Abstract
포유류 마음은 ATP의 주요 소비자이며, 수축의 에너지 기판의 지속적인 공급이 필요합니다. 당연히 심근 대사의 변화가 수축 부전 심부전의 개발과 연결되어있다. 따라서, 신진 대사 및 수축 사이의 링크를 푸는 것은 질병 상태에서 심장 적응 또는 부적응을 지배하는 메커니즘의 일부에 빛을 흘렸다한다. 분리 된 래트 심장 작동 준비를 동시에 실시간 심장 수축 기능 및 산화 적 대사 경로에 기판을 제공하는 에너지의 흐름에 따라 사용될 수있다. 본 프로토콜은 포도당 지방산, 심장의 기판을 제공하는 주된 에너지 산화 비율의 정량적 측정을 위해 버퍼의 제조 및 이용에 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공하는 것을 목적으로한다. 시료 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법에 대해서도 설명합니다.간단히 말해서,이 기술은 정상 체온 결정질 관류 통해 생체 심장 박동로 (14)의 공급 C- 방사성 포도당과 3 H- 방사성 장쇄 지방산에 기초한다. 14 CO 2, 3 H 2 O, 최종 부산물 이러한 에너지 제공 기판의 사용에 관여하는 효소 반응은 다음 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회수된다. 사용되는 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 산화 경로에 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다. 분리 된 심장의 수축 기능은 해당 기록 장치와 병렬로 결정될 직접 대사 플럭스 값과 상관 될 수있다. 이 기술은 사전에로드 및 국소 빈혈, 약물 또는 circula 후 변경 등 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 대사 / 수축 관계를 연구하는 것이 매우 유용하다유전자 산물의 발현의 변화 다음 팅 계수 나.
Introduction
임상 관련성
포유 동물의 심장에서 산화 적 대사 경로, ATP 생성과 심장 작품 (1)을 통해 기판의 플럭스 사이에 강한 긍정적 인 관계가있다. 지난 20 년 동안 심장 대사와 기능 사이의 복잡한 링크의 조사는 심장 대사의 변화는 심장 질환 2-4의 다른 유형의 설정에서 수축 기능 장애 가능성이 병리학 적 구조 리모델링에 대한 원인을 인식하게되었다. 따라서, 스트레인 된 심장의 대사 리모델링을 관리하는 메커니즘에 대한 이해 심부전 5-7의 예방 또는 치료를위한 치료 표적의 확인을 초래할 것으로 예상된다. "심장 대사의 평가"에 미국 심장 협회에서 과학적 진술의 최근 간행물은 t에 대한 과학계의 관심이 점점 강조연구 (8) 자신의 분야. 심장 이미징 기술의 진보는 이제 심장 형태와 기능의 신속하고 정확한 평가를 허용 반면, 심장 대사의 생체 내 연구는 제한적이고 부담이 남아있다 : 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 수 생체 외 날짜 .TO 정상 상태 조건에서 산화 대사에 대한 다양한 기판 기여 9 판별 심장 고 에너지 인산 대사 크렙스 회로 활동을 수행하는데 사용될 수 있지만, 이러한 기술들은 높은 운영 비용으로 자신의 무능력 퍼진 마음의 준비 작업을 동시에 실시간으로, 산화 적 대사 경로 7,9에 수축 기능과 기판의 플럭스에서 공부하는 유일하고 독특한 기술을 사용할 나타냅니다. 다음 프로토콜 래트를 결정하는데 사용될 시약의 제조 및 이용의 지침을 제공하는 것이다격리 된 작업 쥐의 심장에 기판 활용 말이지.
격리 된 작업 쥐 심장 장치
기술은 반세기 이전이지만, 분리 작업 쥐 심장 제제는 심혈관 연구를 선택하는 방법을 남아있다. 랑겐 돌프 심장 제조와 마찬가지로 작용 쥐 심장 신경 호르몬 다른 장기와 다른 순환 계수의 교란 효과는 독립적으로 심장의 다양한 파라미터를 측정 할 수있는 비교적 간단한 신뢰성 있고 저렴한 방법을 제공한다. 그러나 랑겐 돌프 - 관류 마음 대조적으로, 작업 심장에 가까운 생리 심장 연구, 생체 조건에 관련이있는 수준으로 산화 대사 플럭스의 생성을위한 전제 조건을 수행하고 있습니다. 이것은 좌심방 접속 캐뉼라를 통해 좌심실 (LV)로 관류 버퍼를 제공함으로써 달성되고 LV는 채우고 계약으로되어버퍼가 결정된 후 부하 수압에 대한 대동맥 라인을 통해 배출됩니다. 원래 10 이후 Taegtmeyer, HEMS와 크렙스 (11)에 의해 개선 되었으나 닐리와 동료에 의해 기술 된 관류 장치의 디자인은 이후 약간 변경되었습니다. 원래 장치에서 설명한 바와 같이, 수축 기능은 대동맥 측정하기 위해 더 이상 메스 실린더 및 스톱워치를 사용하지 않고, 심 박출량의 측정을 통해 평가 될 수 있고, 관상 동맥은 10, 11을 흐른다. 여러 벤더가 완료 작업 쥐 심장 관류 시스템을 제공합니다. 이들 시판되는 장치 flowprobes, 압력 센서, 압력 볼륨 카테터와 심장 기능의 데이터 수집과 분석에 필요한 모든 장비를 얻을 수있다. 공급 업체는 장비와 새로운 사용자 익숙해 광범위한 문서 및 교육 세션을 제공합니다. 작업 심장기구도에 여러 또한 리뷰 기사 상세 프로토콜[슬라이드 쇼와 카테터의 사용에 설치류 12-15에서 심장 기능을 측정합니다. 이러한 이유로, 우리는 잠시 관류 장치 및 기록 장치의 설정을 언급한다. 본 프로토콜은 다소 동시에 포도당과 장쇄 지방산 산화의 속도는 정상적인 심장의 두 가지 에너지를 제공하는 기판을 측정하도록 구현 될 수있는 방법에 대한 설명과 함께 이미 이용 가능한 정보를 보완하는 것이다. 우리는 데이터 분석 샘플의 회수 및 처리 시약 및 버퍼의 제조에서, 심근 산화 대사 평가 방사성 에너지 기판의 사용에 관련된 현재의 모든 단계를 설명한다.
이 방법의 원리
심근 (glucos를 지방산 (주로 장쇄 지방산)과 탄수화물의 산화 적 인산화의 수축 에너지의 대부분을 생성전자 및 락 테이트). 심장은 매우 정력 보유 제한 및 순환에서 이러한 에너지 제공 기판의 지속적인 공급에 의존하고있다. 당분 경로를 통한 글루코오스의 이화는 미토콘드리아 내막의 피루 베이트 탈수소 효소 복합체에 의해 탈 카복실 화되는 피루브산을 산출한다. 알부민 또는 지단백질 순환하는 트리글리세리드에서 추출한 장쇄 지방산은 제 세포질에서 아실 CoA를 분자로 활성화되고,이어서 베타 산화 경로를 입력 카르니틴 셔틀 통하여 미토콘드리아 기질 내부에 반송된다. 포도당 지방산의 분해 작용에 의해 생성 된 아세틸 -CoA 분자 미토콘드리아 내막을 가로 질러 양성자 원동력을 구축하는 전자 전달계에 사용되는 환원 등가물 (NADH와 FADH 2)를 생성하는 크렙스 회로 연료 및 ATP에 합성 효소의 활동을 통해 ATP를 생성합니다. 물과 이산화탄소의 단부 부산물이다크렙스 사이클 내에서 일어나는 효소 반응. 14 C- 3 H- 방사성 표지 된 기질의 공급은 절연 작업 심장 (예 : C-14 방사성 표지 된 글루코스, 3 H-방사성 올레산) 따라서 14 CO 2, 3 H 2 O의 생산을 유도 할 수있다 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회복 될 수있다. 14 CO 2의 컬렉션은 밀폐 챔버에 격리 관류 심장을 유지하여 그것을 중심을 빠져 나올 때 바로 관상 동맥 유출 물을 회수하여 실시된다. 작은 음이온 교환 컬럼 분리하여 관상 동맥 유출 물로부터 3 H 2 O를 복구하기 위해 사용된다. 처리 된 샘플의 방사능을 액체 섬광 계수기로 측정 한 결과, 사용 된 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다산화는 16, 17을 경로.
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Protocol
참고 : 모든 동물의 절차는 인간의 관리 및 동물의 사용에 대한 NIH 보건 서비스 정책에 따라 수행하고 미시시피 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 방사성 동위 원소의 사용을 포함하는 모든 절차는 미시시피 의료원 대학의 방사선 안전 사무실 정한 가이드 라인에 따라 승인 하였다.
주식 버퍼 솔루션 및 시약 1. 준비
- 크렙스 - Henseleit (KH) 버퍼 스톡 솔루션
- (몰 / L)에 포함 된 20 배 농축 된 소금 원액의 2 L 2.37 염화나트륨, 0.0948의 KCl, 0.0236 KH 2 PO 4, 0.0236 황산 4 * 7H 2 O 준비 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
- 의 NaHCO3의 20 배 농축 (0.5 몰 / L) 용액 2 L를 준비합니다. 이 용액이 될 수있다무기한 실온에서 저장된다.
- 염화칼슘 (2)의 1 몰 / L 원액 250 ml의를 준비합니다. 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
- 염화물 형태의 수산화 양식에 음이온 교환 수지의 전환
- 1 L의 초순수 물에 재현 탁하여, 음이온 교환 수지를 세척 하였다. 수지가 정착 여분의 물을 부어 할 수 있습니다. 이 단계를 4 번 이상 반복합니다.
- 여과 플라스크에 장착 된 유리 미량 진공 필터 홀더에 수지를 부어.
- 천천히 1 N의 NaOH (22) 양을 통과하여 수산화 형태로 수지를 변환합니다. 스테인레스 강 주걱으로 간헐적 슬러리를 섞는다.
- pH가 아래 9.0 떨어질 때까지 초순수로 수지를 씻으십시오. 수지 슬러리의 표면 근처의 pH 테스트 스트립을 찍기에 의해 정기적으로 pH를 확인합니다. 커버 및 보에 초순수 수지 저장rosilicate 유리 병 및 빛으로부터 보호합니다. 수지가 사용하기 전에 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
참고 : 제대로 저장 될 때, 수지가 3 개월 이상 지속됩니다.
- 올레산 - 알부민 8 배 농축 원액
- 4 L 삼각 플라스크에서, 20 배 농축 염 스톡 용액 200 ㎖와 3.6 L의 초순수로 20 배 농축 된 NaHCO3 용액 200 ㎖를 혼합한다.
- 융해 실린더 기체 분산 튜브를 이용하여, 이산화탄소 5 %의 산소 pH를 안정화하기 위해 95 %의 혼합물로 15 분 동안 용액을 기체.
- 470 ml를 1 L 유리 비커에 붓고 버퍼. 4 L 삼각 플라스크에 잔존하는 3530 ml의 완충액에 1 몰 / L CaCl2를 원액 8.75 mL 및 추가 세트는 제외.
- 용해 될 때까지 교반 막대 1 L의 유리 비커에 지방산 무료 BSA 40 g을 넣고 저어.
- (: V V) 초순수의 에탄올 용액 15 mL를 원뿔형 튜브 내에, 50 % 4 mL로 제조. 487 mg을 sodiu 추가분말까지 m 올레산 및 와류가 완전히 용해시킨다.
참고 : 일부 연구자는 재관류 버퍼에 팔 미트 산 대신 올레산을 사용합니다. 팔 미트 산, 알부민 원액과 동일한 절차에 따라 제조 될 수있다. 그러나, 소듐 팔미 테이트의 완전한 용해를 달성하기 위해 70 ºC의 용액을 가온 권장한다. - 일정하게 교반 지방산 무료 BSA 용액에 올 레이트 솔루션 적가을 추가하고 형성하는 올레산-BSA 단지 10 이상 분을 기다립니다.
참고 :이 솔루션은 밝은 노란색이 눈에 보이는 입자의 결여해야한다. 침전물 또는 불용성 입자의 존재는 BSA에 지방산의 불완전 결합을 나타낼 수있다. 이 경우, 용액을 폐기하고, 처리는 반복을 시작한다.
주 : 피펫에 방치되어 적가 될 수 없다면 팔미 침전된다. BSA의 교반 용액 bindin 촉진하기 위해 37 ºC에서 따뜻하게 할 수있다팔 미트 산의 g. BSA의 변성과 응집되는 원인이 과열하지 마십시오.
주의 :이 프로토콜의 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다. - 올레산-BSA의 교반 용액에 160 μL (0.8 MCI) [9,10- 3 H] 올레인산을 첨가하고 추가로 10 분 동안 교반 하였다.
- 올레산-BSA의 교반 용액에 1 몰 / L 염화칼슘이 원액의 2.5 ML을 추가합니다.
- 약 1.2 m 투석막 튜브를 잘라 내부와 외부 수돗물로 모두 씻어. 10 ~ 15 분 멤브레인의 글리세롤 코팅을 제거하는 수돗물에서 적극적으로 투석 튜브를 닦습니다. 또한, 사용하기 전에 1 시간 동안 따뜻한 물에 투석 튜브를 담가 코팅을 제거합니다. 초순수 물 공급과 투석 튜브를 세척하여 마무리아르 자형.
- 안전하게 투석 튜브의 한쪽 끝을 묶어. 올레산-BSA 용액을 채우고 투석 튜브의 다른 쪽 끝을 묶어.
- KH 버퍼의 4 L 삼각 플라스크에 가득 투석 튜브를 넣고 교반 막대와 부드러운 교반하면서 4 ºC에서 하룻밤 투석 수 있습니다.
- 다음 날, 투석 튜브의 8 배 농축 올레산-BSA 솔루션을 제거합니다. -20 ºC에서 관류 또는 나누어지는 및 저장에 대한 즉시 올레산-BSA 솔루션을 사용합니다. 냉동 된 분취 량을 최소 2 개월 동안 안정하다. 이것은 올레산-BSA 복합체의 용해도를 손상시킬 수 있으므로 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오.
참고 만 사용 초순수 (25 ºC 18.2 MΩ.cm의 저항률 총 유기 탄소 <10 ppb의 미생물 ≤ 1 CFU / ㎖, 0.22 μm의 ≤1 / ㎖ 이상 크기의 미립자) 시약 및 버퍼를 준비 심장 관류에 사용됩니다. 그 클로라이드 음이온 교환 수지의 전환수산화물 형태 m은 추가 비용 수산화물 형태의 직접 구매함으로써 회피 할 수있다 (재료 표 참조). 올레산 또는 팔미 외에, 천연 지방산의 다른 유형은 또한 지방산의 삼중 버전의 산화를 수행하는 데 사용할 수만큼 사용될 수있다.
관류 버퍼 2. 준비
- 4 L 삼각 플라스크에서, 20 배 농축 염 스톡 용액 200 ㎖와 3.6 L의 초순수로 20 배 농축 된 NaHCO3 용액 200 ㎖를 혼합한다. 이산화탄소 5 %, 산소 95 %의 혼합물로 15 분 동안 용액을 가스 후 2.5 밀리몰 / L에서 자유 칼슘의 농도를 설정하기 위해 1 몰 / L CaCl2를 스톡 용액 10 ㎖를 추가한다.
주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 가시가 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 준수diation 안전 사무실. - 2 L 붕규산 유리 병에 1.750 L KH 버퍼를 전송합니다. 8 배속 250㎖를 올레산-BSA 용액 1.802 g D- 글루코스 0.4 U / ㎖에서 400 ㎕의 인슐린, 200 μL (0.2 MCI) [U- 14 C] 포도당을 추가 농축시켰다. 혼합 병을 반전. 이것은 올레산 (0.4 밀리몰 / L), D- 글루코오스 (5 밀리몰 / L), 및 인슐린 (40 μU / ㎖)를 함유하는 완전한 관류 완충액 2 L를 줄 것이다.
참고 : 2 L의 볼륨이 적어도 60 분 동안 비 순환 조건에서 작업 성인 쥐의 심장을 관류하기에 충분하다. - 두 절개 요리를 채우기 위해 비 방사성 KH 버퍼의 일부를 사용하여 냉각 얼음 위에 놓는다.
관류 장치 3. 준비
주 : 조사는 Taegtmeyer, HEMS와 크렙스 (11), 또는 상업적으로 사용 가능한 시스템 중 하나에 의해 설명 된 것과 같은 맞춤형 관류 장치를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 관류 시스템은 통상적으로 구성되는아래 그림 1에서 설명하는 요소. 튜브와 유리 외에, 기록 장치의 나머지는 선택적이며 실험 문제를 해결하기 위해 연구자의 필요에 따라 달라진다 그 활용이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 상기 버퍼에 진입 O 2 농도를 측정하는 산소 미소 전극의 사용을 권장하고 관상 동맥 (도 1)을 종료. 이것은 심장 산소를 적절한 양으로 공급된다 연구자 제어 도울 것이며, 산소 공급 실험 사이에서 변화하지 않음. 또한, "동정맥"산소 차의 결정은, 심근 산소 소비량 (16, 18) 및 심근 효율을 계산하는데 사용될 수있다.
- 순환 수조를 켜고 관류 장치를 예열 37 ºC에서 설정합니다.
- 컴퓨터와 의지 데이터 수집 시스템을 켭니다심장 기능을 측정 할.
- 데이터 수집 시스템의 기록 장치 (압력 카테터 압력 볼륨 카테터, 산소 마이크로 전극, 유량계 등)를 연결하고, 제조자의 지시에 따라 상품의 캘리브레이션을 수행한다.
- 초순수와 버퍼 탱크를 채우십시오. 연동 펌프를 켜고 모든 튜브를 통해 물을 세척 시스템을 씻어 유리 제품. 연동 펌프의 전원을 끄고이 같은 튜브 및 / 또는 유리에 물 숙박이 관류 버퍼와 심장 준비의 농도에 영향을 미칠 수 없다 있는지 확인합니다.
- 시스템에 새로운 1.0 ㎛의 유리 섬유 필터를 연결한다. 산소화 챔버 이산화탄소 5 %의 산소 및 95 %의 혼합물을 포함하는 연료 탱크를 연결한다.
주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관에 의해 설정된 안전성과 폐기물 처리 규정을 준수의 방사선 안전 사무실. - 관류 버퍼와 버퍼 탱크를 채우십시오. 펌프를 켜고 관류 버퍼 모든 튜브와 유리의 충전을 보장합니다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 재관류 재순환 모드에서 장치와 네이트 통해 관류 완충액을 실행.
- 단단히 관상 유출 물을 복구하기 위해 심장 챔버 아래 20 ML의 주사기의 튜브를 연결합니다. 세 방향 코크의 상부에 주사기의 끝 부분을 연결한다. 3 ML의 주사기에 사이드 암을 연결합니다. 액체 방사성 폐기물 컨테이너에 튜브를 통해 아래 팔을 연결합니다.
주 : 지방산-BSA 착체를 사용하는 경우에는 용액의 과도한 발포를 일으킬 것 같은 관류 완충액 산소는 기체 분산 튜브를 직접 버블 링을 실시 할 수 없다. 막 형산 (그림 1) 또는 목적으로 시트 흐름 산소화 챔버를 사용합니다. 매우 적절한 수준의 O를 확인하는 것이 좋습니다F 산소를 관류 회로 (도 1)의 산소 미세 전극을 배치하여 도달된다.
4. 쥐의 심장 절연 및 캐 뉼러
- 규모에 쥐 무게.
- 150 mg을 마취제 투여 주사기를 준비 / thiobutabarbital 나트륨 염 수화물 200 USP 단위 헤파린 투베르쿨린 주사기 kg이다.
- thiobutabarbital IP를 주입하고 의식을 잃고 동물 기다립니다. 이 실험의 목적을 방해하지 않을 같은 다른 유도 화제는 (아래의 설명 부분에서 마취제 선택 참조)만큼 사용될 수있다.
- 발가락 핀치 반사의 부족을 확인하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 동물이 절차를 수행하는 동안 통증을 느끼지 않는 것을 보장하기 위해 마취의 적절한 깊이를 유지해야합니다.
- 쥐가 완전히 의식이 운영 테이블 및 초에 그 뒷면에 배치, 발가락 핀치에 응답하지 않습니다되면테이프 나 핀 URE 사지.
- 머리의 복부 무료 클립과 복부의 정중선 절개를 수행합니다. 아직이 시점에서 흉강을 열지 마십시오. 위를 이동하고 하대 정맥을 나타 내기 위해 따로 장기의. 하대 정맥에 직접 헤파린을 주입하고 진행하기 전에 5 초 10을 기다립니다.
- 사용 가위 흉강의 내용을 노출 조리개와 흉곽의 측면을 자른다.
- 섬세 함께 엄지 손가락, 색인과 중간 손가락과 소비세 마음 둘과 폐의 마음을 잡아. 그 과정에서 대동맥 궁과 상행 대동맥 손상되지 않도록주의하면서 하행 대동맥의 수준에서 잘라. 즉시 얼음처럼 차가운 KH 버퍼 가득 해부 요리 중 하나에 심장과 폐를 전송합니다.
- 심장 박동이 정지 한 후, 두 번째 해부 접시에 전송하고 얼음처럼 차가운 KH 버퍼에 잠긴 마음을 유지하면서 부착 된 폐 조직의 큰 조각을 잘라. 이 하강 컷바로 대동맥 궁 위의 대동맥을 보내고.
주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다. - 따뜻한 버퍼 대동맥 캐뉼라를 채우기 위해 여전히 튜브에 존재할 수있는 임의의 물 또는 공기를 제거하기 위해 관류 장치의 대동맥 라인 플러시. 관류 완충액 심장 캐뉼라에 부착 될 때 공기 색전증의 가능성을 최소화하기 위해 대동맥 캐뉼라로부터 떨어 뜨리지.
- 이 마이크로 해부 집게를 사용하여 조심스럽게 대동맥을 열고 대동맥 정맥에 마음을 밀어 넣습니다. 마이크로 클립 캐 뉼러에 대동맥을 고정하고 심장을 Langendorff 관류를 시작합니다. 심장이 다시 박동을 시작하고 관류의 시작 부분에 다음과 같은 초에서 관상 동맥 혈관에 남아있는 모든 피를 추방 관찰한다.
참고 :이 단계 4를 수행하는 것이 매우 중요합니다.심장 비가역 허혈성 손상을 막기 위해 가능한 한 빨리 4.10 내지 6. 경험을 바탕으로, 전체 절차는 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다. 캐 뉼러에 대동맥을 슬라이딩하면이 대동맥 밸브 심근 혈류 손상 될 수 있으므로, 대동맥 루트를 통과하지 않도록주의. - 3-0 실크 봉합사와 대동맥 캐 뉼러에 대동맥을 묶는와 마이크로 클립을 제거합니다. 폐 정맥을 찾습니다. 그것을 찾을 비 심장 조직을 손질 할 필요가있을 수 있지만,이 캐 뉼러로 좌심방를 연결하는 역할을하므로, 비 심장 조직을 너무 많이 차단하지 않는다.
- 따뜻한 버퍼 심방 뉼러를 채우기 위해 여전히 튜브에 존재할 수있는 임의의 물 또는 공기를 제거하기 위해 관류 장치의 좌심방 라인 플러시. 심장 캐뉼라에 부착 될 때 공기 색전증의 가능성을 최소화하기 위해 장치로부터 임의의 기포를 제거하는 것이 특히주의한다.
- 이 마이크로 해부 forc 사용EPS는 섬세 폐 혈관의 개통을 잡고 심방 정맥에 마음을 밀어 넣습니다. 부드럽게이 단계를 수행 할 수있는 심방 및 / 또는 대동맥 캐 뉼러를 회전시켜 심장의 위치를 변경해야 할 수도 있습니다. 임의의 경우에, 절차는 심장에 과도한 부담을 부과하고 대동맥의 휨이 발생하지 않는 것을 보장한다. 3-0 실크 봉합사와 심방 정맥에 좌심방을 묶어.
- 심방 줄을 열고 동시에 작동 모드로 랑겐 돌프 모드에서 대동맥 라인을 전환합니다. 아웃 좌심방에서 버퍼 누출, 심방 라인을 닫습니다 랑겐 돌프 관류에 대동맥 라인을 전환하고, 정맥에보다 안전하게 좌심방를 연결하는 또 다른 3-0 실크 봉합사를 사용하는 경우.
심장 기능 및 시료 채취 5. 측정
주 : 대사 플럭스의 판정이 관상 흐름 (CF)에 대한 지식을 필요로한다. 후술하는 바와 같이, 혈류 값이 가능스톱워치의 간단한 사용으로 얻을. 또한, 동일한 방법으로 동맥 유량의 측정 (AF)은 그 다음에 적용하여 심장 기능의 일반적인 수단으로 심장 전원 (CP)를 계산하는데 사용될 수 심 박출량 (CO = CF + AF)의 판단을 허용 화학식 CP = CO (3 m / s) * 후 부하 (PA). 심장 기능의 평가 가능한 다른 방법은 압력 변환기와 맥압의 실시간 측정 (도 3 및 4)에 의존한다. 선택적이지만, 좌심실 수축기 및 확장기 함수의 결정을 포함한 심장 수축 기능과 혈역학의 가장 정확하고 상세한 측정은 감압 체적 (PV) 컨덕턴스 카테터의 사용으로 달성 될 것이다. 이 절에서는 고립 된 마음의 카테터를 설명합니다. 할 수 있습니다 통계 소프트웨어와 PV 카테터의 교정 및 데이터 분석에 대한 추가 정보참고 문헌 14, 15에서 발견.
주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다.
- 실험이 카테터와 LV 기능의 직접 측정을 포함하는 경우, 26 G 바늘로 LV의 정점에 구멍과 구멍을 통해 카테터를 소개합니다.
- 압력 볼륨 카테터를 사용하면 그 샤프트 선단부 오른쪽 대동맥판 아래에 전극과 내막 경계에 인접하고 바로 심실 벽 내부 근위 전극은 LV 종축과 정렬되도록 신중 카테터를 위치.
- 물 재킷 심실에 중심을 밀봉 및 상기 데이터 수집 소프트웨어와 심장 기능 파라미터를 모니터링한다. 기준 파라미터 심장 이상을 5 분 동안 안정적인 한 후에 촬영을 시작.
- MEA에 의해 관상 동맥의 흐름을 결정심실 아래에 부착 된 20 mL의 주사기 튜브를 채우기 위해 요구되는 시간을 가감하는. 측정 후, 액체 방사성 폐기물 용기에 관상 동맥 유출 물을 비우 삼방 콕을 열어.
주 : 유량 측정은 유량계와 flowprobes을 사용하여 수행 될 수있다. - 이 중심부를 종료 관상 유출 ~ 2 mL로 복구 삼방 스톱 콕의 사이드 아암에 부착 된 3 ㎖ 주사기를 사용한다. 2 ml의 캡이 microcentrifuge 관에 관상 유출의 0.5 ml에 전송하고 즉시 포도당 산화의 비율 (아래 제 6 조)의 결정을 진행합니다.
- 적절하게 레이블이 microcentrifuge 관에 관상 유출 시료 (~ 1.5 ㎖)의 나머지 부분을 전송하고 얼음에 저장합니다.
- 반복 5.4 관류 실험이 끝날 때까지 일정한 간격 (예 : 매 5 또는 10 분)에서 5.6 단계를.
- 압력 볼륨 카테터를 사용하는 경우, 고장 성 식염수 10 ㎕를 볼 러스 주입 (15 %)심방 라인에 오른쪽 실험을 체결하기 전에 심방 정맥 전에. 심장 볼륨 (15)의 정확한 결정에 중요한 병렬 전도도 (V의 p)를 계산하기 위해이 일시 주사를 사용합니다.
- 심실 개봉 한 실험에 사용 된 경우, LV에서 카테터를 제거한다. 다음 방법 중 하나를 사용하여 심장 복구 :
- 이 다운 스트림 분석에 대한 마음의 특정 영역을 분리 할 필요가없고 관류 장치는 즉시, 가까운 심방과 대동맥 두 줄을 허용하고있는 경우 Wollenberger 집게 사용하여 캐 뉼러에 마음을 동결 클램프 경우 액체 질소에 미리를 냉각.
- 또는, 캐 뉼러 떨어져 심장을 잘라 얼음처럼 차가운 KH 버퍼에 놓습니다. 빠르게 종이 타월에 마음을 건조하고 습 중량을 측정한다. 심장 후 해부 조직 샘플은 특정의 측정으로 수집 될 수있다. Wollenberger 통을 사용하여 나머지 조직을 동결의 액체 질소에 미리가 냉각.
- 건조 중량 (섹션을 8 계산 참조)의 결정 때까지 -80 ºC에서 얼어 붙은 심장 조직을 저장합니다.
심근 포도당 산화 요금 6. 결정
참고 :이 방법은 hyamine의 수산화 트래핑 솔루션 관상 유출에서 14 CO 2의 양적 회복으로 구성되어 있습니다. H (14) CO3-이 과염소산와 버퍼의 산성화 다음 회수로 14 CO 2 용해. 샘플은 시간이 지남에 14 CO 2의 손실이 발생할 것입니다 공기와 시료 사이의 가스의 수동 확산 그들의 복구 후 즉시 처리해야한다. 섬광 바이알 단단히 과염소산을 첨가 한 후 14 CO 2의 손실을 방지하기 위해 고무 슬리브 마개로 밀봉한다. 필요한 경우, 파라 필름으로는 고무 슬리브 스토퍼를 고정하는데 사용될 수있다유리 병 (그림 2).
- 유리 섬광 유리 병에 hyamine의 10 배 농축 된 수산화 (샘플 당 하나의 유리 병 + 배경 활동의 결정에 대한 두 개의 여분의 튜브)의 1 ML을 추가합니다.
주의 : hyamine의 수산화 매우 독성이 심한 화상을 일으킴. 적절한 취급 및 보관에 대한 제품의 MSDS를 참조하십시오. - 사용 핀셋 섬세 유리 병 hyamine의 수산화 프리 필드에 0.5 ml의 관상 유출 샘플을 포함하는 2 ml의 캡이 microcentrifuge 관을 전송합니다. 배경 활성의 결정을 위해 0.5 ml의 관류 완충액을 사용한다.
- 고무 슬리브 마개 유리 병 캡. 파라 필름은 유리 병의 밀봉을 확보하기 위해 사용될 수있다. (% w 60 % w) 고무 슬리브 스토퍼를 통해 직접 2ml의 캡 튜브에 1 ㎖의 주사기 23 G 긴 바늘을 사용하여, 과염소산 200 μL를 주입.
참고 : 관상 동맥 유출로 인해 BSA의 침전에 흰색 설정해야합니다. - 유리 병의의를하자그것은 하룻밤.
주의 : 과염소산가 매우 부식성이 산화제 역할 및 / 또는 폭발의 위험이 있습니다. 적절한 취급 및 보관에 대한 제품의 MSDS를 참조하십시오. - 다음 날, 고무 슬리브 마개를 제거합니다. 조심스럽게 핀셋 각 2 ml의 캡 튜브를 검색하고 hyamine의 수산화물을 모두 검색 1 ML의 섬광 칵테일 오픈 유리 병의 상단에있는 튜브의 바닥을 씻는다. 적절하게 레이블 방사성 폐기물 용기에 캡 튜브를 폐기하십시오.
- 유리 병 당 추가 9 ML의 섬광 칵테일을 추가합니다. 특정 활동의 결정에 10 ml의 액체 섬광 칵테일로 채워진 두 개의 유리 병에 직접 0.5 ml의 관류 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 손으로 튜브를 흔들어 기포가 적절하게 이중 라벨 실험 설정 액체 섬광 계수기에서 측정하기 전에 방출 할 수 있도록 적어도 6 시간을 기다립니다.
참고 : 북동를 시각화하기 위해 투명 유리 병을 사용하여edle 고무 슬리브 스토퍼를 관통 할 때. 이 반응을 망칠 것 같은 hyamine의 수산화에 과염소산을 떨어 뜨리지 마십시오. 과염소산 출시 공기에 관상 유출에서 14 CO 2를 추가. 바이알을 밀봉되어야하며 14 CO 2 모두 수산화 hyamine으로 포획해야하지만,이 화학 퓸 후드이 분석을 수행 할 것을 권장한다.
심근 올 레이트 산화 요금 7. 결정
주 : 상기 방법은 강한 음이온 교환 수지를 사용하여 관상 동맥 유출 물로부터 3 H 2 O의 정량적 인 분리 및 회수에 근거한다. 14 CO 2의 복구와는 달리, 어떠한 샘플 안정성 문제가없고, 관상 동맥 유출 물을 분석을 수행하기 전에 얼음에 보관 또는 냉동 장치에 저장 될 수있다.
- 음이온 교환 수지 컬럼 (샘플 + t 당 하나의 열을 준비유리솜으로 3 ㎖ 주사기 튜브의 팁을 작성하여 백그라운드 활성의 측정)에 대한 여분의 열 WO. 수지가 주사기 튜브에 2 ml의 마크에 도달 할 때까지 전송 피펫 수지 / 물 슬러리를 추가합니다.
- 컬럼을 통해 2 ML의 초순수를 전달하여 수지를 씻으십시오. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 열에서 열린 섬광 유리 병을 넣고 0.5 ml의를 열 당 관상 동맥 유출 물을 넣습니다. 배경 활동의 결정을위한 0.5 ml의 관류 버퍼를로드합니다.
- 0.5, 1 및 2 mL의 초순수로 순차적으로 열을 씻는다. 용출이 완료되면, 적절하게 레이블 방사성 폐기물 용기에 열을 폐기합니다.
- 섬광 바이알 당 13 ml의 액체 섬광 칵테일을 추가합니다. 특정 활동의 결정에 13 ml의 액체 섬광 칵테일로 채워진 두 개의 유리 병에 직접 0.5 ml의 관류 버퍼를 추가합니다. 적극적으로 튜브를 흔들 액체 공상 과학에서 측정하기 전에 적어도 6 시간을 기다려야ntillation 카운터는 적절하게 이중 라벨 실험 설정합니다.
8. 계산
- 아직 수행하지 않으면 전체를 관류 마음의 습 중량을 결정합니다.
참고 : 분자 생화학 적 분석 이후에 남아있는 조직에서 수행 될 경우 냉동 조직이 해동하는 것을 허용하지 않습니다. - 전체 관류 심장에서 조직 샘플의 젖은 무게를 결정 (전체 심장의 약 15 ~ 30 % 사용). 밤새 50 ℃에서 오븐 세트에서 조직 샘플을 배치 및 건조 중량을 측정한다. 그램 전체 심장의 건조 중량을 결정하기 위해 조직 샘플의 습윤 중량 / 건조 중량비를 사용하여 (g 건조 중량)..
- 각 시점 x에 대하여 ㎖ / 분의 혈류 CF (X)의 값을 표현한다.
- 글루코스 산화 속도의 결정
- determi하는 14 C의 배경 활동에 대한 측정이 붕괴 / 분 (DPM) 값을 평균보정 계수 (14C)의 DPM 바 북동.
- 14 C 특정 활동 (14C)의 DPM의 SA의 값을 평균 결정합니다.
- 공식을 적용하여 DPM / μmol (F 글루)에서 포도당의 특정 방사능을 결정
참고 : 여기서 n 글루 (μmol) = C 글루 (μmol / L) * 샘플 볼륨 (L) = 2.5 5 밀리몰 / L에서 포도당을 사용하여 0.5 ml의 샘플. - 수식을 적용하여 DPM / 분 (A) 14 CO 2의 생성 속도 X 각 시점에 대한 결정
참고 : 어디 권 × (㎖) = 0.5 - 건조 중량 심장의 결정된 값 나누기 A는 CO 2 (14)의 제조의 정규 유속 (A 규격을 얻었다
- GO는 규범 / F의 Glu가 g 건조 중량 당 포도당 / 분의 μmol의 포도당 산화 (GO)의 속도를 얻을 수 = 공식을 적용합니다.
- 올레산 산화 속도의 결정
- 보정 계수 3H의 DPM 바을 결정하는 3 H의 배경 활동에 대한 측정이 붕괴 / 분 (DPM) 값을 평균.
- 3 H 특정 활동 3H의 DPM의 SA의 값을 평균 결정합니다.
- 공식을 적용하여 DPM / μmol (F 안녕, 전자)의 올레 에이트의 비 방사능을 결정
참고 : 여기서 n 올레 (μmol) = C 올레 (μmol / L) * 샘플 볼륨 (L) = 0.2 0.4 밀리몰 / L에서 올 레이트를 사용하여 0.5 ml의 샘플. - 각 팀에 대한 결정E 지점 DPM / 분 (B) 2 O 수식을 적용하여 3 H의 생성 속도를 X
참고 : 어디 권 × (㎖) = 0.5 - 건조 중량 심장의 결정된 값에 의해 나누기 B은 건조 중량 g 당 DPM / 분에서 3 H 2 O (B 놈)의 제조 정규화 레이트를 얻었다.
- = B 규격 / F 올레가 g 건조 중량 당 올레 에이트 / 분의 μmol에 올 레이트 산화 (OO)의 속도를 얻기 위해 공식 OO을 적용합니다.
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Representative Results
두 대표 실험은 아래 그림에 설명되어 있습니다. 두 경우 모두, 16 주령의 수컷 스프 라그 돌리 래트의 심장을 분리하고, 선행하는 프로토콜에 따라 제조 KH 완충액 작업 모드 관류. 각 실험에서, 심장 심장 작업에 영향을 미치는 응력 상태로 하였다. 심장 수축 기능 대동맥 라인의 압력 센서의 삽입을 통해 심장의 전력 측정하여 맥압의 연속 촬영에 의해 평가 하였다. 에너지 제공 기판의 사용의 각 스트레스 조건의 결과를 동시에 포도당과 올레산의 산화 속도를 측정함으로써 결정 하였다.
첫 번째 실험에서, 부하의 급성 증가가 40 %로 후 부하를 증가시킴으로써 거의 생리 부하에서 20 분 재관류 후 모의 하였다 (수동에 의해 달성대동맥 오버 플로우 챔버를 상승) 및 재관류 버퍼 (그림 3A)에 에피네프린 (1 μmol / L)을 추가하여. 맥압 트레이스의 피크 수축기 혈압 값 사이의 간격을 측정함으로써 결정될 수있다 심박수, workjump 유도 (도 3b)에 50 % 이상 증가 즉시. 글루코스 산화 올레산 (도 3c) 모두 가격의 증가를 수반 하였다 workjump에서 40 % 이상 증가한 심박 전원. 결과는 부하의 증가의 급성 스트레스, 심장을 빠르게 포도당 지방산 산화에서 모두 수축 에너지 생성을 증가시키는 적응 것을 보여준다. 그러나, 산화 속도의 상대적인 증가는 올 레이트 (~ 1.3 배)에 대한보다 포도당 (~ 2.8 배) 더 중요했다. 여분의 작업 부하에 대처하는 탄수화물의 산화에 증가 의존 압력 과부하 포유류의 심장 (18)의 전형적인 특징이다
두 번째 실험에서, 심장을 15 분의 총이어서 20 분 동안 초기 조건으로 관류시키고, 30 분의 재관류 (도 4a) (심방 대동맥 라인 모두 폐쇄에 의해 유도 된) 글로벌 정상 체온 허혈. 이러한 실험 조건에서 거의 정상 맥압 재관류의 시작 (도 4b)이 후, 3 분 사이에 회복되었다. 심장 전원이 신속하게 가까운 기준 값 (그림 4C)로 다시 하락하기 전에 재관류의 첫 10 분 동안 전 허혈 값 이상으로 증가. 글루코스 산화가 빠르게 레벨 허혈 미리 반면 반품 기준선에 비해 올레인산 산화 속도는 재관류 중에 증가 하였다. 동시에 수축 기능 일 수 명확 기판 모두 산화 속도를 측정함으로써 알 즉, 본 실험 조건에서는 지방산 OXID의 비율의 변동ATION 재관류 발생 일의 양의 변화에 대한 주요 결정 인자이다. 지방산 이용 후 허혈을 향해 더 높은 스위치는 재관류 심장 (19)의 잘 estalished 기능입니다.
그림 1 :. 격리 된 작업 쥐 심장 장치의 체계 단순화는 지방산-BSA 용액으로 보충 크렙스 - Henseleit 버퍼 막 형산 통과하여 산소된다. 거의 생리적 조건에서 관류 쥐의 심장에 대한 일반적인 심장 프리로드와 후 부하 값이 표시됩니다. 이 설정은 저장 심방 대동맥 플로우 챔버의 높이를 조절함으로써 변형 될 수있다. 졸업 주사기 튜브 각각 관상 동맥 유량과 유량을 측정하기 위하여 심실과 대동맥 플로우 챔버의 아래에 배치되어있다. 흐름버퍼 (대동맥 및 관상 동맥의 흐름을 측정 할 때)를 중지하거나 삼방 스톱 콕을 사용하여 (작동 모드로 전환하는 경우 랑겐 돌프) 라우팅 할 수있다. 빨간색 화살표는 인라인 산소 microlelectrodes는 "동정맥"산소 차이를 결정하기위한 최적의 위치를 나타냅니다. 인라인 플로우 프로브 및 압력 변환기 심방 대동맥 유량 및 압력 (초록색 화살표)를 모두 측정하는 예압 및 후 부하 라인에 배치 될 수있다. 좌심실 압력과 부피는 좌심실의 정점을 삽입 PV 카테터로 기록 될 수있다. 그림에 표시되지는 모든 유리 요소와 어두운 푸른 색의 관류 튜브를 둘러싸고있는 워터 재킷이다. 이 물 재킷 요소는 모두 37 ºC로 설정 순환 물을 욕조에 튜브를 통해 직렬로 연결되어있다. t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그의 그림.
그림 2 :. 이산화탄소 트랩의 설치에 관련된 다른 단계의 표현 (A)는 hyamine의 10 배 농축 된 수산화 1 ML을 추가합니다. (B) 캡이없는 튜브에 포함 된 0.5 ml의 샘플을 추가한다. (C) 유리 병을 밀봉합니다. (D)는 과염소산 200 μl를 주입 (60 % w % w). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Workjump 실험의 대표 결과 맥압의 (A) 연속 녹화.. (B)에서 짧은workjump 개시시의 펄스 압력 변화를 묘사 terval 기록. (C) 포도당 산화 (원 빨간색 추적)과 올레산 산화 (사각형 블루 추적)의 심장 요금은 5 분 간격으로 관상 유출의 분석에 의해 결정되었다. 심장 전력 (삼각형 검은 색 추적) 관상 유출 물 샘플을 회수하고, 동시에 심 박출량을 측정하여 결정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 허혈 - 재관류 실험의 대표 결과 (A) 맥압의 연속 녹화.. (B) 수축 기능의 회복 뒤 묘사 짧은 간격 녹화재관류의 첫 번째 5 분 반지. (C) 포도당 산화의 심장 요금 (원 빨간색 추적)과 올레산 산화 (사각형 블루 추적) 분석을 수행 하였다 재관류의 첫 5 분 동안을 제외하고는 5 분 간격으로 관상 유출의 분석에 의해 결정되었다 1 분 간격. 심장 전력 (삼각형 검은 색 추적) 관상 유출 물 샘플을 회수하고, 동시에 심 박출량을 측정하여 결정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜을 동시에 분리 작업 쥐 심장 글루코스 산화 및 지방산 산화를 통해 기판의 광속을 정량화하는 방법을 자세히. 측정은 (... 등의 부하 변화, 허혈 재관류) 기준선 스트레스 조건 하에서 기판 대사 심장 워크 간의 관계를 결정하기 위해 기록 된 심장 기능 파라미터에 중첩 될 수있다. 이는 대사 / 수축 관계 심부전 및 당뇨병과 같은 기존의 상태에 의해 영향을받는 방법을 평가하는 것도 가능하다. 또한, 유전자 변형 된 쥐의 심장 심장 대사와 기능의 특정 단백질의 효과를 심문하는 데 사용될 수있다. 최근, 이들 매개 변수에 대한 다른 약물과 순환 요인의 영향이 개별적으로 시험 될 수있다. 당분 통한 글루코스의 흐름은 항상 글루코스 산화의 속도와 상관 관계가 없기 때문에, 그것은 수있다 인포하나의 실험 설정에서 두 경로를 통해 포도당 플럭스의 속도를 따라 포지티브,.
3 H 2 O의 방출은 해당 작용 (20)의 공정에 놀라 제의 활성에 의해 결정되기 때문에 해당 작용의 비율은, 재관류 버퍼 [5- 3 H] 글루코스를 첨가하여 측정 할 수있다. 당분 해 경로의 포스 이성화 단계에서 3 H 2 O의 제조에 이르게 대안 [2-3 H] 글루코오스, 심장 근육 16,17,21 글루코스 흡수율에 신호하는데 사용될 수있다. 그 이화 다른 수준의 글루코스의 운명을 조사하기 위해 여러 방사성 추적자를 선택할 수있는 가능성이 기술의 다양성의 또 다른 예이다. 그러나, 모든 광속 측정 3 H 하나의 정량적 회수에 의존하기 때문에 관상 동맥 유출 물로부터 2 O 14 CO 2, 두 방사성ED 추적기 (한 3 H가 표지 된 14 C로 표지 다른 하나)을 한번에 관류 완충액에 사용될 수있다.
방법 론적 고려 사항
이 프로토콜을 사용하여 심장 대사 플럭스와 기능의 측정에 몇 가지 본질적인 한계가있다. KH 버퍼의 사용이 관류 액의 조성물을 통해 총 제어 할 수 있지만,이 실험 장치의 생리 학적 관련성을 의심 할 수있다. 첫째, 혈액을 통해 결정질 용액의 사용을 부정적으로 허혈 22,23 심장 혈역학 및 내 충격성 알려져있다. 둘째, 여기에서 설명하는 관류 완충 직접 심장 대사를 조절하고 따라서 모의 응력 상태로 심장의 반응에 영향을 미칠 수있는 호르몬과 영양분 다양한 없다. 실제로, 포유류의 심장은 신진 대사 잡식 동물이고, 포도당과 지방산 외에, f를 다른 기판을 이용할 수있다에너지 요건 (젖산, 피루브산, 케톤체, 분지 쇄 아미노산) ulfill. 이들 기판의 일부는 심장 질환 (24, 25)의 개조 대사에 중요한 역할을 장착 증거가있다. 연구자가, 관류 버퍼에이 기판을 추가하는 것이 더 밀접하게 서로 다른 생리 학적 조건 (예를 들어 공급 금식 상태에 비해 상태) 또는 질병 상태를 모방하기 위해 자신의 농도를 조절하는과를 사용하여 산화의 자신의 속도를 따라하는 것은 전적으로 가능하다 적절한 방사성 추적자 (26, 27). 중성 지방의 대사는 추적 될 수 있고, 그 경우에 내피에서 지단백질 리파제의 방출을 유도하고 상당히 버퍼에서 트리글리세리드의 추출을 감소하므로 심장 절제 전에 헤파린의 사용을 피해야 28. 방사성 표지 추적자의 신중한 선택, VAR에 방사능의 결합으로IOU를 조직 대사 산물은 또한 새로이 합성 트리글리 세라이드, 글리코겐 회전율 또는 단백질 합성 18,29,30의 비율 등의 파라미터를 결정하는 관류 후 측정 할 수있다. 즉, 연구자는 기판 / 호르몬 조합 및 농도의 다양한 작업을 할 수있다. 상기 버퍼 조성물의 선택은 대부분의 실험 목적에 따라 달라질 것이다. 이러한 제어 버퍼 조건이 "단순화"생리 학적 모델을 만들기 때문에, 생체 작업 심장 관류 실험은 신중하게 해석되어야하며, 가능하면 데이터가 추가로 생체 내에서 검증해야합니다에서 발생합니다.
마취의 선택
종래 심장 절제에 래트에서 사용되는 마취제는 신중하게 수행되는 실험을 방해하지 않도록하는 심폐 기능과 대사에 미치는 영향에 기초하여 알려진 선택되어야에디션. 모두 주사와 inhalational 마취 빠르게 관류 (31, 32) 중 심장 신진 대사에 영향을 미칠 수 고혈당과 포도당 불내성의 변수도 유도한다. 다른 에이전트에 비해 글루코스 항상성에 바르 비탈 (펜토 바르 비탈 및 thiobutabarbital)의 단기 효과는 31 상대적으로 미미하다. 그러나, 종래의 심장 절제에 복강 내 펜토 바르 비탈 마취는 심 박출량을 감소 좌심실 기능 손상, 허혈 재관류 (33)의 생체 외 프로토콜 심근 락트산 방출을 증가시키는 것으로 나타났다. 펜토 바르 비탈의 적출 심장에 미치는 부정적인 효과는 수축성 약물 (34)의 조직 축적에 의한 것으로 제안된다. 반대로 더 빠르게 심장 조직으로부터 세척 inhalational 마취제의 사용은 생체 (33)보다 수축 기능과 연관된다. 휘발성 마취제 실제로 캘리포니아를 제공 할 수있다미토콘드리아 K ATP 채널의 개구를 포함하는 메커니즘을 통해 허혈 - 재관류 동안 rdioprotection 및 32 미토콘드리아하는 헥소 키나제의 결합을 증가했다. 요약하면, 격리 된 작업 심장 재관류 프로토콜에서 사용되는 마취제의 종류 직접 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 기능 및 대사 두 파라미터의 평가에 중요한 변수이다. 따라서, 종류와 사용 마취제의 용량은 항상 실험의 방법 섹션에보고되어야하고, 이러한 매개 변수와 비교하는 의미 실험 사이에서 변화되지 않아야한다.
심장 관류에 방사성 동위 원소
선행하는 프로토콜을 수행 전체 광속 측정은 관상 동맥 유출 물 대신에, 버퍼 탱크 (도 1)에 반환되는 폐기 즉, 비 - 순환 모드로 수행된다. 조사관이 아니라 할 수있다버퍼 작동 따라서 방사능 훨씬 작은 부피를 필요로한다는 이점을 갖는 순환 모드에서, 관류 장치를 사용하도록 선택한다. 그러나, 관상 동맥 유출 물을 재활용하고 심장의 대사 활동에서 발생한 부산물의 회수를 통해 관류 완충액의 정상 조성물 타협 (락 테이트를 포함하지만,도 3 H 2 O 및 H 14 CO3-)의 결정을 복잡 신진 대사 플럭스도 시간 35 동안 심장 기능을 변경할 수 있으며. 이러한 문제는 비 재순환 모드에서 방지된다. 대사 흐름 분석에 작업 쥐의 심장을 사용하는 경우 때문에 방사능의 양에 단일 실험에 사용 된 관류 버퍼의 큰 볼륨으로, 연구자는 특히주의해야합니다. 처음 관류 장치를 이용하면,이 익숙해 비 방사성 버퍼 몇몇 모의 실험을 수행 할 것을 권장프로토콜 및 안전 절차와 상이한 단계. 이 누설 또는 심장의 절단 된 혈관 중 하나에서 쏘고있다 버퍼 장치와 때문에 가까이 접촉을 확립이 필요하기 때문에 캐 뉼러에 마음의 장착은 특히 민감한 단계입니다. Taegtmeyer 동료 (11)에 의해 설명 된 관류 장치는 관류 장치의 나머지 부분과 완전히 독립된 랑겐 돌프 저장조 등의 이점을 가지므로, 마음의 삽관시에 방사성 물질의 유출을 방지하기 위해 비 - 방사성 KH 버퍼로 채워질 수있다 . 에 관계없이 사용되는 시스템의 실험은 제한된 액세스 할 수있는 전용 지역에서 수행해야합니다. 객실은 싱크대, 같은 지역에있는 버퍼 준비 및 오염 된 장비의 세척을 수행 할 수있는 초순수의 공급을 포함해야한다. 수사관의 설정들은 기관의 방사선 안전 사무실과 긴밀하게 협력한다봉쇄, 제어 및 오염 제거 절차 pecific.
관류 장치의 청소
관류 장치의 사후 실험 클리닝 불량 실험 재현성과 관련된 문제의 대부분을 담당 신중하게 실행되지 않는 경우도 종종 간과되는 중요한 단계이다. 영양이 풍부한 관류 완충액 및 관류 시스템의 고온 세균 및 진균의 성장을위한 이상적인 환경을 제공한다. 이 화합물은, 튜브와 유리의 표면에 붙어 그들을 하드 장치 밖으로 플러시하기 때문에 관류 버퍼에있는 단백질의 활용 (인슐린, BSA) 및 지방산은 청소 절차에 복잡성의 또 다른 정도를 추가합니다. 방사성 동위 원소의 사용은 또한 오염 된 장비 및 고체의 처리 조작을 위해 실험실 전용 격납 영역의 생성 등의 추가 제한을 부과D 액체 방사성 폐기물. 따라서, 적절한 세척 과정은 주로 관류 완충액의 조성과 사용되는 관류 장치의 종류에 양쪽에 의존 할 것이다. 상용 장치를 사용하는 경우, 제조업체의 웹 사이트를 확인하거나 장치의 구성 요소에 손상을주지 않고 청소를 수행하는 방법에 대한 정보를 얻기 위해 고객 서비스에 문의하십시오. 일반적으로, 모든 유리 및 플라스틱 부품은 비누의 넓은 범위로 세척 할 수있다. 효소 활성 전원 세제 지방산 BSA의 잔류 물을 제거하는 것이 특히 유용하다. 대부분의 오염 물질은 0.1 M 염산 또는 몇 시간 동안 장치를 통해 0.1 M HNO 3을 실행하여 제거됩니다. 그리고 마지막으로 초순수 시스템을 세정하여 온수 제조 효소 활성 전원 세제 용액 : 우리는 (V W) 신선한 1 %로 한 후, 0.1 M HCl로 제 시스템을 세척하여 양호한 청소 효과를 얻었다. 원래 D 것과 맞춤식 관류 장치 사용시Taegtmeyer 동료 11 escribed, 완전히 각 실험 날 끝에있어서 해체 쉽고 더 효과적 일 수있다. 유리 제품은 크롬산 및 황산 혼합물의 농축 욕에 15 분간 침지하여 세정한다. 플라스틱 부품과 PVC 튜빙은 무 잔류 세제로 세척 할 수있다. 우리는 그것이 radiochemicals 오염 물질의 조작을 제한하기 때문에 전체적으로, 매일 PVC 튜빙을 교체 실제로보다 빠르고 안정하며 뒤에 세제 잔여 물을 방지하기 때문에 이탈하였습니다. 어떤 경우에, 연구자는 다음 규칙을 적용한다 : 1- 청소 관류 장치 및 모든 장치를 오염 즉시 관류 실험을 완료 한 후. 대기 만 청소 더 어렵고 시간이 소비 할 것입니다. 2 - 오염 정기적으로 워터 재킷 시스템의 순환 목욕을 확인합니다. 물 린스를 사용 C 사이의 간격을 증가시킬 것이다수조의 기울고. 3- 세척 후 충분히 수돗물을 여러 번 모든 유리와 튜브를 세척 및 청소 요원에서 잔류 물을 제거하기 위해 초순수로 세척 마무리합니다. 해부 신중 실행 조심스럽게 제조 관류 완충액 (박테리아 또는 용매 잔기 중)에있어서의 오염을 나타낼 가능성이 때 -4- 두 심장 제제를 연속적으로 실패. 이 경우, 세탁 및 헹굼 과정은 완전히 반복해야합니다.
마우스 마음까지 확장
선행하는 프로토콜은 절연 작용 랫트 심장에서 대사율의 판정에 집중되지만, 동일한 절차는 관류 장치와 데이터 수집 장치 (36)에 약간의 수정을 마우스 심장에 적용될 수있다. 그 작은 크기로 인해 격리 된 작업 마우스 마음 때문에 상당히을 기술적으로 더 도전이지만,낮은 유량은 관류 완충액 훨씬 적은 양을 필요로하는 이점을 갖는다. 이미 사용할 수있는 유전자 변형 마우스 모델의 다수는 심장 대사 및 기능 리모델링에 단일 유전자 제품의 기능을 연구하는 격리 작업 마우스 마음이 매우 매력적 수 있습니다. 그러나, 게놈 편집 및 유전자 변형 및 녹아웃 쥐의 빠르게 성장하는 카탈로그에 최근의 기술 발전이 빠르게 두 설치류 종 사이의 격차를하고 있습니다. 또한, 쥐가 오랫동안 병태 생리가 밀접하게 인간의 조건 (37)을 모방하기 때문에 심혈관 질환을 조사하는 우수한 동물 모델로 높이 평가되고있다. 이러한 이유로, 우리는 격리 된 작업 쥐의 심장은 여전히 심장 혈관 연구의 현대 시대에서 중요한 자리를 잡고 있다고 생각합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 ml HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
