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Biology

पृथक कार्य चूहे दिल में ग्लूकोज और फैटी एसिड ऑक्सीकरण की दरों का निर्धारण करने के लिए तरीके

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

Abstract

स्तनधारी दिल एटीपी के एक प्रमुख उपभोक्ता है और संकुचन के लिए ऊर्जा substrates की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता है। आश्चर्य नहीं कि दौरे चयापचय के परिवर्तन सिकुड़ा रोग और दिल की विफलता के विकास से जोड़ा गया है। इसलिए, चयापचय और संकुचन के बीच की कड़ी को उजागर रोग राज्यों में हृदय अनुकूलन या maladaptation गवर्निंग तंत्र में से कुछ पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। पृथक काम कर चूहे दिल तैयारी का पालन करने के लिए, एक साथ और वास्तविक समय, हृदय सिकुड़ा समारोह और ऊर्जा ऑक्सीडेटिव चयापचय मार्ग में substrates उपलब्ध कराने के प्रवाह में इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल ग्लूकोज और फैटी एसिड होता है, मुख्य ऊर्जा दिल की substrates प्रदान करने के लिए ऑक्सीकरण की दरों की मात्रात्मक माप के लिए तैयार करने और buffers के उपयोग में इस्तेमाल किया तरीकों की एक विस्तृत वर्णन प्रदान करना है। नमूना विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के लिए इस्तेमाल किया तरीकों पर भी चर्चा कर रहे हैं।संक्षेप में, तकनीक normothermic crystalloid छिड़काव के माध्यम से 14 की आपूर्ति सी radiolabeled ग्लूकोज और एक पूर्व vivo दिल की धड़कन के लिए एक 3 एच radiolabeled लंबी श्रृंखला फैटी एसिड पर आधारित है। 14 सीओ 2 और 3 एच 2 हे, अंत उपोत्पाद एंजाइमी इन ऊर्जा प्रदान substrates के उपयोग में शामिल प्रतिक्रियाओं, तो मात्रात्मक कोरोनरी प्रवाह से बरामद कर रहे हैं। radiolabeled इस्तेमाल किया substrates की विशिष्ट गतिविधि के ज्ञान के साथ, यह व्यक्तिगत रूप से ऑक्सीकरण रास्ते में ग्लूकोज और फैटी एसिड का प्रवाह quantitate करने के लिए तो संभव है। पृथक दिल की सिकुड़ा समारोह उचित रिकॉर्डिंग उपकरण के साथ समानांतर में निर्धारित किया जा सकता है और सीधे चयापचय प्रवाह मूल्यों के लिए सहसंबद्ध। तकनीक ऐसी पूर्व में और लोड और ischemia, एक दवा या एक circula के बाद परिवर्तन के रूप में विभिन्न तनाव की स्थिति के जवाब में चयापचय / संकुचन संबंधों का अध्ययन करने के लिए बेहद उपयोगी हैटिंग कारक है, या एक जीन उत्पाद की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के बाद।

Introduction

नैदानिक ​​प्रासंगिकता

स्तनधारी दिल में, वहाँ ऑक्सीडेटिव चयापचय मार्ग, एटीपी पीढ़ी और हृदय का काम 1 के माध्यम से substrates के प्रवाह के बीच एक मजबूत सकारात्मक संबंध है। पिछले दो दशकों में, हृदय चयापचय और समारोह के बीच जटिल लिंक की जांच समझते हैं कि हृदय चयापचय में परिवर्तन सिकुड़ा रोग और हृदय रोग 2-4 की विभिन्न प्रकार की स्थापना में संभवतः रोग संरचनात्मक remodeling के लिए एक कारण हैं प्रेरित किया है। इसलिए, यह उम्मीद है कि जोर दिया दिल के चयापचय remodeling गवर्निंग तंत्र के बारे में हमारी समझ की रोकथाम या दिल की विफलता 5-7 के उपचार के लिए चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व करेंगे। पर "कार्डिएक चयापचय का आकलन" अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक वैज्ञानिक के बयान की हाल ही में प्रकाशन टी के लिए वैज्ञानिक समुदाय की बढ़ती रुचि पर जोर दियाअनुसंधान 8 के अपने क्षेत्र। लेकिन जब हृदय इमेजिंग में तकनीकी विकास अब हृदय आकृति विज्ञान और समारोह की एक तेजी से और सही मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, हृदय की चयापचय के vivo अध्ययन सीमित और भारी रहता है: परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग कर सकते हैं हृदय उच्च ऊर्जा फॉस्फेट चयापचय और क्रेब्स चक्र गतिविधि का पालन करने के लिए स्थिर राज्य की स्थिति में oxidative चयापचय के लिए विभिन्न substrates का योगदान 9 इस तिथि पूर्व vivo .To निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन तकनीकों उच्च परिचालन लागत और उनकी अक्षमता से ग्रस्त हैं दिल तैयारी काम कर एकमात्र और अद्वितीय तकनीक का अध्ययन करने के लिए एक साथ और वास्तविक समय, सिकुड़ा समारोह और substrates के प्रवाह ऑक्सीडेटिव चयापचय मार्ग 7.9 में उपलब्ध प्रतिनिधित्व करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल चूहा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है तैयारी और अभिकर्मकों के उपयोग में दिशा निर्देश प्रदान करना हैअलग काम कर रहे चूहे दिल में substrates के उपयोग की es।

पृथक कार्य कृंतक हार्ट उपकरण

हालांकि तकनीक लगभग आधी सदी पुराना है, अलग से काम कर चूहे दिल तैयारी हृदय अनुसंधान के लिए पसंद की एक विधि बनी हुई है। Langendorff दिल तैयारी के साथ के रूप में, काम कर रहे कृंतक दिल स्वतंत्र रूप से अन्य अंगों, न्यूरोहोर्मोनल और अन्य घूम कारकों के confounding प्रभाव से हृदय मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल, विश्वसनीय, और सस्ता तरीका प्रदान करता है। लेकिन Langendorff-भरकर रखा दिल के विपरीत, काम दिल के पास शारीरिक हृदय का काम है, का स्तर है कि इन विवो की स्थिति के लिए प्रासंगिक हैं ऑक्सीडेटिव चयापचय प्रवाह की पीढ़ी के लिए एक शर्त प्रदर्शन जारी है। इस बाएं आलिंद से जुड़ा एक प्रवेशनी के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) के छिड़काव बफर देने से हासिल की है, और एल.वी. भरता है और अनुबंध के रूप में,बफर एक निर्धारित afterload हीड्रास्टाटिक दबाव के खिलाफ महाधमनी लाइन के माध्यम से अलग हो जाता है। छिड़काव उपकरण मूल रूप से नीली और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित 10 बाद में Taegtmeyer, hems और क्रेब्स 11 से सुधार हुआ है, लेकिन डिजाइन के बाद से कभी भी बहुत थोड़ा बदल गया है। मूल तंत्र में वर्णित है, सिकुड़ा समारोह कार्डियक आउटपुट का दृढ़ संकल्प के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है, महाधमनी को मापने के लिए कोई और अधिक से अधिक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर और एक स्टॉपवॉच का प्रयोग और कोरोनरी बहती 10,11। कई विक्रेताओं अब पूरा काम कृंतक दिल छिड़काव सिस्टम प्रदान करते हैं। इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तंत्र flowprobes, दबाव transducers, एक दबाव मात्रा कैथेटर और सभी उपकरण हृदय कार्यात्मक डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए आवश्यक के साथ प्राप्त किया जा सकता है। विक्रेताओं अपने उपकरणों के साथ नए उपयोगकर्ता परिचित करने के लिए व्यापक प्रलेखन और प्रशिक्षण सत्र प्रदान करते हैं। इसके अलावा कई समीक्षा लेख काम कर दिल instrum पर विस्तार प्रोटोकॉलप्रलेखन और कैथेटर के उपयोग पर मूषक 12-15 में हृदय समारोह को मापने के लिए। इस कारण से, हम केवल संक्षिप्त छिड़काव उपकरण और रिकॉर्डिंग उपकरण का सेट-अप का उल्लेख होगा। वर्तमान प्रोटोकॉल बजाय तरीकों कि एक साथ ग्लूकोज और लंबी श्रृंखला फैटी एसिड ऑक्सीकरण की दर, सामान्य दिल में दो प्रमुख ऊर्जा प्रदान substrates को मापने के लिए लागू किया जा सकता का वर्णन के साथ पहले से ही उपलब्ध जानकारी के पूरक करने के लिए करना है। हम यहाँ सब दौरे ऑक्सीडेटिव चयापचय के आकलन के लिए radiolabeled ऊर्जा substrates के उपयोग में शामिल कदम का वर्णन है, अभिकर्मकों और वसूली और नमूने के प्रसंस्करण के लिए buffers की तैयारी से, डेटा विश्लेषण करने के लिए।

विधि के सिद्धांतों

Cardiomyocytes फैटी एसिड (मुख्यतः लंबी श्रृंखला फैटी एसिड) और कार्बोहाइड्रेट की आक्सीकारक फास्फारिलीकरण से संकुचन के लिए अपनी ऊर्जा के थोक glucos उत्पन्न (ई और लैक्टेट)। दिल बहुत ऊर्जावान भंडार सीमित है और प्रचलन से इन ऊर्जा प्रदान substrates की निरंतर आपूर्ति पर निर्भर हो गया है। glycolytic मार्ग के माध्यम से ग्लूकोज की अपचय पाइरूवेट जो तब भीतरी mitochondrial झिल्ली के पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज जटिल द्वारा decarboxylated है अर्जित करता है। लंबी श्रृंखला फैटी एसिड होता है, एल्बुमिन या लिपोप्रोटीन ट्राइग्लिसराइड्स घूम से निकाला, पहले cytosol में एसाइल सीओए अणुओं में सक्रिय कर रहे हैं और बाद में carnitine शटल के माध्यम से mitochondrial मैट्रिक्स के अंदर ले जाया बीटा-ऑक्सीकरण मार्ग में प्रवेश करने के लिए। ग्लूकोज और फैटी एसिड का अपचय द्वारा उत्पादित एसिटाइल सीओए अणुओं क्रेब्स चक्र को कम करने समकक्ष (NADH और FADH 2) जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के द्वारा किया जाता भीतरी mitochondrial झिल्ली भर प्रोटॉन मकसद बल के निर्माण के लिए उत्पन्न करने के लिए ईंधन और एटीपी synthase की गतिविधि के माध्यम से एटीपी उत्पन्न करते हैं। पानी और कार्बन डाइऑक्साइड के अंत byproducts हैंएंजाइमी क्रेब्स चक्र के अंदर जगह ले रही प्रतिक्रियाओं। 14 सी और 3 एच radiolabeled substrates की आपूर्ति पृथक काम कर दिल को (जैसे 14 सी-radiolabeled ग्लूकोज और 3 एच radiolabeled ओलिक एसिड के रूप में) फलस्वरूप 14 सीओ 2 और 3 एच 2 ओ के उत्पादन को बढ़ावा मिलेगा जो कर सकते हैं मात्रात्मक कोरोनरी प्रवाह से बरामद किया। 14 सीओ 2 का संग्रह एक सील कक्ष में पृथक perfused दिल रख कर और तुरंत कोरोनरी प्रवाह उबरने के रूप में यह दिल से बाहर निकालता द्वारा किया जाता है। एक छोटा सा आयनों विनिमय स्तंभ को अलग और कोरोनरी प्रवाह से 3 एच 2 ओ ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रसंस्कृत नमूनों से रेडियोधर्मिता एक तरल जगमगाहट काउंटर के साथ मापा जाता है, और इस्तेमाल radiolabeled substrates के विशिष्ट गतिविधि के ज्ञान के साथ, यह व्यक्तिगत रूप में ग्लूकोज और फैटी एसिड का प्रवाह quantitate करने के लिए तो संभव हैऑक्सीकरण 16,17 रास्ते।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं पर मानव की देखभाल और पशु का उपयोग एनआईएच सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के अनुसार प्रदर्शन किया गया और मिसिसिपी विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। radioisotopes के उपयोग से जुड़े सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और दिशा निर्देशों मिसिसिपी विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर के विकिरण सुरक्षा कार्यालय द्वारा निर्धारित के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. स्टॉक बफर समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. क्रेब्स-Henseleit (एच) बफर स्टॉक समाधान
    1. एक 20x केंद्रित नमक शेयर युक्त समाधान (मोल / एल में) के 2 एल 2.37 NaCl, 0.0948 KCl, 0.0236 के.एच. 2 4 पीओ, और 0.0236 MgSO 4 * 7H 2 ओ को तैयार अप करने के लिए 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर एक 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार निस्पंदन यूनिट और दुकान पर फ़िल्टर।
    2. 3 NaHCO की एक 20x केंद्रित (0.5 मोल / एल) समाधान के 2 एल तैयार करें। समाधान हो सकता हैसमय की एक अनिश्चित अवधि के लिए कमरे के तापमान पर रखा।
    3. 2 CaCl के एक 1 मोल / एल शेयर समाधान की 250 मिलीलीटर की तैयारी। अप करने के लिए 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर एक 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार निस्पंदन यूनिट और दुकान पर फ़िल्टर।
  2. क्लोराइड फार्म से हाइड्रॉक्साइड फार्म को आयनों विनिमय राल का रूपांतरण
    1. 1 एल ultrapure पानी में resuspending द्वारा आयनों विनिमय राल धो लें। राल बसने और अतिरिक्त पानी टपकना करने की अनुमति दें। इस चरण 4 बार दोहराएँ।
    2. एक गिलास microanalysis वैक्यूम फिल्टर एक छानने कुप्पी पर घुड़सवार धारक में राल डालो।
    3. धीरे धीरे 1 एन NaOH के 22 संस्करणों के माध्यम से गुजर द्वारा हाइड्रॉक्साइड फार्म के लिए राल कन्वर्ट। एक स्टेनलेस स्टील के रंग के साथ रहकर घोल मिलाएं।
    4. ultrapure पानी के साथ राल धो जब तक पीएच 9.0 से नीचे गिर जाता है। राल घोल की सतह के पास एक पीएच परीक्षण पट्टी सूई से नियमित रूप से पीएच की जाँच करें। कवर और एक बो में ultrapure पानी के साथ राल स्टोरrosilicate कांच की बोतल और प्रकाश से बचाने के लिए। राल उपयोग करने से पहले सूखे के लिए अनुमति न दें।
      नोट: जब ठीक से संग्रहीत, राल कम से कम 3 महीने तक चलेगा।
  3. ओलिक एसिड एल्बुमिन 8x केंद्रित स्टॉक समाधान
    1. एक 4 एल Erlenmeyer फ्लास्क में, 20x केंद्रित नमक शेयर समाधान की 200 मिलीलीटर और 3.6 एल ultrapure पानी के साथ 20x केंद्रित 3 NaHCO समाधान के 200 मिलीलीटर मिश्रण।
    2. एक fritted सिलेंडर के साथ एक गैस फैलाव ट्यूब का उपयोग, कार्बन डाइऑक्साइड 5% और ऑक्सीजन पीएच स्थिर करने के लिए 95% का एक मिश्रण के साथ 15 मिनट के लिए समाधान गैस।
    3. डालो 470 मिलीलीटर एक 1 एल कांच बीकर में बफर। 3530 मिलीलीटर 4 एल Erlenmeyer फ्लास्क में शेष बफर करने के लिए 1 मोल / एल 2 CaCl स्टॉक समाधान के 8.75 मिलीग्राम और सेट अलग जोड़ें।
    4. फैटी एसिड मुक्त बीएसए की 40 ग्राम 1 एल कांच बीकर में जोड़ें और हलचल पट्टी के साथ हलचल जब तक भंग कर दिया।
    5. (: V v) ultrapure पानी में इथेनॉल समाधान के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, एक 50% के 4 मिलीलीटर तैयार करते हैं। 487 मिलीग्राम sodiu जोड़ेएम oleate और भंवर पाउडर जब तक पूरी तरह से भंग कर रहा है।
      नोट: कुछ जांचकर्ताओं छिड़काव बफर में पामिटिक के बजाय एसिड ओलिक एसिड का उपयोग करें। एक पामिटिक एसिड एल्बुमिन शेयर समाधान एक ही प्रक्रिया के बाद तैयार किया जा सकता है। हालांकि, यह 70 डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्म करने के लिए सोडियम palmitate की पूरी solubilization प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है।
    6. लगातार सरगर्मी के तहत फैटी एसिड मुक्त बीएसए समाधान के लिए oleate समाधान dropwise जोड़ें और ओलिक एसिड बीएसए जटिल फार्म के लिए 10 से अधिक मिनट तक प्रतीक्षा करें।
      ध्यान दें: समाधान के लिए एक हल्के पीले रंग का है और दिखाई कणों से रहित होना चाहिए। एक वेग या अघुलनशील कणों की उपस्थिति बीएसए को फैटी एसिड की अधूरी विकार का संकेत हो सकता। यदि ऐसा होता है, समाधान खारिज किया जाना चाहिए और इस प्रक्रिया को फिर से शुरू कर दिया।
      नोट: यदि यह एक पिपेट में बैठने की अनुमति दी जाती है और dropwise नहीं जोड़ा जा सकता Palmitate वेग होगा। बीएसए की उभारा समाधान 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जा सकता है bindin की सुविधा के लिएपामिटिक एसिड की जी। इस रूप में ज़रूरत से ज़्यादा गरम विकृतीकरण और बीएसए के एकत्रीकरण का कारण हो सकता मत करो।
      चेतावनी: इस प्रोटोकॉल के अगले कदम रेडियोधर्मी सामग्री के हेरफेर शामिल है। उचित पीपीई पहनते हैं और सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान के नियमों संस्था के विकिरण सुरक्षा कार्यालय द्वारा निर्धारित पालन करें।
    7. ओलिक एसिड बीएसए की सरगर्मी समाधान के लिए 160 μl (0.8 एमसीआई) [9,10- 3 एच] ओलिक एसिड जोड़ें और एक और 10 मिनट के लिए हलचल।
    8. ओलिक एसिड बीएसए की सरगर्मी समाधान के लिए 1 मोल / एल 2 CaCl शेयर समाधान के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. लगभग 1.2 मीटर डायलिसिस झिल्ली ट्यूबिंग कट और दोनों के अंदर और नल के पानी से बाहर कुल्ला। पानी के नल के तहत सख्ती डायलिसिस ट्यूबिंग रगडें 10 से 15 मिनट की झिल्ली ग्लिसरॉल कोटिंग को दूर करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, उपयोग करने से पहले 1 घंटे के लिए गर्म पानी में डायलिसिस ट्यूबिंग भिगोने से कोटिंग को हटा दें। ultrapure wate के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग rinsing द्वारा समाप्तआर।
    10. सुरक्षित रूप से डायलिसिस ट्यूबिंग के एक छोर बंद टाई। ओलिक एसिड बीएसए समाधान के साथ भरें और डायलिसिस टयूबिंग के दूसरे छोर बंद टाई।
    11. के.एच. बफर के 4 एल Erlenmeyer कुप्पी में भरा डायलिसिस ट्यूबिंग प्लेस और एक हलचल पट्टी के साथ कोमल सरगर्मी के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर dialyzing अनुमति देते हैं।
    12. अगले दिन, डायलिसिस टयूबिंग से 8x केंद्रित ओलिक एसिड बीएसए समाधान निकालने। -20 डिग्री सेल्सियस पर छिड़काव या विभाज्य और दुकान के लिए तुरंत ओलिक एसिड बीएसए समाधान का प्रयोग करें। जमे हुए aliquots में कम से कम 2 महीने के लिए स्थिर रहे हैं। कई फ्रीज पिघलना चक्र से बचें क्योंकि इस ओलिक एसिड बीएसए परिसर के घुलनशीलता समझौता हो सकता है।
      नोट: उपयोग केवल ultrapure पानी (25 डिग्री सेल्सियस पर 18.2 MΩ.cm की प्रतिरोधकता, कुल जैविक कार्बन <10 पीपीबी, सूक्ष्म जीवों ≤ 1 CFU / एमएल, 0.22 माइक्रोन ≤1 / एमएल से अधिक आकार के साथ विविक्त) अभिकर्मकों और buffers तैयार करने के लिए दिल छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया। के लिए अपने क्लोराइड से आयनों विनिमय राल का रूपांतरणहाइड्रॉक्साइड फार्म के लिए मीटर एक अतिरिक्त कीमत पर हाइड्रॉक्साइड फार्म की सीधी खरीद से बचा जा सकता है (देखें सामग्री तालिका)। oleate या palmitate इसके अलावा, प्राकृतिक रूप से उत्पन्न फैटी एसिड के किसी भी अन्य प्रकार का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, फैटी एसिड की एक tritiated संस्करण इसकी ऑक्सीकरण का पालन करने के लिए उपलब्ध है, के रूप में लंबे समय के रूप में।

2. छिड़काव बफर की तैयारी

  1. एक 4 एल Erlenmeyer फ्लास्क में, 20x केंद्रित नमक शेयर समाधान की 200 मिलीलीटर और 3.6 एल ultrapure पानी के साथ 20x केंद्रित 3 NaHCO समाधान के 200 मिलीलीटर मिश्रण। कार्बन डाइऑक्साइड 5% और 95% ऑक्सीजन का मिश्रण के साथ 15 मिनट के लिए समाधान गैस, और फिर 2.5 mmol / एल पर मुफ्त सीए 2 की एकाग्रता स्थापित करने के लिए 1 मोल / एल 2 CaCl शेयर समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    चेतावनी: निम्नलिखित कदम रेडियोधर्मी सामग्री के हेरफेर शामिल है। उचित पीपीई पहनें और संस्था के रा द्वारा निर्धारित सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान के नियमों का पालन करेंdiation सुरक्षा कार्यालय।
  2. एक 2 एल borosilicate ग्लास बोतल के लिए 1.750 एल के.एच. बफर स्थानांतरण। 8x के 250 मिलीलीटर केंद्रित ओलिक एसिड बीएसए समाधान, 1.802 जी डी ग्लूकोज, 0.4 यू / एमएल 400 μl इंसुलिन, और 200 μl (0.2 एमसीआई) [यू 14 सी] ग्लूकोज जोड़ें। मिश्रण करने के लिए बोतल पलटना। इस ओलिक एसिड (0.4 mmol / एल), डी ग्लूकोज (5 mmol / एल), और इंसुलिन (40 μU / एमएल) युक्त पूरा छिड़काव बफर के 2 एल दे देंगे।
    नोट: 2 एल के एक मात्रा कम से कम 60 मिनट के लिए गैर-recirculating की स्थिति में काम कर रहे एक वयस्क चूहे दिल छिड़कना करने के लिए पर्याप्त है।
  3. दो विच्छेदन बर्तन भरने के लिए गैर रेडियोधर्मी के.एच. बफर के कुछ का उपयोग करें और ठंडा करने के लिए बर्फ पर जगह है।

3. छिड़काव उपकरण की तैयारी

नोट: इस तरह के अन्वेषक Taegtmeyer, hems और क्रेब्स 11, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों में से एक द्वारा वर्णित एक के रूप में एक कस्टम निर्मित छिड़काव उपकरण का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं। छिड़काव प्रणाली आम तौर से बना रहे हैंनीचे चित्र 1 में वर्णित तत्वों। ट्यूबिंग और कांच के बने पदार्थ इसके अलावा, रिकॉर्डिंग उपकरण के बाकी वैकल्पिक है और इसके उपयोग प्रयोगात्मक सवाल को संबोधित करने के अन्वेषक की जरूरतों पर निर्भर करेगा पूछा जा रहा है। बहरहाल, हम बफर में प्रवेश करने में हे 2 एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए ऑक्सीजन microelectrodes के इस्तेमाल की सिफारिश और कोरोनरी परिसंचरण (चित्रा 1) निकल। इस अन्वेषक नियंत्रण है कि दिल में ऑक्सीजन का एक उचित मात्रा के साथ आपूर्ति की है में मदद मिलेगी, और ऑक्सीजन की आपूर्ति के प्रयोगों के बीच भिन्न नहीं है। इसके अलावा, "धमनी" ऑक्सीजन अंतर के निर्धारण के दौरे ऑक्सीजन की खपत और हृदय दक्षता 16,18 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. घूम पानी स्नान पर मुड़ें और छिड़काव उपकरण गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया है।
  2. कंप्यूटर और डाटा अधिग्रहण प्रणाली है कि चालूहृदय समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. डाटा अधिग्रहण प्रणाली के लिए रिकॉर्डिंग डिवाइस (दबाव कैथेटर, दबाव मात्रा कैथेटर, ऑक्सीजन microelectrodes, flowmeters, आदि) कनेक्ट और निर्माता के निर्देशों का पालन उपकरणों के अंशांकन प्रदर्शन करते हैं।
  4. ultrapure पानी के साथ बफर जलाशय भरें। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी और सभी ट्यूबिंग के माध्यम से पानी को बाहर निकलवाने और सिस्टम कुल्ला करने के लिए कांच के बने पदार्थ। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद करें और सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग और / या इस रूप में कांच के बने पदार्थ में पानी नहीं रहता छिड़काव बफर और दिल की तैयारी की एकाग्रता को प्रभावित कर सकते हैं।
  5. व्यवस्था करने के लिए एक नया 1.0 माइक्रोन ग्लास फाइबर फिल्टर कनेक्ट करें। गैस oxygenating चैम्बर के लिए कार्बन डाइऑक्साइड 5% और 95% ऑक्सीजन का एक मिश्रण युक्त टैंक कनेक्ट करें।
    चेतावनी: निम्नलिखित कदम रेडियोधर्मी सामग्री के हेरफेर शामिल है। उचित पीपीई पहनें और संस्था द्वारा निर्धारित सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान के नियमों का पालन करेंके विकिरण सुरक्षा कार्यालय।
  6. छिड़काव बफर के साथ बफर जलाशय भरें। पंप पर बारी और सभी ट्यूबिंग और छिड़काव बफर के साथ कांच के बने पदार्थ के भरने किया जाता है। कम से कम 30 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले recirculating मोड में छिड़काव उपकरण और आक्सीजन के माध्यम से छिड़काव बफर चलाएँ।
  7. कसकर कोरोनरी प्रवाह ठीक करने के लिए दिल के चैम्बर के नीचे एक 20 मिलीलीटर सिरिंज की ट्यूब देते हैं। एक तीन तरह पानी निकलने की टोंटी के शीर्ष करने के लिए सिरिंज की नोक कनेक्ट करें। एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के लिए तरफ हाथ कनेक्ट करें। तरल रेडियोधर्मी कचरे के लिए एक कंटेनर के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से नीचे वाला हाथ कनेक्ट करें।
    नोट: फैटी एसिड बीएसए जटिल का उपयोग करते हैं, छिड़काव बफर के oxygenation एक गैस फैलाव ट्यूब के साथ प्रत्यक्ष बुदबुदाती के माध्यम से बाहर नहीं किया जा सकता क्योंकि इस समाधान के अत्यधिक झाग का कारण होगा। एक झिल्ली oxygenator (चित्रा 1) या उस उद्देश्य के लिए एक चादर प्रवाह oxygenating चैम्बर का प्रयोग करें। यह अत्यधिक है कि एक उचित स्तर ओ सत्यापित करने के लिए सिफारिश की हैएफ ऑक्सीजन छिड़काव सर्किट (चित्रा 1) में एक ऑक्सीजन microelectrode रखकर पहुँच जाता है।

4. चूहे दिल अलगाव और नलिका

  1. पैमाने पर चूहा वजन।
  2. 150 मिलीग्राम की खुराक संवेदनाहारी के साथ एक सिरिंज तैयार / किलो thiobutabarbital सोडियम नमक हाइड्रेट और 200 खासियत इकाइयों हेपरिन के साथ एक ट्यूबरकुलीन सिरिंज।
  3. thiobutabarbital आईपी इंजेक्षन और जानवर के लिए इंतजार चेतना खो देते हैं। अन्य प्रेरण एजेंट के रूप में लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता के रूप में इस प्रयोग के उद्देश्य के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा (चर्चा अनुभाग नीचे में संवेदनाहारी के विकल्प देखें)।
  4. पैर के अंगूठे चुटकी पलटा की कमी की पुष्टि के द्वारा संज्ञाहरण के उचित स्तर के लिए जाँच करें। संज्ञाहरण के उचित गहराई बनाए रखने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि पशु प्रक्रिया के दौरान दर्द महसूस नहीं करता है सुनिश्चित करें।
  5. एक बार चूहा पूरी तरह से बेहोश है और पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं है, ऑपरेटिंग टेबल और सेकंड पर अपनी पीठ पर जगहटेप या पिन के साथ Ure अंग।
  6. बालों के पेट नि: शुल्क क्लिप और पेट की एक midline चीरा प्रदर्शन करते हैं। अभी तक इस बिंदु पर छाती गुहा मत खोलना। पेट ले जाएँ और अवर रग Cava प्रकट करने के लिए एक तरफ आंत। हेपरिन अवर रग Cava में सीधे इंजेक्षन और आगे बढ़ने से पहले 5 से 10 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. का प्रयोग कैंची छाती गुहा की सामग्री को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम और रिब पिंजरे के पक्ष में कटौती।
  8. नाजुक अंगूठे, सूचकांक और मध्यम उंगलियों और आबकारी दोनों के दिल और फेफड़ों के बीच दिल एक साथ ले लो। उतरते महाधमनी के स्तर में कटौती, महाधमनी चाप और इस प्रक्रिया में आरोही महाधमनी नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है। इसके तत्काल बाद विच्छेदन ठंडा के.एच. बफर के साथ भरा व्यंजनों में से एक के लिए दिल और फेफड़ों के हस्तांतरण।
  9. दिल की धड़कन बंद हो जाता है के बाद, दूसरे विच्छेदन डिश में स्थानांतरित और जब दिल ठंडा के.एच. बफर में डूबे रखने जुड़ी फेफड़े के ऊतकों के किसी भी बड़े टुकड़े बंद ट्रिम। उतर कटसही महाधमनी चाप ऊपर महाधमनी हैैं।
    चेतावनी: निम्नलिखित कदम रेडियोधर्मी सामग्री के हेरफेर शामिल है। उचित पीपीई पहनते हैं और सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान के नियमों संस्था के विकिरण सुरक्षा कार्यालय द्वारा निर्धारित पालन करें।
  10. छिड़काव उपकरण की महाधमनी लाइन फ्लश गर्म बफर के साथ महाधमनी प्रवेशनी को भरने के लिए और किसी भी पानी या हवा है कि अभी भी ट्यूबिंग में मौजूद हो सकता है समाप्त करने के लिए। छिड़काव बफर समय दिल प्रवेशनी से जुड़ा हुआ है पर हवा एम्बोली की संभावना को कम करने के लिए महाधमनी प्रवेशनी से ड्रिप के लिए अनुमति दें।
  11. दो सूक्ष्म विदारक संदंश का प्रयोग सावधानी से महाधमनी खोलने के लिए और महाधमनी प्रवेशनी पर दिल स्लाइड। एक माइक्रो क्लिप के साथ प्रवेशनी पर महाधमनी सुरक्षित और दिल की Langendorff छिड़काव आरंभ करें। निरीक्षण दिल फिर से पिटाई शुरू और सभी रक्त छिड़काव की शुरुआत के बाद सेकंड में कोरोनरी वाहिका में शेष निष्कासित।
    नोट: यह कदम 4 प्रदर्शन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।4.10 दिल के लिए अपरिवर्तनीय इस्कीमिक क्षति को रोकने के लिए संभव के रूप में उपवास के रूप में के माध्यम से 6। अनुभव के साथ, पूरी प्रक्रिया 1 और 2 के बीच मिनट लेना चाहिए। जब महाधमनी फिसलने प्रवेशनी पर, के रूप में इस दौरे hypoperfusion और महाधमनी वाल्व को नुकसान में परिणाम हो सकता है सावधान महाधमनी जड़ पारित करने के लिए नहीं हो।
  12. 3-0 रेशम सीवन के साथ महाधमनी प्रवेशनी महाधमनी टाई और सूक्ष्म क्लिप को हटा दें। फेफड़े के नस का पता लगा। यह गैर-हृदय के ऊतकों ट्रिम करने के लिए इसे खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन गैर-हृदय के ऊतकों के बहुत ज्यादा कटौती नहीं करते हैं, क्योंकि वे प्रवेशनी बाएं आलिंद टाई करने के लिए काम करेगा।
  13. छिड़काव उपकरण के बाएँ आलिंद लाइन फ्लश गर्म बफर के साथ आलिंद प्रवेशनी को भरने के लिए और किसी भी पानी या हवा है कि अभी भी ट्यूबिंग में मौजूद हो सकता है समाप्त करने के लिए। समय दिल प्रवेशनी से जुड़ा हुआ है पर हवा एम्बोली की संभावना को कम करने के लिए तंत्र से किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए विशेष रूप से सावधान रहें।
  14. दो सूक्ष्म विदारक forc का प्रयोगईपीएस नाजुक फेफड़े नस के उद्घाटन हड़पने के लिए और आलिंद प्रवेशनी पर दिल स्लाइड। यह धीरे आलिंद और / या महाधमनी प्रवेशनी इस कदम को पूरा करने के घूर्णन द्वारा दिल का स्थान बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है। किसी भी मामले में, यह सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया दिल पर अत्यधिक तनाव लागू नहीं करता है और महाधमनी के झुकने के कारण। 3-0 रेशम सीवन के साथ आलिंद प्रवेशनी बाएं आलिंद बाँधो।
  15. आलिंद लाइन खुला और एक साथ काम करने के लिए मोड Langendorff मोड से महाधमनी लाइन स्विच। बफर लीक बाएं आलिंद से बाहर, आलिंद लाइन बंद वापस स्विच Langendorff छिड़काव करने के लिए महाधमनी लाइन, और प्रवेशनी के लिए अधिक सुरक्षित रूप से बाएं आलिंद टाई करने के लिए एक और 3-0 रेशम सीवन का उपयोग करते हैं।

हृदय समारोह और नमूना संग्रह के 5. मापन

नोट: चयापचय अपशिष्टों के निर्धारण कोरोनरी प्रवाह (सीएफ) के ज्ञान की आवश्यकता होगी। नीचे के रूप में वर्णित है, कोरोनरी प्रवाह मूल्यों हो सकता हैएक स्टॉपवॉच का सरल उपयोग के साथ प्राप्त की। इसके अतिरिक्त, महाधमनी के प्रवाह की माप (वायुसेना) एक ही विधि के साथ हृदय उत्पादन (सीओ = सीएफ + वायुसेना) के निर्धारण, जो तब लागू करने से हृदय समारोह की एक सामान्य उपाय के रूप में हृदय की शक्ति (सीपी) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की अनुमति देगा सूत्र सी.पी. = सीओ (एम 3 / एस) * afterload (पा)। एक अन्य विधि हृदय समारोह के आकलन के लिए उपलब्ध एक दबाव transducer के साथ पल्स दबाव के वास्तविक समय माप (आंकड़े 3 और 4) पर निर्भर करता है। हालांकि वैकल्पिक, हृदय सिकुड़ा समारोह और hemodynamics, बाएं निलय सिस्टोलिक और डायस्टोलिक कार्यों के निर्धारण सहित का सबसे सटीक और विस्तृत माप, एक दबाव मात्रा (पीवी) प्रवाहकत्त्व कैथेटर के उपयोग के साथ हासिल किया जाएगा। इस खंड में संक्षेप में पृथक दिल की कैथीटेराइजेशन वर्णन करता है। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर हो सकता है के साथ PV कैथेटर की जांच और डेटा विश्लेषण के बारे में अतिरिक्त जानकारीसंदर्भों 14,15 में पाया।
चेतावनी: निम्नलिखित कदम रेडियोधर्मी सामग्री के हेरफेर शामिल है। उचित पीपीई पहनते हैं और सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान के नियमों संस्था के विकिरण सुरक्षा कार्यालय द्वारा निर्धारित पालन करें।

  1. प्रयोग एक कैथेटर के साथ एल.वी. समारोह का सीधा माप भी शामिल है, एक 26 जी सुई के साथ एल.वी. सर्वोच्च पंचर और पंचर के माध्यम से कैथेटर परिचय।
  2. एक दबाव मात्रा कैथेटर का उपयोग करते समय सावधानी से कैथेटर की स्थिति तो यह है कि अपने शाफ्ट सही महाधमनी वाल्व के नीचे बाहर का इलेक्ट्रोड और endocardial सीमा से सटे, और समीपस्थ इलेक्ट्रोड सिर्फ वेंट्रिकुलर दीवार के अंदर के साथ, एल.वी. अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ गठबंधन किया है।
  3. पानी तख्ताबंदीवाला दिल के चेंबर में दिल को सील करने और डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ हृदय कार्यात्मक मापदंडों की निगरानी। रिकॉर्डिंग शुरू होने के बाद आधारभूत हृदय मानकों को अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए स्थिर किया गया है।
  4. विदेश मंत्रालय द्वारा कोरोनरी प्रवाह निर्धारितसमय 20 मिलीलीटर सिरिंज दिल चैम्बर नीचे संलग्न ट्यूब भरने के लिए आवश्यक Suring। माप के बाद, रेडियोधर्मी तरल अपशिष्ट कंटेनर में कोरोनरी प्रवाह खाली करने के लिए तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी खोलते हैं।
    नोट: प्रवाह माप भी एक प्रवाहमापी और flowprobes का उपयोग किया जा सकता है।
  5. 3 मिलीग्राम ठीक करने के लिए ~ 2 मिलीलीटर कोरोनरी प्रवाह के रूप में यह दिल से बाहर निकालता तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी की तरफ हाथ से जुड़ी सिरिंज का प्रयोग करें। एक 2 मिलीलीटर capless microcentrifuge ट्यूब में कोरोनरी प्रवाह के 0.5 मिलीलीटर स्थानांतरण और तुरंत ग्लूकोज ऑक्सीकरण की दर (नीचे धारा 6) के दृढ़ संकल्प के साथ आगे बढ़ें।
  6. एक उचित लेबल microcentrifuge ट्यूब में कोरोनरी प्रवाह नमूना (~ 1.5 एमएल) के बाकी स्थानांतरण और बर्फ पर दुकान।
  7. दोहराएँ 5.4 छिड़काव प्रयोग के अंत तक नियमित अंतराल (जैसे हर 5 या 10 मिनट) पर 5.6 कदम।
  8. एक दबाव मात्रा कैथेटर का उपयोग करते हैं, अतितनावी खारा की एक 10 μl सांस इंजेक्षन (15%)आलिंद लाइन में और सही प्रयोग समापन से पहले आलिंद प्रवेशनी से पहले। समानांतर चालकता (वी पी) है, जो हृदय की मात्रा 15 का सही निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है की गणना करने के लिए इस सांस में इंजेक्शन का प्रयोग करें।
  9. दिल चैम्बर खोलना और अगर एक प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था एल.वी. से कैथेटर को हटा दें। दिल निम्न विकल्पों में से एक का उपयोग कर की वसूली:
    1. तो नीचे की ओर विश्लेषण के लिए दिल के विशिष्ट क्षेत्रों को अलग करने की कोई जरूरत नहीं है और यह छिड़काव उपकरण, बंद दोनों आलिंद और महाधमनी लाइनों की अनुमति देता है और तुरंत अगर अपनी cannulas Wollenberger चिमटे का उपयोग करने पर दिल फ्रीज दबाना तरल नाइट्रोजन में पूर्व ठंडा।
    2. वैकल्पिक रूप से, cannulas बंद दिल में कटौती और ठंडा के.एच. बफर में ड्रॉप। जल्दी से एक कागज तौलिया पर दिल से सूखे और उसके गीला वजन को मापने। दिल तो विच्छेदित किया जा सकता है और ऊतकों के नमूनों विशिष्ट माप के लिए एकत्र। Wollenberger टोंग का उपयोग कर शेष ऊतक फ्रीजतरल नाइट्रोजन में पूर्व ठंडा।
  10. सूखी वजन (अनुभाग देखें 8. गणना) के निर्धारण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हृदय के ऊतकों स्टोर।

6. Myocardial ग्लूकोज ऑक्सीकरण दरों का निर्धारण

नोट: विधि hyamine की हाइड्रॉक्साइड के एक फँसाने समाधान के साथ कोरोनरी प्रवाह से 14 सीओ 2 के मात्रात्मक वसूली में होते हैं। 14 सीओ 2 भंग के रूप में एच 14 CO3- perchloric एसिड के साथ बफर के अम्लीकरण के बाद बरामद किया है। नमूने हवा और नमूना के बीच गैस के निष्क्रिय प्रसार समय के साथ 14 सीओ 2 का नुकसान में परिणाम देगा के रूप में उनकी वसूली के बाद तुरंत कार्रवाई की जानी चाहिए। जगमगाहट शीशियों कसकर perchloric एसिड जोड़ने के बाद 14 सीओ 2 के नुकसान को रोकने के लिए रबर आस्तीन stoppers के साथ बंद किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो, parafilm करने के लिए रबर आस्तीन डाट सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताशीशियों (चित्रा 2)।

  1. कांच जगमगाहट शीशियों को hyamine के 10x केंद्रित हाइड्रॉक्साइड (नमूना प्रति एक शीशी + पृष्ठभूमि गतिविधि के निर्धारण के लिए दो अतिरिक्त शीशियों) के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    चेतावनी: hyamine की हाइड्रॉक्साइड बेहद जहरीला है और गंभीर रूप से जल का कारण बनता है। उचित हैंडलिंग और भंडारण के लिए उत्पाद एमएसडीएस से परामर्श करें।
  2. का प्रयोग चिमटी नाजुक करने hyamine की हाइड्रॉक्साइड के साथ एक शीशी पहले से भरे 2 मिलीलीटर capless microcentrifuge 0.5 मिलीलीटर कोरोनरी प्रवाह नमूना युक्त ट्यूब हस्तांतरण। पृष्ठभूमि गतिविधि के निर्धारण के लिए 0.5 मिलीलीटर छिड़काव बफर का प्रयोग करें।
  3. एक रबर आस्तीन डाट के साथ शीशी कैप। Parafilm शीशी की सील को सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रबर आस्तीन डाट के माध्यम से और सीधे 2 मिलीलीटर capless ट्यूब में: (डब्ल्यू% से 60% डब्ल्यू) 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 23 जी लंबी सुई का प्रयोग, perchloric एसिड के 200 μl इंजेक्षन।
    नोट: कोरोनरी प्रवाह बीएसए की वर्षा के कारण सफेद बारी चाहिए।
  4. चलो शीशियों रोंयह रातोरात।
    चेतावनी: perchloric एसिड, उच्च संक्षारक है आक्सीकारक के रूप में कार्य और / या एक विस्फोट खतरा पैदा हो सकता है। उचित हैंडलिंग और भंडारण के लिए उत्पाद एमएसडीएस से परामर्श करें।
  5. अगले दिन, रबर आस्तीन stoppers को हटा दें। ध्यान से चिमटी के साथ प्रत्येक 2 मिलीलीटर capless ट्यूब पुनः प्राप्त करने और hyamine की हाइड्रॉक्साइड के सभी पुनः प्राप्त करने के लिए 1 मिलीलीटर जगमगाहट कॉकटेल के साथ खुला शीशी के शीर्ष पर ट्यूब के नीचे धो लें। एक उचित लेबल रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में capless ट्यूब त्यागें।
  6. शीशी प्रति एक अतिरिक्त 9 मिलीलीटर जगमगाहट कॉकटेल जोड़ें। 0.5 मिलीलीटर छिड़काव बफर सीधे विशिष्ट गतिविधि के निर्धारण के लिए 10 मिलीलीटर तरल जगमगाहट कॉकटेल के साथ भरी दो शीशियों में जोड़े। सख्ती हाथ से शीशियों हिला और इंतजार में कम से कम 6 घंटा हवा के बुलबुले एक तरल जगमगाहट काउंटर उचित रूप से दोहरी लेबल प्रयोगों के लिए स्थापित में मापने के पहले फैलने के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: ne कल्पना करने के लिए स्पष्ट कांच की शीशियों का प्रयोग करेंEDLE जब रबर आस्तीन stoppers भेदी। hyamine की हाइड्रॉक्साइड में perchloric एसिड ड्रॉप के रूप में इस प्रतिक्रिया को बर्बाद कर देगा मत करो। Perchloric एसिड विज्ञप्ति हवा में कोरोनरी प्रवाह से 14 सीओ 2 जोड़ना। हालांकि शीशियों कसकर बंद किया जाना चाहिए और 14 सीओ 2 के सभी हाइड्रॉक्साइड के hyamine में फंस जाना चाहिए, यह रासायनिक धूआं हुड के तहत इस परख प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है।

7. Myocardial oleate ऑक्सीकरण दर का निर्धारण

नोट: विधि कोरोनरी प्रवाह से मात्रात्मक जुदाई और 3 एच 2 ओ की वसूली के लिए एक मजबूत आयनों विनिमय राल का उपयोग पर आधारित है। 14 सीओ 2 की वसूली के विपरीत, कोई नमूना स्थिरता मुद्दा है और कोरोनरी प्रवाह बर्फ पर रखा जा सकता है या फ्रीजर में जमा हो परख प्रदर्शन से पहले।

  1. आयनों विनिमय राल कॉलम (नमूना + टी प्रति एक स्तंभ तैयारकांच ऊन के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज ट्यूब की नोक भरने के द्वारा पृष्ठभूमि गतिविधि का निर्धारण) के लिए अतिरिक्त कॉलम wo। एक हस्तांतरण विंदुक के साथ राल / पानी के घोल जोड़ें जब तक राल सिरिंज ट्यूब पर 2 मिलीलीटर निशान तक पहुँचता है।
  2. स्तंभ के माध्यम से 2 मिलीलीटर ultrapure पानी से गुजर रहा राल धो लें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  3. कॉलम के तहत खुले जगमगाहट शीशियों की जगह और 0.5 मिलीलीटर लोड स्तंभ प्रति कोरोनरी प्रवाह। पृष्ठभूमि गतिविधि के निर्धारण के लिए 0.5 मिलीलीटर छिड़काव बफर लोड।
  4. 0.5, 1 और 2 मिलीलीटर ultrapure पानी के साथ क्रमिक कॉलम धो लें। एक बार जब क्षालन किया जाता है, एक उचित लेबल रेडियोधर्मी कचरे के कंटेनर में स्तंभों त्यागें।
  5. जगमगाहट शीशी प्रति 13 मिलीलीटर तरल जगमगाहट कॉकटेल जोड़ें। 0.5 मिलीलीटर छिड़काव बफर सीधे विशिष्ट गतिविधि के निर्धारण के लिए 13 मिलीलीटर तरल जगमगाहट कॉकटेल के साथ भरी दो शीशियों में जोड़े। सख्ती शीशियों हिला और एक तरल विज्ञान में मापने से पहले इंतजार में कम से कम 6 घंटाntillation काउंटर उचित रूप से दोहरी लेबल प्रयोगों के लिए निर्धारित किया है।

8. गणना

  1. तो पहले से ही नहीं किया, पूरे perfused दिल का गीला वजन का निर्धारण।
    नोट: जमे हुए ऊतक पिघलना करने के लिए यदि आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण बाद में शेष ऊतक पर प्रदर्शन हो रहे हैं अनुमति न दें।
  2. पूरे छिड़कना-दिल से एक ऊतक के नमूने के गीला वजन का निर्धारण करते हैं (पूरे दिल का लगभग 15 से 30% का उपयोग करें)। एक ओवन में रात भर में 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट में ऊतक का नमूना जगह और उसके सूखी वजन को मापने। ग्राम में पूरे दिल की सूखी वजन निर्धारित करने के लिए ऊतक के नमूने के गीला वजन / ड्राई वजन अनुपात का उपयोग करें (ग्राम सूखी गुम्मट।)।
  3. के लिए हर समय बिंदु एक्स मिलीग्राम / मिनट में कोरोनरी प्रवाह CF एक्स मूल्य व्यक्त करते हैं।
  4. ग्लूकोज ऑक्सीकरण की दर का निर्धारण
    1. दो विघटन / मिनट (डीपीएम) मूल्यों 14 सी की पृष्ठभूमि गतिविधि determi करने के लिए मापा औसतसुधार कारक 14C डीपीएम बीए ne।
    2. निर्धारित बनाने के लिए 14 सी के औसत विशिष्ट गतिविधि 14C डीपीएम एसए के मूल्य।
    3. सूत्र लागू करके DPM / μmol (एफ ग्लू) में ग्लूकोज की विशिष्ट रेडियोधर्मिता का निर्धारण करते हैं
      1 समीकरण
      नोट: कहाँ n ग्लू (μmol) = सी ग्लू (μmol / एल) * नमूना मात्रा (एल) = 2.5 जब 5 mmol / एल में ग्लूकोज का उपयोग कर और एक 0.5 मिलीलीटर नमूना।
    4. सूत्र लागू करके DPM / मिनट (ए) में 14 सीओ 2 के उत्पादन की दर एक्स हर समय बिंदु के लिए निर्धारित
      1 समीकरण
      नोट: कहां खंड एक्स (एमएल) = 0.5
    5. सूखी दिल वजन के निर्धारित मूल्य से फूट डालो एक 14 सीओ 2 के उत्पादन की सामान्यीकृत दर (एक आदर्श प्राप्त करने के लिए
    6. सूत्र जाना = एक आदर्श / एफ ग्लू प्रति ग्राम सूखी गुम्मट ग्लूकोज / मिनट की μmol में ग्लूकोज ऑक्सीकरण (जाओ) की दर प्राप्त करने के लिए लागू करें।
  5. Oleate ऑक्सीकरण की दर का निर्धारण
    1. दो विघटन / मिनट (डीपीएम) 3 एच की पृष्ठभूमि गतिविधि सुधार कारक 3H डीपीएम बीए का निर्धारण करने के लिए मापा मूल्यों औसत।
    2. निर्धारित बनाने के लिए 3 एच औसतन विशिष्ट गतिविधि 3H डीपीएम एसए के मूल्य।
    3. सूत्र लागू करके DPM / μmol (एफ राजभाषा ई) में oleate के विशिष्ट रेडियोधर्मिता का निर्धारण करते हैं
      1 समीकरण
      नोट: कहाँ n ओले (μmol) = सी ओले (μmol / एल) * नमूना मात्रा (एल) = 0.2 जब 0.4 mmol / एल पर oleate का उपयोग कर और एक 0.5 मिलीलीटर नमूना।
    4. प्रत्येक टिम के लिए निर्धारितई 2 ओ बिंदु डीपीएम / मिनट (बी) में फार्मूला लागू करने से 3 एच के उत्पादन की दर x
      1 समीकरण
      नोट: कहां खंड एक्स (एमएल) = 0.5
    5. सूखी दिल वजन के निर्धारित मूल्य से फूट डालो बी 3 एच 2 ओ (बी नॉर्म) प्रति ग्राम सूखी गुम्मट डीपीएम / मिनट में के उत्पादन की सामान्यीकृत-दर प्राप्त करने के लिए।
    6. सूत्र ऊ लागू = बी नॉर्म / एफ ओले प्रति ग्राम सूखी गुम्मट oleate / मिनट की μmol में oleate ऑक्सीकरण (ऊ) की दर प्राप्त करने के लिए।

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Representative Results

दो प्रतिनिधि प्रयोगों नीचे दिए गए आंकड़े में वर्णित हैं। दोनों ही मामलों में, एक 16 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague Dawley चूहे के दिल पृथक और पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार के.एच. बफर के साथ काम कर रहे मोड में भरकर रखा गया था। प्रत्येक प्रयोग में, दिल हृदय का काम प्रभावित करने के लिए एक तनाव हालत के अधीन था। कार्डिएक सिकुड़ा समारोह महाधमनी लाइन में एक दबाव transducer की प्रविष्टि के माध्यम से और हृदय की शक्ति के निर्धारण के द्वारा नाड़ी दबाव की सतत रिकॉर्डिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था। substrates ऊर्जा उपलब्ध कराने के उपयोग पर प्रत्येक तनाव हालत के परिणामों के साथ-साथ ग्लूकोज और oleate ऑक्सीकरण की दर की माप द्वारा निर्धारित किया गया है।

पहले प्रयोग में, काम का बोझ में एक तीव्र वृद्धि 40% से afterload में वृद्धि से निकट शारीरिक काम का बोझ पर 20 मिनट के छिड़काव के बाद नकली था (स्वयं के द्वारा पूरा कियामहाधमनी अतिप्रवाह चैम्बर जुटाने) और छिड़काव बफर (चित्रा 3) के लिए एपिनेफ्रीन (1 μmol / एल) जोड़कर। दिल की दर, जो नाड़ी दबाव का पता लगाने पर शिखर सिस्टोलिक दबाव मूल्यों के बीच के अंतराल को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, workjump प्रेरण (चित्रा 3 बी) पर अधिक से अधिक 50% से तुरंत वृद्धि हुई है। कार्डिएक बिजली workjump में 40% से अधिक की वृद्धि हुई है, जो ग्लूकोज और oleate ऑक्सीकरण (चित्रा -3 सी) के दोनों दरों में वृद्धि के साथ गया था। परिणाम बताते हैं कि, काम का बोझ में एक तीव्र वृद्धि के तनाव के तहत, दिल तेजी से दोनों ग्लूकोज और फैटी एसिड ऑक्सीकरण से संकुचन के लिए ऊर्जा उत्पादन बढ़ाने के लिए adapts। हालांकि, ऑक्सीकरण की दर में वृद्धि के रिश्तेदार ग्लूकोज (~ 2.8 गुना) की तुलना में यह oleate (~ 1.3 गुना) के लिए था, के लिए अधिक महत्वपूर्ण था। कार्बोहाइड्रेट ऑक्सीकरण पर निर्भरता बढ़ी अतिरिक्त काम का बोझ के साथ सामना करने के लिए दबाव अतिभारित स्तनधारी दिल 18 साल की एक खास विशेषता है

दूसरे प्रयोग में, दिल 15 मिनट कुल के द्वारा पीछा 20 मिनट के लिए आधारभूत शर्तों के तहत भरकर रखा गया था, वैश्विक, normothermic ischemia और 30 मिनट के reperfusion (चित्रा 4 ए) (दोनों आलिंद और महाधमनी लाइनें बंद करके प्रेरित)। इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, एक के पास सामान्य नाड़ी दबाव reperfusion की शुरुआत (चित्रा 4 बी) के बाद 2 और 3 मिनट के बीच बहाल किया गया। कार्डिएक शक्ति तेजी से पास आधारभूत मूल्यों (चित्रा 4C) को वापस गिरने से पहले reperfusion के पहले 10 मिनट के दौरान उपरोक्त पूर्व ischemia मूल्यों में वृद्धि हुई। आधारभूत की तुलना में, oleate ऑक्सीकरण की दर में वृद्धि हुई है, जबकि reperfusion के दौरान ग्लूकोज ऑक्सीकरण तेजी से पूर्व इस्कीमिक स्तरों पर लौट आए। एक साथ सिकुड़ा समारोह और सब्सट्रेट ऑक्सीकरण एक स्पष्ट रूप से कर सकते हैं की दोनों दरों को मापने के द्वारा की सराहना करते हैं कि, वर्तमान प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, फैटी एसिड oxid की दरों में बदलावव्यावहारिक काम की राशि reperfusion में उत्पन्न में परिवर्तन के लिए मुख्य निर्धारक है। फैटी एसिड उपयोग पद ischemia की ओर से उच्च स्विच reperfused दिल 19 साल की एक अच्छी तरह से estalished सुविधा है।

आकृति 1
चित्रा 1:। सरलीकृत पृथक कार्य चूहे दिल उपकरण की योजना क्रेब्स-Henseleit बफर फैटी एसिड बीएसए समाधान के साथ पूरक एक झिल्ली oxygenator माध्यम से गुजर द्वारा ऑक्सीजन है। एक चूहे दिल के पास शारीरिक स्थितियों में भरकर रखा जाता लिए विशिष्ट हृदय प्रीलोड और afterload मूल्यों संकेत कर रहे हैं। सेटिंग्स आलिंद जलाशय और महाधमनी अतिप्रवाह कक्ष की ऊंचाई का समायोजन करके संशोधित किया जा सकता है। स्नातक की उपाधि प्राप्त सीरिंज की ट्यूब आदेश क्रमश: कोरोनरी प्रवाह और महाधमनी के प्रवाह को मापने के लिए दिल कक्ष और महाधमनी अतिप्रवाह चैम्बर के नीचे रखा गया है। के प्रवाह मेबफर बंद कर दिया जा सकता है (जब महाधमनी और कोरोनरी प्रवाह मापने) या भेज दिए तीन तरह stopcocks के उपयोग के माध्यम से (जब काम मोड के लिए Langendorff से स्विच)। लाल तीर में लाइन ऑक्सीजन microlelectrodes "धमनी" ऑक्सीजन अंतर को निर्धारित करने के लिए इष्टतम स्थिति से संकेत मिलता है। लाइन में प्रवाह जांच और दबाव transducers प्रीलोड और afterload लाइनों में रखा जा सकता है दोनों आलिंद और महाधमनी प्रवाह दरों और दबावों (हरी तीर) को मापने के लिए। बाएं निलय दबाव और मात्रा भी एक पीवी कैथेटर बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के माध्यम से डाला के साथ दर्ज की जा सकती है। चित्रा पर दिखाया नहीं सभी कांच के बने पदार्थ तत्वों और गहरे नीले रंग में छिड़काव ट्यूबिंग आसपास के पानी जैकेट है। ये पानी तख्ताबंदीवाला तत्वों सब एक घूम पानी स्नान 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थापित करने के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से क्रमानुसार जुड़े हुए हैं। टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा।

चित्र 2
चित्रा 2:। विभिन्न सीओ 2 ट्रैप के सेटअप में शामिल कदम का प्रतिनिधित्व (ए) hyamine के 10x केंद्रित हाइड्रॉक्साइड के 1 मिलीलीटर जोड़ें। (बी) के एक 0.5 मिलीलीटर नमूना एक capless ट्यूब में निहित जोड़ें। (सी) शीशी सील। (डी) perchloric एसिड के 200 μl इंजेक्षन (60% डब्ल्यू डब्ल्यू%)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक Workjump प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम (ए) नाड़ी दबाव की सतत रिकॉर्डिंग।। (बी) में लघुterval रिकॉर्डिंग workjump दीक्षा के समय में नाड़ी दबाव में परिवर्तन का चित्रण है। (सी) ग्लूकोज ऑक्सीकरण (हलकों के साथ लाल ट्रेस) और oleate ऑक्सीकरण (वर्गों के साथ नीले रंग ट्रेस) के हृदय की दरों में एक 5 मिनट के अंतराल पर कोरोनरी प्रवाह का विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है। कार्डिएक शक्ति (त्रिकोण के साथ काले ट्रेस) एक ही समय कोरोनरी प्रवाह नमूने बरामद किए गए पर कार्डियक आउटपुट की माप द्वारा निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक ischemia-reperfusion प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम (ए) नाड़ी दबाव की सतत रिकॉर्डिंग।। (बी) के कम अंतराल रिकॉर्डिंग सिकुड़ा समारोह डु की वसूली का चित्रणreperfusion के पहले 5 मिनट की अंगूठी। (सी) ग्लूकोज ऑक्सीकरण के हृदय की दर (हलकों के साथ लाल ट्रेस) और oleate ऑक्सीकरण (वर्गों के साथ नीले रंग ट्रेस) reperfusion के पहले 5 मिनट जहां विश्लेषण पर प्रदर्शन किया गया दौरान एक 5 मिनट के अंतराल पर कोरोनरी प्रवाह का विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है, सिवाय एक 1 मिनट के अंतराल। कार्डिएक शक्ति (त्रिकोण के साथ काले ट्रेस) एक ही समय कोरोनरी प्रवाह नमूने बरामद किए गए पर कार्डियक आउटपुट की माप द्वारा निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल विवरण के तरीकों को एक साथ ग्लूकोज ऑक्सीकरण और अलग काम कर रहे चूहे दिल में फैटी एसिड ऑक्सीकरण के माध्यम से सब्सट्रेट के प्रवाह यों की। माप तो दर्ज की हृदय कार्यात्मक मापदंडों को आरोपित किया जा सकता आधारभूत और तनाव की स्थिति के तहत substrates चयापचय और हृदय का काम बीच के रिश्ते निर्धारित करने के लिए (काम का बोझ में परिवर्तन, ischemia reperfusion-, आदि ...)। यह भी मूल्यांकन करने के लिए कैसे चयापचय / संकुचन संबंध में इस तरह के दिल की विफलता और मधुमेह के रूप में पहले से मौजूद स्थितियों से प्रभावित है संभव है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित मूषक के दिल हृदय चयापचय और समारोह पर एक विशेष प्रोटीन के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले है, इन मानकों के आधार पर दवाओं और अन्य घूम कारकों के प्रभाव को व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जा सकता है। क्योंकि ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से ग्लूकोज का प्रवाह हमेशा ग्लूकोज ऑक्सीकरण की दर के साथ संबंध स्थापित नहीं है, यह हो सकता है सूचनाएक एकल प्रायोगिक स्थापना में दोनों रास्ते के माध्यम से ग्लूकोज प्रवाह की दर का पालन करने के ेश्य।

ग्लायकोलायसिस की दरों, [5 3 एच] छिड़काव बफर करने के लिए ग्लूकोज को जोड़ने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, क्योंकि 3 एच 2 ओ की रिहाई ग्लाइकोलाइसिस 20 के enolase कदम की गतिविधि के द्वारा निर्धारित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से [2- 3 एच] ग्लूकोज, जो 3 एच 2 ओ glycolytic मार्ग की phosphoglucose आइसोमेरेस कदम पर के उत्पादन की ओर जाता है, हृदय की मांसपेशी 16,17,21 द्वारा ग्लूकोज तेज की दरों में पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संभावना अपनी अपचय के विभिन्न स्तरों पर ग्लूकोज के भाग्य की जांच करने के लिए कई radiolabeled ट्रेसर से चुनने के लिए तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा का एक और उदाहरण है। हालांकि, क्योंकि सभी प्रवाह माप सकते हैं या तो 3 एच के मात्रात्मक वसूली पर भरोसा ओ 2 या 14 सीओ 2 कोरोनरी प्रवाह से केवल दो radiolabelएड ट्रेसर (एक 3 एच लेबल और 14 सी के साथ लेबल एक दूसरे के) एक समय में छिड़काव बफर में इस्तेमाल किया जा सकता है।

methodological विचार

वहाँ हृदय चयापचय प्रवाह और समारोह इस प्रोटोकॉल का उपयोग की माप के लिए कुछ निहित सीमाएं हैं। हालांकि के.एच. बफर के उपयोग perfusate की संरचना पर कुल नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, इस प्रयोगात्मक स्थापना की शारीरिक प्रासंगिकता संदिग्ध हो सकता है। सबसे पहले, रक्त के ऊपर एक crystalloid समाधान के उपयोग के नकारात्मक ischemia 22,23 करने के लिए हृदय hemodynamics और प्रतिरोध को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। दूसरा, छिड़काव बफर हम यहाँ वर्णन हार्मोन और पोषक तत्वों है कि सीधे हृदय चयापचय मिलाना कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप एक नकली तनाव हालत के लिए दिल की प्रतिक्रिया प्रभाव की एक किस्म का अभाव है। दरअसल, स्तनधारी दिल एक चयापचय omnivore है और, ग्लूकोज और फैटी एसिड होता है इसके अलावा, एफ के लिए अन्य substrates उपयोग कर सकते हैंअपनी ऊर्जा आवश्यकताओं (लैक्टेट, पाइरूवेट, कीटोन निकायों, branched श्रृंखला एमिनो एसिड) ulfill। बढ़ते सबूत है कि इन substrates के कुछ रोगग्रस्त दिल 24,25 के चयापचय remodeling में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। यह पूरी तरह संभव है अन्वेषक, छिड़काव बफर करने के लिए इन substrates जोड़ने के लिए आदेश में और अधिक बारीकी से विभिन्न शारीरिक शर्तों (जैसे उपवास राज्य बनाम फेड राज्य) या रोग राज्यों की नकल करने की उनकी एकाग्रता मिलाना, और का उपयोग ऑक्सीकरण की अपनी दरों में पालन करने के लिए उचित radiolabeled ट्रेसर 26,27। ट्राइग्लिसराइड्स के चयापचय भी पता लगाया जा सकता है, और उस मामले में यह रूप में इस endothelium से लिपोप्रोटीन lipase की रिहाई प्रेरित करेगा और काफी बफर से ट्राइग्लिसराइड की निकासी में कमी दिल के छांटना करने से पहले हेपरिन के उपयोग से बचने के लिए सिफारिश की है 28। radiolabeled ट्रेसर का चयन सावधानी से, वार में रेडियोधर्मिता के समावेश के साथious ऊतक चयापचयों भी छिड़काव ऐसे नए सिरे से ट्राइग्लिसराइड संश्लेषण, ग्लाइकोजन कारोबार, या प्रोटीन संश्लेषण 18,29,30 की दरों के रूप में मापदंडों का निर्धारण करने के बाद मापा जा सकता है। दूसरे शब्दों में, अन्वेषक substrates / हार्मोन संयोजन और सांद्रता की एक विस्तृत विविधता के साथ काम कर सकते हैं। बफर रचना की पसंद ज्यादातर प्रयोग के उद्देश्यों पर निर्भर करेगा। क्योंकि इन नियंत्रित बफर की स्थिति एक "सरल" शारीरिक मॉडल बनाने, पूर्व vivo काम कर दिल छिड़काव प्रयोगों सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए और यदि संभव हो तो डेटा आगे विवो में मान्य किया जाना चाहिए का परिणाम है।

संवेदनाहारी की पसंद

पूर्व के दिल के छांटना के लिए चूहों पर प्रयोग किया जाता संवेदनाहारी ध्यान से हृदय समारोह और चयापचय पर अपने ज्ञात प्रभाव के आधार पर चयन किया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने के इस प्रयोग के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा प्रदर्शन किया जाना हैईडी। दोनों इंजेक्शन और inhalational anesthetics तेजी से hyperglycemia और ग्लूकोज असहिष्णुता के चर डिग्री है कि छिड़काव 31,32 के दौरान हृदय की चयापचय को प्रभावित कर सकता प्रेरित। अन्य एजेंटों की तुलना में, ग्लूकोज homeostasis पर बार्बीचुरेट्स (pentobarbital और thiobutabarbital) की अल्पकालिक प्रभाव अपेक्षाकृत नगण्य 31 हैं। हालांकि, दिल छांटना करने से पहले intraperitoneal pentobarbital संज्ञाहरण, हृदय उत्पादन में कमी बाएं निलय समारोह ख़राब, और ischemia reperfusion-33 के एक पूर्व vivo प्रोटोकॉल में दौरे लैक्टेट रिहाई बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। Pentobarbital पृथक चूहे दिल पर है कि नकारात्मक inotropic प्रभाव दवा 34 के ऊतक संचय के कारण हो सुझाव दिया है। इसके विपरीत inhalational anesthetics, जो और अधिक तेजी से हृदय के ऊतकों से बाहर धोया जाता है का उपयोग करें, बेहतर सिकुड़ा समारोह के साथ पूर्व vivo 33 जुड़ा हुआ है। अस्थिर anesthetics वास्तव में सीए प्रदान कर सकता हैmitochondrial कश्मीर एटीपी चैनलों के उद्घाटन से जुड़े एक तंत्र के माध्यम से ischemia-reperfusion दौरान rdioprotection और hexokinase के बंधन 32 माइटोकॉन्ड्रिया की वृद्धि हुई। सारांश में, एनेस्थेटिक के प्रकार एक अलग काम कर दिल छिड़काव प्रोटोकॉल में प्रयुक्त दोनों कार्यात्मक और चयापचय पैरामीटर है कि सीधे प्रयोग के परिणामों को प्रभावित कर सकता का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण चर रहा है। इसलिए, प्रकार और संवेदनाहारी इस्तेमाल की खुराक हमेशा एक प्रयोग के तरीकों खंड में सूचित किया जाना चाहिए, और इन मानकों प्रयोगों है कि तुलना में किया जा के लिए होती हैं के बीच बदला नहीं जाना चाहिए।

दिल छिड़काव में radioisotopes

पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल के साथ प्रदर्शन सभी प्रवाह माप गैर recirculating मोड में प्रदर्शन कर रहे हैं, जिसका अर्थ है कि कोरोनरी प्रवाह के बजाय बफर जलाशय (चित्रा 1) को लौट जा रहा से खारिज कर दिया है। अन्वेषक के बजाय हो सकताrecirculating विधा है, जो बफर और इसलिए संचालित करने के लिए रेडियोधर्मिता का एक बहुत छोटे मात्रा की आवश्यकता होती है का लाभ दिया है में छिड़काव उपकरण का उपयोग करने के लिए चुनते हैं। हालांकि, कोरोनरी प्रवाह की रीसाइक्लिंग के दिल की चयापचय क्रिया से होने वाले उपोत्पाद की वसूली के माध्यम से छिड़काव बफर के स्थिर राज्य रचना समझौता (लैक्टेट सहित, लेकिन यह भी 3 एच 2 हे और एच 14 CO3-) है, जो दृढ़ संकल्प पेचीदा चयापचय अपशिष्टों और यहां तक कि समय 35 से अधिक हृदय समारोह में बदल सकता है। इन मुद्दों को गैर-recirculating मोड में रोका जाता है। रेडियोधर्मिता की मात्रा के कारण और एक ही प्रयोग में इस्तेमाल छिड़काव बफर की बड़ी मात्रा के लिए, अन्वेषक विशेष रूप से सतर्क जब काम चूहे दिल का उपयोग कर चयापचय प्रवाह में विश्लेषण किया जाना चाहिए। पहली बार के लिए एक छिड़काव उपकरण का उपयोग करते हैं, इसके साथ परिचित बनने के लिए गैर रेडियोधर्मी बफर के साथ कई नकली प्रयोगों प्रदर्शन करने की सिफारिश की हैप्रोटोकॉल के और सुरक्षा प्रक्रियाओं के साथ विभिन्न चरणों। cannulas पर दिल के बढ़ते एक विशेष रूप से संवेदनशील कदम है क्योंकि यह बफर तंत्र के साथ और क्योंकि एक करीबी संपर्क स्थापित करने रिसाव या दिल की कटे रक्त वाहिकाओं में से एक से बाहर गोली मार कर सकते हैं की आवश्यकता है। छिड़काव उपकरण Taegtmeyer और उनके सहयोगियों ने 11 से वर्णित एक Langendorff जलाशय छिड़काव उपकरण के बाकी हिस्सों से पूरी तरह से स्वतंत्र है कि सहित का लाभ दिया है, और इसलिए गैर रेडियोधर्मी के.एच. बफर दिल की केन्युलेशन के दौरान रेडियोधर्मी सामग्री की फैल को रोकने के साथ भरा जा सकता है । इस्तेमाल प्रणाली के बावजूद, प्रयोगों सीमित पहुँच के साथ एक समर्पित क्षेत्र में किया जाना चाहिए। कमरे में एक सिंक और ultrapure पानी की आपूर्ति एक ही क्षेत्र में बफर तैयार करने और दूषित उपकरणों की सफाई करने के लिए शामिल करना चाहिए। जांचकर्ताओं ने उनकी संस्था के विकिरण सुरक्षा कार्यालय के साथ मिलकर काम करते हैं स्थापित करने के लिए करना चाहिए रोंpecific रोकथाम, नियंत्रण और परिशोधन प्रक्रियाओं।

छिड़काव उपकरण की सफाई

छिड़काव उपकरण के पद प्रयोगात्मक सफाई एक महत्वपूर्ण कदम है कि अक्सर अनदेखी की है और, अगर सावधानी से अंजाम नहीं, गरीब प्रयोगात्मक reproducibility से संबंधित मुद्दों के अधिकांश के लिए जिम्मेदार है। पोषक तत्वों से भरपूर छिड़काव बफर और छिड़काव प्रणाली के उच्च तापमान बैक्टीरियल और फंगल विकास के लिए आदर्श स्थिति प्रदान करते हैं। छिड़काव बफर में प्रोटीन के उपयोग (इंसुलिन, बीएसए) और फैटी एसिड होता है, क्योंकि इन यौगिकों, ट्यूबिंग और कांच के बने पदार्थ की सतह के लिए रहना होगा उन्हें तंत्र के बाहर निकलवाने के लिए कड़ी मेहनत कर रही सफाई की प्रक्रिया के लिए जटिलता का एक और डिग्री कहते हैं। radioisotopes का उपयोग भी इस तरह के दूषित उपकरण और ठोस एक के निपटान के हेरफेर के लिए प्रयोगशाला में एक समर्पित नियंत्रण क्षेत्र के निर्माण के रूप में अतिरिक्त बाधाओं लागू होगाडी तरल रेडियोधर्मी कचरे। इसलिए, पर्याप्त सफाई प्रक्रिया ज्यादातर दोनों छिड़काव बफर की रचना और इस्तेमाल छिड़काव उपकरण के प्रकार पर निर्भर करेगा। एक वाणिज्यिक तंत्र का उपयोग करते हैं, निर्माता की वेबसाइट की जाँच करें या कैसे तंत्र के घटकों में से किसी को नुकसान पहुँचाए बिना सफाई प्रदर्शन करने के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए ग्राहक सेवा से संपर्क करें। सामान्य में, सभी कांच के बने पदार्थ और प्लास्टिक के हिस्सों साबुन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ धोया जा सकता है। एनजाइम सक्रिय संचालित डिटर्जेंट विशेष रूप से फैटी एसिड बीएसए अवशेषों को हटाने के लिए उपयोगी होते हैं। अधिकांश दूषित पदार्थों को भी 0.1 एम एचसीएल या कई घंटे के लिए 0.1 एम 3 HNO तंत्र के माध्यम से चलाने के द्वारा निकाल दिया जाएगा। , और अंत में ultrapure पानी के साथ प्रणाली rinsing द्वारा एंजाइम सक्रिय संचालित गर्म पानी में तैयार डिटर्जेंट का समाधान: हम प्रणाली एक ताजा 1% से 0.1 एम एचसीएल के साथ पहली निस्तब्धता, तो (वी डब्ल्यू) द्वारा संतोषजनक सफाई परिणाम प्राप्त करते हैं। एक मूल रूप से विकास के रूप में एक कस्टम निर्मित छिड़काव उपकरण का उपयोग करते हैंTaegtmeyer और उनके सहयोगियों ने 11 से escribed, यह पूरी तरह से एक प्रयोगात्मक दिन के अंत में तंत्र को नष्ट करने के लिए आसान और अधिक प्रभावी हो सकता है। कांच के बने पदार्थ एक क्रोमिक एसिड और सल्फ्यूरिक एसिड के मिश्रण का एक केंद्रित स्नान में एक 15 मिनट के विसर्जन से साफ किया जाता है। प्लास्टिक के हिस्सों और पीवीसी टयूबिंग एक अवशेषों से मुक्त साबुन के साथ धोया जा सकता है। हम यह वास्तव में तेजी से और अधिक विश्वसनीय है पूरी तरह से, पीवीसी टयूबिंग हर दिन को बदलने के लिए है, क्योंकि यह radiochemicals से दूषित सामग्री के हेरफेर की सीमा और क्योंकि इसके पीछे एजेंटों की सफाई के अवशेषों छोड़ने रोकता पाया। छिड़काव उपकरण और सभी गंदे उपकरण तुरंत छिड़काव प्रयोग पूरा करने के बाद 1- साफ: किसी भी मामले में, अन्वेषक निम्नलिखित नियम लागू करना चाहिए। वेटिंग केवल सफाई और अधिक कठिन और समय लेने बनाना होगा। 2- संदूषण के लिए नियमित रूप से पानी जैकेट प्रणाली के घूम स्नान की जाँच करें। एक पानी कंडीशनर का प्रयोग करें सेल्सियस के बीच के अंतराल में वृद्धि होगीनहाने के पानी का झुकाव। 3 सफाई के बाद, अच्छी तरह से सभी कांच के बने पदार्थ और पानी के नल के साथ कई बार ट्यूबिंग कुल्ला और ultrapure पानी के साथ rinsing सफाई एजेंटों से अवशेषों को हटाने के लिए खत्म। 4 दो दिल की तैयारी लगातार नाकाम रहने के लिए जब विच्छेदन ध्यान से मार डाला गया था और सावधानी से तैयार छिड़काव बफर (या तो बैक्टीरिया द्वारा या विलायक अवशेषों से) तंत्र का एक संदूषण से संकेत मिलता है की संभावना है। यदि ऐसा होता है, कपड़े धोने और rinsing प्रक्रियाओं पूरी तरह से दोहराया जाना चाहिए।

माउस दिल के नीचे स्केलिंग

हालांकि पिछले प्रोटोकॉल एक अलग काम कर रहे चूहे दिल में चयापचय दर के निर्धारण पर केंद्रित है, एक ही प्रक्रियाओं छिड़काव उपकरण और डाटा अधिग्रहण उपकरण 36 को कुछ संशोधनों के साथ माउस दिल के लिए लागू किया जा सकता है। अपने छोटे आकार के कारण अलग-थलग काम कर माउस दिल तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण है, लेकिन क्योंकि इसकी काफी कीनिचले प्रवाह की दर में यह छिड़काव बफर का एक बहुत कम मात्रा की आवश्यकता होती है का लाभ दिया है। आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल है कि पहले से ही उपलब्ध हैं की बड़ी संख्या को भी अलग काम कर रहे माउस दिल बहुत हृदय चयापचय और कार्यात्मक remodeling पर एक भी जीन उत्पाद के समारोह में अध्ययन करने के लिए आकर्षक बना देता है। हालांकि, जीनोम संपादन और ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों की एक तेजी से बढ़ती सूची में हाल ही में तकनीकी विकास तेजी से दो कृंतक प्रजातियों के बीच की खाई को बंद कर रहे हैं। इसके अलावा, चूहे लंबे समय से एक बेहतर पशु मॉडल की वजह से अपनी pathophysiology बारीकी से मानव की स्थिति 37 mimics हृदय रोग की जांच करने के रूप में प्रशंसा की गई है। इन कारणों के लिए, हमें विश्वास है कि पृथक काम कर चूहे दिल अभी भी हृदय अनुसंधान के आधुनिक युग में एक महत्वपूर्ण स्थान पकड़ो।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

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References

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जैव रसायन अंक 115 दिल छिड़काव काम दिल हृदय समारोह चयापचय ग्लूकोज ऑक्सीकरण फैटी एसिड ऑक्सीकरण radioisotopes
पृथक कार्य चूहे दिल में ग्लूकोज और फैटी एसिड ऑक्सीकरण की दरों का निर्धारण करने के लिए तरीके
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Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

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