Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling av en mer sensitiv og spesifikk kromogen Agar Medium for deteksjon av Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54493

Abstract

Matbårne infeksjoner i USA forårsaket av Vibrio-arter har vist en oppadgående trend. I slekten Vibrio, V. parahaemolyticus er ansvarlig for de fleste av Vibrio -associated infeksjoner. Dermed nøyaktig differensiering blant Vibrio spp. og påvisning av V. parahaemolyticus er kritisk viktig for å ivareta sikkerheten for vår matforsyning. Selv om molekylære teknikker blir stadig vanligere, er kultur avhengig metoder fortsatt rutinemessig gjort, og de anses standard metoder under visse omstendigheter. Derfor ble en roman kromogent agar medium testet med mål om å tilby en bedre metode for isolering og differensiering av klinisk relevant Vibrio spp. Protokollen sammen følsomhet, nøyaktighet og deteksjonsgrensen for påvisning av V. parahaemolyticus mellom den nye kromogene medium og et konvensjonelt medium. Various V. parahaemolyticus stammer (n = 22) representasjon av forskjellige serotyper og kilde opprinnelse ble anvendt. De ble tidligere identifisert av Food and Drug Administration (FDA) og Centers for Disease Control and Prevention (CDC), og ytterligere bekreftet i vårt laboratorium ved TLH -PCR. I minst fire separate forsøk, ble disse stammer inokulert på de kromogene agar og tiosulfat-citrat-gallesalter-sukrose (TCBS)-agar, som er den anbefalte medium for dyrkning av denne arten, etterfulgt av inkubering ved 35-37 ° C i 24 -96 hr. Tre V. parahaemolyticus stammer (13,6%) vokste ikke optimalt på TCBS, likevel viste grønne kolonier hvis det var vekst. To stammer (9,1%) ikke gir de forventede cyan kolonier på kromogent agar. Ikke- V. parahaemolyticus stammer (n = 32) ble også testet for å bestemme spesifisiteten av den kromogene agar. Blant disse stammene, gjorde 31 ikke vokse eller utstilt andre koloni morfologi. Den midlere gjenvinning av V. parahaemolyticus på chromogenic agar var ~ 96,4% i forhold til tryptisk soyaagar supplert med 2% NaCl. I konklusjonen, er den nye kromogent agar et effektivt medium for å oppdage V. parahaemolyticus og å skille den fra andre Vibrio-arter.

Introduction

Som medlem av Vibrio slekten, V. parahaemolyticus er en Gram-negative, ikke-sporedannende, buet, stavformet bakterie. Det oppviser høy bevegelighet i både flytende og halvfaste miljøer. Mest V. parahaemolyticus stammer er ikke-patogene for mennesker, men de patogene subtyper har forårsaket epidemier og pandemier, derav denne arten anses å være en viktig matbåren patogen i mange land 1,2. Forekomsten av Vibrio infeksjon i USA har vist en oppadgående trend siden 2000 tre. Blant Vibrio spp., V. parahaemolyticus er de hyppigst rapporterte arter forårsaker sykdommer i USA 4,5. Andre klinisk relevante arter inkluderer V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En liten prosentandel av sykdommer forårsaket av flere arter samtidig.

V. parahaemolyticus er en naturlig jegnhabitant av marine vann og derfor utbredt i marine farvann over hele verden, inkludert elvemunninger. Arten ble oppdaget i 1950 etter et utbrudd av matforgiftning i Japan. I USA ble arten først isolert i sjøvann, sedimenter og skalldyr i Puget Sound regionen 6,7. Filter feeders i marine habitater, for eksempel skjell skalldyr, kan havnen V. parahaemolyticus som en del av deres naturlige flora 8. Som sådan, V. parahaemolyticus infeksjoner hos mennesker er ofte knyttet til inntak av forurenset sjømat, spesielt rå eller kokt skalldyr. En mindre vanlig svei skjer når åpent sår er utsatt for sjøvann, noe som fører til hudinfeksjon. Mest V. parahaemolyticus stammer ikke forårsake sykdom hos mennesker, men enkelte subtyper husing virulens faktorer som termostabile direkte hemolysin (TDH) er sykdomsfremkallende. De mest utbredte symptomer på matbåren V. parahaemolyticus infeksjon erdiaré og magesmerter, fulgt av kvalme, oppkast og feber. Hodepine og frysninger er også rapportert. Median Inkubasjonstiden er 15 timer, men kan være opp til 96 timer etter inntak av tilstrekkelig mengde av patogene stammer 9. Sykdommen varer fra to til tre dager. De gastroenteritt symptomer forårsaket av V. parahaemolyticus er i stor grad selvbegrensende og derfor spesiell behandling er ikke nødvendig. Milde tilfeller av gastroenteritt kan effektivt behandles med oral rehydrering. Mer alvorlige sykdommer kan behandles med antibiotika slik som tetracyklin eller ciprofloksacin 10. Dødeligheten er om lag 2% for gastroenteritt tilfeller, men kan være så høy som 29% av de som utvikler blodbanen infeksjon eller septikemi. Enhver person som bruker sjømat eller har åpne sår utsettes for sjøvann er i fare for V. parahaemolyticus infeksjon. Jo mer alvorlig form av sykdommer, livstruende sepsis, er mer vanlig i en undergruppe med underliggende medisinsk cold 11, som omfatter alkoholisme, leversykdom, diabetes, nyresykdommer, kreft, og andre tilstander som fører til en svekket immunrespons. Spesielt er denne gruppen av individer også på et høyere risiko for å pådra alvorlige sykdommer forårsaket av V. vulnificus, som kan finnes i naturlige habitater som ligner på V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus er rutinemessig isolert ved anvendelse av tiosulfat-citrat-gallesalter-sukrose (TCBS) agar som et selektivt og differensielt medium. Berikelse i alkalisk peptonvann kan gå forut for isolasjon på TCBS agar. Presumptive kolonier på TCBS deretter videre testet i en rekke biokjemiske tester og / eller molekylære analyser rettet mot tilstedeværelsen av artsspesifikke gener. PCR-baserte metoder blir ofte brukt til å bekrefte identiteten til V. parahaemolyticus ved å forsterke de termo hemolysin genet, TLH 12.

Uavhengig av choice av bekreftelsesmetoden, er det viktig å ha et effektivt medium for å isolere og skille V. parahaemolyticus fra andre marine Vibrio-arter i første omgang. TCBS har rutinemessig blitt brukt til å skille arter innenfor Vibrio slekten i henhold til deres evner til å gjære sukrose 12. Positive fermenteringsreaksjonen er ledsaget av en fargeendring i pH-indikator bromtymolblått. V. parahaemolyticus kolonier er ganske særegent på TCBS, viser blå til grønn farge. Imidlertid kan dette mediet ikke lett å skille V. alginolyticus og V. cholerae. Sukrose-fermen Proteus arter kan produsere gule kolonier som ligner V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Ved første gangs isolasjon på TCBS, V. parahaemolyticus kan også bli feilidentifisert som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, og Pseudomonas spp 14. Stammer med forsinket sukrose fermentering kan forveksles med andre sukrose nonfermenting Vibrio 13, som inkluderer V. parahaemolyticus. TCBS ble funnet å være ikke følsomt mot Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, blant andre. Flere andre arter gi grønt til grå kolonier som er potensielt forveksles med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som et resultat, er det ønskelig å utvikle alternative kulturmedier med bedre følsomhet og spesifisitet mot å detektere og isolere V. parahaemolyticus og andre nær beslektede arter.

Flere medie alternativer har nylig blitt utviklet. I tillegg til å inkludere selektive midler, mest innlemme kromogene substrater for å skille arter basert på deres differensial enzymatiske aktiviteter. For eksempel har indoksyl-β-glukosid og indoxyl-β-galaktosid blitt anvendt som de kromogene substrater for å skille V. parahaemolyticus kolonier (som vises blågrønn) fra de av V. cholerae (purpur) på grunn av deres differensielle evner til å produsere β-glukosidase og β-galaktosidase 16. Ulike formuleringer av kromogent agar utviklet av flere grupper har blitt evaluert og ble rapportert å utføre sammenlign eller bedre enn TCBS 17,18,19. En fordel ved å bruke et kromogent medium er at farging av det omgivende medium er minimalt for derved å lette isoleringen av bestemte kolonier. I denne studien evaluerte vi muligheten for en nylig formulert kromogent medium for å påvise og isolere V. cholerae, V. parahaemolyticus og V. vulnificus; med et spesielt fokus på sin evne til å skille V. parahaemolyticus fra andre arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Media og dyrking av mikrobielle stammer

MERK: Bruk aseptiske teknikker i alle forsøk. Bruk sterile materialer. Steriliser alle containere, verktøy og reagenser før bruk. Autoklav alle avfall før deponering fordi de anses som biologisk farlig. Autoklav temperatur og tid kombinasjonen er ≥121 ° C x ≥15 min for alle de følgende prosedyrer.

  1. For å gjøre ~ en-L tryptisk soya-agar (TSA), først å tilsette en l avionisert vann i et to-L Erlenmeyer-kolbe inneholdende en magnetisk rørestav. Bruke en kolbe som er minst to ganger større enn det endelige volum. Tilsett 30 g av tryptisk soyavekstmedium pulver og 20 g agar granuler inn i kolben.
    MERK: Bruk 2% agar i stedet for 1,5% for å begrense svermende av noen Vibrio spp.
    1. Bland grundig ved å slå på røre. Mens røring, slå på varmen for å koke blandingen. Fjern kolben fra varmeren så snart blandingen begynner å koke. Løst dekke the kolbe med en aluminiumsfolie. Tape folien for å feste den til kolben før autoklav.
    2. For å gjøre tryptisk soya buljong (TSB), utelater agar fra oppskriften i trinn 1.1.
      MERK: Kan bruke flasker i stedet for erlenmeyerkolbe.
    3. For å gjøre tryptisk soyaagar supplert med 2% natriumklorid eller NaCI (TSA), tilsett 20 g NaCl i blandingen før omrøring og oppvarming. For å gjøre tryptisk soyavekstmedium supplert med 2% NaCl (TSBS), utelater agar, tilsett 20 g NaCl i blandingen før omrøring og oppvarming.
  2. For å gjøre Brain Heart Infusion (BHI) agar, suspendere 37 g BHI pulver og 15 g agar granulat i en L av renset vann. Varme med hyppig omrøring for å løse opp pulveret. Autoklav. Utelate agar for å gjøre BHI kraft.
  3. For å gjøre TCBS agar, suspendere 89 g av TCBS pulver i en L av renset vann. Varme med hyppig omrøring og koke i 1 min for fullstendig å løse opp pulveret. Ikke autoklaver.
  4. For all agar media, kjøle den varme agar til 45-50 ° C i et vannbad. Ordne tomme Petri plater i stabler på fem til seks plater. Med start fra bunnen av stabelen, helle det smeltede agar i hver Petri-plate for å oppnå omtrent halvfull. Lukk Petri plate lokket etter helle. Tillat agar for å størkne ved å la platene stå ved romtemperatur.
    1. Bruk agarskåler neste dag eller etter 12 timer. Oppbevar ubrukte plater i kjøleskap i inntil to uker. Før bruk, ta platene ut av kjøleskapet og likevekt dem i romtemperatur i minst 15 min.
      MERK: En liter agar gjør ~ 45 agar plater. Tillat agarplatene å tørke tilstrekkelig på dagen for fremstillingen, og likevekt dem til romtemperatur etter kald lagring for å effektivt redusere spredning av koloniene.
  5. Skaffe sjokolade og kromogen agarskåler og likevekt dem i romtemperatur før hvert forsøk.
  6. Subkultur alle 54 mikrobielle stammer vist i tabell 1 hver noen days.
    1. Bruk en steril inoculating sløyfe for å overføre kulturer fra en frossen lager eller en tidligere parti til ikke-selektive medier som BHI, TSB / TSA eller sjokolade agar. Grow halofile Vibrio spp. på TSBS / TSA.
    2. For å kontrollere renheten av kulturen, strek alle stammer i et mønster som ville tillate observasjon av isolerte kolonier. For eksempel bruke en tre-fase striper mønster for å fortynne en stor mengde bakterier til mindre beløp, til slutt som gir isolerte kolonier.
  7. Inkuber platene opp ned ved 35-37 ° C i opp til 48 timer. For Campylobacter spp., Ruge rør eller plater i et lukket lokk krukke inneholdende en gass pose for å frembringe en mikroaerofile miljø. Observer koloni morfologi etter inkubasjon. Rene kulturer skal gi koloniene som viser lignende koloni morfologi.
    MERK: Inkuber alle platene opp-ned for å hindre kondenserte vanndråper som dannes på undersiden av lokket fra å falle på colonies.

2. Arter Fastsettelse av PCR

  1. Gjennomføre TLH -PCR å bekrefte identiteten til V. parahaemolyticus stammer. Bruk primere TLH -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') og TLH -R (5 'GCT ACT TTC Tags CAT TTT CTC TGC 3') for å forsterke en 450-bp fragment av de termo hemolysin gen 20 .
    1. Bruk en steril inoculating løkke til å overføre noen isolerte kolonier av hver V. parahaemolyticus belastning fra TSA til 5 ml TSBS. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
    2. Sentrifuger kulturer ved 14 000 xg i 1 min. Fjern supernatanten og vask det pellet to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS). Koke suspensjonen i 3 minutter under dannelse av cellelysat.
      MERK: V. parahaemolyticus er lett å bli lysert. Derfor lysereagensen ikke er nødvendig. Det er også mulig å anvende en bit av koloni direkte som templat.
    3. Utføre PCR i en 25 pl reaksjons vKanonvolumet. Fremstille en reaksjonsblanding inneholdende en sluttkonsentrasjon på 1 x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl2, 100 uM av hver dNTP, 1 uM av hver primer, en U Taq-polymerase, og 1 ul cellelysat. Etter preinkubering ved 94 ° C i 5 minutter, drevet 35 amplifikasjons-cykler av 94 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 60 sek 21.
    4. Last aliquoter av 5-ul fragment på 1,5% agarosegeler. Slå på strømforsyningen til å starte elektroforese. Å visualisere nærværet eller fraværet av amplikonene under UV-belysning etter etidiumbromidfarging.

3. Vekst på selektiv og differensiert Media

  1. To til fire dager før forsøket, strek alle mikrobielle stammer vist i tabell 1 på ikke-selektivt medium (TSA, BHI eller sjokolade-agar) for koloni isolasjon. Inkuber platene ved 35-37 ° C i 48 timer. Sjekke renheten av kulturene ved å observere kolonimorfologi etter inkubering. Rene kulturer skal gi koloniene som viser lignende koloni morfologi.
  2. Overfør noen isolerte kolonier fra trinn 3,1 til 5 ml kjøttkraft. Inkuber rørene ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
    MERK: Bruk små kolonier, som er mindre enn fire dager gammel, for å forberede natten kulturer i alle forsøk.
  3. Streak en løkkefull av natten kulturer på selektiv og differensiert media (TCBS og kromogent agar) for koloni isolasjon. Inkuber platene ved 35-37 ° C i opp til 96 timer.
  4. Ta opp den generelle veksten av alle stammer ved å undersøke både kultur tetthet på platen og størrelsen på isolerte kolonier. Spill fargen på koloniene under omgivende og / eller UV-lys. Merk andre kjennetegn isolert koloni som høyde, margin og form.

4. Recovery analyse

  1. Velg en representant undergruppe av V. parahaemolyticus stammer (n = 14) som omfatter ulike serotyper og opprinnelse av isolasjon
  2. Gjennomføre en Standard Plate Count metoden natt kulturer som beskrevet nedenfor.
    1. Vortex å blande natt kulturer brønnen. Foreta en 10 gangers eller 10 -1 fortynning ved å overføre 100 ul av over natten-kulturen til et rør inneholdende 900 ul PBS. Vortex for å blande godt.
    2. Bruk en ny pipettespiss for å overføre 100 mL fra 10 -1 fortynning rør til et annet rør som inneholder 900 mL PBS. Vortex for å blande godt. Dette utgjør 10 -2 fortynning. Gjenta prosessen sekvensielt for å oppnå 10 -7 fortynning.
    3. Bruke 10 -4 til 10 -7 fortynningsrør, plate 100 pl hver på de kromogene, TCBS og TSA agarskåler.
      MERK: fortynningsfaktoren (df) på plate blir 10 -5 til 10 -8, henholdsvis.
    4. Spre porsjoner jevnt på than agaroverflaten.
      MERK: det er greit å bruke den samme sprederen pr belastning på det samme medium, så lenge som den mest fortynnede prøvemengde spres første (dvs. fra 10 -8 til 10 -5). Ikke bruk samme spreder for ulike medier.
    5. Inkuber platene ved 35-37 ° C i opp til 96 timer. Telle kolonier på platene. Ignorer plater peiling kolonier som er for mange til å telle (tntc) eller mindre enn 25. Beregn cfu / ml i henhold til følgende:
      ligning 1
      Hvor
      N = antall celler i ufortynnet røret, uttrykt som CFU / ml eller CFU / g
      C = den totale antallet kolonier telles på platene som bærer 25-300 kolonier
      n 1 = antallet av platen (e) der telles koloniene er fra den nedre df
      n 2 = antall platen (e) der telles koloniene er fra den etterfølgende 10-gangers fortynning
      df = den nedre fortynningsfaktoren (dvs. mer konsentrert fortynning)
  3. Sammenligne CFU / ml mellom ulike medier. Bruk CFU / ml på TSA som 100%, beregne gjenvinning% av V. parahaemolyticus dyrket på kromogen og TCBS agar.

5. Konkurranse analyse

  1. Velg en undergruppe av stammer som viser forskjellige koloni morfologi på kromogen og TCBS agar.
    MERK: På denne måten vil det være mulig å telle koloniene oppsto fra V. parahaemolyticus bare, til tross for tilstedeværelsen av andre arter i inokulum.
    1. Velg en V. parahaemolyticus belastning som gir de forventede turkise og cyan kolonier på TCBS og kromogent agar, henholdsvis.
    2. Velg en ikke- V. parahaemolyticus og en ikke- Vibrio-artene som ikke vokser på hver av disse mediene, eller utviser annen koloni farge.
      MERK: For eksempel, V. metschnikovii vokser veldig svakt on TCBS og ikke vokser på kromogent agar. Shigella sonnei ikke vokser på TCBS men gir magenta kolonier på kromogent agar.
  2. Etter valg av stammene ovenfor, forberede over natten buljongkulturer ved hjelp av isolerte kolonier dyrket på selektive medier.
    1. Gjør natten kulturer av V. parahaemolyticus og V. metschnikovii ved å overføre noen få isolerte kolonier fra TSA til 5 ml TSBS. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
    2. Gjør natten kulturer av Shigella sonnei ved å overføre noen få isolerte kolonier fra BHI agar til 5 ml BHI kraft. Inkuber ved 35-37 ° C i 16-24 timer.
  3. For hver stamme, utføre en fortynningsrekke lik trinn 4.2.1 og 4.2.2. Plate egnede fortynninger på TSA eller BHI for å bestemme CFU / ml av over natten-kulturen, under anvendelse av ligningen vist i trinn 4.2.5.
    MERK: Vanligvis 100 pl fra 10 -5 til 10 -7 fortynningrør fungerer for de fleste kulturer. Bruk cfu / ml verdier sikkerhets beregne den nøyaktige mengden av celler som brukes i neste trinn. De beregnede CFU / ml verdier oppnås etter inkubasjon, selv om de følgende trinnene er utført på samme dato som trinn 5.3.
  4. Bruke natten kulturer og fortynningsrør i trinn 5.2 og 5.3, blande ulike mengder av en V. parahaemolyticus belastning og en ikke- V. parahaemolyticus arter. For eksempel, blande 500 ul av 10 -5 fortynning rør av V. parahaemolyticus med 500 ul av over natt kulturer av V. metschnikovii.
    MERK: Denne blandingen simulerer høy mikroflora bakgrunn. For å simulere en lav mikroflora bakgrunn, blande 500 mL hver av de 10 -5 fortynning røret fra begge artene.
  5. Spre 100 ul av blandingen ble hver av de kromogene, TCBS og TSA-agarplater.
  6. Etter inkubering ved 35-37 ° C i opp til 96 timer, telle koloniene av V. parahaemolyticus og ikke- V. parahaemolyticus arter basert på deres forskjell i vekst og koloni morfologi på kromogen og TCBS agar.
    MERK: For eksempel, hvis den ikke V. parahaemolyticus arter vokser ikke på det kromogene og TCBS agar, alle kolonier vil være av V. parahaemolyticus. Hvis den ikke V. parahaemolyticus arter vokser på begge medier, vil bare det turkise koloniene på TCBS og cyan kolonier på kromogent agar være av V. parahaemolyticus. Den ikke- V. parahaemolyticus art kan eller ikke kan ha lignende kolonimorfologi V. parahaemolyticus på TSA.
    1. Hvis den ikke V. parahaemolyticus arter vokser på samme måte V. parahaemolyticus på dette selektivt medium, dele kimtall på to for å få tall for V. parahaemolyticus bare. Sammenligne selve kimtall med forventet tellingen stammer fra trinn 5.3.

6. Effstp av Oyster Homogenater

  1. Vei ≥50 g østers kjøtt fra ≥12 bløtdyr inkludert kjøtt og brennevin.
    1. Legg lik mengde PBS til østers kjøtt og brennevin. Bland blandingen ved høy hastighet i 90 sek. Dette utgjør 2 -1 utvannet østers homogenat.
    2. Tilsett 100 g 2 -1 fortynnet østers homogenat til 400 g av PBS. Bruke en skala for å måle vekt, ikke volum. Bland blandingen ved høy hastighet i 1 min. Autoklav østers homogenat.
      MERK: Dette vil være den østers homogenat brukes for spiking.
  2. Gjenta Recovery-analysen (trinn 4) i nærvær av østers homogenat.
    1. Etter 500 g østers homogenat kjøles ned, tilsett 100 mL av V. parahaemolyticus natten kulturer dyrket i TSBS til det. Bestem den faktiske mengden av V. parahaemolyticus celler i inokulum ved å gjennomføre de standardiserte platetelle-prosedyrer som er beskrevet i trinn 4,2.
  3. Repspise konkurranseanalyse (Trinn 5) i nærvær av østers homogenat.
    1. Etter 500 g østers homogenat kjøles ned, legge til 100 mL hver av natten kulturer av V. parahaemolyticus og ikke- V. parahaemolyticus til det. Bestemme den faktiske mengden av bakterie Cellene i inokulum ved å gjennomføre de standardiserte platetelle-prosedyrer er beskrevet i trinn 4.2
  4. Bland de bakterielle cellene med østers homogenatet godt ved hjelp av en homogenisator.
    MERK: Etter blanding østers homogenat som inneholder forsettlig lagt celler kalles piggete østers homogenat.
  5. Gjør fortynninger av piggete østers homogenatet for å oppnå 10 -1 til 10 -3 fortynningsrør i henhold til prosedyrene beskrevet i trinn 4.2.2. Spre 100 ul av hver fortynning på kromogen, TCBS og TSA agar. Inkuber platene ved 35-37 ° C i opp til 96 timer.
  6. Sammenligne selve kimtall på kromogen og TCBS agar med exforventes kimtall utledet fra trinn 6.2.1 og 6.3.1.
    MERK: For eksempel, hvis en tube med V. parahaemolyticus over natten kultur inneholder 10 8 CFU / ml, et inokulum på 100 ul betyr at 10 7 celler tilsettes til 500 g av østers homogenat, noe som ga 5 x 10 4 celler / g. Etter fortynning og platekledning, platen har df = 10 -2 bør gi 500 kolonier; mens det som hadde df = 10 -3 bør gi 50 kolonier. Dette er de forventede kimtall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien ble 54 mikrobielle stammer sammenstilt, som omfattet 22 belastninger i V. parahaemolyticus arter, Vibrio 19 andre arter, og 13 ikke-Vibrio-artene (tabell 1). Mest V. parahaemolyticus stammer enten ble mottatt fra FDA, CDC eller andre statlige helse avdelinger. De representerer ulike serotyper og isolasjon kilder. Disse stammene ble tidligere identifisert av tilsynsorganer. Vi ytterligere bekreftet identiteten til disse V. parahaemolyticus ved å gjennomføre en TLH -PCR 21,22.

Arter Antall stammer testet Vekst og farge av kolonier
TCBS Chromogenic medium
Aeromonas hydrophila 2 Ingen vekst En sil ingen vekst;
En belastning magenta farge
Candida albicans 1 Svak vekst, gul Ingen vekst
Campylobacter jejuni 1 Ingen vekst Ingen vekst
Escherichia coli 1 Ingen vekst Svak vekst, magenta
Proteus mirabilis 1 Ingen vekst Ingen vekst
Pseudomonas aeruginosa 2 turkis Gul
Staphylococcus aureus 1 Svak vekst, gul Ingen vekst
Salmonella choleraesuer 1 Ingen vekst Ingen vekst
Shigella boydii 1 Ingen vekst Ingen vekst
Shigella flexneri 1 Ingen vekst Ingen vekst
Shigella sonnei 1 Ingen vekst Svak vekst, magenta
Vibrio alginolyticus 3 Gul eller turkis Gul
V. cholerae 4 Gul eller turkis Magenta
V. damsela 1 turkis Cobalt
V. fisheri 1 Svak vekst, gul Ingen vekst
V. fluvialis 1 turkis Cobalt
V.furnissii 1 Gul Gul
V. hollisae 1 turkis Gul
V. metschnikovii 1 Ingen vekst Ingen vekst
V. mimicus 1 turkis Magenta
V. parahaemolyticus 22 De fleste stammer turkis De fleste stammer cyan; noen klar
V. proteolyticus 1 turkis Cobalt
V. vulnificus 4 Turkis eller klart Magenta

Tabell 1. Mikrobielle arter brukt i denne studien og deres vekstegenskaper på selektive og differensial media. Farge kall var BAsed på et fargehjul. Cyan er lik i Teal; magenta er lik rosa lavendel, er turkis lik grønn, gul omfatter oliven og brun.

Fire separate studier ble utført for å fastslå vekst og kolonienes morfologi av disse stammene på det selektive og differensial media - TCBS og det kromogene agar. TCBS er det konvensjonelt medium som brukes for isolering av enkelte Vibrio-arter, inklusive V. cholerae og V. parahaemolyticus 12. Color variant av kolonier dyrket på TCBS var gul, turkis (grønn) eller klar (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Colony morfologi Vibrio spp. på TCBS agar. V. parahaemolyticus (turkis), V. cholerae (gul), og am implisitte inokulering av de to arter (a). Kolonier av V. parahaemolyticus vises turkis, med en sirkulær, hele, og konveks morfologi (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Muligheten av en ny kromogent medium for å selektere for klinisk relevante Vibrio-arter fra mat og miljøprøver ble testet. I tillegg, ble evnen til dette mediet for samtidig å skille disse arter fra hverandre evaluert. Colony farge observert på kromogent agar var kobolt, cyan, magenta, gul eller klar (figur 2). Som vist i tabell 1, både TCBS og det kromogene agar oppviste visse grader av selektivitet mot ikke- Vibrio mikroorganismer.

1 "> Figur 2
Figur 2. Colony morfologi Vibrio spp. på den nyutviklede kromogen agar. V. parahaemolyticus (cyan), V. cholerae (magenta), og en blandet inokulering av de to arter (a). Kolonier av V. parahaemolyticus vises cyan, med en sirkulær, hele, og konveks morfologi (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Følgende standard Plate Count metoden på natten kulturer, kolonier av V. parahaemolyticus ble observert på de kromogene agarplater som fikk den høyeste fortynningsfaktoren (for eksempel, df = 10 -8). Disse resultatene var sammenlignbare med de som er på et ikke-selektivt medium (TSA). Dette tyder på at påvisningsgrensen for den kromogene mediet er lik den ikke-selektive media, som er omtrent 10 celler eller lavere i fravær av mat matrise. Påvisningskapasiteten til andre Vibrio-arter som V. alginolyticus, V. fluvialis og V. pike var også grei i forhold til ikke-selektivt medium. Men noen stammer av V. cholerae, V. vulnificus og V. mimicus ga 10- til 100-ganger mindre CFU på den kromogene agar. De selektive midler som anvendes i de kromogene eller andre selektive media uunngåelig hemme noen celler. Skadde celler, for eksempel, kan ikke komme i selektive media. Likevel er det litt dårligere deteksjon evne et ikke-tema i de fleste rutinemessige prosedyrer som ansetter en berikelse trinn. Liten mengde av mikroorganismer i næringsmidler eller miljøprøve vil formere seg til et høyt nivå i anrikningsbuljong, overgår deteksjonsgrensen. Berikelse i alkalisk peptonvann er Often gjøres for å fastslå utbredelsen av Vibrio-artene i miljøprøver 12.

I nærvær av østers homogenat, fortsatte det kromogene agar for å vise en god grad av utvinning. Med andre ord, en stor andel (> 70%) av V. parahaemolyticus celler var i stand til å vokse på det kromogene agar, upåvirket av tilstedeværelsen av østers matriksen (Figur 3a). Veksten og utvinning av V. parahaemolyticus celler, ble heller ikke påvirket av tilstedeværelsen av en annen Vibrio-arter (figur 3b). Dette er en viktig egenskap fordi miljøprøver er nødt til å inneholde forskjellige Vibrio-arter, hvilken er ved høye tall spesielt etter en anrikningsfremgangsmåte.

Figur 3
Figur 3. Prosent utvinning av en V. parahaemolyticus belastning i østers homogenat med og uten en bakteriell konkurrent. Recovery (gjennomsnitt ± SD) ble beregnet i henhold til den observerte vs den forventede CFU stole på agarplatene. Forventet antall kolonidannende enheter ble beregnet på grunnlag av den bakterielle belastning i inokulum. Høy utvinning av en V. parahaemolyticus stamme ble observert på alle media uten konkurranse (a). Tilsvarende nivå av bedring ble observert når høye nivåer av V. metschnikovii celler var tilstede (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For ytterligere å sammenligne de kromogene og TCBS agar, ble sensitiviteten og spesifisiteten beregnes. Tabell 2 viser evnen til disse media til Accurat identifisere V. parahaemolyticus. Sensitivitet er relatert til den prosentandel av sann positiv, som betyr at V. parahaemolyticus stammer ga den forventede koloni morfologi på media. Spesifisitet er relatert til den prosentandel av sann negativ, noe som betyr at ikke-V. parahaemolyticus stammer skal fremvise dårlig eller ingen vekst, eller en annen koloni morfologi enn V. parahaemolyticus. Sensitiviteten og spesifisiteten for TCBS å identifisere V. parahaemolyticus var 86,4% og 71,8%, respektivt. Til sammenligning, sensitiviteten og spesifisiteten av det kromogene mediet var 90,9% og 96,9%, respektivt.

en)
TCBS agar V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
God vekst og turkis colonies 19 9
Dårlig vekst eller ikke-turkise kolonier 3 23
b)
kromogent agar V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
God vekst og cyan kolonier 20 1
Dårlig vekst eller ikke-cyan kolonier 2 31

Tabell 2. Sensitivitet og spesifisitet av TCBS (a) og kromogen (b) agar i deteksjon av V. parahaemolyticus. Identiteten til V. parahaemolyticus ble bestemt tidligere av biokjemisk test og tlh- PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien fokuserer på kultur medieutvikling og evaluering. Konvensjonelt, er TCBS den selektivt og differensielt medium som brukes for å isolere og detektere V. parahaemolyticus, V. cholerae og V. vulnificus 12. Imidlertid begrensninger har vært rapportert for dette medium, slik som manglende evne til å skille V. cholerae fra andre Vibrio-artene. Sukrose og pH-indikator er differensiering agenter for TCBS. Således syreproduksjon av sakkarose fermenter bevirker fargeendring av mediet. Farging av mediet er en ulempe ved TCBS fordi det kan utydeliggjøre observasjon av kolonienes morfologi. Den nyutviklede kromogene medium benytter høy pH og saltholdighet å undertrykke veksten av ikke Vibrio-artene som finnes i mange marine prøver. Den nye kromogene medium har en endelig pH-verdi på 8,6 ± 0,2. Per liter deionisert vann, den består av 10 g pepton, 10 g sjøsalt blanding, 10 g oksegalle, 10 g natriumtiosulfat, 5 g gjærekstrakt, 5 g natriumcitrat, 2,2 g natriumkarbonat, 2 g laktose, 0,5 g natrium-pyruvat, 0,3 g av en kromogen blanding og 15 g agar. Den kromogene mix tillater differensiering blant Vibrio spp. i henhold til deres differensielle evner til å produsere visse enzymer. I stedet for å endre fargen på TCBS agarmedium, forskjellig Vibrio spp. ville oppvise forskjellig kolonifarge på den nye kromogene medium. Til sammenligning inneholder en kommersielt tilgjengelig kromogent medium 15 g agar, 8 g pepton og gjærekstrakt, 51,4 g salt, 0,3 g av en kromogen blanding og en slutt-pH på 9,0 ± 0,2.

Robustheten av et assay evaluering avhenger av prøvestørrelsen. Etter denne studien streker på effektiviteten av de nye kromogene medium for å isolere og detektere V. parahaemolyticus, er det viktig å samle mange forskjellige V. parahaemolyticus stammer. Tidligere studier som sammenligner TCBS ogny kultur media ofte involvert miljømessige eller smaksprøver som inneholder ukjente typer og mengder av mikroorganismer 23,24,25,26. Flere kolonier per prøve ble isolert, men den klonale karakter av isolatene var ofte ikke fastslått. Ideelt sett bør forskjellige stammer testes i analysen utvikling ellers nøyaktigheten av analysen ville bli oppblåst. Belastning identitet kan fastslås ved konvensjonelle metoder så som subtyping pulset felt gelelektroforese (PFGE) eller multi-locus sekvensering. V. parahaemolyticus stammer i denne studien var tidligere preget av ribotyping og PFGE 19.

Under analysen utvikling, sensitivitet, spesifisitet og deteksjonsgrensen er blant de viktigste faktorene for å bli undersøkt. Følsomhet, også kjent som nøyaktighet eller diagnostisk sensitivitet, er den positive prosent avtale mellom referanse- og testmetoder. Spesifisitet, også kjent som presisjon eller diagnostisk spesifisitet, er den negative prosent en Greement mellom referanse og testmetoder. I denne studien brukte vi PCR-basert metode som referansemetoden fordi resultatene ble verifisert mellom forskjellige grupper. TCBS og kromogene mediene var de testmetoder. For å bestemme sensitiviteten, resulterer fra V. parahaemolyticus stammer ble brukt, dvs. Sensitivitet = 100% x Sann Positive / (sanne positive + falske negative). På den annen side resulterer fra ikke- V. parahaemolyticus stammer ble benyttet for å bestemme spesifisiteten; og dermed spesifisitet = 100% x Sann Negativ / (Sann Negativ + False Positive). For å gi mer pålitelige spesifisitet resultater, ikke- V. parahaemolyticus stammer bør isoleres fra et miljø hvor prøvetaking skal gjennomføres. Våre sensitivitet og spesifisitet Beregningene er basert på dokumenter som er skrevet av regjeringen 27, akademia 28 og vitenskapelige organisasjonen 29 på et emne relatert til analyse utvikling og validering.

nt "> På grunnlag av våre resultater, det kromogene mediet viste bedre resultater enn TCBS i identifisering av V. parahaemolyticus. Den totale prosent avtale mellom referansemetoden og kromogent medium er 94,4%, sammenlignet med 77,8% mellom referansemetoden og TCBS. sensitiviteten og spesifisiteten av det kromogene mediet er 90,9% og 96,9%, respektivt, som er større enn de av TCBS (86,4% og 71,9%, respektivt). Tidligere undersøkelser som evaluerte andre kromogene media for påvisning av V. parahaemolyticus funnet at sensitiviteter varierte 85-88%, mens særegen varierte 94-95% 23,24,25. Men disse studiene ikke bruke samme beregningsmetode som vår studie. Videre, de noen ganger brukt en annen referansemetode eller de kombinerte resultater fra både biokjemiske analyser og kromogent medium som en prøvemetode. som et resultat av dette er det vanskelig å direkte sammenligne våre resultater med disse tidligere studiene.

V. parahaemolyticus, kan det kromogene agar brukt i denne studien også skille flere Vibrio-arter enn TCBS på grunn av inkludering av en kromogen blanding i mediet formel, hvilket ga flere farger. Selv om det var ikke fokus for denne studien å oppdage V. cholerae og V. vulnificus, er det verdt å merke seg at magenta kolonier utstilt ved disse artene kan bli ytterligere differensiert av fluorescens under UV. En begrensning for å bruke det kromogene agar for påvisning av V. cholerae og V. vulnificus er dens tilsynelatende lav utvinnings for disse artene. For å omgå dette problemet, må en berikelse trinn bli inkludert. En annen mulig begrensning av kromogen agar er dens kortere holdbarhet enn TCBS. Pågående optimalisering av dette nye mediet er nødvendig for å opprettholde pH under lagring.

Til tross for populariteten av molekylære teknikker, Kultur-avhengig metoder er fremdeles verdifulle som de ofte er mindre kostbare og har en bedre påvisningsgrense. Disse dyrking metoder kan brukes som et screening-verktøy. Omvendt kan de brukes for å bekrefte identiteten og levedyktighet av mikroorganismer Følgende molekylære analyser. For å oppsummere bakterier via en kultur-avhengig tilnærming, er Standard kimtall anerkjent som standard metode. Ligningen vist i trinn 4.2.5 er en mer nøyaktig måte å bestemme CFU / g eller CFU / ml enn gjennomsnittet CFU fra ulike utvannings faktorer. Det er viktig å merke seg at alle fortynningsmidler og media i hele fremgangsmåten, må inneholde tilstrekkelig salt til å opprettholde levedyktigheten av halofile bakterier som for eksempel V. parahaemolyticus. Inkubasjon temperatur og omgivelsene må være optimale for bakterievekst.

Den kromogene medium er konstruert for å detektere Vibrio-arter som er viktige humane patogener. Derfor må ytterligere studier gjennomføres for å determine dens effektivitet til å oppdage andre miljø Vibrio-artene som ikke er medisinsk relevante. I fremtidige anvendelser, kan den nye kromogene agar inkorporeres i rutinemessig testing av miljøprøver for V. parahaemolyticus. Dette kan gjøres ved direkte striper av prøver på det kromogene agar for å detektere for tilstedeværelsen av presumptive V. parahaemolyticus. Den kromogene agar kan også brukes til å spesifisere V. parahaemolyticus følgende fortynninger. Kvantifisering kan også estimeres ved å gjennomføre en mest sannsynlige tall metode med oppformeringsbuljong, etterfulgt av striper på kromogent agar for bekreftelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker M. Channey, E. Chau, og K. Tomas for deres hjelp på prosjektet. Prosjekt forsyninger ble delvis finansiert av California Polytechnic State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any  
 
 
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisheri Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
  2. Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
  3. Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
  4. Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
  5. Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
  6. Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
  7. Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
  8. Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
  9. Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
  10. Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
  11. Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
  12. Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
  13. MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
  14. Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
  15. Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
  16. Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
  17. Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
  18. Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
  19. Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
  20. Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
  21. Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
  22. Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
  23. Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
  24. Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
  25. Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
  26. Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
  27. Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
  28. Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
  29. World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).

Tags

Infeksjon , Kromogene media analyse utvikling TCBS selektive og differensial media diagnostisering isolering sensitivitet spesifisitet Standard kimtall
Utvikling av en mer sensitiv og spesifikk kromogen Agar Medium for deteksjon av<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Og annet<em&gt; Vibrio</em&gt; Arter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeung, M., Thorsen, T. DevelopmentMore

Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter