Summary
Een protocol voor de synthese en karakterisering van diffuse beweging van cyclische polymeren op de single molecule-niveau wordt gepresenteerd.
Protocol
1. Synthese van monofunctionele en bifunctionele poly (THF)
- Monofunctioneel poly (THF)
- Flame droge een 2-hals 100 ml rondbodemkolf. Vacuüm en vul de kolf met stikstof (3 cycli).
- Voeg gedestilleerd tetrahydrofuran (THF) (50 ml) aan de kolf. Plaats de kolf in een waterbad bij 20 ° C en equilibreren van de temperatuur.
- Voeg methyl trifluormethaansulfonaat (0,5 mmol) aan de kolf met een injectiespuit. Roer het mengsel gedurende 5-10 minuten bij 20 ° C.
- Voeg N fenyl pyrrolidine (4-6 equiv.) Aan de kolf met een injectiespuit. Roer het mengsel gedurende 30-60 min.
- Volledig het oplosmiddel onder verlaagde druk (ongeveer 100 Torr) verwijderd. Los het residu op in 3-5 ml aceton. Voeg de acetonoplossing in 300-500 ml n-hexaan. Filtreer het precipitaat en drogen onder verminderde druk.
- Bifunctionele poly (THF)
- Flame droge een 2-hals 100 ml rondbodemkolf. Vacuum en vul de kolf met stikstof (3 cycli).
- Voeg gedestilleerd THF (50 ml) aan de kolf. Plaats de kolf in een waterbad bij 20 ° C en equilibreren van de temperatuur.
- Voeg trifluormethaansulfonzuuranhydride (0,3 mmol) aan de kolf met een injectiespuit. Roer het mengsel gedurende 5-10 minuten bij 20 ° C.
- Voeg N fenyl pyrrolidine (4-6 equiv.) Aan de kolf met een injectiespuit. Roer het mengsel gedurende 30-60 min.
- Volledig het oplosmiddel onder verlaagde druk (ongeveer 100 Torr) verwijderd. Los het residu op in 3-5 ml aceton. Voeg de acetonoplossing 300-500 ml n-hexaan. Filtreer het precipitaat en drogen onder verminderde druk.
2. Synthese van Perylene diimide-opgenomen 4-bewapende Star en 8-vormige dicyclisch Poly (THF)
- Gewapende ster poly (THF)
- ionenwisselende
- Ontbinden peryleen diimide tetracarboxylaat natriumzout in water (10 mg / ml, 150 ml). ontbindenmonofunctioneel poly (THF) in aceton (160 mg / ml, 4 ml). Voeg de acetonoplossing druppelsgewijs in de krachtig geroerde waterige oplossing. Verzamel het gevormde neerslag door filtratie.
- Herhaal de bovenstaande procedure met het gewonnen neerslag (2.1.1.1) vier keer.
- covalente fixatie
- Los het verkregen precipitaat in tolueen (5 mg / ml). Reflux de oplossing 4 uur.
- Volledig het oplosmiddel onder verlaagde druk (ongeveer 100 Torr) verwijderd. Filtreer het residu door een prop silicagel met n-hexaan / aceton (2/1 vol / vol). Voeg de oplossing in met ijs gekoeld water (300-500 ml) om het product te precipiteren. Verzamel het neerslag door filtratie.
- ionenwisselende
- Dicyclisch 8-vormige poly (THF)
- ionenwisselende
- Ontbinden peryleen diimide tetracarboxylaat natriumzout in water (6 mg / ml, 50 ml). Ontbinden bifunctionele poly (THF) (0,5 g) In 30-50 ml aceton. Voeg de acetonoplossing druppelsgewijs in de krachtig geroerde waterige oplossing bij 0 ° C. Verzamel het gevormde neerslag door filtratie.
- Herhaal de bovenstaande procedure met de teruggewonnen neerslag (2.2.1.1).
- covalente fixatie
- Los het verkregen precipitaat in tolueen (0,05 g / l). Reflux de oplossing 4 uur.
- Volledig het oplosmiddel onder verlaagde druk (ongeveer 100 Torr) verwijderd. tolueen toe te voegen aan het residu gedeeltelijk te ontbinden. Re-neerslaan in 300-500 ml n-hexaan.
- Filtreer het precipitaat gevormd door een prop silicagel met n-hexaan / aceton (2/1 vol / vol). Re-neerslaan in 300-500 ml water.
- Zuiver het gevormde precipitaat door kolomchromatografie onder toepassing van een 18 polystyreen gel. Het verder zuiveren van het ruwe product door preparatieve gelpermeatiechromatografie (GPC) 19 met een eluens CHCI3 REMove bijproducten door het bewaken van de brekingsindex (RI) en UV-detectoren.
- ionenwisselende
3. Single-molecule Fluorescence Imaging Experiment
- monstervoorbereiding
- Reiniging van microscoop dekglaasjes
- Plaats No. 1.5 24 x 24 mm microscoop dekglaasjes in een kleuring pot.
- Voeg 1 M kaliumhydride (100 ml) in de pot en ultrasone trillingen gedurende 15 min. Giet de kaliumhydroxideoplossing door decanteren en spoel de dekglaasjes met ultra-zuiver water meerdere malen. Voeg spectroscopische kwaliteit ethanol (100 ml) in de pot en ultrasone trillingen gedurende 15 min.
- Giet het ethanol door decanteren en spoel de dekglaasjes met ultra-zuiver water gedurende een aantal keren. Na het storten van de ultra-zuiver water door decanteren, herhaalt u de stap 3.1.1.2.
- Voeg ultra-zuiver water aan de pot en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. Spoel de dekglaasjes met ultra-zuiver water gedurende een aantal keren. Verwijder de dekglaasjes van de pot door een kunststof pincet en droog ze door een van beide droge lucht of droge stikstof.
- Bereiding van monsters polymeersmelt 14,15
- Voeg 100 ul van niet-gemerkte lineaire poly (THF) in een glazen fles en verwarmen tot een temperatuur boven het smeltpunt (ongeveer 25 ° C) met een haardroger.
- Los de fluorofoor opgenomen polymeer (lineair, 4-armige ster, cyclische, of 8-vormige dicyclisch gesynthetiseerd 2,1 en 2,2) in chloroform (1 ml, 10 -6 M). Voeg 1 pl van de oplossing van de 100 ui van de smelt van de niet-gemerkte lineaire poly (THF).
- Na grondig mengen van het monster met een pipetpunt, chloroform verdampt door verwarming van het monster met behulp van een droger.
Opmerking: Dit verschaft een smelt van de niet-gemerkte lineaire poly (THF) met 10 -8 M van de fluorofoor opgenomen polymeren. - Neem 10 pi van het monster met behulp van een micropipet en dRop het op een gereinigde dekglas. Zet een andere gereinigd dekglas op het monster en sandwich van het monster tussen de twee dekglaasjes.
- Druk op het monster voorzichtig met een kunststof pincet.
- Reiniging van microscoop dekglaasjes
- Wide-field fluorescentie beeldvorming setup 15
- Invoering van een excitatie laser (488 nm) in de achterhaven van de omgekeerde microscoop
- Steek een excitatie banddoorlaatfilter en polarisator in de laserstraal pad.
- Vouw de bundel tot ongeveer 1 cm in diameter en een bundel expander.
- Steek een kwart golfplaat in de laserstraal pad. Stel de optische as van de golfplaat van 45 graden ten opzichte van die van de polarisator. Als alternatief, plaatst u een Berek compensator en zet de optische vertraging van A / 4.
- Plaats een membraan in de excitatie balk pad naar de bundel grootte aan te passen.
- Vóór de invoering van de laserstraal op de achterkant haven van de omgekeerde optische Micrpe, plaatst u een focus lens (plan-bolle lens, brandpuntsafstand ≈ 300 mm) op een positie waar de laserstraal uit het objectief wordt gecollimeerd.
- Na als gevolg van de laserstraal met behulp van een dichroïsche spiegel gemonteerd op een filter kubus, de invoering van de laserstraal naar het monster door een hoge numerieke apertuur (NA) objectief (bijvoorbeeld NA 1,3, 100X vergroting, olie-immersie).
- Bevestig een doelstelling kachel naar de objectieflens en de temperatuur tot 30 ° C.
- Montage het monster op het stadium van het omgekeerde microscoop
- Drop een druppel immersie olie op het objectief en monteer het monster op de microscoop staat.
- Verzekeren dat de steekproef dikte van ongeveer 10 urn wordt verkregen door controle van de axiale positie van de onderste en bovenste oppervlak van het monster.
- Stel de focus van de microscoop om een paar micrometer boven het bodemoppervlak van het monster.
- Steek een polarisator in de gecollimeerde laserstraal uit van het objectief.
- Noteer de intensiteit van de laser door de polarisator aan door een vermogensmeter na de polarisator. Noteer de uitgezonden laservermogen bij verschillende hoeken polarisatie door rotatie van de polarisator.
- Als de uitgezonden laservermogen niet constant is helemaal polarisatie hoeken, iets draai de kwart golfplaat of Berek compensator in de excitatie stralengang geplaatst.
- Herhaal stap 3.2.5.2 en 3.2.5.3 tot de constante uitgezonden laservermogen wordt verkregen bij alle polarisatie hoeken. Zorg ervoor dat het circulair gepolariseerd licht wordt verkregen bij het monster.
- Stel de EM (elektron vermenigvuldigen) -Charge Coupled Device (CCD) camera
- Bevestig de EM-CCD-camera aan de zijkant poort van de microscoop en sluit deze aan tHij afbeelding acquisitie software.
- Eventueel synchroniseert de camera blootstelling aan een mechanische sluiter of een akoesto-optisch afstembaar filter in de excitatie stralengang ingevoegd bij het versturen van de transistor-transistor logic (TTL) signalen van de EM-CCD camera om de apparaten. Alternatief synchroniseren van de camera blootstelling aan de laseruitvoer door toezending van TTL signalen van de EM-CCD camera om de laser.
Opmerking: Deze optie is alleen van toepassing wanneer een halfgeleiderlaser waarvan uitgangsvermogen worden gemoduleerd door de input transistor-transistor logic (TTL) signalen voor het experiment gebruikt. - Breng een EM versterking (typisch ongeveer 300) aan de CCD camera met software besturen van de camera om een hoge kwaliteit beeld fluorescentie van één fluorofoor verkrijgen.
- Stel een van belang (ROI) (typisch 128 x 128 pixels in het midden van het gezichtsveld) via software de camera bedient.
LET OP: Deze maakt het mogelijk om Imaging experimenten bij framesnelheden van 100-200 Hz in het frame transfer mode, die nodig is voor het visualiseren van de beweging van de fluorofoor opgenomen polymeerketens in de smelt monster.
- Invoering van een excitatie laser (488 nm) in de achterhaven van de omgekeerde microscoop
- Het uitvoeren van het experiment
- Het optimaliseren van de experimentele omstandigheden
- Pas het belichtingsgebied van het monster tot ongeveer 20 urn in diameter met het membraan in de excitatie stralengang geplaatst.
- Stel de excitatie laservermogen aan het monster 4-8 mW door het handmatig selecteren van een geschikte neutrale dichtheid (ND) filter in de excitatie stralengang geplaatst.
Opmerking: Dit geeft het gemiddelde laservermogen van 1-2 kW cm -2 in het monster. - Record fluorescentie beelden van het monster op de framerates van 100-200 Hz. Indien de fluorescentie-intensiteit verkregen uit de afzonderlijke fluorofoor opgenomen polymeren te laag is, geleidelijk de excitatie stroom met the ND-filter tot het bereiken van ongeveer 100 mW bij het monster.
- Als de beeldkwaliteit van de single-molecule fluorescentie van is nog steeds niet bevredigend is, controleer dan de fluorescentie onzuiverheden in het monster door het opnemen van fluorescentie beelden van een zuivere smelt van de niet-gelabelde poly (THF). Indien een hoge achtergrond fluorescentie wordt waargenomen, gebruiken verschillende niet-gemerkte poly (THF).
- Als de dichtheid van de fluorescentie vlek verkregen uit de fluorofoor opgenomen polymeren in de smelt te hoog is om ze (dit veroorzaakt fouten bij de analyse van de diffuse beweging) ruimtelijk isoleren, verminderen de concentratie van het fluorofoor opgenomen polymeren in het monster zo ruimtelijk geïsoleerde plekken worden waargenomen.
- Als de dichtheid van de fluorescentie vlek verkregen uit de fluorofoor opgenomen polymeren in de smelt te laag (dit veroorzaakt een geringe productie van het beeldvormende experiment), verhoging van de concentratie van het fluorofoor opgenomen polymeren in het monster tot een KREDIETENiate dichtheid van de fluorescentie plaats bereikt.
- Indien de fluorescentie beelden verkregen uit de-fluorofoor opgenomen polymeren in de smelt zijn wazig, verhoging van de framerates van de imaging overname.
NB: Dit vereist vaak een kleinere ROI, meestal 64 x 64 pixels.
- Het optimaliseren van de experimentele omstandigheden
- Afbeeldingen verwerving
- Zodra de proefomstandigheden worden geoptimaliseerd, laat de gemonteerde monster op de microscoop podium voor een uur zodat het monster evenwichtsvoorwaarden bereikt.
- Neem 500 - 1000 afbeelding fluorescentie-sequenties van de fluorofoor opgenomen polymeren in de gesmolten toestand bij een 100-200 Hz frame rate. Als het standaard bestandsformaat is niet TIFF, zet alle beeldsequenties de aan de TIFF-formaat.
4. Analyse van de Diffusive Motion
- Mean-squared verplaatsing (MSD) analyse
- De afbeelding bijsnijden fluorescentie sequenties zodanigdat elk beeld sequentie bevat een enkel en goed gerichte diffunderen-fluorofoor opgenomen polymeer met behulp van software voor beeldverwerking, zoals ImageJ.
- Wanneer de bijgesneden afbeelding sequenties bevatten meer dan 10 frames, splitsing van de afbeelding sequenties in meerdere sequenties zodanig dat elke reeks bestaat uit 10 frames.
- Bepaal de posities van de moleculen in elke beeldsequenties geschieden via tweedimensionale Gauss montage van de beelden.
- Bepaal de diffusiecoëfficiënt (D) van de individuele moleculen van gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) analyse van de diffusie trajecten (dwz tijdsafhankelijke posities van het molecuul) een expressie 20
waarin xi en yi positie van het molecuul in het beeldframe i en n geeft het framenummer de tijdspanne At uit i frame. - Plot van de diffusie coëfficiënten ineen frequentie histogram.
OPMERKING: Typisch het histogram is opgebouwd uit meer dan 100 moleculen.
- Cumulatieve verdelingsfunctie (CDF) analyse
OPMERKING: Een CDF, P (r 2, i Δ t) overeenkomt met de cumulatieve waarschijnlijkheid om de diffunderende moleculen binnen een straal r van de oorsprong na een zekere vertraging i At.- Bereken het kwadraat-verplaatsing optreedt tijdens vertragingen van 1Δt, 2Δt, ····, iΔt voor de verspreiding trajecten verkregen in 4.1.3.
LET OP: Deze berekeningen geven totale m i kwadraat-verplaatsingen voor de tijd loopt van iΔt. - Bereken nummers van de kwadraat-verplaatsingen (l i) binnen de totale m i dataset die kleiner zijn dan R2 zijn bij verschillende r 2 waarden (0 <R2 <∞). De genormaliseerde l i vs r 2 percelen komen overeen met de CDF, P (r 2, iΔt).
- Bereken het kwadraat-verplaatsing optreedt tijdens vertragingen van 1Δt, 2Δt, ····, iΔt voor de verspreiding trajecten verkregen in 4.1.3.
- Analyse van CDFS met verschillende diffusiemodellen
NB: De verkregen CDFS worden gemonteerd door verschillende diffusiemodellen; homogene diffusiemodel, verschillende diffusie standen waarin de verdeling D wordt beschreven door een Gauss (enkelvoudige Gaussische model), en meerdere diffusie modi waarin de verdeling D wordt beschreven door meerdere Gaussian (veelvoudige Gaussische model).- In de homogene diffusie model, bepaalt een gemiddelde D door het aanbrengen van de CDF met behulp van een vergelijking 21
OPMERKING: Elke afwijking van de vergelijking suggereert de heterogene verspreiding van het molecuul. - In de enkelvoudige Gaussische model Bepaal de waarschijnlijkheidsverdeling van D beschreven door een Gauss (f (D)) Door het aanbrengen van de CDF via 15
on3 "src =" / files / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
waarbij A, B en D zijn 0 de amplitude, breedte en middelpunt van de Gauss. - In een dubbele Gaussische model Bepaal de waarschijnlijkheidsverdeling van jde component D beschreven door een Gauss (f (D)) Door het aanbrengen van de CDF via 14
waarbij A j is de fractie van elke component diffusie en α j, w j en j 0 D zijn de amplitude, breedte en middelpunt van de jde component van de Gauss.
- In de homogene diffusie model, bepaalt een gemiddelde D door het aanbrengen van de CDF met behulp van een vergelijking 21
- Berekening van het theoretische kans distridrage van de diffusiecoëfficiënt
OPMERKING: De kansverdelingen D ontstaan door de statistische fouten (p (D) d D) berekend voor de verschillende diffusiemodellen; homogene diffusiemodel, verschillende diffusie standen waarin de verdeling D wordt beschreven door een Gauss (enkelvoudige Gaussische model), en meerdere diffusie modi waarin de verdeling D wordt beschreven door meerdere Gaussian (veelvoudige Gaussische model).- In de homogene diffusie model berekent de statistische kansverdeling van D een expressie 22
waarbij N het aantal gegevenspunten in een diffusie traject (N = 10, zie 4.1.2), D 0 is de gemiddelde diffusiecoëfficiënt (bepaald volgens de CDF analyse, zie 4.2.3.1) en D is de experimenteel verkregen diffusiecoëfficiënt voor een individuele traject. - In deenkele Gauss diffusiemodel, berekenen de statistische kansverdeling van D met behulp van een vergelijking 15
waarin f (D) staat voor waarschijnlijkheidsverdeling van D bepaald door de CDF analyse (zie 4.2.3.2) en D 0 is de gemiddelde diffusiecoëfficiënt (bepaald volgens de CDF analyse, zie 4.2.3.2). - In de dubbele Gauss diffusiemodel, berekenen de statistische kansverdeling van D met behulp van een vergelijking 14
waarin f (D j) staat voor waarschijnlijkheidsverdeling van de jde component van D (D j) bepaald door de CDF analyse (zie 4.2.3.3) en D 0J de gemiddelde diffusiecoëfficiënt van de jde component (bepaald volgens de CDF analyse, zie 4.2.3.3).
- In de homogene diffusie model berekent de statistische kansverdeling van D een expressie 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De peryleen diimide-4 opgenomen bewapende ster en 8-vormige dicyclisch poly (THF) s werden gesynthetiseerd met behulp van de elektrostatische zelfassemblage en covalente fixatie (CF-ESA) werkwijze (figuur 1, figuur 2). Time-lapse enkel-molecuul fluorescentie beelden werden gemeten voor de 4-armige (Figuur 3a) en 8-vormige (figuur 3b) polymeren. De time-lapse fluorescentie beelden (figuur 3) tonen ruimtelijk geïsoleerd helder en scherp vlekken vanwege de opname van de sterk fluorescerende peryleen diimide fluorofoor 23 in de ketens. Frequentiehistogrammen van de diffusiecoëfficiënt werden berekend voor de 4-armige (figuur 4a) en 8-vorm (figuur 4b) polymeren van de analyse gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) van de time-lapse beelden. De berekeningen van MSD percelen en CDFS worden uitgevoerd met behulp van routines geschreven in MATLAB. de fittingvan het CDFS verkregen uit de experimenten wordt uitgevoerd met behulp van data processing software zoals Origin Pro. De frequentie histogrammen van de diffusiecoëfficiënt bepaald door de MSD analyse tonen brede verdelingen (figuur 4) als gevolg van zowel de statistische fout van de analyse en de heterogeniteit van de diffusie. De frequentie histogrammen vertonen duidelijke afwijkingen van de homogene diffusiemodel (groene lijn in figuur 4), die heterogene diffusie van de polymeermoleculen toont. 14 verdelingsfunctie (CDFS) werden berekend voor de 4-armige (figuur 5a) en 8-vormige (Figuur 5b) polymeren en gemonteerd door de enkele Gauss (figuur 5a) en dubbele Gauss (Figuur 5b) modellen. De statistische kansverdelingen van de diffusiecoëfficiënt werden berekend voor de 4-armige (figuur 4a) en 8-vorm (figuur 4b) pol ymers door de enkele Gauss, of dubbele Gaussische modellen. De single (figuur 5a) en dubbele (figuur 5b) Gauss-modellen aan te passen de experimenteel verkregen CDFS goed. Deze resultaten tonen aan dat de verspreiding van de 4-armige polymeer wordt beschreven door de brede verspreiding van de diffusiecoëfficiënt, terwijl de 8-vormige polymeer vertoont twee verschillende modi diffusie.
Figuur 1. Synthese route van peryleen diimide-opgenomen poly (THF) s. Synthese route van (a) 4-sterren gewapende polymeren en (b) 8-vormige dicyclisch polymeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
54503fig2.jpg "/>
Figuur 2. Karakterisering van de gesynthetiseerde polymeren. NMR-spectra van (a) 4-sterren gewapende polymeren en (b) 8-vormige dicyclisch polymeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 (films). Enkel molecuul fluorescentie beeldvorming van de peryleen-diimide opgenomen poly (THF) s. Time-lapse fluorescentiebeelden van (a) 4-bewapende stervormige polymeren en (b) 8-vormige dicyclisch polymeren in de smelt van niet-gemerkte lineaire poly (THF ). Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om films te bekijken (a) en3 / Figure_3b_submit.mov "target =" _ blank "> (b).
Figuur 4. MSD analyse van de peryleen-diimide opgenomen poly (THF) s diffunderen in de smelt. Frequentie histogrammen van de diffusiecoëfficiënt bepaald individu (a) 4-bewapende stervormige polymeren en (b) 8-vormige dicyclisch polymeren in de smelt ongelabelde lineaire poly (THF). De getrokken lijnen tonen theoretisch berekende waarschijnlijkheidsverdeling van de diffusiecoëfficiënt basis van de drie verschillende diffusiemodellen; homogene diffusie model (groene lijnen, zie 4.3.1), enkele Gauss-model (redlines, zie 4.3.2), en dubbele Gauss-model (blauwe lijn, zie 4.3.3). 14 Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 5. CDF analyse van de peryleen-diimide opgenomen poly (THF) s diffunderen in de smelt experimenteel bepaalde verdelingsfunctie (iΔt = 7,5-75 msec). In de vorm van 1-P (a) 4-armige sterpolymeren en (b) 8-vormige dicyclisch polymeren in de smelt van niet-gemerkte lineaire poly (THF). Gestippelde lijnen geven fittingen met (a) vergelijkingen in 4.2.3.2 en (b) vergelijkingen in 4.2.3.3. 14 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 4-armige en 8 gevormde polymeren werden bereid via de ESR-CF protocol (figuur 1), die een kritische stap voor de synthese. 12,24 monofunctionele en bifunctionele lineaire poly (THF) s N -phenylpiperidinium eindgroepen bereid volgens de voorgaande procedure. 11 de ionenwisselende werd uitgevoerd door opnieuw neerslaan van een acetonoplossing van een polymeer precursor met triflaat tegenanionen uitgevoerd in een waterige oplossing die een overmaat carboxylaat.
De covalente omzetting van de ionenuitwisseling product voor de 4-gewapende stervormige polymeren werd uitgevoerd in tolueen (4,9 g / l) van reflux gedurende 4 uur. Als de conversie is niet voldoende, verlengen de reactietijd. Het covalent gebonden product werd verkregen door middel van silicagel kolomchromatografie met aceton / n-hexaan en opnieuw neerslaan in water. De 1H NMR van het 4-armige polymeren wordt getoond in figuur 2a. This ESA-CF procedure zorgt voor de daadwerkelijke synthese van cyclische polymeren. Echter, dit protocol beperkt tot polymeren die oniumzout cyclische eindgroepen hebben.
Voor de 8-vormige polymeerproduct werd de reactie uitgevoerd in tolueen in verdunning (0,2 g / l) onder terugvloeikoeling gedurende 4 uur uitgevoerd en resulteerde in de vorming van een groot deel van de onoplosbare fractie, waarschijnlijk door de intermoleculaire gereageerde producten. Een oplosbare deel werd opnieuw geprecipiteerd in n-hexaan, onderworpen aan silicagelkolomchromatografie met aceton / n-hexaan en opnieuw neergeslagen met water. Het verkregen ruwe product werd onderworpen aan kolomchromatografie met size exclusion kralen en recyclen GPC isolatie van de 8-vormige polymeerproduct mogelijk. De 1H NMR van de 8-vormige polymeren wordt getoond in figuur 2b. Deze ESE-CF protocol toepassing kunnen verdere complexe topologische polymeren.
De hoge kwaliteit fluorescentie beelden zijn Essential de nauwkeurige analyse van de diffuse beweging van de moleculen. De fluorescentiebeelden aanzienlijk verslechterd wanneer 1) fluorescentie onzuiverheden in het monster aanwezig zijn, 2) de fluorescentie kwantumopbrengst van een ingebouwde fluorofoor is, en 3) de framesnelheid van de beeldvorming is langzamer dan de diffuse beweging van de polymeermoleculen. de temperatuur beneden kamertemperatuur (20 ° C) of hoger dan 37 ° C instellen van een mismatch brekingsindex, die ook op het opgenomen fluorescentiebeelden zal achteruit gaan. Met behulp van een smallere band emissie banddoorlaatfilter gemonteerd op een filter kubus ergens verbetert de beeldkwaliteit van de fluorescentie van. Aangezien de belichtingstijd van de EM-CCD-camera gebruikt in het beeldvormende experiment meestal beperkt tot milliseconden, kan de diffuse beweging sneller dan deze tijdschaal niet worden opgevangen door deze methode.
De evaluatie van het effect van de statistische fout in de MSD analyse is de kritische stap for de karakterisering van de heterogene diffusie. De statistische fout moet zorgvuldig geëvalueerd door het berekenen van de kansverdeling van de diffusiecoëfficiënt met het homogene diffusiemodel 22, daarna worden de heterogene diffusie. De heterogene verspreiding moet ook zorgvuldig worden geëvalueerd door de CDF-analyse. Wanneer de CDFS vertonen duidelijke afwijkingen van het homogene diffusiemodel (dwz één exponentiële verval kromme), suggereert de aanwezigheid van meerdere componenten diffunderen. De kwantitatieve karakterisering van heterogene diffusie vereist gecombineerde MSD, CDF en kansverdeling analyses. 14,15
Polymer dynamiek, waaronder diffuse beweging, is beschreven als-ensemble gemiddelde waarden in de gebruikelijke werkwijzen zoals NMR, lichtverstrooiing 7, 8 en viscositeitsmetingen. 9 immers de heterogene diffusieve beweging geopenbaard door de singe-molecule imaging 16 is vaak erg moeilijk te detecteren in het ensemble gemiddelde methoden. Gezien de inherente heterogeniteit van polymeren, is gerapporteerd 25-27 de in dit protocol werkwijze niet beperkt tot de karakterisering van topologische polymeren, maar is toepasbaar op alle soorten polymeren onder verstrengelde omstandigheden. 28 Bovendien zal de benadering die in dit voorbeeld protocol een brede toepassing bij de analyse van heterogene diffusie in complexe systemen, zoals moleculaire diffusie door mesoporeuze materialen. 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
- Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
- McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
- McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
- Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
- Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
- Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
- von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
- Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
- Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
- Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
- Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
- Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
- Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
- Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
- Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
- Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
- Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
- Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
- Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
- Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
- Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
- Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
- Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).
