Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Синтез циклических полимеров и характеристика их диффузионное движение в расплавленном состоянии на уровне отдельной молекулы

Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54503

Summary

Протокол для синтеза и определения характеристик диффузионного движения циклических полимеров на одной молекулы уровне представлена.

Protocol

1. Синтез монофункциональных и бифункциональных Поли (ТГФ)

  1. Монофункциональное поли (ТГФ)
    1. Пламя насухо 2-образным вырезом 100-мл колбу с круглым дном. Вакуумные и заполняют колбу с азотом (3 цикла).
    2. Добавить дистиллированную тетрагидрофуран (ТГФ) (50 мл) в колбу. Поместите колбу в водяную баню при температуре 20 ° С и уравновешивания температуры.
    3. Добавить метилтрифлатом (0,5 ммоль) в колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 5-10 мин при температуре 20 ° С.
    4. Добавить N -фенил пирролидина (4-6 экв.) В колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 30-60 мин.
    5. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Остаток растворяют в 3-5 мл ацетона. Добавить раствор ацетона в 300-500 мл н - гексана. Фильтр осадка и сушат под пониженным давлением.
  2. Бифункциональные поли (ТГФ)
    1. Пламя насухо 2-образным вырезом 100-мл колбу с круглым дном. Vacuum и заполнить колбу с азотом (3 цикла).
    2. Добавить дистиллированную ТГФ (50 мл) в колбу. Поместите колбу в водяную баню при температуре 20 ° С и уравновешивания температуры.
    3. Добавить ангидрида трифторуксусной кислоты (0,3 ммоль) в колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 5-10 мин при температуре 20 ° С.
    4. Добавить N -фенил пирролидина (4-6 экв.) В колбу с помощью шприца. Смесь перемешивают в течение 30-60 мин.
    5. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Остаток растворяют в 3-5 мл ацетона. Добавить раствор ацетона в 300-500 мл н - гексана. Фильтр осадка и сушат под пониженным давлением.

2. Синтез перилен диимидом-4 включены вооруженные Звезда и 8-образный бициклических Поли (ТГФ)

  1. Вооруженный звезда поли (ТГФ)
    1. Ионный обмен
      1. Растворите периленкарбок диимид тетракарбоксилата натриевой соли в воде (10 мг / мл, 150 мл). растворятьсямонофункциональный поли (ТГФ) в ацетоне (160 мг / мл, 4 мл). Добавл ют по капле ацетонового раствора в интенсивно перемешиваемой водном растворе. Собирают образовавшийся осадок фильтрацией.
      2. Повторите описанную выше процедуру с извлеченного осадка (2.1.1.1) четыре раза.
    2. Ковалентная крепление
      1. Растворение полученного осадка в толуоле (5 мг / мл). Нагревание с обратным холодильником раствора в течение 4 ч.
      2. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Фильтр остаток через пробку из силикагеля с использованием н - гексан / ацетон (2/1 об / об). Добавить раствор в охлажденную льдом воду (300-500 мл), чтобы осадить продукт. Собирают осадок фильтрованием.
  2. Двухцикличный 8-образный поли (ТГФ)
    1. Ионный обмен
      1. Растворите периленкарбок диимид тетракарбоксилата натриевой соли в воде (6 мг / мл, 50 мл). Растворите бифункциональный поли (ТГФ) (0,5 г) В 30-50 мл ацетона. Добавл ют по капле ацетонового раствора в интенсивно перемешиваемой водном растворе при 0 ° С. Собирают образовавшийся осадок фильтрацией.
      2. Повторите описанную выше процедуру с извлеченного осадка (2.2.1.1).
    2. Ковалентная крепление
      1. Растворение полученного осадка в толуоле (0,05 г / л). Нагревание с обратным холодильником раствора в течение 4 ч.
      2. Полностью удалить растворитель при пониженном давлении (около 100 мм рт.ст.). Добавить толуол частично растворяют остаток. Повторно осаждаются в 300-500 мл н - гексана.
      3. Фильтр образовавшийся осадок через пробку из силикагеля с использованием н - гексан / ацетон (2/1 об / об). Повторно осаждаются в 300-500 мл воды.
      4. Очищают образовавшийся осадок путем хроматографии на колонке с использованием 18 гель полистирола. Дальнейшей очистки сырого продукта с помощью препаративной гель - проникающей хроматографии (ГПХ) с 19 в качестве элюента смеси CHCl 3 РемуOve побочных продуктов путем мониторинга показателя преломления (RI) и УФ-детекторов.

3. одиночных молекул флуоресцентной томографии Эксперимент

  1. Базовые приготовления
    1. Очистка микроскопа покровных стеклах
      1. Место No. 24 1,5 х 24 мм микроскоп крышка скользит в сосуд для окрашивания.
      2. Добавить раствор гидрида 1 М калия (100 мл) в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Слейте раствор гидроксида калия при декантации и ополаскивают покровных стеклах с ультра-чистой водой несколько раз. Добавить спектроскопического класса этанола (100 мл) в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин.
      3. Слейте этанол путем декантации и ополаскивают покровных стеклах с ультра-чистой водой несколько раз. После заливки от ультра-чистой воды декантацией, повторите шаг 3.1.1.2.
      4. Добавить ультра-чистую воду в банку и разрушать ультразвуком в течение 15 мин. Промыть покровных стеклах с ультра-чистой воды в несколько раз, Выньте крышку ускользает из кувшина с помощью пластиковых пинцеты и высушить их либо сухим воздухом или сухим азотом.
    2. Приготовление образцов полимерного расплава 14,15
      1. Добавьте 100 мкл немеченого линейного поли (ТГФ) в стеклянной бутылке и нагреть его до температуры выше точки плавления (приблизительно 25 ° C) с помощью фена.
      2. Развести флуорофора внедренной полимер (линейный, 4-вооруженных звезду, циклический или 8-образную дициклическую , синтезированный в 2,1 и 2,2) в хлороформе (1 мл, 10 -6 М). Добавляют 1 мкл раствора к 100 мкл расплава немеченого линейного поли (ТГФ).
      3. После тщательного перемешивания образца с наконечником пипетки, испаряются хлороформа путем нагревания образца с использованием сушилки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает расплав немеченого линейного поли (ТГФ) , содержащего 10 -8 М флуорофора включены полимеров.
      4. Возьмите 10 мкл образца с использованием микро-пипетки и дROP его на очищенную покровным. Другими очищенную крышку скольжения на образце и сэндвич образца между двумя покровных стеклах.
      5. Нажмите пробу осторожно с помощью пластикового пинцета.
  2. Установка 15 флуоресцентных изображений Широкое поле
    1. Внедрение лазера возбуждения (488 нм) в задний порт инверсионного микроскопа
      1. Вставьте полосовой фильтр возбуждения и поляризатор в пути луча.
      2. Разверните луч приблизительно 1 см в диаметре с помощью расширителя пучка.
      3. Вставьте четвертьволновой пластины в пути луча. Установить оптическую ось волновой пластины на 45 градусов по отношению к этому поляризатора. В качестве альтернативы, вставить компенсатор Berek и установить оптическую задержку Л / 4.
      4. Вставьте диафрагму в пути луча возбуждения для регулировки размера пучка.
      5. Перед введением лазерного луча в задний порт инвертированного оптического microscoPE, вставить фокусирующую линзу (план-выпуклой линзы, фокусное расстояние ≈ 300 мм) в положении, где коллимируется лазерный луч из объектива.
    2. После того, как отражении лазерного луча с помощью дихроичного зеркала , установленного на светофильтров, вводится лазерный луч на образец через высокой числовой апертурой (NA) линзы объектива (например, Н. А. 1,3, увеличение в 100 раз, масло погружения).
    3. Приложить объективный нагреватель для объектива и установить температуру до 30 ° С.
    4. Монтаж стенда на предметный столик инверсионного микроскопа
      1. Отбросьте одну каплю иммерсионного масла на объектив и крепление образца на состояние микроскопа.
      2. Убедитесь, что толщина образца приблизительно 10 мкм получают путем проверки осевого положения нижней и верхней поверхности образца.
      3. Отрегулируйте фокусировку микроскопа до нескольких микрометров выше нижней поверхности образца.
      Получить циркулярно поляризованный свет возбуждения под объективом
      1. Вставьте поляризатор в коллимированный лазерный луч из объектива.
      2. Записывают интенсивности лазерного пучка, прошедшего через поляризатор, вставив измеритель мощности после поляризатора. Записывают, передаваемую мощность лазера под разными углами поляризации при вращении поляризатора.
      3. Если переданная мощность лазера не постоянна на всех углах поляризации, слегка вращать пластину четверти волны или Berek компенсатор, вставленный в пути пучка возбуждения.
      4. Повторите шаг 3.2.5.2 и 3.2.5.3 до постоянной передаваемой мощности лазера получается при всех углах поляризации. Убедитесь в том, что циркулярно поляризованный свет получается на образце.
    5. Установка ЭМ (электронного умножителя) отрицательный заряд связью (ПЗС) камеры
      1. Установите камеру EM-CCD с боковой порт микроскопа и подключить его к тон программное обеспечение захвата изображений.
      2. При необходимости синхронизации экспозиции камеры с механическим затвором или акустооптического перестраиваемого фильтра, вставленного в пути луча возбуждения, послав транзисторно-транзисторной логики (TTL) сигналы, генерируемые EM-CCD камеры к устройствам. В качестве альтернативы, синхронизировать экспозицию камеры на выходе лазера, посылая сигналы TTL, генерируемых ЭМ-ПЗС-камеры лазера.
        Примечание: Последний вариант применим только тогда, когда твердотельный лазер, выходная мощность может быть модулируется входным транзисторно-транзисторной логики сигналы (TTL) используется для эксперимента.
      3. Нанести усиление ЭМ (как правило, приблизительно 300) к ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения управления камерой, чтобы получить флуоресцентного высокого качества изображения одного флуорофора.
      4. Установить область интереса (ROI) (как правило, 128 х 128 пикселей в центре поля зрения) с использованием программного обеспечения управления камерой.
        Примечание: Это позволяет томографовнг эксперименты на частоты кадров 100 - 200 Гц в режиме передачи кадров, который необходим для визуализации движения Флуорофор внедренной полимерных цепей в образце расплава.
  3. Запуск эксперимента
    1. Оптимизация условий эксперимента
      1. Настройка области освещения образца до приблизительно 20 мкм в диаметре, используя диафрагму, вставленный в пути пучка возбуждения.
      2. Установка лазерного возбуждения мощности на образце до 4 - 8 мВт вручную, выбирая соответствующую нейтральной плотности (ND) фильтр, вставленный в пути пучка возбуждения.
        Примечание: Это обеспечивает среднюю мощность лазера 1 - 2 кВт · см -2 в образце.
      3. Запись флуоресцентные изображения образца при частоте кадров 100 - 200 Гц. Если интенсивность флуоресценции получены из отдельных флуорофором включены полимеров является слишком низкой, постепенно увеличивать мощность возбуждения с использованием юе ND фильтр до достижения примерно 100 мВт на образце.
      4. Если качество флуоресцентного изображения одной молекулы до сих пор не является удовлетворительным, проверьте примеси флуоресценции в образце путем регистрации флуоресценции изображения чистого расплава немеченого поли (ТГФ). В случае наблюдается высокий уровень фона флуоресценции, используют различные немеченого поли (ТГФ).
      5. Если плотность пятна флуоресценции, полученной из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве слишком велико, чтобы пространственно изолировать их (это приводит к ошибкам в анализе диффузионного движения), снижение концентрации флуорофора внедренной полимеров в образце до пространственно наблюдаются единичные пятна.
      6. Если плотность пятна флуоресценции, полученной из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве слишком низкое (это приводит к низкой пропускной способности эксперимента изображений), не увеличивают концентрацию Флуорофор внедренной полимеров в образце до достижения approprIate плотность пятна флуоресценции достигается.
      7. Если Флуоресцентные изображения, полученные из Флуорофор внедренной полимеров в расплаве размыты, увеличивают частоту кадров приобретения изображений.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто требует меньшего ROI, как правило, 64 х 64 пикселей.
  4. получение изображений
    1. После того, как условия эксперимента оптимизированы, оставьте установленный образец на предметный столик микроскопа в течение часа таким образом, что образец достигает условий равновесия.
    2. Запись 500 - 1000 последовательности флуоресцентного изображения флуорофора внедренной полимеров в расплавленном состоянии при 100 - 200 Гц частотой кадров. Если формат файла по умолчанию не TIFF, конвертировать все последовательности изображений в формате TIFF.

4. Анализ диффузионного движения

  1. Среднеквадратичное смещение (MSD) анализ
    1. Обрезка последовательности флуоресцентного изображения таким образом,что каждая последовательность изображений содержит одну и целенаправленный рассеивающий флуорофора внедренной полимера с использованием программного обеспечения для обработки изображений, например ImageJ.
    2. Когда вырезанный последовательности изображений содержат более 10 кадров, разделить последовательности изображений на множество последовательностей таким образом, что каждая последовательность состоит из 10 кадров.
    3. Определить положение молекул в каждой последовательности изображений точно двумерной гауссовой подгонки изображений.
    4. Определить коэффициент диффузии (D) отдельных молекул среднеквадратичного смещения (MSD) анализ диффузионных траекторий (т.е. зависящих от времени положениях молекулы) , используя уравнение 20
      Equation1
      где х я и у меня есть позиции молекулы в изображении кадра I, а п обозначает номер кадра с промежутком времени & Delta ; t от кадра I.
    5. Участок коэффициентов диффузии вчастота гистограммы.
      Примечание: Как правило, гистограмма строится из более чем 100 молекул.
  2. Интегральная функция распределения (CDF) анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: CDF, Р 2, я Δ T) соответствует кумулятивной вероятности нахождения диффундирующих молекул в пределах радиуса г от начала координат по истечении определенного времени запаздывания я Д т.
    1. Вычислить квадратным смещение во время встречающийся отстает от 1Δt, 2Δt, ···, iΔt для всех диффузионных траекторий, полученных в п.4.1.3.
      Примечание: Эти расчеты дают общую м я квадратным перемещений на некоторое время отстает от iΔt.
    2. Расчет чисел квадратным смещений (L I) в пределах общего набора данных м я, которые меньше , чем R 2 при различных значениях г 2 (0 <r2 <∞). Нормализованная л я против г 2 участки соответствуют CDF, P (R 2, iΔt).
  3. Анализ CDFs с различными моделями диффузии
    Примечание: Полученные CDFs обтянуты различных моделей диффузии; однородная модель диффузии, несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается гауссовым (одной гауссовой модели), а также несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается множественной Gaussian (множественный гауссова модель).
    1. В однородной модели диффузии, определяют средний D путем установки CDF с помощью уравнения 21
      Equation2
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое отклонение от уравнения означает гетерогенную диффузии молекулы.
    2. В одной гауссовой модели, определяют распределение вероятностей D описывается гауссовым (F (D)) путем подгонки CDF с использованием 15
      on3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
      Equation4
      где A, W, и D 0 являются амплитуда, ширина, и центром гауссовой.
    3. В двойной гауссовой модели, определяют распределение вероятностей J - й компонент D описывается гауссовым (F (D)) путем установки CDF с помощью 14
      Equation5
      Equation6
      где А J представляет собой долю каждого компонента диффузионной и α мкВт дж и D 0 J являются амплитуда, ширина, и центром J - й компонент гауссовой.
  4. Расчет теоретической вероятности DISTRIпределение коэффициента диффузии
    Примечание: распределения вероятности D , происходящих из - за статистических ошибок (D) d D) рассчитываются для различных моделей диффузии; однородная модель диффузии, несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается гауссовым (одной гауссовой модели), а также несколько режимов диффузии , в которых распределение D описывается множественной Gaussian (множественный гауссова модель).
    1. В однородной модели диффузии вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения 22
      Equation7
      где N есть число точек данных в диффузионной траектории (N = 10 см 4.1.2), D 0 средний коэффициент диффузии (определяется анализом КОР, см 4.2.3.1) и D является экспериментальным путем коэффициент диффузии для индивидуальной траектории.
    2. вединая гауссова модель диффузии, вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения 15
      Equation8
      где F (D) обозначает распределение вероятностей D определяется с помощью анализа КОР (см 4.2.3.2) и D 0 средний коэффициент диффузии (определяется анализом КОР, см 4.2.3.2).
    3. В двойной гауссовой модели диффузии, вычислить статистическое распределение вероятностей D с помощью уравнения 14
      Equation9
      где F (D J) обозначает распределение вероятностей J - го компонента D (D) J определяется анализом КОР (см 4.2.3.3) и D 0j является средний коэффициент диффузии J - го компонента (определяется CDF анализ см 4.2.3.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Периленовой диимид внедренной 4-вооруженную звезду и 8-образную форму двухцикличный поли (ТГФ) s были синтезированы с использованием электростатического самосборки и ковалентной фиксации (ESA-CF) процесса (Рисунок 1, Рисунок 2). В заданный промежуток времени одной молекулы флуоресцентного изображения были измерены для 4-вооруженных (рисунок 3а) и 8-образную форму (рис 3b) полимеры. В замедленной флуоресценции изображения (рисунок 3) показывают , пространственно изолированных яркие и резкие пятна из - за включения высоко люминесцентной периленовой диимидом флуорофора 23 в цепи. Частотные гистограммы коэффициента диффузии были вычислены для 4- х вооруженных (рис 4а) и 8-образную форму (рис 4б) полимеры на основе анализа среднеквадратичное смещение (MSD) времени покадровой изображений. Расчеты MSD участков и CDFs проводятся с использованием процедуры, написанные на MATLAB. фитингиз CDFs, полученных из экспериментов проводится с использованием программного обеспечения для обработки данных, таких как исток Pro. Частотные гистограммы коэффициента диффузии определяется путем анализа MSD отображения широких распределений (рисунок 4) в результате как статистической погрешности анализа и неоднородности диффузии. Частотные гистограммы показывают явные отклонения от однородной модели диффузии (зеленая линия на рисунке 4), которая демонстрирует гетерогенную диффузии молекул полимера. 14 Кумулятивные функции распределения (CDFs) были рассчитаны для 4- х вооруженных (рис 5а) и 8-образный (5б) полимеры и подбираются с помощью одной гауссовой (рис 5а) и модели двойного Gaussian (5б). Распределения вероятностей статистических коэффициента диффузии были вычислены для 4- х вооруженных (рис 4а) и 8-образную форму (рис 4b) Pol ymers по единой Gaussian или двойных гауссовских моделей. Сингл (рис 5а) и двойные (5б) Гауссовские модели соответствуют экспериментально полученные ВРР хорошо. Эти результаты показывают, что диффузия 4-вооруженного полимера описывается широким распределением коэффициента диффузии, в то время как 8-образный полимер показывает два различных режима диффузии.

Рисунок 1
Рисунок 1. Синтез маршрут периленовой диимид внедренной поли (ТГФ) с. Синтез маршрут (а) 4-вооруженных звездных полимеров и (б) 8-образных бициклических полимеров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

54503fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Характеристика синтезированных полимеров. ЯМР - спектры (а) 4-вооруженных звездных полимеров и (б) 8-образных бициклических полимеров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 (фильмов). Одиночной молекулы флуоресцентной визуализации перилена диимидом внедренной поли (ТГФ) s. Покадровый флуоресцентные изображения (а) 4-вооруженных звездчатых полимеров и (б) 8-образных бициклических полимеров в расплаве немеченого линейного поли (ТГФ ). Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра фильмов (а) и3 / Figure_3b_submit.mov "целевых =" _blank "> (б).

Рисунок 4
Рисунок 4. МСД анализ перилена диимидом внедренной поли (ТГФ) ов диффундировать в расплаве. Частотные гистограммы коэффициента диффузии , определенной для индивидуальных (а) 4-вооруженными звездообразных полимеров , и (б) 8-образных бициклических полимеров в расплаве немеченого линейных поли (ТГФ). Сплошные линии показывают теоретические расчеты распределения вероятностей коэффициента диффузии на основе трех различных моделей диффузии; однородная модель диффузии (зеленые линии, см 4.3.1), единая гауссова модель (пометок, см 4.3.2), и двойная гауссова модель (синяя линия, 4.3.3). 14 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра.


Рисунок 5. КОР анализ перилена диимидом внедренной поли (ТГФ) ов диффундировать в расплаве , полученные экспериментально кумулятивные функции распределения (iΔt = 7,5 - 75 мс). В виде 1-P для (а) 4-вооруженными звездообразных полимеров и (б) 8-образных двухцикличный полимеров в расплаве немеченого линейного поли (ТГФ). Пунктирные линии показывают фитингов с (а) уравнений в 4.2.3.2 и (б) уравнений в 4.2.3.3. 14 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В 4- х вооруженных и 8-образные полимеры получают по протоколу ESA-CF (Рисунок 1), что является важным шагом для синтеза. 12,24 Монофункциональное и бифункциональный линейный поли (ТГФ) s с N -phenylpiperidinium концевыми группами были синтезировали в соответствии с предыдущей процедуре. 11 ионный обмен осуществляли путем повторного осаждения ацетонового раствора предшественника полимера с трифлат противоионами в водном растворе , содержащем избыточное количество карбоновой кислоты.

Ковалентный превращение ионообменной продукта для 4-вооруженных звездообразных полимеров проводили в толуоле (4,9 г / л) при нагревании с обратным холодильником в течение 4 часов. Если преобразование не является достаточным, продлить время реакции. , Ковалентно связанный продукт получают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с ацетон / н - гексан и повторное осаждение в воде. 1 Н ЯМР - 4-вооруженных полимеров показано на рисунке 2а. ТхиПроцедура с ЕСС-CF позволяет эффективно синтеза циклических полимеров. Тем не менее, этот протокол ограничен полимерами, которые имеют циклические ониевые концевые группы.

Для получения 8-образного полимерного продукта на реакцию проводят в толуоле в раствор (0,2 г / л) при нагревании с обратным холодильником в течение 4 ч и приводит к образованию большого части нерастворимой фракции, предположительно, из-за межмолекулярного реагировала продуктов. Растворимая часть повторно осаждают в н - гексан, подвергали хроматографии на колонке с силикагелем с применением ацетона / н - гексана, и осадили в воде. Полученный неочищенный продукт подвергали хроматографии на колонке с исключением по размеру бусинок и перерабатывают GPC, чтобы обеспечить изоляцию 8-образного полимерного продукта на. 1 Н ЯМР - 8-образных полимеров показана на рисунке 2b. Этот протокол ESA-CF может быть применима к дальнейшему сложных топологических полимеров.

Флуоресцентные изображения высокого качества являются essentiаль для точного анализа диффузионного движения молекул. Флуоресцентные изображения значительно ухудшается, когда 1) флуоресценция примеси присутствуют в образце, 2) квантовый выход флуоресценции инкорпорированного флуорофора низка, и 3) скорость передачи кадра изображения происходит медленнее, чем диффузным движением молекул полимера. Установка температуры ниже комнатной температуры (20 ° С) или выше 37 ° С приведет к рефракционной рассогласование индекса, который также будет ухудшать качество записанных изображений флуоресценции. Использование более узкой полоса излучения полосовой фильтр, установленный на светофильтров-то улучшает качество флуоресцентного изображения. Так как время экспозиции камеры EM-CCD, используемого в эксперименте изображения, как правило, ограничивается миллисекундах, диффузионный движение быстрее, чем это время масштаба не может быть захвачен этим методом.

Оценка влияния статистической ошибки в анализе MSD является важным шагом FOг характеристику гетерогенной диффузии. Статистическая погрешность следует тщательно оценивать путем расчета распределения вероятностей коэффициента диффузии с использованием однородной модели диффузии 22 , прежде чем обсуждать гетерогенной диффузии. Гетерогенной диффузии также следует тщательно оценивать с помощью анализа КОР. Когда CDFs показывают явные отклонения от однородной модели диффузии (т.е. одноэкспоненциальным кривой затухающей), это указывает на наличие нескольких диффундирующих компонентов. Количественная характеристика гетерогенной диффузии требует комбинированного MSD, СГО, а также анализ распределения вероятностей. 14,15

Динамика полимеров, в том числе диффузным движением, был описан как ансамбль усредненных значений в традиционных способах , таких как ЯМР, 7 светорассеяния, 8 и измерения вязкости. 9 Действительно, гетерогенный диффузионное движение , обнаруженными по Singlе-молекула изображения 16 часто очень трудно обнаружить в ансамбле усредненный методов. Принимая во внимание присущую гетерогенной природе полимеров, 25-27 способом , описанным в данном протоколе не ограничивается характеризации топологических полимеров, но применимо ко всем видам полимеров при запутанных условиях. 28 Кроме того, подход сообщалось в данном протоколе найдет широкое применение при анализе гетерогенной диффузии в сложных системах, таких как молекулярная диффузия через мезопористых материалов. 29

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
THF Godo
Wakosil C-300 Wako Pure Chemical Industries
Acetone Godo
Toluene Godo
n-Hexane Godo
CHCl3 Kanto Chemical
Bio-Beads S-X1 Bio-Rad
Methyl triflate Nacalai Tesque
Triflic anhydride Nacalai Tesque
Potassium Hydroxide Wako Pure Chemical Industries
Ethanol Wako Pure Chemical Industries
Poly(tetrahydrofuran) Aldrich
Chloroform Wako Pure Chemical Industries
Immersion oil Cargille Type 37 / Type A
Equipment
2-Neck 100-ml round-bottom flask
Flask
Beaker
Funnel
Filter paper Whatman
Reflux condenser
Syringe
Water bath
Magnetic stirrer
Rotary evaporator
Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) Matsunami Glass CO22241
Staining jar AS ONE Corporation 1-7934-01
Ultrasonic cleaner VWR International  142-0047
Inverted microscope Olympus IX71
Ar-Kr ion laser Coherent Innova 70C
Berek compensator Newport 5540
Excitation filter Semrock LL01-488-12.5
Dichloric mirror Omega optical 500DRLP
Emission filter Semrock BLP01-488R-25
Lens and mirror Thorlabs
EM-CCD camera Andor Technology iXon
Objective lens (100X, N.A. = 1.3) Olympus UPLFLN 100XOP
Objective heater Bioptechs
Preparative GPC Japan Analytical Industry LC-908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
  2. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
  3. Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
  4. McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
  5. McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
  6. Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
  7. Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
  8. Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
  9. von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
  10. Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
  11. Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
  12. Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
  13. Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
  14. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
  15. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
  16. Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
  17. Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
  18. Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
  19. Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
  20. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  21. Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
  22. Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
  23. Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
  24. Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
  25. Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
  26. Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
  27. Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
  28. Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
  29. Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).

Tags

Химия выпуск 115 циклический полимер синтез расплав полимера топология диффузия одна молекула флуоресцентная микроскопия
Синтез циклических полимеров и характеристика их диффузионное движение в расплавленном состоянии на уровне отдельной молекулы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka,More

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (115), e54503, doi:10.3791/54503 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter