Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder for bestemmelse av priser av glukose og fettsyreoksidasjon i isolerte Working Rat Hjerte

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

Abstract

Pattedyr hjerte er en stor forbruker av ATP og krever en konstant tilførsel av energi substrater for sammentrekning. Ikke overraskende forandringer i myokardial metabolisme har vært knyttet til utviklingen av kontraktile dysfunksjon og hjertesvikt. Derfor rakne koblingen mellom stoffskiftet og sammentrekning skal belyse noen av de mekanismene som styrer hjerte tilpasning eller maladaptation i sykdomstilstander. Det isolerte arbeidsrottehjerte preparat kan anvendes for å følge, samtidig og i sanntid, kardial kontraktil funksjon og forandring av energigivende substrater til oksidative metabolske veier. Denne protokoll som mål å gi en detaljert beskrivelse av metodene som brukes til fremstilling og bruk av buffere for kvantitativ måling av satsene for oksidasjon for glukose og fettsyrer, hovedenergigivende substrater av hjertet. Metodene som benyttes for analyse av prøver og data tolkning blir også diskutert.I korte trekk, er teknikken basert på leveranse av 14 C- radiomerket glukose og en tre H- radiomerket langkjedet fettsyre til en ex vivo bankende hjerte via normotermisk crystalloid perfusjon. 14 CO 2 og 3 H 2 O, ende biprodukter av de enzymatiske reaksjoner som er involvert i bruken av disse energi tilveiebringe substrater, blir deretter kvantitativt gjenvunnet fra den koronare avløpet. Med kjennskap til den spesifikke aktivitet av den radiomerkede substrater som benyttes, er det da mulig å individuelt kvantifisere fluksen av glukose og fettsyre i oksidasjonsreaksjonsveier. Kontraktile funksjon av det isolerte hjertet kan bestemmes i parallell med den aktuelle opptaksutstyr og direkte korrelert til metabolske fluks-verdier. Den teknikken er svært nyttig å undersøke metabolismen / sammentrekning forhold som respons på forskjellige stressbetingelser, for eksempel endringer i forhånds og etter belastning og iskemi, et medikament eller et opplagting faktor, eller som følge av endring i ekspresjonen av et genprodukt.

Introduction

klinisk Relevans

I pattedyr hjerte, er det en sterk positiv sammenheng mellom fluksen av substratene gjennom oksidative metabolske veier, ATP generering og hjertearbeid 1. I løpet av de siste to tiårene, har etterforskningen av den intrikate sammenhengen mellom hjerte metabolisme og funksjon førte til erkjenne at endringer i hjerte metabolisme er en årsak til kontraktile dysfunksjon og muligens patologiske strukturelle ombygging i innstillingen av ulike typer hjertesykdom 2-4. derfor er det forventet at vår forståelse av mekanismene som styrer metabolsk ombygging av stresset hjerte vil føre til identifisering av terapeutiske mål for forebyggelse eller behandling av hjertesvikt 5-7. Den nylige utgivelsen av en vitenskapelig uttalelse fra American Heart Association på "Assessing Cardiac Metabolism" understreker den økende interessen av det vitenskapelige samfunn for thans forskningsfelt 8. Men mens de teknologiske fremskritt innen hjerteavbildning nå åpner for en rask og nøyaktig vurdering av hjerte morfologi og funksjon, in vivo studier av hjerte stoffskiftet er fortsatt begrenset og tyngende: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi og Positron Emission Tomography (PET) avbildning kan brukes til å følge hjerte høy energi fosfat metabolisme og Krebs syklus aktivitet, men disse teknikkene er plaget av høye driftskostnader og av deres manglende evne til å bestemme bidraget fra ulike underlag til oksidativ metabolisme i steady-state 9 .For denne datoen ex vivo hjertet preparat representerer den eneste og unike teknikk tilgjengelig for å studere, samtidig og i sanntid, kontraktile funksjon og fluksen av substrater til oksidative metabolske veier 7,9. Følgende protokoll tar sikte på å tilveiebringe retningslinjer i fremstilling og bruk av reagenser benyttet for å bestemme den rottees av substrater utnyttelse i den isolerte arbeidsrottehjerte.

Den Isolert Arbeids Rodent Hjerte Apparatus

Selv om teknikken er nesten et halvt århundre gammel, forblir isolert arbeider rottehjerte forberedelse en metode for valg for kardiovaskulær forskning. Som med den Langendorff-hjerte fremstillingen, arbeids gnager hjertet har en forholdsvis enkel, pålitelig og rimelig måte for å måle et bredt spekter av hjerte parametre uavhengig av de ledsagende virkninger av andre organer, neurohormonal og andre sirkulerende faktorer. Men i motsetning til Langendorff-hjerte perfusert, fortsetter arbeids hjerte å utføre nesten fysiologisk hjertearbeid, er en forutsetning for generering av oksydativ metabolsk flux til nivåer som er relevante for in vivo-betingelser. Dette oppnås ved å levere perfusjon buffer til den venstre ventrikkel (LV) via en kanyle koblet til det venstre atrium, og som LV fylles og trekker seg sammen, ibuffer utstøtes gjennom aorta linje mot en bestemt afterload hydrostatisk trykk. Utformingen av perfusjon apparatet opprinnelig beskrevet av Neely og kolleger 10 ble senere forbedret ved Taegtmeyer, Hems og Krebs 11, men har endret seg lite siden den gang. Som beskrevet i den opprinnelige anordningen kan kontraktile funksjon vurderes ved bestemmelse av hjertets minuttvolum, ved hjelp av ikke mer enn graderte sylindere og en stoppeklokke for å måle aorta og koronar flyter 10,11. Flere leverandører tilbyr nå komplett arbeids gnager hjertet perfusjon systemer. Disse kommersielt tilgjengelig apparat kan bli kjøpt med flowprobes, press transdusere, en trykk volum kateter og alt nødvendig utstyr for hjerte funksjonell datainnsamling og analyse. Leverandørene gir omfattende dokumentasjon og treninger for å lest den nye brukeren med sitt utstyr. Flere oversiktsartikler også detalj protokoller på arbeids hjertet Instrumentering og ved bruk av kateter for å måle hjertefunksjonen hos gnagere 12-15. Av denne grunn, vil vi bare kort nevne oppsett av perfusjon anordningen og registreringsutstyret. Denne protokoll heller tar sikte på å utfylle den allerede tilgjengelig informasjon med en beskrivelse av de metoder som kan iverksettes for å samtidig måle utbredelsen av glukose og langkjedet fettsyre oksidasjon, de to store energi gi underlag i normal hjerte. Vi beskriver her alle trinnene som er involvert i bruk av radiomerkede energi underlag for vurdering av hjerteinfarkt oksidativ metabolisme, fra utarbeidelse av reagenser og buffere til gjenvinning og behandling av prøver, til dataanalyse.

Prinsipper for Method

Cardiomyocytes generere mesteparten av sin energi til sammentrekning fra oksidativ fosforylering av fettsyrer (hovedsakelig langkjedede fettsyrer) og karbohydrater (glucose og laktat). Hjertet har svært begrenset energisk reserver og er avhengig av en kontinuerlig tilførsel av disse energi tilveiebringe substrater fra sirkulasjonen. Nedbrytningen av glukose inn i glykolysen gir pyruvat som deretter dekarboksyleres av pyruvat-dehydrogenase-komplekset av den indre mitokondrie-membran. Langkjedede fettsyrer, hentet fra sirkulerende albumin eller lipoprotein triglyserider, blir først aktivert i acyl-CoA-molekyler i cytosol og senere transportert inn i mitokondrie matrise gjennom karnitin shuttle å gå inn i beta-oksidasjon veien. Den acetyl-CoA-molekyler som produseres ved nedbrytningen av glukose og fettsyrer drivstoff Krebs syklus for å generere de reduserende ekvivalenter (NADH og fadh 2) som benyttes ved elektrontransportkjeden for å bygge det proton-drivkraft på tvers av den indre mitokondrie-membran og generere ATP gjennom aktiviteten av ATP-syntase. Vann og karbondioksyd er biprodukter av endede enzymatiske reaksjoner som finner sted inne i Krebs syklus. Tilgangen på 14 C og 3 H- radiomerkede substrater (for eksempel 14 C-radioaktivt merket glukose og 3H-radiomerket oljesyre) til det isolerte hjertet arbeider vil følgelig føre til produksjon av 14 CO 2 og 3 H 2 O som mulig kvantitativt gjenvunnet fra den koronare avløpet. Samlingen av 14 CO 2 utføres ved å holde det isolert perfusert hjerte inn i et lukket kammer, og ved straks å utvinne den koronare effluenten som kommer ut av hjertet. En liten anionbytterkolonne brukes til å separere og utvinne 3 H 2 O fra den koronare avløpet. Radioaktiviteten av de behandlede prøvene blir målt med en væskescintillasjonsteller, og med kjennskap til den spesifikke aktivitet av den radiomerkede substrater anvendes, er det da mulig å individuelt kvantifisere fluksen av glukose og fettsyre ioksidasjon trasé 16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til NIH Public Health Service politikk på Human Care og bruk av dyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Mississippi Medical Center. Alle prosedyrer som involverer bruk av radioisotoper ble godkjent og utført i henhold til retningslinjer fastsatt av stråling sikkerhet kontoret ved University of Mississippi Medical Center.

1. Utarbeidelse av arkiv Buffer Solutions og reagenser

  1. Krebs-Henseleit (KH) Buffer Stock Solutions
    1. Forbered 2 l av en 20x konsentrert saltstamløsning inneholdende (i mol / l) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH 2PO 4, og 0,0236 MgSO4 * 7H 2 O. Filtrer på 0,45 mikrometer porestørrelse filtreringsenhet og oppbevares ved romtemperatur i opptil en måned.
    2. Forbered 2 l av en 20x konsentrert (0,5 mol / l) oppløsning av NaHCO3. Løsningen kan blioppbevares i romtemperatur for en ubestemt periode.
    3. Fremstille 250 ml av en 1 mol / l stamløsning av CaCl2. Filtrer på 0,45 mikrometer porestørrelse filtreringsenhet og oppbevares ved romtemperatur i opptil en måned.
  2. Omdannelse av anionbytterharpiks fra kloridformen til hydroksidformen
    1. Vask anionebytterharpiksen ved resuspendering det i en L ultrarent vann. La harpiks å bosette og hell av overflødig vann. Gjenta dette trinnet 4 ganger.
    2. Hell harpiksen i en glass-mikroanalyse vakuumfilterholderen er montert på en filtrerings kolbe.
    3. Omdanne harpiksen til hydroksidformen ved sakte å passere gjennom 22 volumer av 1 N NaOH. Bland oppslemmingen intermitterende med en rustfri stålspatel.
    4. Vask harpiksen med ultrarent vann inntil pH-verdien faller under 9,0. Kontroller pH-verdien med jevne mellomrom ved å dyppe en pH-test strimmel nær overflaten av harpiksen oppslemmingen. Dekk og lagre harpiks med ultrarent vann i en boksrosilicate glassflaske og beskytte mot lys. Ikke la harpiksen tørke før bruk.
      MERK: Når lagret på riktig måte, vil harpiksen vare i minst 3 måneder.
  3. Oljesyre-albumin 8x Konsentrert lagerløsning
    1. I et 4 L Erlenmeyer-kolbe, bland 200 ml av 20x konsentrerte saltstamløsning og 200 ml av 20x konsentrert NaHCO3-løsning med 3,6 l av ultrarent vann.
    2. Ved hjelp av en gass-dispersjon rør med en frittet sylinder, gass løsningen i 15 minutter med en blanding av karbondioksid og 5% oksygen 95% for å stabilisere pH-verdien.
    3. Hell 470 ml buffer i en 1-liters begerglass. Legg 8,75 ml av 1 mol / l CaCl 2 stamløsning på 3530 ml buffer som er igjen i 4 liter Erlenmeyer-kolbe og satt til side.
    4. Legg 40 g fettsyre-fri BSA til en L glassbeger og rør med en rørepinne til det er oppløst.
    5. I et 15 ml konisk rør, fremstille 4 ml av en 50% (v: v) etanol-løsning i ultrarent vann. Legg 487 mg natriumsilikofluoridm oleat og vortex til pulveret er fullstendig oppløst.
      MERK: Noen forskere bruker palmitinsyre i stedet for oljesyre i perfusjon buffer. En palmitinsyre-albumin stamløsningen kan fremstilles ved å følge den samme prosedyre. Imidlertid er det anbefalt å varme oppløsningen ved 70 ° C for å oppnå fullstendig oppløsning av natrium-palmitat.
    6. Tilsett oleat oppløsning dråpevis til den fettsyre-fri BSA-oppløsning under konstant omrøring og vente 10 flere minutter for oljesyre-BSA-komplekset å dannes.
      MERK: Oppløsningen skal ha en lys gul farge og være blottet for synlige partikler. Tilstedeværelse av et bunnfall eller uoppløselige partikler kan indikere ufullstendig konjugering av fettsyren til BSA. Hvis dette skjer, skal oppløsningen kastes og prosessen startet på nytt.
      MERK: Palmitate vil utløse hvis det er lov til å sitte i en pipette og kan ikke tilsatt dråpevis. Den omrørte oppløsning av BSA kan være varmet ved 37 ° C for å lette binding palmitinsyre. Ikke overopphetes, da dette kan forårsake denaturering og aggregering av BSA.
      FORSIKTIG: De neste trinnene i denne protokollen innebærer manipulering av radioaktivt materiale. Bruk egnet personlig verneutstyr og følger sikkerhet og avfallshåndtering forskrifter fastsatt av institusjonens strålingssikkerhet kontor.
    7. Legg 160 ul (0,8 mCi) [9,10- 3H] oljesyre til den omrørte oppløsning av oljesyre-BSA og omrør i ytterligere 10 min.
    8. Legg 2,5 ml av 1 mol / l CaCl to lageroppløsning til den omrørte oppløsning av oljesyre-BSA.
    9. Skjær ca 1,2 m dialysemembran rør og skyll både innvendig og utvendig med vann fra springen. Skrubb dialyserøret kraftig under vann fra springen i 10 til 15 minutter for å fjerne glyserol belegg av membranen. Alternativt kan fjerne belegget ved å dyppe dialyseslangen i varmt vann i 1 time før bruk. Avslutt med å skylle dialyserøret med ultra water.
    10. Forsvarlig feste en ende av dialyserøret. Fyll med oljesyre-BSA-oppløsning og feste den andre enden av dialyserøret.
    11. Plasser fylt dialyse slangen inn i 4 L erlenmeyerkolben av KH buffer og la dialyse natten ved 4 ºC under forsiktig omrøring med en rørepinne.
    12. Neste dag, fjerne 8x konsentrert oljesyre-BSA løsning fra dialyserøret. Bruk oljesyre-BSA løsning umiddelbart for perfusjon eller delmengde og oppbevares ved -20 ºC. Frosne aliquoter er stabil i minst 2 måneder. Unngå flere fryse-tine-sykluser, da det kan gå ut over oppløseligheten av oljesyre-BSA-komplekset.
      MERK: Bruk bare ultrarent vann (resistivitet av 18,2 MΩ.cm ved 25 ºC, totalt organisk karbon <10 ppb, mikroorganismer ≤ 1 CFU / ml, partikler med størrelse over 0,22 mikrometer ≤1 / ml) for å forberede reagenser og buffere brukes for hjerte perfusjon. Omdannelsen av anionbytterharpiks fra dets klorid form til hydroksidformen kan unngås ved direkte kjøp av hydroksidformen ved en ekstra utgift (se Materialer tabell). Foruten oleat eller palmitat, kan en hvilken som helst annen type av naturlig forekommende fettsyre også anvendes, så lenge som et tritiert versjon av fettsyren er tilgjengelig for å følge dets oksydasjon.

2. Utarbeidelse av perfusjon buffer

  1. I et 4 L Erlenmeyer-kolbe, bland 200 ml av 20x konsentrerte saltstamløsning og 200 ml av 20x konsentrert NaHCO3-løsning med 3,6 l av ultrarent vann. Gass løsningen i 15 minutter med en blanding av karbondioksid og 5% oksygen 95%, og deretter tilsettes 10 ml av 1 mol / l CaCl2-stamløsning for å innstille konsentrasjonen av fri Ca2 + ved 2,5 mmol / L.
    FORSIKTIG: de neste trinnene skal manipulering av radioaktivt materiale. Bruk egnet personlig verneutstyr og følge sikkerhets og avfallshåndtering forskrifter fastsatt av institusjonens radiation sikkerhet kontor.
  2. Overfør 1,750 L KH-buffer til en 2 liters flaske borsilikatglass. Tilsett 250 ml av 8x konsentrert oljesyre-BSA-oppløsning, 1,802 g D-glukose, 400 ul insulin på 0,4 U / ml, og 200 pl (0,2 mCi) [U- 14C] glukose. Snu flasken for å blande. Dette vil gi 2 liter fullstendig perfusjon buffer inneholdende oljesyre (0,4 mmol / L), D-glukose (5 mmol / L), og insulin (40 uU / ml).
    Merk: Et volum på 2 liter er tilstrekkelig til å gjennomstrømme en arbeider voksen rottehjerte i ikke-resirkulerende betingelser i minst 60 min.
  3. Bruk noen av de ikke-radioaktive KH buffer til å fylle to disseksjon retter og legg på is for å kjøle.

3. Utarbeidelse av Perfusjons Apparatus

MERK: Etterforskeren kan velge å bruke en spesialbygd perfusjon apparat slik som den er beskrevet av Taegtmeyer, Hems og Krebs 11, eller en av de kommersielt tilgjengelige systemer. Perfusjon systemer er vanligvis sammensatt avelementene som er beskrevet i Figur 1 nedenfor. I tillegg til rør og glass, resten av opptaksutstyr er valgfritt og dens utnyttelse vil avhenge av søkerens behov for å ta den eksperimentelle spørsmålet blir stilt. Likevel anbefaler vi bruk av oksygen mikroelektroder for å bestemme konsentrasjonen i bufferen inngåelse O 2 og spennende koronar sirkulasjon (figur 1). Dette vil bidra til undersøkeren styre at hjertet er forsynt med en passende mengde oksygen, og at oksygentilførselen varierer ikke mellom eksperimentene. Dessuten kan bestemmelsen av "arteriovenøse" oksygen forskjell anvendes for å beregne myokardial oksygenforbruk og hjerte effektivitet 16,18.

  1. Skru på sirkulerende vannbad og innstilt på 37 ° C for å varme opp den perfusjon apparat.
  2. Slå på datamaskinen og datainnsamlingssystem som vilbrukes for å måle hjertefunksjonen.
  3. Koble opptak enheter (trykk kateter, trykk-volum kateter, oksygen mikroelektroder, mengdemålere, etc.) til datainnsamlingssystemet og utføre kalibrering av instrumentene etter produsentens anvisninger.
  4. Fyll bufferreservoaret med ultrarent vann. Slå på den peristaltiske pumpen og spyle ut vannet gjennom hele slangen og glass for å skylle systemet. Slå av peristaltiske pumpen og sørge for at ingen vann forblir i slangen og / eller glass, da dette kan påvirke konsentrasjonen av perfusjon buffer og hjertet forberedelse.
  5. Koble en ny 1,0 um glassfiberfilter til systemet. Koble gasstanken som inneholdt en blanding av karbondioksid og 5% oksygen 95% til oksygene kammeret.
    FORSIKTIG: de neste trinnene skal manipulering av radioaktivt materiale. Bruk egnet personlig verneutstyr og følge sikkerhets og avfallshåndtering forskrifter fastsatt av institusjonen'S strålingssikkerhet kontor.
  6. Fyll bufferreservoaret med perfusjon buffer. Skru på pumpen og sikre fylling av alle rør og glass med perfusjon buffer. Kjør perfusjon bufferen via perfusjon anordningen i den resirkulerende modus og oksygenat i minst 30 minutter før bruk.
  7. Tett feste røret i en 20 ml sprøyte under hjertekammeret for å gjenvinne koronar avløpet. Koble tuppen av sprøyten til toppen av en tre-veis stoppekran. Koble sidearmen til en 3 ml sprøyte. Koble den nedre arm via en slange til en beholder for flytende radioaktivt avfall.
    MERK: Ved bruk av fettsyren-BSA kompleks, kan oksygenopptaket i perfusjon buffer ikke utføres gjennom direkte bobler med en gass spredning tube da dette vil føre til overdreven skumming av løsningen. Bruke en membran oksygenator (figur 1) eller et ark strømningsoksygene kammeret for dette formål. Det anbefales sterkt å verifisere at et passende nivå of oksygenering er oppnådd ved å plassere en oksygenmikroelektroden i den perfusjon krets (figur 1).

4. Rat Hjerte Isolasjon og Kanylering

  1. Vei rotte på en skala.
  2. Forbered en sprøyte med bedøvelse dose på 150 mg / kg thiobutabarbital natriumsaltet hydrat og en tuberkulinprøve sprøyte med 200 USP enheter heparin.
  3. Injisere thiobutabarbital IP og vente på at dyret å miste bevisstheten. Andre induksjons midler kan anvendes så lenge dette ikke vil forstyrre den hensikt å forsøket (se Valg av narkosen i diskusjonen nedenfor).
  4. Sjekk for riktig nivå av anestesi ved å bekrefte manglende tå klype refleks. Sørg for å opprettholde riktig anestesidybden for å sikre at dyret ikke føler smerte under inngrepet.
  5. Når rotta er fullt bevisstløs og ikke svarer til tå klype, legg den på ryggen på operasjonsbordet og sekure lemmer med tape eller pinner.
  6. Clip buken fri for hår og utføre en midtlinjen snitt på magen. Ikke åpne brysthulen på dette punktet ennå. Flytt magen og tarmen til side for å avdekke vena cava inferior. Injisere heparin direkte inn i vena cava inferior og vent 5-10 sekunder før du fortsetter.
  7. Ved hjelp av saks skjæres membranen og sidene av brystkassen for å avdekke innholdet i brysthulen.
  8. Delikat ta tak i hjertet mellom tommel, peke- og langfingeren og avgiftsdirektoratet både hjerte og lunger sammen. Kutt på nivå med den synkende aorta, være forsiktig så du ikke skader aortabuen og stigende aorta i prosessen. Umiddelbart overføre hjerte og lunger til en av de disseksjon retter fylt med iskald KH buffer.
  9. Etter hjertet slutter å slå, overføres til den andre disseksjon fatet og klippe av eventuelle store stykker av lungevev festet samtidig som hjerte neddykket i iskald KH buffer. Kutt descending aorta rett ovenfor aortabuen.
    FORSIKTIG: de neste trinnene skal manipulering av radioaktivt materiale. Bruk egnet personlig verneutstyr og følger sikkerhet og avfallshåndtering forskrifter fastsatt av institusjonens strålingssikkerhet kontor.
  10. Spyl aorta linje av perfusjon anordningen for å fylle den aortiske kanylen med varm buffer og for å eliminere eventuelle vann eller luft som fremdeles kan være til stede i produksjonsrøret. Tillate perfusjon buffer for å dryppe fra den aortiske kanylen for å minimalisere sjansen for luft embolier på det tidspunkt hjertet er festet til kanylen.
  11. Ved hjelp av to mikro dissecting pinsett åpne nøye aorta og skyv hjerte opp på aorta kanylen. Fest aorta på kanylen med en mikro klipp og initiere Langendorff perfusjon av hjertet. Observer hjertet begynner å slå igjen og utvise alt blodet som er igjen i koronar blodkar i sekundene etter begynnelsen av perfusjon.
    MERK: Det er svært viktig å utføre trinn 4.6 til 4,10 så raskt som mulig for å forhindre irreversibel iskemisk skade på hjertet. Med erfaring, bør hele prosedyren tar mellom 1 og 2 min. Når du skyver aorta opp på kanylen, være forsiktig med å passere aortarot da dette kan føre til hjerteinfarkt hypoperfusjon og skader på aortaklaffen.
  12. Bind aorta til aorta kanylen med en 3-0 silke sutur og fjern micro klippet. Finn lungevene. Det kan være nødvendig å trimme de ikke-kardiale vev for å finne den, men ikke skjære for mye av de ikke-kardiale vev som de vil tjene til å binde venstre atrium til kanylen.
  13. Skyll venstre atrial linje av perfusjon anordningen for å fylle den atriale kanylen med varm buffer og for å eliminere eventuelle vann eller luft som fremdeles kan være til stede i produksjonsrøret. Være spesielt forsiktig for å fjerne luftboblene fra anordningen for å minimalisere sjansen for luft embolier på det tidspunkt hjertet er festet til kanylen.
  14. Ved hjelp av to mikro dissekere forceps delikat ta tak i åpningen av lungevene og skyv hjerte opp på atrial kanyle. Det kan være nødvendig å omplassere hjertet ved forsiktig rotering av atrial og / eller aortiske kanylen for å utføre dette trinnet. I alle fall sørge for at prosedyren ikke pålegge overdreven belastning på hjertet og føre til bøying av aorta. Bind venstre atrium til atrial kanylen med en 3-0 silke sutur.
  15. Åpne atrial linje og samtidig bytte aorta linje fra Langendorff modus til arbeidsmodus. Hvis buffer lekker ut fra venstre atrium, lukke atrial linje, bytte tilbake aorta linje til Langendorff perfusjon, og bruke en annen 3-0 silke sutur å knytte venstre atrium mer sikkert til kanylen.

5. Måling av hjertefunksjonen og Prøvetaking

MERK: bestemmelse av metabolske flukser vil kreve kunnskap om den koronare strømmen (CF). Som beskrevet nedenfor, kan koronare strømningsverdier blioppnådd med enkel bruk av en stoppeklokke. I tillegg vil målingen av aorta-strømnings (AF) med det samme fremgangsmåte tillater bestemmelse av hjertets minuttvolum (CO = CF + AF), som deretter kan brukes til å beregne hjerte strøm (CP) som et generelt mål på hjertefunksjonen ved å anvende formelen CP = CO (m3 / s) * afterload (Pa). En annen metode er tilgjengelig for vurdering av hjertefunksjonen er avhengig av sanntids måling av pulstrykket med en trykkomformer (figurene 3 og 4). Selv om det valgfrie, de mest nøyaktige og detaljerte målinger av kardial kontraktil funksjon og hemodynamikk, herunder bestemmelse av venstre ventrikulære systoliske og diastoliske funksjoner, vil bli oppnådd ved bruk av et trykk-volum (PV) konduktans kateter. Denne delen beskriver kort kateterisering av den isolerte hjertet. Ytterligere informasjon om kalibrering av PV katetre og dataanalyse med statistisk programvare kan værefunnet i referanser 14,15.
FORSIKTIG: de neste trinnene skal manipulering av radioaktivt materiale. Bruk egnet personlig verneutstyr og følger sikkerhet og avfallshåndtering forskrifter fastsatt av institusjonens strålingssikkerhet kontor.

  1. Hvis forsøket omfatter direkte måling av LV-funksjon med et kateter, punktere LV apex med en 26 G nål og innføre kateteret via punktering.
  2. Ved bruk av et trykk-volum kateter, forsiktig posisjonere kateteret slik at dens aksel er innrettet med LV lengdeakse, med den ytre elektrode rett under aortaventilen og tilstøtende til den endokardiale grensen, og den proksimale elektrode rett innenfor den ventrikulære veggen.
  3. Tett hjerte i vannkappe hjertekammeret og overvåke hjerte funksjonelle parametere med datainnsamling programvare. Begynn opptak etter baseline hjerte parametere har vært stabile i mer enn 5 min.
  4. Bestem koronar flyt av measuring den tid som kreves for å fylle 20 ml sprøyte rør festet på undersiden av hjertekammeret. Etter målingen ved å åpne tre-veis stoppekran for å tømme koronar avløpet inn i det radioaktive flytende avfallsbeholder.
    MERK: Strøm målinger kan også utføres ved hjelp av en strømningsmåler og flowprobes.
  5. Bruk 3 ml sprøyte festet til sidearmen av den tre-veis stoppekran for å gjenvinne ~ 2 ml koronar utstrømning som kommer ut av hjertet. Overfør 0,5 ml av koronar avløpet i en 2 ml Fuel mikrosentrifugerør og umiddelbart videre med fastsettelse av satsene for glukoseoksidasjon (§ 6 nedenfor).
  6. Overfør resten av koronar avløpet prøven (~ 1,5 ml) i et hensiktsmessig merket mikrosentrifugerør og lagres på is.
  7. Gjenta trinn 5.4 til 5.6 med jevne mellomrom (for eksempel hver 5 eller 10 min) til slutten av perfusjonen eksperimentet.
  8. Ved å bruke en trykk-volum kateter, injiserer en 10 ul bolus av hypertonisk saltløsning (15%)inn i atrial linje og rett før atrial kanylen før de konkluderer forsøket. Bruk denne bolusinjeksjon for å beregne den parallelle konduktans (V p), som er kritisk for nøyaktig bestemmelse av hjerte volum 15.
  9. Unseal hjertekammeret og fjerne kateteret fra den LV hvis ene ble brukt i forsøket. Gjenopprette hjertet ved hjelp av ett av følgende alternativer:
    1. Hvis det ikke er noe behov for å isolere bestemte områder av hjertet for nedstrøms analyser og hvis perfusjon Apparatet tillater det, nær både atrielle og aorta linjer og straks fryse-klemme midt på sin kanyler ved hjelp av Wollenberger tang på forhånd avkjølt i flytende nitrogen.
    2. Alternativt kuttet hjertet av kanylene og slippe den inn i iskald KH buffer. Raskt tørke hjertet på et papirhåndkle og måle dens våtvekt. Hjertet kan da bli dissekert og vevsprøver samlet for konkrete målinger. Fryse de resterende vev ved hjelp av Wollenberger tongs på forhånd avkjølt i flytende nitrogen.
  10. Oppbevar frosne hjerte vev ved -80 ºC til bestemmelse av tørrvekt (se avsnitt 8. beregninger).

6. Fastsettelse av hjerteinfarkt Glukose Oksidasjon priser

MERK: Metoden består i den kvantitative utvinning av 14 CO 2 fra koronar avløpet med en fangst løsning av kalsiumhydroksid som Hyamine. Den 14 CO 2 oppløst i H 14 CO3- utvinnes etter surgjøring av buffer med perklorsyre. Prøver som skal behandles umiddelbart etter deres utvinning som passiv diffusjon av gass mellom luft og prøve vil resultere i et tap av 14 CO 2 over tid. De scintillasjonsampuller skal være tett forseglet med gummihylse stoppere for å hindre tap av 14 CO 2 etter tilsetning av perklorsyre. Om nødvendig, kan parafilm brukes for å sikre gummihylsen stopperne tilampuller (figur 2).

  1. Tilsett 1 ml av 10x konsentrert hydroksyd av Hyamine til glass scintillasjonsrør (en ampulle per prøve + to ekstra ampuller for bestemmelse av bakgrunnsaktivitet).
    FORSIKTIG: Hydroksid av Hyamine er svært giftig og forårsaker alvorlige brannskader. Se i produktdatablad for riktig håndtering og lagring.
  2. Ved hjelp av pinsett delikat overføre 2 ml Fuel mikrosentrifugerør inneholdende 0,5 ml koronar avløpet prøven til en ampulle ferdigfylt med hydroksydet av Hyamine. Bruk 0,5 ml perfusjon buffer for bestemmelse av bakgrunnsaktivitet.
  3. Lukk glasset med en gummihylse stopper. Parafilm kan anvendes for å sikre forsegling av ampullen. Anvendelse av en 1 ml sprøyte og en 23 G nål lang, injisere 200 ul perklorsyre (60% vekt: vekt%) gjennom gummihylsen proppen og direkte inn i 2 ml Fuel rør.
    MERK: koronar avløp skal slå hvitt på grunn av utfelling av BSA.
  4. La hetteglassene sdet over natten.
    FORSIKTIG: Perchlorsyre er sterkt etsende, kan fungere som en oksidant og / eller føre til eksplosjonsfare. Se i produktdatablad for riktig håndtering og lagring.
  5. Neste dag, fjerne gummihylse stoppere. hente nøye hver 2 ml Fuel rør med pinsett og vaske bunnen av røret på toppen av den åpne ampulle med 1 ml scintillasjons-cocktail for å hente alle hydroksydet av Hyamine. Kast Fuel røret i en hensiktsmessig merket radioaktivt avfallsbeholder.
  6. Legg til en ekstra 9 ml scintillasjonsvæske per hetteglass. Tilsett 0,5 ml buffer perfusjon direkte til to ampuller fylt med 10 ml flytende scintillasjons-cocktail for bestemmelse av den spesifikke aktivitet. Rist hetteglassene kraftig for hånd og vent i minst 6 timer for å tillate luftbobler løse før måling i en væskescintillasjonsteller riktig satt opp for to label eksperimenter.
    MERK: Bruk klare hetteglass til å visualisere neEdle når piercing gummihylsen stoppere. Ikke slipp perklorsyre inn i hydroksid av Hyamine da dette vil ødelegge reaksjonen. Legge til perklorsyre frigjør 14 CO 2 fra koronar avløpet i luften. Selv om hetteglassene skal være tett forseglet, og alle de 14 CO 2 skulle bli fanget inn i Hyamine av hydroksyd, anbefales det å utføre denne analyse under avtrekksskap.

7. Fastsettelse av hjerteinfarkt oleate Oksidasjon priser

MERK: Fremgangsmåten er basert på den kvantitative separering og gjenvinning av 3 H 2 O fra den koronare avløpet ved hjelp av en sterk anionbytterharpiks. I motsetning til gjenvinning av 14 CO 2, er det ingen prøve stabilitetsproblem og den koronare avløpet kan holdes på is eller lagres i fryseren før analysen utføres.

  1. Forbered anionbytterharpiks kolonner (en kolonne per prøve + two ekstra kolonner for bestemmelse av bakgrunnsaktivitet) ved å fylle spissen av 3 ml sprøyte-rør med glassull. Tilsett harpiks / vann-oppslemming med en overføring pipette inntil harpiksen når 2 ml på sprøyten røret.
  2. Vask harpiksen ved føring 2 ml ultrarent vann gjennom kolonnen. Gjenta dette trinnet to ganger til.
  3. Plasser åpne scintillasjonsglass under søylene og laste 0,5 ml koronar avløpsvann per kolonne. Laster 0,5 ml perfusjon buffer for bestemmelse av bakgrunnsaktivitet.
  4. Vask kolonnene suksessivt med 0,5, 1 og 2 ml ultrarent vann. Når elueringen er gjort, kast på kolonnene i et passende merket radioaktivt avfallsbeholder.
  5. Legg 13 ml flytende scintillasjons-cocktail per scintillasjonsglass. Tilsett 0,5 ml buffer perfusjon direkte til to ampuller fylt med 13 ml flytende scintillasjons-cocktail for bestemmelse av den spesifikke aktivitet. Rist hetteglassene kraftig og vent i minst seks timer før måling i en flytende scintillation teller riktig satt opp for to label eksperimenter.

8. Beregninger

  1. Hvis det ikke allerede er gjort, bestemme den våte vekten av hele perfusert hjerte.
    MERK: Ikke la den frosne vev å tine hvis biokjemiske og molekylærbiologiske analyser skal deretter utføres på den gjenværende vev.
  2. Bestem våtvekt av en vevsprøve fra hele perfuse-hjerte (bruke omtrent 15 til 30% av hele hjertet). Plasser vevsprøve i en ovn ved 50 ° C natten over og måle dets tørrvekt. Bruk våtvekt / tørrvektforhold av vevsprøven for å bestemme tørrvekten av hele hjertet i gram (g tørrvekt.).
  3. For hvert tidspunkt x uttrykker verdien av koronar strømning CF x i ml / min.
  4. Bestemmelse av hastigheten for glukoseoksidasjon
    1. Gjennomsnittlig to oppløsningen / min (dpm) verdier målt for bakgrunnen aktiviteten til 14 C til determine korreksjonsfaktoren 14C dpm BA.
    2. Bestem 14 C i gjennomsnitt verdien av spesifikk aktivitet 14C dpm SA.
    3. Bestemme den spesifikke radioaktivitet av glukose i dpm / pmol (F Glu) ved bruk av formelen
      ligning 1
      MERK: Hvor n Glu (umol) = C-Glu (umol / l) * prøvevolum (L) = 2,5 ved bruk av glukose ved 5 mmol / l og en 0,5 ml prøve.
    4. Bestemme for hvert tidspunkt x produksjonshastigheten av 14 CO 2 i dpm / min (A) ved bruk av formelen
      ligning 1
      MERK: Hvor Vol x (ml) = 0,5
    5. Dividere A ved den bestemte verdi av tørr hjertevekt for å oppnå den normaliserte frekvensen av produksjon av 14 CO 2 (A Norm
    6. Bruke formelen GO = En Norm / F Glu å få frekvensen av glukose oksidasjon (GO) i mikromol glukose / min per g tørrvekt.
  5. Fastsettelse av Valuta oleat Oksidasjon
    1. Gjennomsnittlig de to nedbrytings / min (DPM) verdier målt for bakgrunnen aktiviteten til 3 H å bestemme korreksjonsfaktoren 3H dpm BA.
    2. Bestem 3H gjennomsnitt verdien av spesifikk aktivitet 3H dpm SA.
    3. Bestemme den spesifikke radioaktivitet av oleat i dpm / pmol (F Ol e) ved bruk av formelen
      ligning 1
      MERK: Hvor n Ole (umol) = C Ole (umol / l) * prøvevolum (L) = 0,2 ved bruk av oleat på 0,4 mmol / l, og en 0,5 ml prøve.
    4. Bestem for hver time punkt x produksjonshastigheten av 3 H 2 O i dpm / min (B) ved bruk av formelen
      ligning 1
      MERK: Hvor Vol x (ml) = 0,5
    5. Dividere B ved den bestemte verdi av tørr hjertevekt for å oppnå normal-produksjonshastigheten av 3 H 2 O (B Norm) i dpm / min per g tørrvekt.
    6. Bruke formelen OO = B Norm / F Ole å få frekvensen av oleat oksidasjon (OO) i mikromol av oleat / min per g tørrvekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To representative eksperimenter er beskrevet i tallene nedenfor. I begge tilfeller ble hjertet av en 16 uker gamle Sprague Dawley rotter og isolert perfusert i arbeidsmodus med KH buffer fremstilt i henhold til den foregående protokollen. I hvert forsøk ble hjerte underkastet en spenningstilstand for å påvirke hjertearbeid. Cardiac kontraktile funksjon ble målt ved kontinuerlig registrering av pulstrykket ved innføring av en trykkgiver i aorta linje og ved bestemmelse av hjertekraft. Konsekvensene av hver spenningstilstand på utnyttelse av energi tilveiebringe substrater ble samtidig bestemt ved måling av utbredelsen av glukose og oleat oksydasjon.

I det første eksperiment ble en akutt økning av arbeidsmengden simulert etter 20 min perfusjon på nær fysiologisk arbeidsbelastning ved å øke afterload med 40% (oppnådd ved manueltheving av aorta overløpskammeret) og ved tilsetning av epinefrin (1 umol / L) for å perfusjon buffer (figur 3A). Hjertefrekvens, som kan bestemmes ved å måle intervallet mellom peak systolisk trykkverdiene på pulstrykk spor, økte umiddelbart med mer enn 50% ved workjump induksjon (figur 3B). Cardiac kraft økte med mer enn 40% ved workjump, som ble ledsaget av en økning i både priser av glukose og oleat oksidasjon (Figur 3C). Resultatene viser at, under belastning av en akutt økning av arbeidsbelastning, hjertet raskt tilpasses for å øke energigenerering for sammentrekning av både glukose og fettsyre oksidasjon. Men den relative økningen i oksidasjonshastigheten var viktigere for glukose (~ 2,8-ganger) enn det var for oleat (~ 1,3 ganger). Økt avhengighet av karbohydrater oksidasjon til å takle den ekstra arbeidsbelastningen er et typisk trekk ved den trykkbelastet pattedyr hjerte 18

I det andre eksperimentet ble hjertet perfundert i henhold til grunnlinjebetingelser i 20 minutter etterfulgt av 15 min totalt, global, normotermisk iskemi (fremkalt ved å lukke både den atriale og aorta linjer) og 30 minutter reperfusjon (figur 4A). Under disse forsøksbetingelser, ble en tilnærmet normal pulstrykket gjenopprettes mellom to og tre minutter etter starten av reperfusjon (figur 4B). Cardiac makt økt raskt over før-iskemi verdier under de første 10 min av reperfusjon før den falt tilbake til nær-baseline-verdier (Figur 4C). Sammenlignet med baseline, frekvensen av oleat oksidasjon økt i løpet av reperfusjon mens glukose oksidasjon raskt tilbake til pre-iskemiske nivåer. Ved samtidig å måle kontraktile funksjon og begge priser av underlaget oksidasjon kan man tydelig setter pris på at det i dagens eksperimentelle forhold, variasjonen i satsene for fettsyre oxidasjon er den viktigste determinant for endringer i mengden arbeid som genereres ved reperfusjon. Jo høyere bryteren mot fettsyren utnyttelse post iskemi er et godt estalished funksjon i reperfunderes hjerte 19.

Figur 1
Fig. 1: Forenklet Scheme of Isolated arbeidsrottehjerte Apparat for Krebs-Henseleit-buffer supplert med fettsyre-BSA-oppløsning tilføres oksygen ved passering gjennom en membran oxygenator. Typiske hjerteforhåndsinnlaste og afterload verdier for et rottehjerte dynket i nærheten fysiologiske forhold er indikert. Innstillingene kan endres ved å justere høyden på atrial reservoaret og aorta overløpskammeret. Rørene i graderte sprøyter har blitt plassert på undersiden av hjertekammeret og aorta overløpskammeret for å måle koronar strømning og aorta strømning, henholdsvis. Strømmen avbuffer kan stoppes (ved måling av aorta og kransstrømmer) eller omdirigert (når du bytter fra Langendorff til arbeidsmodus) ved bruk av treveis stoppekraner. Røde piler indikerer optimal plassering for in-line oksygen microlelectrodes å bestemme "arteriovenøse" oksygen forskjell. In-line flyt prober og trykkgiver kan plasseres i forspenningspakken og afterload linjer for å måle både atrial og aorta strømningshastigheter og trykk (grønne piler). Venstre ventrikkel trykk og volum kan også tas opp med en PV kateter inn gjennom toppen av venstre ventrikkel. Ikke vist på figuren er vannkappe rundt alle glass elementer og Perfusjonsslangen i mørk blå farge. Disse vannkappe elementer er alle koblet serielt via rør til en sirkulerende vannbad innstilt på 37 ºC. Klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.

Figur 2
Figur 2:. Representasjon av de ulike trinnene involvert i Oppsett av CO 2 Trap (A) Tilsett 1 ml 10x konsentrert hydroksid av Hyamine. (B) Legg en 0,5 ml prøve inneholdt i en Fuel tube. (C) Tett hetteglasset. (D) Sprøyt 200 ul perklorsyre (60% w: w%). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Representative Resultater av en Workjump Experiment (A) Kontinuerlig opptak av pulstrykk.. (B) Kort iintervallet opptak viser forandringen i pulstrykk ved tidspunktet for workjump initiering. (C) Hjerte forekomst av glukoseoksidasjon (rød kurve med sirkler) og oleat oksidasjon (blå kurve med kvadrater) ble bestemt ved analyse av den koronare avløpet ved en 5 min intervall. Cardiac effekt (svart spor med trekanter) ble bestemt ved måling av blodsirkulasjon samtidig koronaravløpsprøver ble gjenvunnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Representative Resultater av en iskemi-reperfusjon Experiment (A) Kontinuerlig opptak av pulstrykk.. (B) Kort intervallopptak som viser utvinning av kontraktile funksjon duringen de første 5 min av reperfusjon. (C) Hjerte forekomst av glukoseoksidasjon (rød kurve med sirkler) og oleat oksidasjon (blå kurve med kvadrater) ble bestemt ved analyse av den koronare avløpet ved en 5 min intervall, unntatt under den første 5 minutter av reperfusjon hvor analyser ble utført ved en 1 min intervall. Cardiac effekt (svart spor med trekanter) ble bestemt ved måling av blodsirkulasjon samtidig koronaravløpsprøver ble gjenvunnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foregående protokollen detaljer metoder for samtidig å kvantifisere fluksen av substratet gjennom glukoseoksidasjon og fettsyre oksidasjon i det isolerte arbeidende rottehjerte. Målingene kan da bli overlagret på de registrerte hjerte funksjonelle parametre for å bestemme forholdet mellom substratene metabolisme og hjerte- arbeid under basislinje og spenningsforholdene (endring i arbeidsbelastning, ischemi-reperfusjon, etc ...). Det er også mulig å evaluere hvor metabolismen / sammentrekning forhold påvirkes av preexisting tilstander slik som hjertesvikt og diabetes. I tillegg, kan sentrum av genetisk-modifiserte gnagere brukes til å avhøre virkningen av et spesifikt protein på hjertemetabolismen og funksjon. Sist, kan effekten av narkotika og andre sirkulasjonsfaktorer på disse parametrene individuelt testet. På grunn av at fluksen av glukose gjennom glykolysen ikke alltid korrelerer med graden av glukoseoksidasjon, kan det være informative til å følge utbredelsen av glukose fluks gjennom begge veier i en enkelt eksperimentell setting.

Satsene for glykolyse kan bestemmes ved tilsetning av [5- 3H] glukose til perfusjon buffer, fordi frigjøringen av 3 H 2 O er bestemt av aktiviteten av enolase trinn av glykolyse 20. Alternativt [2- 3H] glukose, noe som fører til fremstilling av 3-H 2 O ved fosfoglukoseisomerase trinnet i glykolysen, kan brukes til å avhøre utbredelsen av glukoseopptaket ved hjertemuskelen 16,17,21. Muligheten til å velge mellom flere radiomerkede tracere å undersøke skjebnen til glukose på ulike nivåer av sin katabolisme er et annet eksempel på allsidigheten av teknikken. Imidlertid, fordi alle flux målingene er avhengige av den kvantitative utvinning av enten 3 H 2 O eller 14 CO2 fra koronar avløpet, bare to radioaktiv merkinged tracere (en 3-H-merket og den andre er merket med 14 C) kan anvendes ved perfusjon-buffer ved en annen.

metodiske betraktninger

Det er noen iboende begrensninger til måling av hjerte metabolsk flux og funksjon ved hjelp av denne protokollen. Selv om bruken av KH buffer gjør det mulig for en total kontroll over sammensetningen av perfusatet, kan den fysiologiske relevansen av denne eksperimentelle oppsettet være tvilsom. For det første er bruken av en crystalloid løsning over blod er kjent for å ha negativ innvirkning på hjerte hemodynamikk og motstand mot iskemi 22,23. For det andre, perfusjon buffer vi beskriver her mangler en rekke hormoner og næringsstoffer som kan direkte modulerer hjerte metabolisme og dermed påvirke hjertets respons på en simulert spenningstilstand. Faktisk, er den pattedyr hjerte et metabolsk omnivore og kan, i tillegg til glukose og fettsyrer, bruke andre substrater til fulfill sitt energibehov (laktat, pyruvat, ketonlegemer, forgrenede aminosyrer). Det er bevis på at noen av disse substrater spiller en viktig rolle i den metaboliske ombygging av syke hjertet 24,25. Det er fullt mulig for forskeren å legge slike underlag til perfusjon buffer, for å modulere sin konsentrasjon for å etterligne nærmere ulike fysiologiske forhold (for eksempel matet statlige versus fastende) eller sykdomstilstander, og til å følge sine priser for oksidasjon ved hjelp av passende radiomerket sporstoff 26,27. Metabolismen av triglyserider kan også spores, og i så fall er det anbefalt å unngå bruk av heparin før fjerning av hjertet, da dette vil indusere frigjøring av lipoprotein lipase fra endotelet og betydelig redusere ekstraksjon av triglycerid fra bufferen 28. Med nøye utvalg av de radiomerkede tracere, inkorporering av radioaktivitet i Various vev metabolitter kan også måles etter perfusjon for å bestemme parametere som de novo triglycerid-syntese, glykogen omsetning, eller forekomst av proteinsyntese 18,29,30. Med andre ord, kan undersøkeren fungere med et bredt utvalg av substrater / hormoner kombinasjoner og konsentrasjoner. Valget av buffer sammensetning vil hovedsakelig avhenge av målene for forsøket. Fordi disse kontrollerte bufferbetingelsene lage en "forenklet" fysiologisk modell, resultater fra ex vivo arbeider hjerte perfusjon eksperimenter bør tolkes med forsiktighet og hvis mulig dataene skal videre validert in vivo.

Valg av narkosen

Anestesi brukt på rotter før fjerning av hjertet bør være nøye valgt basert på den kjente effekten på hjerte-funksjon og metabolisme for å sikre at dette ikke vil forstyrre eksperimentet som skal utføreed. Både injiserbare og inhalasjonsanestetika raskt indusere hyperglykemi og variable grader av glukoseintoleranse som kan påvirke hjerte metabolisme under perfusjon 31,32. Sammenlignet med andre agenter, de kortsiktige effektene av barbiturater (Pentobarbital og thiobutabarbital) på glukose homeostase er relativt ubetydelig 31. Imidlertid har intraperitoneal pentobarbital bedøvelse før hjerte excision blitt vist å redusere hjertets minuttvolum, forringe funksjonen til venstre ventrikkel, og øke myocardial laktat frigivelse i en ex vivo protokollen for ischemi-reperfusjon 33. Den negative inotrope effekt som pentobarbital har på det isolerte rottehjerte er foreslått å være forårsaket av vev akkumulering av medikamentet 34. Omvendt bruk av inhalasjonsanestetika, som er mer hurtig vasket ut fra hjertevev, er assosiert med bedre kontraktile funksjon ex vivo 33. Flyktige anestetika kan faktisk gi cardioprotection i løpet av ischemi-reperfusjon via en mekanisme som involverer åpning av mitokondrie K-ATP-kanaler og økt binding av heksokinase til mitokondriene 32. I sammendraget, type bedøvelse som brukes i et isolert arbeider hjerte perfusjon protokollen er en vesentlig variabel i vurderingen av både funksjonelle og metabolske parametere som kan direkte påvirke utfallet av eksperimentet. Derfor, type og dosen av bedøvelsesmidlet som brukes bør alltid rapporteres i metodedelen av et eksperiment, og disse parametrene bør ikke endres mellom eksperimenter som er ment å bli sammenlignet.

Radioisotoper i hjertet perfusjon

Alle fluks målinger utført med den foregående protokoll er utført i den ikke-resirkulerende modus, noe som betyr at den koronare avløpet kastes i stedet for å bli returnert til bufferreservoaret (figur 1). Etterforskeren kan hellervelger å bruke perfusjon anordningen i den resirkulerende modus, som har den fordel at den krever et mye mindre volum av buffer, og følgelig radioaktivitet å operere. Imidlertid resirkulering av den koronare avløpet kompromitterer steady state sammensetningen av perfusjon buffer ved gjenvinning av biprodukter som stammer fra den metabolske aktiviteten i hjertet (inkludert laktat, men også 3 H 2 O og H 14 CO3-), som vanskeliggjør bestemmelsen av metabolske flukser og kan selv endre hjertefunksjon over tid 35. Disse problemene er forhindret i den ikke-resirkulerende modus. På grunn av mengden av radioaktivitet og til det store volumet av perfusjon buffer som brukes i et enkelt eksperiment, bør utprøver være spesielt forsiktig når man bruker arbeidsrottehjerte i metabolsk fluks analyser. Når du bruker en perfusjon apparat for første gang, anbefales det å utføre flere mock eksperimenter med ikke-radioaktive buffer til å bli kjent medulike trinnene i protokollen og med sikkerhetsprosedyrene. Monteringen av hjertet på kanylene er et særlig følsomt trinn fordi det krever etablering av en tett kontakt med anordningen og fordi buffer kan lekke eller skyte ut fra en av hjertets avkuttede blodkar. Perfusjon beskrevne apparat ved Taegtmeyer og kolleger 11 har fordelen av å inkludere et Langendorff reservoar som er fullstendig uavhengig av resten av perfusjon anordningen, og kan derfor bli fylt med ikke-radioaktive KH buffer for å hindre søl av radioaktivt materiale i løpet av hjertets kanylering . Uansett hvilket system som benyttes, bør forsøkene utføres i et dedikert område med begrenset tilgang. Rommet skal inneholde en vask og en tilførsel av ultrarent vann for å utføre buffer forberedelse og rengjøring av forurenset utstyr i samme område. Etterforskerne skal jobbe tett med sine institusjonens strålingssikkerhet kontor for å etablere specific containment, kontroll og dekontaminering prosedyrer.

Rengjøring av perfusjon apparat

Innlegget eksperimentelle rengjøring av perfusjon apparat er et kritisk punkt som er altfor ofte oversett, og hvis ikke nøye utført, ansvarlig for de fleste av problemene knyttet til dårlig eksperimentell reproduserbarhet. Den næringsrike perfusjon buffer og den høye temperaturen i perfusjon system gir ideelle forhold for bakterie- og soppvekst. Anvendelsen av proteiner (insulin, BSA) og fettsyrer i perfusjon bufferen gir en annen grad av kompleksitet til rengjøringsprosessen fordi disse forbindelser vil feste seg på overflaten av røret og glass, noe som gjør dem vanskelig å spyle ut av apparatet. Bruk av radioisotoper vil også innføre ytterligere begrensninger slik som etablering av en egen beholdningsområdet i laboratoriet for manipulering av forurenset utstyr og avhending av fast end flytende radioaktivt avfall. Derfor vil det tilstrekkelig renseprosedyren for det meste avhenge av både sammensetningen av perfusjon buffer og av typen av perfusjon apparat som anvendes. Hvis du bruker et kommersielt apparat, sjekk produsentens hjemmeside eller ta kontakt med kundeservice for å få informasjon om hvordan du utfører rengjøring uten å skade noen av komponentene i apparatet. Generelt kan alle glass og plastdeler vaskes med et bredt spekter av såper. Enzym aktiv drevet vaskemidler er spesielt nyttig for å fjerne fettsyre-BSA rest. De fleste forurensninger vil også bli fjernet ved å kjøre 0,1 M HCl eller 0,1 M HNO 3 gjennom apparatet i flere timer. Vi oppnå tilfredsstillende rengjøringsresultat ved å spyle systemet først med 0,1 M HCl, deretter med en frisk 1% (w: v) oppløsning av enzym-aktivt drevne vaskemiddel fremstilt i varmt vann, og til slutt ved å skylle systemet med ultrarent vann. Når du bruker en spesialbygd perfusjon apparat som den opprinnelig described ved Taegtmeyer og kolleger 11, kan det være lettere og mer effektivt å fullstendig demontere apparatet ved slutten av hver forsøks dag. Det glass er renset ved en 15 minutters neddykking i et konsentrert bad av en kromsyre og svovelsyre blanding. Plastdelene og PVC-slanger kan vaskes med en rest-fri rengjøringsmiddel. Vi fant det er faktisk raskere og mer pålitelig for å fullstendig erstatte PVC-slanger hver dag, fordi den begrenser manipulering av materiale som er forurenset med radiochemicals og fordi det hindrer etterlater rester av rengjøringsmidler bak. I alle fall bør etterforsker gjelder følgende regler: 1 Rengjør perfusjon apparater og alle skitne utstyr umiddelbart etter endt perfusjon eksperiment. Venter vil bare gjøre rengjøringen mer vanskelig og tidkrevende. 2- Kontroller sirkulerende bad av vannet jakke systemet regelmessig for forurensing. Bruk av vannanlegget vil øke intervallet mellom cskjev i vannbadet. 3- Etter rengjøring, skylle alt glass og rør med vann fra springen flere ganger og avslutt skylling med ultrarent vann for å fjerne rester fra rengjøringsmidler. 4- To hjertepreparater etter hverandre svikter når disseksjon ble omhyggelig utført og perfusjon buffer tilfredsstilles er sannsynlig å indikere en forurensning av apparatet (enten ved bakterier, eller ved oppløsningsmiddelrester). Hvis dette skjer, bør vaske- og skylleprosedyrer være helt gjentas.

Skalere ned til muse hjertet

Selv om den foregående protokollen fokuserer på bestemmelsen av stoffskifte i en isolert arbeidende rottehjerte, kan de samme prosedyrene påføres på mus hjerte med noen få modifikasjoner til perfusjon apparater og datainnsamlingsverktøy 36. På grunn av sin mindre størrelse isolert arbeids musen hjerte er teknisk mer utfordrende, men på grunn av sin betydeliglavere strømningshastighet har den fordel at den krever et mye mindre volum av perfusjon buffer. Det store antall genetisk modifiserte musemodeller som allerede er tilgjengelige gjør også det isolerte arbeidende mus hjerte meget attraktivt for å studere funksjonen av et enkelt genprodukt på hjerte metabolske og funksjonell ombygging. Imidlertid er de siste teknologiske fremskritt i genomet redigering og en raskt voksende katalog av transgene og knockout rotter raskt lukke gapet mellom de to gnagerarter. Videre har rotte lenge blitt hyllet som en overlegen dyremodell for å undersøke hjerte-og karsykdommer fordi patofysiologien etterligner menneskelige forhold 37. Av disse grunner, tror vi at den isolerte arbeidsrottehjerte fortsatt holder en viktig plass i den moderne æra av hjerte- forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
  2. Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
  3. Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
  4. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
  5. Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
  6. Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
  7. Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
  8. Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
  9. Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
  10. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
  11. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
  12. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  13. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
  14. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  15. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
  16. Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
  17. Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
  18. Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
  19. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
  20. Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
  21. Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
  22. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  23. Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
  24. Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
  25. Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
  26. Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
  27. Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
  28. Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
  29. Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
  30. Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
  31. Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
  32. Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
  33. Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
  34. Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
  35. Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
  36. Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
  37. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).

Tags

Biochemistry hjerte perfusjon arbeider hjerte hjertefunksjon metabolisme glukoseoksidasjon fettsyre oksidasjon radioisotoper
Metoder for bestemmelse av priser av glukose og fettsyreoksidasjon i isolerte Working Rat Hjerte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakrania, B., Granger, J. P.,… More

Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter