות דילול שלבי 5.2 ו -5.3, לערבב כמויות שונות של V. זן parahaemolyticus לבין V. אי מיני parahaemolyticus. לדוגמה, לערבב 500 μl של הצינור 10 -5 דילול של V. parahaemolyticus עם 500 μl של תרבויות לילה של V. metschnikovii.
הערה: תערובת זו מדמה רקע microflora גבוהה. כדי לדמות רקע microflora נמוך, לערבב 500 μl כל של צינור 10 -5 דילול משני המינים. - מורחים 100 μl של תערובת כל על צלחות אגר chromogenic, TCBS ו TSAS.
- לאחר הדגרה ב 35-37 מעלות צלזיוס למשך עד 96 שעות, לספור מושבות של V. parahaemolyticuים ואת V. אי מיני parahaemolyticus מבוסס על שונותם בצמיחה ומורפולוגיה מושבה על אגר chromogenic ו TCBS.
הערה: לדוגמה, אם V. אי מיני parahaemolyticus לא צומחים על אגרת chromogenic ו TCBS, כל המושבות תהיינה של V. parahaemolyticus. אם V. אי מיני parahaemolyticus גדלו משני התקשורת, רק המושבות הטורקיז על מושבות TCBS ציאן על אגרת chromogenic תהיינה של V. parahaemolyticus. הזווית הלא מיני parahaemolyticus יכולים או לא יכולים להציג מורפולוגיה מושבה דומה V. parahaemolyticus על TSAS.- אם V. אי מיני parahaemolyticus גדלו בדומה V. parahaemolyticus על מדיום סלקטיבי זה, לחלק את ספירת המושבה על ידי שני כדי להשיג מספרים על V. parahaemolyticus בלבד. השווה את ספירת המושבה בפועל עם הספירה הצפויה נגזרת שלב 5.3.
6. Effects של אויסטר homogenates
- לשקול ≥50 בשר גרם צדף מאי ≥12 רכיכות molluscan כוללים בשר ומשקאות חריפים.
- להוסיף כמות שווה של PBS על בשר הצדפה והמשקאות החריפים. טוחנים את התערובת במהירות גבוהה במשך 90 שניות. זה מהווה 2 -1 homogenate צדפה מדולל.
- להוסיף 100 גרם של homogenate צדפה 2 -1 מדולל ל 400 גרם של PBS. השתמש בקנה מידה כדי למדוד את המשקל, לא נפח. טוחנים את התערובת במהירות גבוהה במשך 1 דקות. חיטוי homogenate הצדפה.
הערה: זו תהיה homogenate צדפה המשמש spiking.
- חזור על assay Recovery (שלב 4) בנוכחות של homogenate צדפה.
- לאחר homogenate צדפה 500 גרם מתקרר, להוסיף 100 μl של V. parahaemolyticus תרבויות לילה הגדלים TSBS אליו. קבע את הסכום בפועל של V. תאי parahaemolyticus ב הבידוד על ידי ביצוע נהלי רוזן פלייט הרגילים המתואר בשלב 4.2.
- נציגלאכול את assay תחרות (שלב 5) בנוכחות של homogenate צדפה.
- לאחר homogenate צדפה 500 גרם מתקרר, להוסיף 100 μl כל תרבויות לילה של V. parahaemolyticus וו אי parahaemolyticus אליו. קבע את הסכום בפועל של חיידקים תאי הבידוד על ידי ביצוע נהלי רוזן פלייט הרגילים המתואר בשלב 4.2
- מערבבים את התאים חיידקים עם homogenate צדפה גם באמצעות homogenizer.
הערה: לאחר ערבוב, את homogenate צדפה המכיל את התאים הוסיף בכוונה נקרא ממוסמר homogenate צדפה. - הפוך את דילולים של homogenate צדפה ממוסמר להשיג 10 -1 עד 10 -3 צינורות דילול פי הנהלים המתוארים שלב 4.2.2. מורחים 100 μl של דילול כל על אגר chromogenic, TCBS ו TSAS. דגירה צלחות על 35-37 מעלות צלזיוס עד 96 שעות.
- השווה את ספירת המושבה בפועל על אגר chromogenic ו TCBS עם האקסספירת המושבה pected להסיק שלבים 6.2.1 ו 6.3.1.
הערה: לדוגמה, אם צינור של V. תרבות הלילה parahaemolyticus מכיל 10 8 CFU / ml, גידול הבידוד של 100 μl כלומר 10 7 תאים מתווספים 500 גרם של homogenate צדפה, מניב 5 x 10 4 תאים / g. לאחר דילול ציפוי, צלחת שיש df = 10 -2 אמורים להניב 500 מושבות; בעוד כי DF שיש = 10 -3 אמורים להניב 50 מושבות. אלו הם ספירת מושבה הצפויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, 54 זנים של חיידקים נאספו, שכלל 22 זנים בתוך V. מיני parahaemolyticus, 19 מיני Vibrio אחרים, ו -13 מיני Vibrio מייננת (טבלה 1). רוב V. זני parahaemolyticus התקבלו גם מן ה- FDA, ה- CDC או מחלקות בריאות ממלכתיות אחרות. הם מייצגים קפסיד מגוונים ומקורות בידוד. זנים אלה זוהו בעבר על ידי רשויות רגולטוריות. אנחנו עוד חיזק את זהותם של V. אלה parahaemolyticus ידי ביצוע tlh -PCR 21,22.
| מִין | מספר זנים נבדקו | צמיחה וצבע של מושבות | |
| TCBS | Cבינוני hromogenic | ||
| Aeromonas hydrophila | 2 | אין צמיחה | 1 להתאמץ אין צמיחה; |
| 1 צבע מגנט זן | |||
| קנדידה אלביקנס | 1 | צמיחה חלשה, צהוב | אין צמיחה |
| jejuni קמפילובקטר | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| אי קולי | 1 | אין צמיחה | צמיחה חלשה, מגנט |
| מיראביליס פרוטאוס | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | טורקיז | צהוב |
| Staphylococcus aureus | 1 | צמיחה חלשה, צהוב | אין צמיחה |
| סלמונלה choleraesuהוא | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| Shigella boydii | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| Shigella flexneri | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| Shigella sonnei | 1 | אין צמיחה | צמיחה חלשה, מגנט |
| Vibrio alginolyticus | 3 | צהוב או טורקיז | צהוב |
| Cholerae V. | 4 | צהוב או טורקיז | מַגֶנטָה |
| V. damsela | 1 | טורקיז | קובלט |
| V. fisheri | 1 | צמיחה חלשה, צהוב | אין צמיחה |
| Fluvialis V. | 1 | טורקיז | קובלט |
| V.furnissii | 1 | צהוב | צהוב |
| V. hollisae | 1 | טורקיז | צהוב |
| V. metschnikovii | 1 | אין צמיחה | אין צמיחה |
| Mimicus V. | 1 | טורקיז | מַגֶנטָה |
| Parahaemolyticus V. | 22 | רוב זני טורקיז | רוב זני ציאן; כמה ברור |
| V. proteolyticus | 1 | טורקיז | קובלט |
| Vulnificus V. | 4 | טורקיז או ברור | מַגֶנטָה |
טבלת 1. מינים של חיידקים המשמשים במחקר זה ומאפייני הצמיחה שלהם על תקשורת סלקטיבית הפרש. קוראים צבע היו based על גלגל הצבעים. ציאן דומה צהבהב; מגנט דומה לבנדר ורדרד, הטורקיז דומה ירוק, צהוב מקיף זית וחום.
ארבעה מחקרים נפרדים שנערכו כדי לקבוע את מורפולוגיה צמיחת מושבה של זנים אלה על תקשורת סלקטיבית הפרש - TCBS ואת אגר chromogenic. TCBS הוא המדיום הקונבנציונלי המשמש לבידוד של כמה מיני Vibrio, כולל V. cholerae ו V. parahaemolyticus 12. וריאצית צבע של מושבות גדלו על TCBS הייתה צהובה, טורקיז (ירוק) או ברור (איור 1).
באיור 1. מורפולוגיה מושבה של spp Vibrio. על אגר TCBS. V. parahaemolyticus (טורקיז), ו ' cholerae (צהוב), ו- AM חיסון ixed של שני המינים (א). מושבות של V. parahaemolyticus להופיע טורקיז, עם חוזר, כולו, ומורפולוגיה קמורה (ב). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
היכולת של מדיום chromogenic חדש כדי לבחור עבור מיני Vibrio רלוונטיים קליני ממזון דגימות סביבתיות נבדקה. בנוסף, היכולת של המדיום הזה כדי להבחין בו זמנית מינים אלה זה מזה הוערכה. צבע המושבה שנצפו על אגר chromogenic היו קובלט, ציאן, מגנטה, צהוב או ברור (איור 2). כפי שניתן לראות בטבלה 1, הן TCBS ואת אגר chromogenic הציג מעלות מסוימות של הסלקטיביות נגד מיקרואורגניזמים Vibrio אי.
1 ">
איור 2. מורפולוגיה מושבה של spp Vibrio. על אגר chromogenic פתח. V. parahaemolyticus (ציאן), ו ' cholerae (מג'נטה), וכן חיסון מעורב של שני המינים (א). מושבות של V. parahaemolyticus להופיע ציאן, עם חוזר, כולו, ומורפולוגיה קמורה (ב). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בעקבות שיטת ספירת פלייט התקן על תרבויות לילה, מושבות של V. parahaemolyticus נצפה על צלחות chromogenic אגרו קבלת הגורם לדילול הגבוה ביותר (כלומר, df = 10 -8). תוצאות אלו היו דומות לאלה על מדיום סלקטיבי (TSAS). הדבר מצביע על כך את גבול הגילוי של מדיום chromogenic דומה תקשורת לא סלקטיבי, המהווה כ 10 תאים או נמוכים בהעדר מטריקס מזון. קיבולת זיהוי מיני Vibrio אחרים כגון V. alginolyticus, fluvialis V. ו V. העלמה הייתה גם הגונה לעומת המדיום לא סלקטיבי. עם זאת, כמה זנים של V. cholerae, V. vulnificus ו V. mimicus הניב 10 עד פי 100 פחות CFU על אגר chromogenic. הסוכנים סלקטיבית בשימוש בתקשורת סלקטיבית chromogenic או אחרת באופן בלתי נמנעים לעכב תאים מסוימים. תאים פצועים, למשל, לא יכול היה לחלץ התקשורת סלקטיבית. עם זאת, יכולת הגילוי מעט העניה היא לא נושא לשיחה ברוב הפרוצדורות שיגרתיות המעסיקות צעד העשרה. כמות קטנה של מיקרואורגניזמים במזון או דיגום סביבתי היה להכפיל לרמה גבוהה במרק העשרה, מצוין את גבול הגילוי. עשרה במי peptone אלקליין הם often נעשה כדי לקבוע את השכיחות של מיני Vibrio דגימות סביבתיות 12.
בנוכחות homogenate צדפה, אגר chromogenic המשיך להציג התאוששות מסוימת טובה. במילים אחרות, חלק גדול (> 70%) של V. תאי parahaemolyticus הצליחו לגדול על אגר chromogenic, לא מעושה על ידי הנוכחות של מטריקס הצדפה (איור 3 א). הצמיחה וההתאוששות של V. תאי parahaemolyticus גם לא הושפעו על ידי הנוכחות של מין אחר Vibrio (איור 3B). זוהי תכונה חשובה כי דגימות סביבתיות מאוגדות מכילות מיני Vibrio שונים, אשר הם במספרים גבוהים במיוחד לאחר הליך העשרה.
איור 3. התאוששות חזקה> אחוז של V. זן parahaemolyticus ב homogenate צדפה עם ובלי מתחרה חיידקים. שחזור (ממוצע ± סטיית תקן) חושב על פי נצפה vs את CFU צפוי לסמוך על הצלחות אגרו. ספירת CFU צפוי חושבה על בסיס עומס חיידקי הבידוד. התאוששות גבוהה של V. זן parahaemolyticus נצפה על כל מדיה ללא תחרות (א). רמה דומה של התאוששות נצפתה כאשר רמות גבוהות של V. תאי metschnikovii נכחו (ב). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי להמשיך להשוות את אגר chromogenic ו TCBS, את הרגישות והסגוליות חושבו. טבלה 2 מראה את היכולת של התקשורת האלה Accurately לזהות V. parahaemolyticus. רגישות קשורה אחוז חיובי נכון, כלומר V. זני parahaemolyticus הניבו את מורפולוגיה המושבה הצפויה על התקשורת. סגולי קשור האחוז השלילי נכון, כלומר V. אי זני parahaemolyticus צריכים להפגין עניים אין צמיחה, או מורפולוגיה מושבה שונה V. parahaemolyticus. הרגישות והסגוליות עבור TCBS לזהות V. parahaemolyticus היו 86.4% ו 71.8%, בהתאמה. לשם השוואה, את הרגישות והסגוליות של המדיום chromogenic היו 90.9% ו -96.9%, בהתאמה.
| א) | ||
| אגר TCBS | Parahaemolyticus V. | ללא-V. parahaemolyticus |
| צמיחה טובה ג טורקיזolonies | 19 | 9 |
| מושבות צמיחה מסכנה או-טורקיז הלא | 3 | 23 |
| ב) | ||
| אגר chromogenic | Parahaemolyticus V. | ללא-V. parahaemolyticus |
| מושבות צמיחת ציאן טובות | 20 | 1 |
| מושבות צמיחה מסכנה או-ציאן הלא | 2 | 31 |
טבלה 2. רגישות וספציפיות של TCBS (א) ו- chromogenic (ב) אגר זיהוי של V. parahaemolyticus. זהותם של V. parahaemolyticus נקבע בעבר על ידי בדיקה ביוכימית ו tlh- PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מתמקד בפיתוח התקשורת והתרבות והערכה. כמקובל, TCBS היא סלקטיבית ובינוניים ההפרש המשמש לבידוד ואיתור V. parahaemolyticus, V. cholerae ו V. vulnificus 12. עם זאת, מגבלות דווחו על המדיום הזה, כגון אי היכולת להבדיל V. cholerae ממיני Vibrio אחרים. סוכרוז אינדיקטור pH הם סוכני בידול של TCBS. לפיכך, ייצור חומצה על ידי פרמנטור סוכרוז גורם שינוי צבע של המדיום. הצביעה של המדיום היא חסרון של TCBS כי זה עלול לטשטש תצפית של מורפולוגיה מושבה. מדיום chromogenic החדש שפותח מנצל pH גבוה ומליח לדכא את הצמיחה של מינים שאינם Vibrio שנמצאו בדגימות ימיות רבות. מדיום chromogenic החדש יש pH סופי של 8.6 ± 0.2. לליטר מים ללא יונים, זה מורכב מ 10 גרם של peptone, 10 גרם של תערובת מלחי ים, 10 גרם של מרת שור, 10 גרם של נתרןthiosulfate, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של נתרן ציטרט, 2.2 גרם של סודיום קרבונט, 2 גרם של לקטוז, 0.5 גרם של פירובט נתרן, 0.3 גרם של תערובת chromogenic ו -15 גרם של אגר. תמהיל chromogenic מאפשר בידול בין spp Vibrio. לפי יכולות ההפרש שלהם לייצר אנזימים מסוימים. במקום לשנות את הצבע של המדיום אגר TCBS, spp Vibrio השונה. יציג בתערוכת צבע מושבה שונה על מדיום chromogenic החדש. לשם השוואה, מדיום chromogenic זמין מסחרי מכיל 15 גרם של אגר, 8 גרם של peptone ותמצית שמרים, 51.4 גרם של מלחים, 0.3 גרם של תערובת chromogenic ו- pH סופי של 9.0 ± 0.2.
חוסנו של הערכה assay תלוי בגודל המדגם. מאחר והמחקר הזה שמה דגש על האפקטיביות של מדיום chromogenic החדש לבודד ולזהות V. parahaemolyticus, חשוב לצבור V. רבים ומגוונים זני parahaemolyticus. מחקרים קודמים השוואת TCBS ותקשורת והתרבות החדשה לעתים קרובות מעורבת דגימות סביבתיות או מזון המכילות סוגים ידועים וכמות מיקרואורגניזמים 23,24,25,26. מושבות מרובות לדגימה בודדו עדיין האופים המשובטים של הבידודים היו לעתים קרובות לא נקבעו. באופן אידיאלי, זנים שונים צריכים להיבדק בפיתוח assay אחרת את הדיוק של assay יהיה מנופח. זהות זנים ניתן לקבוע על ידי שיטות לתת-סוגים קונבנציונליים כגון ג'ל אלקטרופורזה פעם שדה (PFGE) או רצף מוקד רב. V. זני parahaemolyticus במחקר זה התאפיינו בעבר על ידי ribotyping ו PFGE 19.
במהלך פיתוח assay, רגישות, סגולי גבול גילוי הוא בין הגורמים המרכזיים להיחקר. רגישות, הידוע גם בשם דיוק או רגישות אבחון, היא הסכם האחוז החיובי בין שיטות התייחסות ובדיקה. סגולי, הידוע גם בשם דיוק או סגולי אבחון, הוא אחוז שהלילי greement בין שיטות התייחסות ובדיקה. במחקר זה, השתמשנו בשיטה המבוססת על PCR כשיטת ההתייחסות משום שהתוצאות אומתו בין קבוצות שונות. TCBS ותקשורת chromogenic היו שיטות הבדיקה. כדי לקבוע רגישות, נובע V. זנים parahaemolyticus שימשו; כלומר, רגישות = 100% x נכון חיובי / (נכון חיובי + False Negative). מצד השני, הנובעת V. אי זני parahaemolyticus שמשו כדי לקבוע סגולי; ומכאן, הסגולי = 100% x נכון שלילי / (Negative נכון + False Positive). כדי לספק תוצאות סגוליות אמינות יותר, V. אי זני parahaemolyticus צריכים להיות מבודדים בסביבה שבה דגימה תתנהל. חישובים הרגישות והסגוליות שלנו מבוססים על מסמכים שנכתבו על ידי הממשלה 27, אקדמיה 28 ו הארגון המדעי 29 על נושא הקשור לפיתוח assay ואימות.
NT "> בהתבסס על התוצאות שלנו, מדיום chromogenic הראה ביצועים טובים יותר מאשר TCBS בזיהוי parahaemolyticus V.. הסכם האחוזים הכולל בין למודל ההתייחסות והבינוני chromogenic הוא 94.4%, לעומת 77.8% בין שיטת ייחוס TCBS. הרגישות והסגוליות של המדיום chromogenic הם 90.9% ו 96.9% בהתאמה, אשר הם גדולים יותר מאלה של TCBS (86.4% ו 71.9%, בהתאמה). מחקרים קודמים להערכת התקשורת chromogenic אחרים לצורך זיהוי של parahaemolyticus V. נמצא כי רגישויות נע מ 85 ל -88% ואילו ספציפיות נעות בין 94 ל 95% 23,24,25. עם זאת, מחקרים אלה לא להשתמש באותה שיטת חישוב כפי המחקר שלנו. יתר על כן, לעתים השתמשו בשיטת התייחסות שונה או בשילוב להם תוצאות משתי ביוכימיים מנתח ובינוניים chromogenic כשיטת בדיקה אחת. כתוצאה מכך, קשה להשוות את התוצאות שלנו ישירות עם מחקרים קודמים אלה.= "jove_content"> בנוסף מציג ביצועים טובים יותר באיתור V. parahaemolyticus, אגר chromogenic השתמש במחקר זה גם יכול להבדיל יותר מיני Vibrio מ TCBS בשל הכללת שילוב chromogenic בנוסחא הבינונית, מניב צבעים מרובים. למרות שזה לא היה במוקד של מחקר זה לזהות V. cholerae ו V. vulnificus, ראוי לציין כי מושבות מגנט שהפגינו מינים אלה יכולים להיות מובחנות יותר על ידי קרינה תחת UV. מגבלה להשתמש אגר chromogenic לצורך זיהוי של V. cholerae ו V. vulnificus הוא ההתאוששות נמוכה בעליל למינים אלה. כדי לעקוף בעיה זו, צעד העשרה חייב להיכלל. מגבלה אפשרית נוספת של אגר chromogenic היא חיי המדף הקצרים שלה מ TCBS. אופטימיזציה מתמשכת של המדיום החדש הזה נדרש לשמור pH במהלך האחסון.
למרות הפופולריות של שיטות מולקולאריות, שיטות-תלוי תרבות עדיין יקרות כפי שהם לעתים קרובות פחות יקרים ויש להם גבול גילוי טוב יותר. שיטות culturing אלה יכולים לשמש ככלי מיון. לעומת זאת, הם יכולים לשמש כדי לוודא את הזהות ואת הכדאיות של מיקרואורגניזמים הבאים בניתוחים מולקולריים. כדי למנות חיידקים באמצעות גישת תרבות-תלוי, רוזן פלייט תקן מוכר כשיטה הסטנדרטית. המשוואה המוצגת שלב 4.2.5 היא דרך מדויקת יותר על מנת לקבוע CFU / g או CFU / ml מ ממוצעי CFUs מגורמים דילול שונים. חשוב לציין כי כל החומר מדלל ומדיה ברחבי הנהלים חייבים לכלול מלח מספיק כדי לשמור על יכולת הקיום של חיידקי halophilic כגון V. parahaemolyticus. טמפרטורה בסביבת דגירה חייבת להיות אופטימליים עבור התפתחות החיידקים.
מדיום chromogenic נועד לזהות מיני Vibrio כי הם פתוגנים אנושיים חשובים. לכן, מחקרים נוספים צריכים להתנהל כדי determine יעילותו לזהות מיני Vibrio סביבתיים אחרים שאינם רלוונטיים מבחינה רפואית. ביישומים עתידיים, אגר chromogenic חדש ניתן לשלב בדיקה שגרתית של דגימות סביבתיות עבור V. parahaemolyticus. ניתן לעשות זאת על ידי קווים מפוספסים ישירים של דגימות על אגרת chromogenic לזהות הנוכחות של V. המשוערת parahaemolyticus. אגר chromogenic יכול לשמש גם כדי למנות V. parahaemolyticus הבא דילולים. כימות יכול גם להיות מוערך על ידי ביצוע שיטת מספר סבירה ביותר באמצעות מרק העשרה, ואחריו נמרח על אגרת chromogenic לאישור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים מ Channey, א צ'או, ו ק תומס על עזרתם על הפרויקט. אספקה הפרויקט מומנו חלקית על ידי אוניברסיטת מדינת הפוליטכני בקליפורניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | |
|
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
