Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Syntese av Sykliske Polymers og karakterisering av deres diffusiv Motion i smeltet tilstand ved enkelt molekyl nivå

Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54503

Summary

En protokoll for syntese og karakterisering av diffusive bevegelse av cykliske polymerer på enkelt molekyl nivå er presentert.

Protocol

1. Syntese av Monofunksjonelt og bifunksjonelle Poly (THF)

  1. Monofunksjonelle poly (THF)
    1. Flamme tørke en 2-halset 100 ml rundbunnet kolbe. Støvsug og fylle flasken med nitrogen (3 sykluser).
    2. Tilsett destillert tetrahydrofuran (THF) (50 ml) til kolben. Sett kolbe i et vannbad ved 20 ° C og likevekt temperaturen.
    3. Legg metyltriflat (0,5 mmol) til kolben med en sprøyte. Og blandingen rørt i 5-10 minutter ved 20 ° C.
    4. Legg N-fenyl pyrrolidin (4-6 ekv.) Til kolben med en sprøyte. Omrør blandingen i 30-60 min.
    5. Fullstendig fjerne løsningsmidlet under redusert trykk (ca. 100 torr). Oppløs residuet i 3-5 ml aceton. Tilsett acetonløsning inn i 300-500 ml n-heksan. Filtrer bunnfallet og tørk den under redusert trykk.
  2. Bifunksjonelt poly (THF)
    1. Flamme tørke en 2-halset 100 ml rundbunnet kolbe. Vacuum og fylle flasken med nitrogen (3 sykluser).
    2. Tilsett destillert THF (50 ml) til kolben. Sett kolbe i et vannbad ved 20 ° C og likevekt temperaturen.
    3. Legg triflicanhydrid (0,3 mmol) til kolben med en sprøyte. Og blandingen rørt i 5-10 minutter ved 20 ° C.
    4. Legg N-fenyl pyrrolidin (4-6 ekv.) Til kolben med en sprøyte. Omrør blandingen i 30-60 min.
    5. Fullstendig fjerne løsningsmidlet under redusert trykk (ca. 100 torr). Oppløs residuet i 3-5 ml aceton. Tilsett acetonløsning til 300-500 ml n-heksan. Filtrer bunnfallet og tørk den under redusert trykk.

2. Syntese av perylen diimid-innlemmet fire-armet stjerne og 8-formet dicyklisk Poly (THF)

  1. Armed stjerners poly (THF)
    1. ionebytting
      1. Oppløs perylen diimid tetracarboxylate natriumsalt i vann (10 mg / ml, 150 ml). Løse oppmonofunksjonelle poly (THF) i aceton (160 mg / ml, 4 ml). Tilsett acetonløsning dråpevis til den kraftig omrørte vandige oppløsning. Samle det dannede bunnfall ved filtrering.
      2. Gjenta prosedyren ovenfor med den gjenbunnfallet (2.1.1.1) fire ganger.
    2. kovalent fiksering
      1. Oppløs det oppnådde bunnfall i toluen (5 mg / ml). Refluks løsningen i 4 timer.
      2. Fullstendig fjerne løsningsmidlet under redusert trykk (ca. 100 torr). Filtrer residuet gjennom en plugg av silikagel med n-heksan / aceton (2/1 volum / volum). Tilsett løsningen i is-avkjølt vann (300-500 ml) for å utfelle produktet. Oppsamle bunnfallet ved filtrering.
  2. Dicyklisk 8 formet poly (THF)
    1. ionebytting
      1. Oppløs perylen diimid tetracarboxylate natriumsalt i vann (6 mg / ml, 50 ml). Løs opp bifunksjonelt poly (THF) (0,5 g) I 30-50 ml aceton. Tilsett acetonløsning dråpevis til den kraftig omrørte vandige løsning ved 0 ° C. Samle det dannede bunnfall ved filtrering.
      2. Gjenta prosedyren ovenfor med den gjenbunnfallet (2.2.1.1).
    2. kovalent fiksering
      1. Oppløs det oppnådde bunnfall i toluen (0,05 g / l). Refluks løsningen i 4 timer.
      2. Fullstendig fjerne løsningsmidlet under redusert trykk (ca. 100 torr). Legg toluen for delvis å oppløse residuet. Re-bunnfall i 300-500 ml n-heksan.
      3. Filtrer det dannede bunnfall gjennom en plugg av silikagel med n-heksan / aceton (2/1 volum / volum). Re-felle i 300-500 ml vann.
      4. Rens det dannede bunnfall ved kolonnekromatografi under 18 anvendelse av en polystyren-gel. Ytterligere å rense det urene produkt ved preparativ gelpermeasjonskromatografi (GPC) 19 med et elueringsmiddel av CHCI3 til remove biprodukter ved å overvåke brytningsindeks (RI) og UV-detektorer.

3. Single-molekylet Fluorescens Imaging Experiment

  1. prøveopparbeidelse
    1. Rengjøring av mikroskop dekkglass
      1. Place No. 1.5 24 x 24 mm mikroskop dekkglass i en flekker krukke.
      2. Tilsett 1 M kalium-hydrid-løsning (100 ml) inn i glasset og sonikere i 15 min. Hell av kalilut ved dekantering og skyll dekkglass med ultrarent vann flere ganger. Legg spektroskopiske karakter etanol (100 ml) inn i glasset og sonikere i 15 min.
      3. Hell av etanol ved dekantering og skyll dekkglass med ultrarent vann for flere ganger. Etter å helle av ultrarent vann ved dekantering, gjenta trinn 3.1.1.2.
      4. Legg ultrarent vann til glasset og sonikere i 15 min. Skyll dekkglass med ultrarent vann for flere ganger. Ta ut dekkglass fra glasset ved en plast pinsett og tørk dem enten ved tørr luft eller tørr nitrogen.
    2. Fremstilling av polymer-smelteprøver 14,15
      1. Tilsett 100 ul av ikke-merket lineære poly (THF) i en glassflaske og varme den til en temperatur over smeltepunktet (ca. 25 ° C) ved hjelp av en hårtørker.
      2. Oppløs det fluorofor-innlemmet polymer (lineære, fire-armet stjerne, cyklisk, eller 8-formet dicyklisk syntetisert på 2,1 og 2,2) i kloroform (1 ml, 10 -6 M). Tilsett 1 pl av oppløsningen til 100 ul av smeiten av det ikke-merkede lineære poly (THF).
      3. Etter grundig blanding av prøven med en pipettespiss, fordampe kloroform ved oppvarming av prøven ved hjelp av en tørketrommel.
        MERK: Dette gir en smelte av det ikke-merkede lineære poly (THF) inneholdende 10 -8 M av fluoroforen innlemmet polymerer.
      4. Ta 10 ul av prøven ved bruk av en mikro-pipette og dRop det på en renset dekkglass. Sagt på en annen renset dekkglass på prøven og sandwich prøven mellom de to dekkglass.
      5. Trykk prøven forsiktig med en plast pinsett.
  2. Wide-field fluorescens bildebehandling oppsett 15
    1. Innføring av en eksitasjon laser (488 nm) på baksiden porten på invertert mikroskop
      1. Sette inn en eksitasjon båndpassfilter og polarisator i strålegangen.
      2. Utvide strålen til omtrent 1 cm i diameter ved en stråleutvider.
      3. Sette inn en kvartbølgeplate i strålegangen. Setter den optiske aksen til bølgeplate på 45 grader med hensyn til den av polarisatoren. Alternativt sette inn en Berek kompensator og sette den optiske forsinkelse til X / 4.
      4. Sett en membran i eksitasjon strålebanen for å justere strålen størrelsen.
      5. Før innføring av laserstrålen inn bak porten på omvendt optisk mikroskop,pe, sette inn en fokuseringslinse (plan-konveks linse, brennvidde ≈ 300 mm) i en posisjon hvor laserstrålen ut av objektivet er kollimert.
    2. Etter å reflektere laserstrålen ved hjelp av et dikroisk speil som er montert på et filter kube, innføre laserstrålen til prøven gjennom en høy numerisk apertur (NA) objektiv (f.eks NA 1,3, 100X forstørrelse, oljeimmersjon).
    3. Fest en objektiv varmer til objektiv og sett temperaturen til 30 ° C.
    4. Montering av prøven på scenen av invertert mikroskop
      1. Slippe en dråpe olje nedsenking på objektivlinsen og montere prøven på mikroskopet tilstand.
      2. Sikre at prøven tykkelse på omtrent 10 um oppnås ved å kontrollere den aksiale stilling av den nedre og øvre flate av prøven.
      3. Justere fokus for mikroskopet til noen få mikrometer over den nedre overflate av prøven.
      Skaff sirkulært polarisert eksitasjon lys under objektiv
      1. Sett inn en polarisator inn i kollimert laserstråle ut av objektiv.
      2. Registrere intensiteten av lasers overføres gjennom polarisatoren ved å sette inn en kraftmåler etter polarisatoren. Spill den overførte lasereffekten ved ulike polarisering vinkler ved å rotere polarisatoren.
      3. Hvis den utsendte lasereffekten er ikke konstant ved alle polarisasjonsretninger vinkler, noe rotere kvartbølgeplate eller Berek kompensator innsatt i eksitasjon strålebanen.
      4. Gjenta trinn 3.2.5.2 og 3.2.5.3 til konstant overført lasereffekten oppnås ved alle polarisering vinkler. Sørge for at det sirkulært polariserte lyset blir oppnådd ved prøven.
    5. Oppsett EM (elektron multiplisere) -Lade coupled device (CCD) kamera
      1. Fest EM-CCD kamera til sideporten av mikroskopet og koble den til tHan image oppkjøpet programvare.
      2. Hvis det er nødvendig, synkroniserer kameraet eksponering for en mekanisk lukker eller akusto-optisk avstembart filter innsatt i eksitasjon strålebanen ved å sende den transistor-transistorlogikk (TTL) signaler generert av EM-CCD-kamera til enhetene. Alternativt kan synkron kameraet eksponering for laserutgangen ved å sende den TTL-signaler generert av den EM-CCD-kamera til laseren.
        NB: Det siste alternativet er anvendbar bare når en solid-state laser hvis utgangseffekt kan moduleres ved input transistor-transistorlogikk (TTL) signaler blir brukt til eksperimentet.
      3. Anvende et EM forsterkning (typisk ca. 300) for CCD-kameraet ved bruk av programvare som styrer kameraet for å oppnå en høy kvalitet fluorescens bilde av det indre fluoroforen.
      4. Sett en region av interesse (ROI) (typisk 128 x 128 piksler i sentrum av synsfeltet) ved hjelp av programvaren som styrer kameraet.
        MERK: Det kan for Imaging forsøk ved de bildefrekvens på 100 - 200 Hz i rammen overføringsmodus, som er nødvendig for å visualisere bevegelse av fluoroforen-innlemmet polymerkjeder i smelten prøven.
  3. Kjøre eksperimentet
    1. Optimalisering av forsøksbetingelsene
      1. Juster belysning område av prøven til omtrent 20 pm i diameter ved å bruke innsatt i eksitasjon strålebanen membran.
      2. Sett eksitasjon laser makt på prøven til 4-8 mW ved manuelt å velge en passende nøytral tetthet (ND) filter satt inn i eksitasjon strålebanen.
        MERK: Dette gir den midlere lasereffekten av 1 - 2 kW cm 2 ved prøven.
      3. Record fluorescens bilder av prøven ved bildefrekvens på 100 - 200 Hz. Dersom fluorescensintensiteten oppnådd fra de individuelle fluoroforen-innlemmet polymerer er for lav, øker gradvis magnetiseringseffekten ved hjelp the ND filter til å nå ca 100 mW ved prøven.
      4. Hvis kvaliteten av den enkelt-molekyl fluorescens bilde er fortsatt ikke tilfredsstillende, sjekker fluorescens urenheter i prøven ved å registrere fluorescens-bilder av en ren smelte av det ikke-merkede poly (THF). I tilfelle en høy fluorescens bakgrunn observeres, bruke ulike ikke-merket poly (THF).
      5. Dersom tettheten av den fluorescens flekk oppnådd fra fluoroforen-innlemmet polymerer i smelten er for høy til å romlig isolere dem (dette fører til feil i analysen av den diffusive bevegelse), redusere konsentrasjonen av fluoroforen-innlemmet polymerer i prøven inntil romlig isolerte flekker er observert.
      6. Dersom tettheten av den fluorescens flekk oppnådd fra fluoroforen-polymerer innlemmet i smelten er for lav (dette fører til en lav gjennomstrømning av avbildnings eksperimentet), øker konsentrasjonen av fluoroforen-innlemmet polymerer i prøven til en approprIate tetthet av fluorescensen sted er nådd.
      7. Hvis fluorescens bilder hentet fra fluoroforen-innlemmet polymerer i smelten er uskarpe, øke bildefrekvens på bilde oppkjøpet.
        MERK: Dette krever ofte en mindre avkastning, typisk 64 x 64 piksler.
  4. Bilde oppkjøp
    1. Når forsøksbetingelsene blir optimalisert, la montert prøven på mikroskop scenen på en time, slik at prøven har nådd likevektsbetingelser.
    2. Posten 500 - 1000 fluorescens bildesekvenser av fluoroforen-innlemmet polymerer i smeltet tilstand ved 100 - 200 Hz bildefrekvens. Hvis standard filformat er ikke TIFF, konvertere alle bildesekvenser til TIFF-format.

4. Analyse av den diffusive bevegelses

  1. Mean-squared forskyvning (MSD) analyse
    1. Beskjære fluorescens bildesekvenser på en slik måteat hver bildesekvens inneholder et enkelt og godt fokusert spre fluorophore-innlemmet polymer ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ.
    2. Når det beskårede bildesekvenser inneholder mer enn 10 bilder, dele bildesekvenser i flere sekvenser slik at hver sekvens består av 10 bilder.
    3. Bestemme posisjonene til molekylene i hvert bildesekvenser nøyaktig ved todimensjonal Gaussisk montering av bildene.
    4. Bestemme diffusjonskoeffisienten (D) av individuelle molekyler av midlere kvadrerte forskyvning (MSD) analyse av diffusjon baner (dvs. tidsavhengige posisjoner av molekylet) under anvendelse av en ligning 20
      Equation1
      hvor x i y og jeg er posisjonene av molekylet i bilderammen i, og n betyr rammenummeret sammen med tidsrommet At fra ramme i.
    5. Plott diffusjonskoeffisientene ien frekvens histogram.
      MERK: Typisk blir histogrammet konstruert fra mer enn 100 molekyler.
  2. Kumulative fordelingsfunksjonen (CDF) analyse
    MERK: En CDF, P (r 2, jeg Δ t) tilsvarer den kumulative sannsynligheten for å finne de som diffunderer molekyler innenfor en radius r fra origo etter en viss tidsforskyvning i S t.
    1. Beregn squared-forskyvning som oppstår under tidsforskyvninger av 1Δt, 2At, ····, iΔt for alle diffusjon baner oppnådd i 4.1.3.
      MERK: Disse beregningene gi totalt m jeg squared-forskyvninger for tidsetterslep av iΔt.
    2. Beregn antall kvadrat-forskyvningene (l i) innen totale m jeg datasett som er mindre enn r 2 på ulike r 2 verdier (0 <r2 <∞). Normalisert l i vs r 2 plott svarer til CDF, P (r 2, iΔt).
  3. Analyse av CDFS med tydelige diffusjonsmodeller
    Merk: De oppnådde CDFS er utstyrt med forskjellige diffusjonsmodeller; homogen diffusjon modell, flere diffusjon modi hvori D fordelingen er beskrevet av en Gaussisk (enkel Gaussisk modell), og flere diffusjon modi hvori D fordelingen er beskrevet av multiple Gaussian (multiple Gaussisk modell).
    1. I den homogene diffusjonsmodell, bestemme en midlere D ved å montere den CDF ved hjelp av en ligning 21
      Equation2
      MERK: Eventuelle avvik fra ligningen antyder den heterogene spredning av molekylet.
    2. I enkelt gaussisk modell, bestemme sannsynlighetsfordelingen av D beskrevet av en Gaussisk (f (D)) ved å tilpasse den CDF ved hjelp 15
      On3 "src =" / files / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
      Equation4
      hvor A, W, D og 0 er den amplitude, bredde, og på midten av gaussisk.
    3. I den doble gaussisk modell, bestemme sannsynlighetsfordelingen av j th komponent av D beskrevet av en Gaussisk (f (D)) ved å tilpasse den CDF ved hjelp 14
      Equation5
      Equation6
      hvor A j er den brøkdel av hver diffusjon komponent, og α j, w j, og D 0 j er den amplitude, bredde, og på midten av j te komponenten av gaussisk.
  4. Beregning av den teoretiske sannsynligheten distrisjon av diffusjonskoeffisienten
    MERK: sannsynlighetsfordelinger av D oppstår på grunn av de statistiske feil (p (D) d D) er beregnet for de ulike spredningsmodeller; homogen diffusjon modell, flere diffusjon modi hvori D fordelingen er beskrevet av en Gaussisk (enkel Gaussisk modell), og flere diffusjon modi hvori D fordelingen er beskrevet av multiple Gaussian (multiple Gaussisk modell).
    1. I den homogene diffusjonsmodell, beregne statistiske sannsynligheten fordelingen av D ved hjelp av en ligning 22
      Equation7
      hvor N er antallet av datapunktene i en diffusjon bane (N = 10, se 4.1.2), D 0 er den midlere diffusjonskoeffisient (bestemt av CDF-analyse, se 4.2.3.1), og D er den eksperimentelt oppnådde diffusjonskoeffisienten for en individuell bane.
    2. påenkelt Gaussisk modell diffusjon, beregne statistiske sannsynligheten fordelingen av D ved hjelp av en ligning 15
      Equation8
      hvor f (D) betegner sannsynlighetsfordeling av D bestemmes av CDF-analyse (se 4.2.3.2), og D er den midlere 0 diffusjonskoeffisient (bestemt av CDF-analyse, se 4.2.3.2).
    3. I den doble Gaussian diffusjonsmodell, beregne statistiske sannsynligheten fordelingen av D ved hjelp av en ligning 14
      Equation9
      der f (D j) betegner sannsynlighetsfordeling av den j te komponenten av D (D j) bestemmes av CDF-analyse (se 4.2.3.3), og D er den midlere 0j diffusjonskoeffisienten av den j th komponent (bestemt av CDF analyse, se 4.2.3.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den perylen diimid-innlemmet fire-armet stjerne og 8 formet dicyklisk poly (THF) s ble syntetisert ved anvendelse av den elektrostatiske selv-sammenstillingen og kovalent fiksering (ESA-CF) Fremgangsmåte (figur 1, figur 2). Time-lapse single-molekyl fluorescens bildene ble målt for fire-armet (figur 3a) og 8-formet (figur 3b) polymerer. De time-lapse fluorescens bilder (figur 3) viser romlig isolerte lyse og skarpe flekker på grunn av inkorporering av den svært fluorescerende perylen diimid fluorophore 23 til kjedene. Frekvens histogrammer av diffusjonskoeffisienten ble beregnet for de fire-armet (figur 4a) og 8-formet (figur 4b) polymerer ved den midlere kvadrerte forskyvning (MSD) analyse av time-lapse bilder. Beregningene av MSD ​​plott og CDFS er utført med rutiner skrevet i MATLAB. beslagetav CDFS hentet fra forsøkene er utført ved bruk av databehandling programvare som Origin Pro. Frekvens histogrammer av diffusjonskoeffisienten bestemmes av MSD-analyse viser brede distribusjoner (figur 4) som følge av både den statistiske feil av analysen og heterogenitet av diffusjonen. Frekvenshistogrammene viser klare avvik fra den homogene diffusjonsmodell (grønn linje i figur 4), som demonstrerer heterogen diffusjon av polymermolekylene. 14 kumulativ fordelingsfunksjon (CDFS) ble beregnet for de fire-armet (figur 5a) og 8-formet (figur 5b) polymerer og monteres av én Gauss (figur 5a) og dobbel Gaussian (figur 5b) modeller. De statistiske sannsynlighetsfordelinger av diffusjonskoeffisienten ble beregnet for de fire-armet (figur 4a) og 8-formet (figur 4b) pol ymers av singelen Gaussian, eller doble Gaussisk modeller. Singelen (figur 5a) og dobbel (figur 5b) Gaussian modeller passe eksperimentelt innhentet CDFS godt. Disse resultater viser at diffusjonen av de fire-armet polymer som beskrives av den brede fordeling av diffusjonskoeffisienten, mens den 8-formede polymer viser to forskjellige modi diffusjon.

Figur 1
Figur 1. Syntese ruten for perylen diimid-innlemmet poly (THF) s. Syntese ruten for (a) 4-væpnede stjerners polymerer og (b) 8-formet dicykliske polymerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

54503fig2.jpg "/>
Figur 2. Karakterisering av de syntetiserte polymerer. NMR spektra av (a) 4-væpnede stjerners polymerer og (b) 8-formet dicykliske polymerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3 (filmer). Enkelt molekyl fluorescens avbildning av perylen diimid-innlemmet poly (THF) s. Tidsforsinkelses fluorescens bilder av (a) 4-væpnede stjerne-polymerer, og (b) 8-formet dicykliske polymerer i smelte av ikke-merket lineære poly (THF ). Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se filmer (a) og3 / Figure_3b_submit.mov "target =" _ blank "> (b).

Figur 4
Figur 4. MSD-analyse av perylen diimid-innlemmet poly (THF) s diffunderer i smelten. Frekvens histogrammer av diffusjonskoeffisienten bestemmes for de enkelte (a) 4-væpnede stjerne-polymerer, og (b) 8-formede dicykliske polymerer i smelten av ikke-merket lineære poly (THF). De heltrukne linjer viser teoretisk beregnede sannsynlighetsfordelinger av diffusjonskoeffisienten basert på de tre forskjellige diffusjonsmodeller; homogen diffusjon modell (grønne linjer, se 4.3.1), singel Gaussian modell (redlines, se 4.3.2), og dobbel Gaussian modell (blå linje, se 4.3.3). 14 Klikk her for å se en større versjon av denne figur.


Figur 5. CDF-analyse av perylen diimid-innlemmet poly (THF) s diffunderer i smelten Eksperimentelt erholdt kumulativ fordelingsfunksjon (iΔt = 7,5 til 75 millisekunder). I form av en P-for (a) 4-væpnede stjernepolymerer og (b) 8-formet dicykliske polymerer i smelte av ikke-merket lineære poly (THF). Stiplede linjene viser koblinger med (a) ligninger i 4.2.3.2 og (b) ligninger i 4.2.3.3. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De 4-armert og 8-formede polymerer ble fremstilt via ESA-CF-protokollen (figur 1), som er et kritisk trinn for syntesen. 12,24 Monofunksjonelt og bifunksjonelle lineære poly (THF) s med N -phenylpiperidinium endegrupper var syntetiseres i henhold til den foregående prosedyre. 11 ionebytter ble utført ved gjenutfelling av en acetonoppløsning av en polymer forløper med triflat counteranions i en vandig oppløsning inneholdende en overskuddsmengde av karboksylat.

Den kovalente Omdannelsen av ionebytter-produkt for de fire enarmede stjernepolymerer ble utført i toluen (4,9 g / l) ved tilbakeløp i 4 timer. Hvis omdannelsen er ikke tilstrekkelig, forlenge reaksjonstiden. Det kovalent bundet produkt ble oppnådd ved silikagel-kolonnekromatografi med aceton / n-heksan og utfelling på nytt i vann. Den 1H NMR av de fire enarmede polymerer er vist i figur 2a. This ESA-CF fremgangsmåte tillater effektiv syntese av cykliske polymerer. Imidlertid er denne protokollen begrenset til polymerer som har cykliske onium-endegrupper.

For den 8-formede polymerprodukt, ble reaksjonen utført i toluen i fortynning (0,2 g / l) under tilbakeløp i 4 timer og resulterte i dannelse av en stor del av en uløselig fraksjon, antagelig på grunn av den intermolekylære reagerte produkter. En oppløselige delen ble utfelt på nytt i n-heksan, underkastet silikagel-kolonnekromatografi med aceton / n-heksan, og utfelt på nytt i vann. Det oppnådde urene produkt ble underkastet kolonnekromatografi med størrelseutelukkelses perler og resirkulere GPC for å tillate isolering av den 8-formede polymerprodukt. Den 1H NMR av den 8-formede polymerer er vist i figur 2b. Dette ESA-CF-protokollen kan være aktuelt for flere komplekse topologiske polymerer.

Den høye kvaliteten fluorescens bilder er Essential for nøyaktig analyse av den diffusive bevegelse av molekylene. Fluorescens bildene blir betydelig forverret når en) fluorescens urenheter er til stede i prøven, 2) fluorescens kvanteutbytte av en innlemmet fluoroforen er lav, og 3) den bildefrekvens på bilde er langsommere enn den diffusive bevegelse av polymermolekylene. Innstilling av temperatur under romtemperatur (20 ° C) eller over 37 ° C vil føre til en brytningsindeks mismatch, som også vil forringe kvaliteten av innspilte fluorescens bilder. Ved hjelp av et smalere bånd utslipp båndpassfilter som er montert på et filter terning en gang forbedrer kvaliteten av det bilde fluorescens. Ettersom eksponeringstiden av EM-CCD-kamera som brukes i bilde forsøket er vanligvis begrenset til millisekunder, kan den diffusive bevegelse hurtigere enn denne tidsskalaen ikke kan fanges opp ved denne metoden.

Vurderingen av virkningen av den statistiske feil i MSD-analysen er den kritiske trinn for karakteriseringen av den heterogene diffusjon. Den statistiske feil bør vurderes nøye ved å beregne sannsynlighetsfordelingen av diffusjonskoeffisienten bruker homogen spredning modell 22 før diskutere den heterogene diffusjon. Den heterogene diffusjon bør også være nøye evaluert av CDF analyse. Når CDFS viser klare avvik fra det homogene diffusjonsmodell (dvs. enkelt-eksponentielle kurve råtnende), antyder dette nærværet av flere diffuserende komponenter. Den kvantitative karakterisering av heterogene diffusjon krever kombinert MSD, CDF, og sannsynlighetsfordeling analyser. 14,15

Polymer dynamikk, inkludert diffusive bevegelse, er blitt beskrevet som ensemble-midlet verdier i de konvensjonelle metoder så som NMR, 7 lysspredning, 8 og viskositetsmålinger. 9 faktisk den heterogene diffusive bevegelse åpenbart av single-molekyl avbildnings 16 er ofte svært vanskelig å oppdage i de ensemble-gjennomsnitt metoder. Tatt i betraktning den iboende heterogene natur av polymerer, er 25-27 fremgangsmåten rapportert i denne protokollen ikke begrenset til karakterisering av topologiske polymerer, men er anvendelig for alle typer polymerer i henhold viklet betingelser. 28 Videre vil den tilnærmingen rapportert i denne protokollen finne en bred anvendelse i analysen av heterogene diffusjon i komplekse systemer, for eksempel molekylær diffusjon gjennom mesoporøse materialer. 29

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
THF Godo
Wakosil C-300 Wako Pure Chemical Industries
Acetone Godo
Toluene Godo
n-Hexane Godo
CHCl3 Kanto Chemical
Bio-Beads S-X1 Bio-Rad
Methyl triflate Nacalai Tesque
Triflic anhydride Nacalai Tesque
Potassium Hydroxide Wako Pure Chemical Industries
Ethanol Wako Pure Chemical Industries
Poly(tetrahydrofuran) Aldrich
Chloroform Wako Pure Chemical Industries
Immersion oil Cargille Type 37 / Type A
Equipment
2-Neck 100-ml round-bottom flask
Flask
Beaker
Funnel
Filter paper Whatman
Reflux condenser
Syringe
Water bath
Magnetic stirrer
Rotary evaporator
Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) Matsunami Glass CO22241
Staining jar AS ONE Corporation 1-7934-01
Ultrasonic cleaner VWR International  142-0047
Inverted microscope Olympus IX71
Ar-Kr ion laser Coherent Innova 70C
Berek compensator Newport 5540
Excitation filter Semrock LL01-488-12.5
Dichloric mirror Omega optical 500DRLP
Emission filter Semrock BLP01-488R-25
Lens and mirror Thorlabs
EM-CCD camera Andor Technology iXon
Objective lens (100X, N.A. = 1.3) Olympus UPLFLN 100XOP
Objective heater Bioptechs
Preparative GPC Japan Analytical Industry LC-908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
  2. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
  3. Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
  4. McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
  5. McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
  6. Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
  7. Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
  8. Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
  9. von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
  10. Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
  11. Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
  12. Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
  13. Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
  14. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
  15. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
  16. Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
  17. Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
  18. Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
  19. Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
  20. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  21. Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
  22. Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
  23. Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
  24. Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
  25. Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
  26. Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
  27. Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
  28. Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
  29. Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).

Tags

Kjemi syklisk polymer syntese polymer smelte topologi diffusjon enkelt molekyl fluorescens mikroskopi
Syntese av Sykliske Polymers og karakterisering av deres diffusiv Motion i smeltet tilstand ved enkelt molekyl nivå
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka,More

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (115), e54503, doi:10.3791/54503 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter