Abstract
哺乳动物的心脏是ATP的主要消费和需要能量底物进行收缩的稳定供应。不足为奇的是，心肌代谢的改变已被链接到的收缩功能障碍和心脏衰竭的发展。因此，解开新陈代谢和收缩之间的联系应该在某些领导在疾病状态下心脏适应或适应不良的机制线索。分离的工作大鼠心脏制剂可用于跟踪，同时和实时，心脏收缩功能和能量提供基板到氧化代谢途径的通量。本协议的目的是提供在缓冲器的氧化的葡萄糖和脂肪酸，主要能量提供所述心脏的基板用率的定量测量的制备和利用所采用的方法的详细描述。还讨论了用于样品分析和数据解释的方法。简言之，该技术是基于通过常温晶体灌注的14供给的C放射性标记的葡萄糖和3 H-放射性标记长链脂肪酸对离体心脏跳动。14 CO 2和3 H 2 0，结束副产物参与这些提供能量的基板的利用酶反应，然后定量地从冠状动脉流出物中回收。与所使用的放射性标记的底物的比活性的知识，那么有可能单独定量葡萄糖和脂肪酸的通量在氧化途径。离体心脏的收缩功能可以并行确定与适当的记录设备和直接相关代谢通量的值。该技术是研究响应于各种胁迫条件的代谢/收缩关系极为有用，如在前和负荷和缺血，药物或circula之后改变廷因子，或者在基因产物的表达的改变如下。
Introduction
临床相关性
在哺乳动物心脏，有基材的通量之间通过氧化代谢途径，ATP的生成和心脏工作1较强的正相关关系。在过去的二十年中，心脏代谢和功能之间的错综复杂的链路的调查已经导致认识到，在心脏代谢的改变是用于在不同类型的心脏疾病2-4的设置收缩功能障碍和可能的病理结构重建的原因。因此，可以预期，我们的管辖强调心脏的代谢重构机制的理解会导致心脏衰竭5-7的预防或治疗的治疗靶的鉴定。从美国心脏协会科学语句的“评估心脏代谢”的最近的出版物强调了科学界的T的兴趣与日俱增他的研究领域8。不过，虽然在心脏成像的技术进步现在允许心脏形态和功能的一个快速，准确的评估，心脏代谢的体内研究仍然有限和繁重：核磁共振（NMR）谱和正电子发射断层扫描（PET）成像可以用来跟随心脏高能磷酸代谢和克雷布斯循环的活性，但这些技术都受到高的操作费用和他们无法困扰，以确定各种基材在稳态条件9的贡献氧化代谢。对此日期体外工作心脏制备代表鞋底和独特的技术可用来研究，同时，实时，收缩功能和底物的助熔剂装入氧化代谢途径7,9。以下方案的目的在于提供在用于确定大鼠试剂的制备和使用的指南在大鼠离体心脏基板利用率上课。
隔离工作鼠类心脏仪器
虽然技术是近半个世纪之久，隔离工作大鼠心脏的准备仍然首选心血管研究的方法。由于与心脏的Langendorff编制，工作啮齿动物心脏提供了一个相对简单，可靠和廉价的方式从其他器官，神经内分泌等循环因子的混杂效应独立测量范围广泛的心脏参数。但与此相反的的Langendorff灌注心脏，工作心脏继续执行近生理心脏工作，为氧化代谢通量的产生是相关的体内条件级的先决条件。这是通过经由连接到左心房的插管递送灌注缓冲液至左心室（LV）的实现，并作为低压填充和合同，该缓冲器是通过对一个确定的负荷静水压力主动脉线喷射。最初由尼利和他的同事描述的10后来被Taegtmeyer，折边和克雷布斯11好转，但灌注设备的设计至今变化不大。如在原始设备描述的，收缩功能可以通过测定心输出量的评估，使用不超过量筒和秒表来测量主动脉和冠状动脉流10,11。一些厂商现在提供完整的工作啮齿动物心脏灌注系统。这些可商购的装置可与flowprobes，压力传感器，一个压力 - 体积导管和必需的所有心功能数据采集和分析的设备来获得。该供应商提供大量的文档和培训课程，熟悉他们的设备新用户。一些评论文章还详细协议的工作心脏仪器和设备行进，而对使用导管来测量在啮齿类动物12-15心脏功能。因为这个原因，我们将只简要地提及灌注装置和记录设备的设置。本协议，而旨在用的，可以被实现同时测量葡萄糖和长链脂肪酸的氧化的速率，在正常心脏两大能量提供衬底的方法的描述，以补充已经可用的信息。我们在这里描述的所有参与利用放射性标记的能量底物的心肌氧化代谢的评估的步骤，从试剂和缓冲液，以样品的回收和处理的制备中，对数据的分析。
该方法的原理
心肌细胞产生它们的能量的对收缩从脂肪酸（主要的长链脂肪酸）和碳水化合物的氧化磷酸化的体（glucose和乳酸）。心脏有非常有限的精力充沛的储量依赖于从循环这些能源提供基板的稳定供应。葡萄糖通过糖酵解途径分解代谢产生丙酮酸，然后通过线粒体内膜的丙酮酸脱氢酶复合脱羧。长链脂肪酸，从循环白蛋白或脂蛋白甘油三酯萃取，首先活化成酰基-CoA分子在细胞质中，并随后输送的线粒体基质内通过肉碱穿梭进入β-氧化途径。由葡萄糖和脂肪酸分解代谢产生的乙酰-CoA分子燃料三羧酸循环来产生其用于通过电子传递链来构建跨线粒体内膜的质子动力的还原当量（NADH和FADH 2）和通过ATP合酶的活性产生的ATP。水和二氧化碳是的端部的副产物酶反应发生的克雷布斯循环回路内。的14 C和3 H-放射性标记的底物的供给（如14 C-放射性标记的葡萄糖和3 H-放射性标记油酸）的分离工作心脏将因此导致生产14 CO 2和3 的 H 2的O其可以定量地从冠脉流出液回收。 14 CO 2的集合由保持离体灌注心脏成密封室以及由冠状动脉流出物在离开心脏立即恢复进行。一个小的阴离子交换柱用于分离和从冠状动脉流出物中回收3 H 2 O操作。从经处理的样品的放射活性用液体闪烁计数器测定，并与所使用的放射性标记的底物的比活性的知识，那么有可能单独定量葡萄糖和脂肪酸中的磁通氧化通路16,17。
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Protocol
注：根据对人文关怀和动物用NIH公共卫生服务政策进行所有动物的程序和密西西比医学中心大学的机构动物护理和使用委员会批准。根据密西西比医学中心大学辐射安全办公室的指导方针所有涉及使用放射性同位素的程序进行批准和执行。
1.股票缓冲溶液和试剂的制备
- 克雷布斯，亨氏（KH）缓冲库存解决方案
- 制备2升含有20倍浓缩的盐储液（在摩尔/升）2.37氯化钠，0.0948氯化钾，0.0236 KH 2 PO 4，和0.0236 硫酸镁 * 7H 2 O.一个0.45μm孔径的过滤装置和店铺过滤在室温下长达1个月。
- 制备2升碳酸氢钠的20倍浓缩的（0.5摩尔/升）溶液。该溶液可以是在室温下保存的时间无限期。
- 制备250毫升氯化钙的1摩尔/ L的储备液。一个0.45μm孔径的过滤装置和店铺过滤在室温下长达1个月。
- 阴离子交换树脂的转化率从氯化物形式的氢氧化物形式
- 通过在1升纯水再悬浮它洗涤阴离子交换树脂。让树脂沉降，倒出多余的水。重复此步骤4次以上。
- 倒在安装在一个过滤烧瓶的玻璃微量真空过滤器保持器的树脂。
- 通过22体积的1N NaOH缓慢传递树脂转化为羟基型。用不锈钢刮勺间歇混合的浆料。
- 用超纯水洗涤树脂，直到pH值低于9.0。通过浸渍的pH测试条的树脂浆料的表面附近定期检查pH值。盖，并用超纯水树脂存储到微博rosilicate玻璃瓶避光。不要让树脂使用前晾干。
注：如果存放不当，树脂将持续至少3个月。
- 油酸白蛋白8倍浓缩原液
- 在一个4升锥形烧瓶中，混合200毫升的20倍浓缩的盐储备溶液和200毫升与3.6升超纯水的20倍浓缩的NaHCO 3溶液。
- 使用气体分散管具有多孔筒，气体与二氧化碳5％，氧95％以稳定的pH的混合物15分钟的溶液中。
- 倾470毫升在1L玻璃烧杯中缓冲。添加8.75毫升1摩尔/升的CaCl 2原液残留在4升锥形瓶中3530毫升缓冲液中，放在一边。
- 40克不含脂肪酸的牛血清白蛋白的添加到1升玻璃烧杯中，并搅拌搅拌棒直至溶解。
- 在一个15毫升锥形管，制备4-毫升50％的（体积比）在超纯水中乙醇溶液。添加487毫克sodiu米油和涡流直至粉末完全溶解。
注：一些研究者利用棕榈酸代替油酸灌注缓冲。棕榈酸白蛋白原液可以按照相同的程序来制备。然而，建议预热在70ºC溶液达到棕榈酸钠的完全溶解。 - 的油酸溶液滴添加到不断搅拌下的不含脂肪酸的BSA溶液并等待10更分钟为油酸-BSA复合物形成。
注：溶液应具有浅黄色颜色，并不含可见颗粒。沉淀或不溶性微粒的存在可以指示脂肪酸的BSA的不完全偶联。如果发生这种情况，溶液应被丢弃并且该过程开始一遍。
注意：如果它被允许在吸移管坐，不能滴加棕榈酸酯会沉淀。 BSA的搅拌的溶液可在37ºC被加温以促进结合蛋白摹棕榈酸。不要过热，因为这可能会引起BSA的变性和聚集。
注意：此协议的下一步骤涉及放射性物质的操作。穿戴合适的个人防护装备，并按照该机构的辐射安全办公室设置安全和废物处理的规定。 - 添加160微升（0.8毫居里）[9,10- 3 H]油酸到油酸-BSA的搅拌溶液中，并搅拌另外10分钟。
- 添加2.5的1摩尔/升的CaCl 2原液油酸-BSA的搅拌溶液中。
- 切大约1.2米渗析膜管和漂洗内外用自来水之外。大力擦洗透析管自来水下进行10至15分钟以除去膜的甘油的涂层。可替代地，通过浸泡在温水中透析管在使用前1小时除去涂层。完成用超纯水：洗涤透析管河
- 牢固地打结透析管的一端。与油酸-BSA溶液填充并打结的透析管的另一端。
- 放置填充透析管进KH缓冲的4升锥形烧瓶中，并允许有搅拌棒温和搅拌下，于4ºC透析过夜。
- 第二天，除去来自透析管的8倍浓缩油酸-BSA溶液。在-20ºC立即使用油酸BSA溶液灌注或分装店铺。冷冻等分试样是稳定至少2个月。避免多个冻融，因为这可能会影响油酸-BSA复合物的溶解度。
注：仅使用超纯水（25ºC18.2MΩ.cm的电阻率，总有机碳<10ppb以下，微生物≤1 CFU /毫升，用颗粒大小在0.22微米≤1/ ml）的制备试剂和缓冲液用于心脏灌注。从它的氯化物阴离子交换树脂为转化米至氢氧化物形式可以通过直接购买氢氧化物形式的支付额外费用来避免（参见材料数据表 ）。除了油酸或棕榈酸，任何其它类型的天然存在的脂肪酸的也可以使用，只要该脂肪酸的氚化版本可按照其氧化。
2.灌注缓冲液的制备
- 在一个4升锥形烧瓶中，混合200毫升的20倍浓缩的盐储备溶液和200毫升与3.6升超纯水的20倍浓缩的NaHCO 3溶液。气体与二氧化碳5％，氧95％的混合物中15分钟的溶液，然后添加10 1 mol / L的氯化钙原液设置游离Ca 2+的浓度为2.5毫摩尔/升的溶液中。
注意：下面的步骤包括放射性物质的操纵。穿戴合适的个人防护装备，并按照该机构的设置RA安全和废物处理规定diation安全办公室。 - 转移1.750 L KH缓冲到2L硼硅酸盐玻璃瓶中。加入250毫升的8倍的浓油酸-BSA溶液，1.802克D-葡萄糖，400微升胰岛素0.4单位/毫升，和200微升（0.2毫居里）[U- 14 C]葡萄糖。倒置瓶混合。这会给2升含有油酸（0.4毫摩尔/ L）D-葡萄糖（5毫摩尔/升），和胰岛素（40μU/ ml）的完全灌注缓冲液中。
注：2升体积足以灌注非循环条件下工作的成年大鼠心脏至少60分钟。 - 使用一些非放射性KH液来填充两个夹层的菜肴，并放置在冰上冷却。
3.灌注设备的研制
注：研究者可以选择使用一个定制灌注装置诸如通过Taegtmeyer，下摆和克雷布斯11，或市售的系统之一描述的。灌注系统通常由的在下面的图1描述的元件。除了管和玻璃器皿中，记录设备的其余部分是可选的，其利用将取决于研究者的需求，解决了实验问题被提出。然而，我们建议使用氧气微电极，以确定在缓冲区进入O 2浓度和退出冠脉循环（ 图1）。这将有助于使心脏与氧气的适量供给研究者控制，而且供氧不实验之间变化。此外，“静脉”氧差的测定可用于计算心肌耗氧量和心效率16,18。
- 接通循环水浴，并在37ºC设置热身灌注装置。
- 打开计算机和数据采集系统，将上可用于测量心脏功能。
- 连接在记录设备（压力导管，压力容积导管，氧气微电极，流量计等 ）中的数据采集系统，并执行以下的制造商的说明校准仪器。
- 填用超纯水的缓冲贮存器。打开蠕动泵，并通过所有的管道冲洗出来的水和玻璃器皿冲洗系统。关掉蠕动泵，并确保没有水停留在管道和/或玻璃器皿，因为这可能会影响灌注缓冲液和心脏制剂的浓度。
- 一个新的1.0微米玻璃纤维过滤器连接到该系统。连接含有二氧化碳5％，氧95％的混合物，以补氧室中的气体罐。
注意：下面的步骤包括放射性物质的操纵。穿戴合适的个人防护装备，并按照该机构设定的安全和废物处理规定的辐射安全办公室。 - 填充灌注缓冲液的缓冲液容器。开启泵并确保所有管道和玻璃器皿的灌注缓冲的填充。贯穿在再循环模式中的灌注装置和含氧化合物的灌注缓冲液在使用前至少30分钟。
- 紧紧附着20ml的注射器管内的心脏腔下方，以恢复冠状动脉污水。注射器的前端连接到一个三路活塞的顶部。侧臂连接到3毫升注射器。经由管道底部臂连接到用于液体的放射性废物的容器。
注：当使用脂肪酸的BSA复杂，灌注缓冲液的氧合无法通过直接鼓泡进行用气体分散管，因为这将引起溶液过度发泡。使用膜式氧合（ 图1）或用于该目的的片流补氧室中。强烈建议，以验证适当水平Ø˚F氧合是通过将氧的微电极在灌注回路（ 图1）到达。
4.大鼠心脏分离和插管
- 权衡的规模老鼠。
- 制备具有150毫克麻醉剂剂量的注射器/ kg的thiobutabarbital钠盐水合物，并用200的USP单位肝素结核菌素注射器。
- 注射thiobutabarbital IP，等待动物失去了知觉。其它诱导剂可以用作只要这不会对实验的目的干扰（见下面的讨论 部分麻醉的选择）。
- 通过确认缺乏脚趾捏反射检查麻醉适当的水平。确保维持麻醉的适当深度，以确保在手术过程中的动物不会感到疼痛。
- 一旦老鼠完全是无意识的，并没有脚趾捏反应，将其放置在其上手术台秒回URE四肢用胶带或引脚。
- 剪辑腹部无发并执行腹部正中切口。请不要在此时打开胸腔呢。移动至胃和小肠一旁以显示下腔静脉。直接注射肝素进入下腔静脉和继续之前等待5到10秒。
- 用剪刀切开隔膜和肋笼的侧面，以暴露胸腔的内容。
- 巧妙抓住拇指，食指和中指和消费都的心脏和肺之间的心脏在一起。在切降主动脉的水平，注意不要损坏的过程中主动脉弓和升主动脉。马上心脏和肺部转移到填充用冰冷的KH缓冲解剖菜肴之一。
- 心脏停止跳动后，转移到第二解剖盘和剪掉任何大块肺组织，同时保持在冰冷的KH液淹没的心脏连接。切降序ING右主动脉弓上方主动脉。
注意：下面的步骤包括放射性物质的操纵。穿戴合适的个人防护装备，并按照该机构的辐射安全办公室设置安全和废物处理的规定。 - 冲洗灌注装置的主动脉线以填充用温缓冲主动脉插管，并消除任何水或空气可能仍然存在于管路。允许灌注缓冲液从主动脉插管滴，以尽量减少空气栓子在心脏附接到所述套管的时间的机会。
- 使用两个微解剖镊子小心地打开主动脉和向上滑动的心脏上的主动脉插管。固定在插管的主动脉用微夹子和启动的心脏的Langendorff灌注。观察心脏再次开始跳动排出所有剩余在秒冠状脉管以下灌注开始的血。
注：要执行4个步骤是非常重要的。图6至4.10尽可能防止对心脏不可逆缺血性损伤一样快。有经验的，整个过程应1和2分钟之间。当滑动主动脉上来就套管，小心不要通过主动脉根部，因为这可能会导致心肌灌注不足而损坏的主动脉瓣。 - 领带主动脉主动脉插管用3-0丝线缝合，并删除微剪辑。找到肺静脉。它可能有必要修整非心脏组织中发现，但不切太多非心脏组织中，因为他们将投放到左心房绑到套管。
- 冲洗灌注装置的左心房线以填充用温缓冲心房插管并消除任何水或空气可能仍然存在于管路。要特别小心，以从装置除去任何气泡，以减少空气栓子在心脏附接到所述套管的时间的机会。
- 使用两个微解剖FORCEPS微妙抢肺静脉开口向上滑动到心脏心房插管。可能有必要通过轻轻转动心房和/或主动脉插管来完成此步骤以重新定位心脏。在任何情况下，确保该程序不会对心脏施以过度劳损而导致的主动脉弯曲。领带的左心房的心房插管以3-0丝线缝合。
- 打开心房线，同时从的Langendorff模式，工作模式切换主动脉线。如果缓冲器漏出从左心房，关闭心房线，切换回主动脉线的Langendorff灌注，并使用另一3-0丝线缝合到更牢固地绑左心房套管。
5.心功能及样品采集的测量
注：代谢通量的测定将所需要的冠状动脉流量（CF）的知识。如下所述，冠状动脉血流值可以是与简单的使用秒表的获取。此外，主动脉流（AF）用相同的方法测量将允许心输出量（CO = CF + AF）的确定，然后可以通过施加用于计算心脏功率（CP），为心脏功能的一般量度式CP = CO（米3 /秒）*后负荷（帕）。可用于心功能的评估的另一种方法依赖于脉冲压力的实时测量与压力换能器（ 图3和4）。虽然可选的，心脏收缩功能及血液动力学，包括左心室收缩和舒张功能的确定的最准确和详细的测量，将与使用一个压力 - 体积（PV）电导导管的实现的。本节简要介绍了离体心脏的导管。关于光伏导管的校准和数据分析与统计软件可以更多信息参考文献14,15找到。
注意：下面的步骤包括放射性物质的操纵。穿戴合适的个人防护装备，并按照该机构的辐射安全办公室设置安全和废物处理的规定。
- 如果实验包括具有导管LV功能的直接测量，穿刺LV尖与＆G针并通过穿刺引入导管。
- 当使用压力 - 体积导管，仔细地定位导管，使得它的轴与LV纵轴对齐，与远侧电极权利主动脉瓣下方和邻近于心内膜边界，只是心室壁内的近端电极。
- 封心脏入水套式心脏室，并监控与数据采集软件心功能参数。开始记录后基线心脏参数已稳定超过5分钟。
- 确定由MEA冠状动脉血流suring填补附着在心脏腔室下方20毫升注射器管所需的时间。测量后，打开活塞三方清空冠状动脉流出入的放射性废液的容器中。
注：流量测量也可以使用一个流量计和flowprobes进行。 - 使用附连到三路活塞的侧臂以回收约2ml冠状动脉流出物在离开心脏3毫升注射器。传送将0.5ml冠状动脉流出物到2ml无盖微量离心管中，并立即用葡萄糖氧化的速率（下文第6节）的测定进行。
- 在适当标记的微量离心管转移冠状动脉流出物样品（〜1.5ml）中的其余部分，并存储在冰上。
- 重复步骤定期（ 例如每5或10分钟），直到灌注实验结束5.4至5.6。
- 如果使用的压力 - 体积的导管，注入高渗盐水的10微升大丸剂（15％）进房线和结束前实验前心房插管权利。使用该推注来计算平行电导（ⅤP），这对于精确确定心脏体积15的关键。
- 开封心脏腔室和从LV取出导管如果已在实验中使用。恢复使用下列选项之一的心脏：
- 如果没有必要分离出心脏的特定区域为下游分析，并且如果灌注设备允许的话，靠近两个心房和主动脉线并立即冷冻夹紧使用Wollenberger钳其插管的心脏预冷于液氮中。
- 另外，切离心脏插管，并把它放到冰冷的KH缓冲区。干燥迅速在纸巾上的心脏，并测量其湿重。随后心脏可以解剖并收集特定测量组织样本。冻结使用Wollenberger塘剩余的组织前S冷却在液氮中。
- 储存在-80ºC冰冻心脏组织，直到确定干重（见第8节计算）的。
6.测定心肌葡萄糖氧化率的
注：该方法包括在14 的 CO 2从与季铵盐的氢氧化物的捕获溶液冠状动脉流出物中定量回收。 14 CO 2的溶解以H 14 CO3-回收以下用高氯酸缓冲的酸化。样品应立即它们作为空气和样品之间的气体的被动扩散将导致14 CO 2随时间损失恢复后进行处理。闪烁小瓶应与橡胶套塞子紧密地密封，以防止加入高氯酸后14 的 CO 2的损失。如果需要的话，封口膜可用于确保橡胶套筒止动件的小瓶（ 图2）。
- 加入1ml季铵盐的10倍浓缩的氢氧化玻璃闪烁瓶（每个样品一小瓶+测定背景活动的两个额外瓶）的。
注意：季铵盐氢氧化物是剧毒，可致严重灼伤。咨询适当的处理和储存产品MSDS。 - 使用镊子微妙含有0.5毫升冠状动脉流出物样品2 mL萃取免盖微量离心管转移到小瓶中预先填充有季铵盐的氢氧化物。使用0.5毫升灌注缓冲区为背景活动的决心。
- 帽用橡胶套筒塞子的小瓶。封口膜可用于固定小瓶密封。用1ml注射器和23政长针，注入200μl的高氯酸（60％重量：重量％）通过橡胶套筒塞子并直接进入2 mL萃取无帽管中。
注：冠状动脉流出应该变成白色，由于BSA的沉淀。 - 让小瓶小号它过夜。
注意：高氯酸是高腐蚀性的，可作为氧化剂和/或引起爆炸的危险。咨询适当的处理和储存产品MSDS。 - 第二天，除去橡胶套筒瓶塞。仔细检索与镊子每2ml无帽管与洗管的底部上的开口小瓶用1ml闪烁鸡尾酒顶部检索所有季铵盐的氢氧化物。弃去无盖管适当标记的放射性废物的容器中。
- 添加每瓶再延长9毫升闪烁鸡尾酒。直接添加0.5毫升灌注缓冲液至两个小瓶填充用10ml液体闪烁鸡尾酒的比活性的测定。大力手工摇动小瓶，并等待至少6小时，以允许气泡在适当的设置为双标签实验用液体闪烁计数器测量前消散。
注：使用透明玻璃小瓶以可视化的NEedle刺入橡胶套塞子时。不要跌落高氯酸成季铵盐的氢氧化物，因为这会毁了反应。加入高氯酸释放14 CO 2从冠状动脉流出到空气中。虽然小瓶应紧密地密封并且所有的14 CO 2的应陷入氢氧化物的季铵盐，建议的化学通风橱下执行该测定。
7.测定心肌油酸氧化率的
注：该方法是基于从冠状动脉流出物使用强阴离子交换树脂3 H 2的O的定量分离和回收。不同于14 的 CO 2的回收率，没有样品的稳定性问题和冠状动脉流出物可以被保持在冰上或在冰箱中存放在进行试验之前。
- 制备阴离子交换树脂柱（每个样品+ t的一列WO测定背景活性的）通过用玻璃棉填充3毫升注射器管的尖端的额外的列。用移液管添加树脂/水的浆料，直到树脂到达在注射器管的2毫升标记。
- 通过使2毫升超纯水通过该柱洗涤树脂。重复此步骤两次。
- 将开放闪烁瓶柱下和负载0.5毫升，每列冠脉流出。加载用于确定背景活动为0.5ml灌注缓冲液中。
- 用0.5,1和2ml超纯水依次洗涤列。一旦洗脱完成后，丢弃在适当标记的放射性废物容器的列。
- 每添加闪烁13瓶毫升的液体闪烁鸡尾酒。直接添加0.5毫升灌注缓冲液至两个小瓶填充13毫升的液体闪烁鸡尾酒用于确定具体活性。大力摇晃瓶和液体测量SCI前等待至少6小时ntillation计数器适当的设置为双标实验。
8.计算
- 如果尚未完成，决定着整个灌注心脏的湿重。
注意：不要让冷冻组织解冻，如果分子和生化分析是对其余的组织随后进行。 - 确定从整个灌流-心脏组织样品的湿重（使用整个心脏的约15至30％）。放置组织样品中，在50℃设定过夜烘箱中并测量其干重。使用组织样品的湿重/干重比，以确定整个心脏的以克干重（g干重）。
- 对于每个时间点x表示冠状动脉血流的CF x的以毫升/分钟的值。
- 葡萄糖氧化率的测定
- 平均的14 C-背景活动determi测量两个解体/分钟（DPM）值网元修正系数14C DPM 学士学位 。
- 确定14 C-平均比活度14C衰变SA的价值。
- 通过应用公式确定葡萄糖的dpm /微摩尔（F 谷氨酸 ）的比放射性
注意：其中n 谷氨酸 （微摩尔）= C 谷氨酸 （微摩尔/升）*样品体积（L）= 2.5在5毫摩尔/升使用葡萄糖时和0.5ml的样品。 - 通过应用公式确定每个时间点x的生产中的dpm /分（A）的14 CO 2的速率
注意：如果卷X（毫升）= 0.5 - 干心脏重量的确定值分割获得生产14 二氧化碳的归一化率（A 规范
- 套用公式GO = A 规范 /˚F 谷氨酸获得在每克干重葡萄糖/ min的微摩尔葡萄糖氧化（GO）的速率。
- 油酸的氧化速率的测定
- 平均两个崩解/分钟（DPM）3 H的背景活性，以确定校正因数3H DPM 巴测量的值。
- 确定3小时平均比活度3H衰变SA的价值。
- 通过应用公式确定DPM /微摩尔（F 01 E）油的具体放射性
注：其中n OLE（微摩尔）= C 奥莱 （微摩尔/ L）*样品体积（L）= 0.2 0.4 mmol / L的油酸使用时和0.5毫升样品。 - 确定每个添E点应用公式2 O在DPM /分（B）×生产3小时的速度
注意：如果卷X（毫升）= 0.5 - 通过干心脏重量的所确定的值除以B至获得生产每克干重的dpm /分钟3 H 2 O（ 乙范数 ）的归一化速率。
- 套用公式OO = B 规范 /˚F 奥莱获得油氧化（OO）的速度在每克干重油/ min的微摩尔。
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Representative Results
两个代表性实验在下面的图中描述。在这两种情况下，一个16周龄的雄性Sprague Dawley大鼠的心脏中分离，并与根据前述方案制备KH液的工作模式灌注。在每个实验中，将心脏经受应力条件影响心脏的工作。心脏收缩功能是由脉压的连续记录通过主动脉线压力传感器的插入和通过测定心肌力量评估。在提供能量的底物的利用每个应力条件下的后果是同时由葡萄糖和油的氧化速率的测量确定。
在第一个实验中，在工作量的急性增加是由40％增加负荷后20分钟的灌注模拟在接近生理负荷（由人工完成养主动脉溢流室），并通过添加肾上腺素（1微摩尔/升）的灌注缓冲液（ 图3A）。心脏速率，这可以通过测量在脉冲压力轨迹的峰值收缩压值之间的间隔来确定，超过50％时workjump诱导（ 图3B）立即增加。心脏功率workjump增长超过40％，这是伴随着增加葡萄糖和油的氧化（ 图3C）的这两个比率。结果表明，在工作量的急性增加的应力作用下，心脏快速适应增加能量产生用于从葡萄糖和脂肪酸氧化的收缩。然而，在氧化的速率相对增加是葡萄糖（〜2.8倍）比是油酸（〜1.3倍），更重要。碳水化合物氧化依赖增加，以应付额外的工作量是压力超负荷哺乳动物心脏18的典型特征
在第二个实验中，将心脏在基线条件下灌注20分钟，随后15分钟总，全球，常温缺血和30分钟再灌注（ 图4A）（通过关闭两个心房和主动脉行内引起）。在这些实验条件下，接近正常的脉冲压力2和3分钟之间再灌注的开始（ 图4B）之后还原。心脏功率迅速上述预缺血值回落到近基线值（ 图4C）之前再灌注前10分钟内增加。与基线相比，油酸盐氧化速率灌注期间增加，而葡萄糖氧化迅速恢复到预缺血水平。通过同时测量的收缩功能和底物氧化可以清楚地的两个速率欣赏的是，在本实验条件下，在脂肪酸氧化氮的速率的变化通货膨胀是用于在再灌注产生的工作的量的变化的主要决定因素。朝向脂肪酸利用交缺血越高开关是再灌注心脏19的良好亮相检测功能。
图 1： 简化的大鼠离体装置的方案补充有脂肪酸的BSA溶液中的Krebs-Henseleit缓冲液通过穿过一个膜式氧合氧化。对大鼠心脏在近生理条件下灌注心脏的典型前，后负荷值表示。该设置可以通过调整心房水库和主动脉溢流室的高度进行修改。刻度注射器的管已被放置在心脏腔室和主动脉溢流室下方，以便分别测量冠脉流量和主动脉流量。的流动缓冲器可以停止（测量主动脉和冠状动脉流动时）或重新路由通过使用三通旋塞（来自的Langendorff切换到工作模式时）。红色箭头指示在线氧气microlelectrodes确定的“静脉”氧分压差的最佳定位。在线流量探头和压力换能器被放置在前后负荷线来测量心房和主动脉流量和压力（绿色箭头）。左心室压力和容积也可以记录用光伏导管通过左心室的顶部插入。在图中未示出的是围绕所有的玻璃器皿中的元素和深蓝色灌注管水套。这些水套元素都通过管道串接设置在37ºC循环水浴。 请点击此处查看T的放大版本。他的身影。
图 2： 在二氧化碳陷阱的设置涉及的不同步骤的表示 （A）加入1ml季铵盐10倍浓缩的氢氧化物。 （B）中添加包含在一个无帽管0.5ml的样品。 （C）的密封小瓶。 （D）注入200微升高氯酸（60％重量：重量％）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：Workjump实验的代表性结果 （A）脉压的连续记录。 （B）在短terval记录描绘在workjump开始时在脉冲压力的变化。 （C）葡萄糖氧化（红色曲线与圆）和油氧化（蓝色线与广场）的心脏率是由冠状动脉流出物的分析以5分钟间隔决定。心脏功率（黑色线与三角形）是由冠状动脉污水样本回收的同时心输出量的测量确定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 缺血再灌注实验的代表性结果 （A）脉压的连续记录。 （B）短间隔记录描绘收缩功能都恢复响前5分钟再灌注。 （C）的葡萄糖氧化的心脏速率（红色迹线与圆圈）和油酸氧化（蓝色迹线与广场）由冠状动脉流出物的分析再灌注前5分钟，其中分析物在执行期间以5分钟的间隔来确定，除了一分钟时间。心脏功率（黑色线与三角形）是由冠状动脉污水样本回收的同时心输出量的测量确定。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
前述协议的细节的方法，通过在隔离工作大鼠心脏葡萄糖氧化和脂肪酸氧化同时量化底物的通量。然后测量可以叠加到所记录的心功能参数，以确定基线和压力条件下，底物的代谢和心脏工作的关系（在工作量的变化，缺血再灌注等 ）。它也可以评估如何新陈代谢/收缩关系由先前存在的条件，如心脏衰竭和糖尿病的影响。此外，转基因啮齿动物的心脏可用于询问特定蛋白质对心脏代谢和功能的影响。最后，药物和其他循环因素对这些参数的影响，可以单独测试。因为葡萄糖通过糖酵解通量并不总是与葡萄糖氧化的速率相关，它可以是Informa的略去通过在一个单一的实验设置两种途径遵循葡萄糖流量的速率。
糖酵解的速率可以通过加入[5- 3 H] -葡萄糖的灌注缓冲液来确定，因为3 H 2的O的释放是由糖酵解20的烯醇步骤的活性来测定。备选[2- 3 H] -葡萄糖，这导致产生在糖酵解途径的磷酸葡萄糖异构酶步骤3 H 2的O，可用于通过心脏肌肉16,17,21询问的葡萄糖摄取的速率。来自多个放射性示踪剂来选择不同层次其分解代谢的研究葡萄糖的命运的可能性的技术中的通用性的另一个例子。然而，因为所有的通量测量依靠任3 H的定量回收2 O或14 的 CO 2从冠状动脉流出物中，只有两个放射性标记编示踪剂（一个3 H-标记的，而另一个标记为14℃）所用的灌注缓冲液在同一时间内使用。
方法问题
有心脏代谢通量和使用此协议功能的测量一些固有的限制。虽然使用KH缓冲允许在灌注液的组成的总控制，本实验装置的生理学相关性可能是有问题的。首先，使用过的血液晶体溶液的已知心脏血流动力学和抗缺血22,23产生负面影响。其次，我们在这里描述的灌注缓冲缺乏各种激素和营养成分，可以直接调节心脏代谢，从而影响心脏的一个模拟应力状态的反应。的确，哺乳动物心脏是代谢杂食动物，并且可以，除了葡萄糖和脂肪酸，利用其它基材至fulfill其能量需求（乳酸盐，丙酮酸盐，酮体，支链氨基酸）。有越来越多的证据，其中一些基板的在患病心脏24,25的代谢重塑中发挥重要作用。这是完全可能的研究者对这些衬底添加到灌注缓冲液，以调节它们的浓度，以模仿更密切地不同的生理条件（ 例如进食状态与禁食状态下），或疾病状态，以及使用该跟随氧化它们的速率合适的放射性示踪剂26,27。甘油三酯的代谢也可以跟踪，在这情况下，建议事先避免使用肝素到心脏切除，因为这将引起从内皮脂蛋白脂肪酶的释放和来自缓冲器显著降低甘油三酯的提取28。随着放射性示踪剂的精心挑选，放射性VAR中掺入白条组织的代谢物也可灌注，以确定参数，如从头甘油三酯合成，糖原营业额，或蛋白质合成18,29,30的速率进行测量。换句话说，研究者可与多种底物/激素组合和浓度工作。所述缓冲组合物的选择将主要依赖于实验的目标。由于这些控制的缓冲区条件创造一个“简化的”生理模型，结果从体外工作心脏灌注实验，应该谨慎地解释，如果可能的数据应在体内进一步验证。
麻醉剂的选择
对大鼠前的心脏切除使用的麻醉剂应仔细选择基于对心肺功能和代谢的已知作用，以确保这不会干扰实验被执行编辑。这两种注射和吸入麻醉药迅速引起高血糖和不同程度的糖耐量异常，可能会灌注31,32中影响心脏代谢。相比其他代理商，在葡萄糖稳态巴比妥（戊巴比妥和thiobutabarbital）的短期影响相对可以忽略不计31。然而，心脏切除之前腹膜内戊巴比妥麻醉已显示减少心输出量，损害左心室功能，并增加在缺血再灌注33的体外协议心肌乳酸释放。建议戊巴比妥对大鼠离体心脏的负性肌力作用由药物34的组织堆积所致。相反使用吸入麻醉药，这是更迅速地从心脏组织冲出来的，是具有较好的收缩功能体外 33有关。麻醉药可能实际上提供CA通过涉及线粒体ATP敏感性钾通道的开放的机构缺血再灌注期间rdioprotection和增加的己糖激酶的结合线粒体32。总之，在分离的工作心脏灌注协议中使用的麻醉剂的类型是在可能直接影响了实验的结果的功能和代谢参数的评估一个显著变量。因此，类型和麻醉使用的剂量应始终报告的实验方法部分，并且这些参数不应该认为是为了进行比较实验之间改变。
在心脏灌注放射性同位素
与前一方案进行所有通量测量是在非再循环模式中执行，这意味着冠状动脉流出物被丢弃，而不是被返回到缓冲贮存器（ 图1）。调查员可宁选择使用灌注装置在再循环模式中，其中具有需要缓冲，因此放射性来操作的一个更小的体积的优点。然而，冠状动脉流出物的再循环损害了灌注缓冲液的稳定状态的组合物通过从心脏的代谢活性始发副产品的回收（包括乳酸盐，而且3 H 2 O和H 14 CO3-），它的确定变得复杂代谢通量甚至可能改变心脏功能随时间35。这些问题被防止在非再循环模式。由于放射性的量，并在一个单一实验中使用的大体积灌注缓冲液中，使用工作大鼠心脏时在代谢通量分析研究者应特别小心。当使用用于第一次灌注装置中，建议使用非放射性缓冲器执行多个模拟实验来熟悉不同步骤的协议的，并与安全程序。心脏的上套管的安装是一个特别敏感的一步，因为它需要建立与设备，并因为缓冲区来一次亲密接触可能会泄漏或心脏的切断血管的一个拍出来。由Taegtmeyer和同事11所描述的灌注装置具有包括的Langendorff水库，它是从灌注装置的其余部分完全独立的优点，因此可以填充有非放射性KH缓冲，以防止心脏的插管过程中放射性物质的泄漏。无论所使用的系统的，实验应该限制访问的专用区域来执行。房间应包括水槽和超纯水的供应，在同一地区执行的缓冲准备和被污染的设备清洗。调查人员应与机构的辐射安全办公室密切合作，建立小号pecific遏制，控制和净化程序。
灌注设备清洗
灌注设备的试验后的清洗是关键的一步就是常常被人们忽视，如果不认真执行，负责大部分的不良有关实验的重复性问题。营养丰富的灌注缓冲液和灌注系统的高温提供了细菌和真菌的生长提供了理想的条件。蛋白质的利用（胰岛素，BSA）和脂肪酸在灌注缓冲液添加到清洁过程复杂的另一度，因为这些化合物会粘到管道和玻璃器皿的表面上，使得它们难以冲洗装置的出来。使用放射性同位素的也将施加额外的约束，例如，在实验室中建立一个专用容纳区域为被污染的设备和处理固体一个的操纵ð液体放射性废物。因此，在适当的清洗步骤将主要依赖于灌注缓冲液的两个组合物和所使用的灌注装置的类型。如果使用商业设备，检查制造商的网站或联系客服获取有关如何在不损害任何设备的部件进行清洁的信息。在一般情况下，所有玻璃器皿和塑料部件可以具有广泛的肥皂洗涤。酶活性供电洗涤剂是特别有用的以除去脂肪酸BSA的残基。大多数污染物也将运行的0.1M HCl或0.1M的HNO 3通过该装置进行数小时除去。我们通过用0.1M的HCl第一冲洗系统，然后用新鲜的1％（重量：v）的获得满意的清洁结果在温水中制备的酶 - 活性动力洗涤剂溶液，最后通过用超纯水漂洗该系统。当使用定制灌注设备作为一个与原始ð由Taegtmeyer和同事11旁切，这可能是更容易和更有效地在每个实验日结束完全拆除装置。玻璃器皿由15分钟浸渍清洗成铬酸和硫酸混合物的浓缩浴。塑料件和PVC管可以用无残留的洗涤剂进行清洗。我们发现它实际上是更快和更可靠，以每天完全替代PVC管，因为它限制了通过放射性化学污染物质的操纵和因为它可以防止留下清洁剂后面的残基。在完成灌注实验后立即1-清洁灌注装置和所有脏设备：在任何情况下，调查应适用以下规则。等待只会使清洁更加困难和耗费时间。 2 - 定期检查冷却水套的循环浴污染。一水空调的使用将增加C之间的间隔倚水浴。 3清洗后，彻底清洗所有玻璃容器和管道用自来水几次，完成与超纯水冲洗，从清洗剂除去残渣。当解剖小心地执行，精心准备的灌注缓冲液有可能（通过细菌或通过溶剂残基），以指示该设备的污染4-两个心脏制剂连续失败。如果发生这种情况，在洗涤和漂洗程序应完全重复。
按比例缩小到小鼠心脏
尽管前面的协议着重于在一个孤立的工作大鼠心脏代谢率的测定，同样的程序可以应用于小鼠心脏用几个修改到灌注设备与数据采集设备36。由于其较小的尺寸分离工作小鼠心脏在技术上更具挑战性，但由于其显著较低的流速它具有需要灌注缓冲液中低得多的体积的优点。大量的转基因小鼠模型中已经可用的也使得分离的工作小鼠心脏非常有吸引力的，研究对心脏的代谢和功能重构单个基因产物的功能。然而，最近在基因组中的编辑和快速增长的转基因和基因敲除鼠的目录中的技术进步迅速关闭两个啮齿动物物种之间的差距。此外，老鼠一直被称赞为卓越的动物模型来研究心血管疾病，因为它的病理生理过程密切模仿人类的条件37。基于这些原因，我们认为大鼠离心脏仍然持有心血管疾病研究的新时代的重要场所。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 ml HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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