Summary
sentez ve tek molekül düzeyinde halkalı polimerlerin uzadıya hareket karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur.
Protocol
Tek fonksiyonlu ve iki fonksiyonlu Poli 1. N- (THF)
- Tek fonksiyonlu poli (THF)
- Alev 2 boyunlu 100 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye kuru. Vakum ve nitrojen (3 kür) ile şişeyi doldurun.
- şişeye damıtılmış tetrahidrofuran (THF) (50 mi) eklenir. 20 ° C'de bir su banyosu içinde balon koyun ve sıcaklık dengelenmesi.
- Bir şırınga ile bir şişeye metil triflat (0.5 mmol) ekleyin. 20 ° C'de 5-10 dakika süreyle karıştırın.
- Bir şırınga ile bir şişeye N-fenil pirolidin (4-6 eşi.) Eklenir. 30-60 dakika boyunca karıştırın.
- Tamamen düşük basınçta (yaklaşık 100 Torr) altında çözücüyü çıkarın. aseton 3-5 ml artığı içinde çözündürülür. N-heksan 300-500 ml aseton solüsyonu ekleyin. çökelti filtre edin ve indirgenmiş basınç altında kurutulur.
- Çift işlevli poli (THF)
- Alev 2 boyunlu 100 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye kuru. Vacuum ve azot (3 kez) ile şişesi doldurun.
- şişeye damıtılmış THF (50 mi) eklenir. 20 ° C'de bir su banyosu içinde balon koyun ve sıcaklık dengelenmesi.
- Bir şırınga ile şişeye triflik anhidrit (0.3 mmol) ekleyin. 20 ° C'de 5-10 dakika süreyle karıştırın.
- Bir şırınga ile bir şişeye N-fenil pirolidin (4-6 eşi.) Eklenir. 30-60 dakika boyunca karıştırın.
- Tamamen düşük basınçta (yaklaşık 100 Torr) altında çözücüyü çıkarın. aseton 3-5 ml artığı içinde çözündürülür. N-heksan 300-500 ml aseton solüsyonu ekleyin. çökelti filtre edin ve indirgenmiş basınç altında kurutulur.
2. Perylene Sentezi etitkarbodiimit-dahil 4 kollu yıldız ve 8 şeklinde disiklik Poli (THF)
- Silahlı yıldız poli (THF)
- İyon değişimi
- Suda perilen diimid tetrakarboksilat, sodyum tuzu (10 mg / ml, 150 mi) içinde çözülür. eritmekAseton tek fonksiyonlu poli (THF) (160 mg / ml, 4 mi) eklenmiştir. kuvvetli bir şekilde karıştırıldı, sulu çözelti içine aseton çözeltisi damla damla ekleyin. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak.
- kazanılan çökelti (2.1.1.1) dört kez yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- kovalent tespit
- toluen içinde elde edilen çökelti (5 mg / ml) içinde çözülür. 4 saat çözelti, geri akış.
- Tamamen düşük basınçta (yaklaşık 100 Torr) altında çözücüyü çıkarın. N-heksan / aseton (2/1 hacim / hacim), bir silika jel tıpası içinden tortu filtre. Ürünü çöktürmek için buz gibi soğuk su (300-500 ml) içine çözeltisi ekleyin. Çökeltinin süzülerek toplanır.
- İyon değişimi
- Disiklik 8-şeklinde bir poli (THF)
- İyon değişimi
- Suda perilen diimid tetrakarboksilat, sodyum tuzu (6 mg / ml, 50 mi) içinde çözülür. (0.5 g çift fonksiyonlu poli (THF) içinde çözülür) Aseton 30-50 ml. 0 ° C'de kuvvetli bir şekilde karıştırıldı, sulu çözelti içine aseton çözeltisi damla damla ekleyin. süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak.
- kazanılan çökelti (2.2.1.1) ile yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- kovalent tespit
- toluen içinde elde edilen çökelti (0,05 g / L) içinde çözülür. 4 saat çözelti, geri akış.
- Tamamen düşük basınçta (yaklaşık 100 Torr) altında çözücüyü çıkarın. Kısmen tortu çözünmesi için toluen ekleyin. Yeniden çökeltilmesi n-heksan 300-500 ml.
- N-heksan / aseton (2/1 hacim / hacim), bir silika jel tamponundan oluşan çökelti filtre. Yeniden çökeltilmesi su 300-500 ml.
- Bir polistiren jel kullanılarak kolon kromatografisiyle 18 ile oluşturulan çökelti saflaştınlır. Bundan başka REM CHCI3 bir eluent ile 19 preparatif jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile ham ürünün arıtılmasırefraktif indeks (RI) ve UV dedektörler izleyerek ove yan.
- İyon değişimi
3. Tek-molekül Floresans Görüntüleme Deneyi
- örnek hazırlama
- Mikroskop kapak fişleri temizliği
- Yeri No 1.5 24 x 24 mm mikroskop kapağı boyama kavanoza kayıyor.
- 15 dakika boyunca kavanoz ve sonikasyon olarak 1 M potasyum hidrit çözeltisi (100 mi) eklenir. durultma yoluyla potasyum hidroksit çözeltisi dökün ve birkaç kez ultra saf su ile kapak slipi üzerinde çalkalayın. 15 dakika boyunca kavanoz ve sonikasyon içine spektroskopik dereceli etanol (100 mi) eklenir.
- durultma yoluyla etanol dökün ve birkaç kez ultra saf su ile kapak fişleri durulayın. durultma yoluyla ultra saf su kapalı döküldükten sonra, adımı 3.1.1.2 tekrarlayın.
- 15 dakika boyunca kavanoz ve sonikasyon ultra saf su ekleyin. birkaç kez ultra saf su ile kapak fişleri durulayın. Bir plastik cımbız ile kavanoz kapağı fişleri çıkarın ve kuru hava veya kuru nitrojen ya onları kurutun.
- Polimer eriyiği örnekleri 14,15 hazırlanması
- bir cam şişe içinde etiketli olmayan lineer poli (THF) 100 ul ilave edin ve bir saç kurutma makinesi kullanılarak erime noktasından (yaklaşık 25 ° C) üzerindeki bir sıcaklığa kadar ısıtılır.
- Florofor dahil polimer (lineer, 4 kollu bir yıldız, siklik ya da 8-şeklinde bir disiklik 2.1 ve 2.2 sentezlenir), kloroform (1 mi, 10 -6 M) içinde çözülür. etiketli olmayan lineer poli (THF) eriyiğin 100 ul çözelti 1 ul ekle.
- İyice bir pipet ucu ile karıştırılarak sonra, kurutucu kullanılarak örnek ısıtılmasıyla kloroform buharlaşır.
NOT: Bu florofor dahil polimerlerin 10 8 M ihtiva eden etiketli olmayan lineer poli (THF) içindeki bir eriyiği içerir. - örnek 10 ul mikro-pipet ve D'nin kullanımı almakbir temizlenmiş kapak kayma üzerinde ROP. numune üzerinde başka temizlenmiş kapak kayma koyun ve iki kapak fişleri arasında örnek sandviç.
- nazikçe plastik cımbız kullanarak örnek basınız.
- Mikroskop kapak fişleri temizliği
- Geniş alan floresan görüntüleme kurulumu 15
- Ters mikroskop arka portuna bir uyarım lazer (488 nm) tanıtımı
- ışın yoluna bir uyarım bant geçiren filtre ve polarize takın.
- Bir ışın genişletici tarafından çapı yaklaşık 1 cm ışını genişletin.
- ışın yoluna çeyrek dalga plakası yerleştirin. polarizörün olduğu ile ilgili olarak 45 derece dalga plakası optik eksenine ayarlayın. Alternatif olarak, bir Berek kompansatör eklemek için / 4 l optik gecikmeyi ayarlamak.
- kiriş boyutunu ayarlamak için uyarma ışın yolunda bir diyafram takın.
- ters optik mikroskobik arka portuna lazer ışını tanıtan öncePE, bir odaklama lensi yerleştirin (Plan dışbükey lens, odak uzaklığı ≈ 300 mm) objektif lens üzerinden bir lazer ışını kolime olan bir pozisyonda.
- Bir filtre küpü üzerine monte edilmiş bir dikroik ayna kullanılarak lazer ışını yansıtılarak ve sonra yüksek bir sayısal açıklık (NA) objektif lens numuneye lazer ışını tanıtmak (örneğin NA 1.3, 100X büyütme, yağ daldırma).
- objektife objektif bir ısıtıcı takın ve 30 ° C sıcaklığını ayarlamak.
- Ters mikroskop aşamasında numune montaj
- objektif lens üzerinde immersiyon bir damla damla ve mikroskop durumuna örnek monte edin.
- yaklaşık 10 um örnek kalınlığı numunenin alt ve üst yüzeyi eksenel pozisyonunu kontrol edilmesiyle elde olduğundan emin olun.
- numunenin alt yüzeyi üzerinde bir kaç mikrometre mikroskop odağı ayarlayın.
- objektif lens dışarı paralelleştirilmiş lazer ışınına bir polarize yerleştirin.
- polarize sonra bir güç ölçer takarak polarize iletilen lazer yoğunluğunu kaydedin. polarize çevirerek farklı polarizasyon açılarında iletilen lazer gücünü kaydedin.
- iletilen lazer gücü tüm polarizasyon açılarında sabit değilse, biraz uyarma ışın yoluna yerleştirilen çeyrek dalga plakası veya Berek kompansatör döndürün.
- sabit iletilen lazer gücü kadar adımı yineleyin 3.2.5.2 ve 3.2.5.3 tüm polarizasyon açılarında elde edilir. dairesel polarize ışık numunesi elde emin olun.
- Kurulum EM (elektron çoğaltan) cihazı birleştiğinde -Ödeme (CCD) kamera
- mikroskop yan port EM-CCD kamera takın ve t bağlayıngörüntü elde etme yazılımı o.
- Gerekirse, cihazlara EM-CCD kamera tarafından oluşturulan transistör-transistör mantığı (TTL) sinyalleri göndererek bir mekanik obtüratör veya uyarma ışın yolu takılı acousto-optik ayarlanabilir filtre kamera poz senkronize. Alternatif olarak, lazer EM-CCD kamera tarafından oluşturulan TTL sinyaller göndererek lazer çıkışına kamera poz senkronize.
NOT:, çıkış gücü giriş transistörü-Transistör modüle edilebilir katı-hal lazer (TTL) sinyalleri deney için kullanılan yalnızca sonuncu seçenek, uygulanabilir. - Tek fluorofor yüksek kalitede floresan görüntü elde etmek için kamerayı kontrol yazılımı kullanarak CCD kamera bir EM kazanç (genellikle yaklaşık 300) uygulayın.
- Faiz (ROI) bir bölge kamerayı kontrol yazılımı kullanarak (görüş alanının merkezinde tipik 128 x 128 piksel) olarak ayarlayın.
NOT: Bu IMAGI sağlareriyik numunedeki fluorofor dahil polimer zincirleri hareketini görüntülenmesi için gerekli olan çerçeve aktarım modunda, 200 Hz - 100 kare hızında ng deneyler.
- Ters mikroskop arka portuna bir uyarım lazer (488 nm) tanıtımı
- deneme çalıştırırken
- Deneysel koşulları optimize
- uyarma ışın yolu takılı diyafram kullanarak çapı yaklaşık 20 um numunenin aydınlatma alanını ayarlayın.
- elle uyarma ışın yoluna yerleştirilen uygun bir nötr yoğunluk (ND) filtresi seçerek 8 mW - 4 numune uyarma lazer gücünü ayarlayın.
NOT: - 2 kW cm -2 örnek de bu 1 ortalama lazer gücü sağlar. - 200 Hz - 100 kare hızlarında örnek rekor floresan görüntüler. Bireysel florofor dahil polimerlerden elde edilen floresans yoğunluğu çok düşükse, yavaş yavaş TH ile uyarım gücünü artırmaknumune yaklaşık 100 mW ulaşana kadar e ND filtre.
- tek-molekül floresan görüntü kalitesi hala tatmin edici değilse, etiketli olmayan poli (THF) saf bir eriyik floresan görüntüleri kaydederek numunede floresan kirleri kontrol edin. Yüksek floresan arka plan görülmektedir durumda, farklı etiketli olmayan poli (THF) kullanın.
- eriyik içinde florofor dahil polimerlerden elde floresan nokta yoğunluğu uzamsal olması (bu pasif hareket analizinde hatalara neden) izole etmek için çok yüksek ise, örnek kadar içeri florofor dahil polimer konsantrasyonunu azaltmak mekansal izole noktalar görülmektedir.
- eriyik içinde florofor dahil polimerlerden elde floresan nokta yoğunluğu (bu görüntüleme deneyinde düşük verim neden olur) çok düşük ise, appropr kadar örnek florofor dahil polimer konsantrasyonunu arttırmakfloresan nokta iate yoğunluğu ulaşılır.
- eriyik içinde fluorofor dahil polimerlerden elde edilen floresan görüntüleri bulanık ise, görüntüleme edinimi çerçeve oranlarını artırmak.
NOT: Bu genellikle tipik olarak 64 x 64 piksel daha küçük bir yatırım getirisi gerektirir.
- Deneysel koşulları optimize
- Görüntü edinme
- Deney koşulları optimize sonra örnek denge şartları ulaşır, böylece bir saat mikroskop sahnede monte örnek bırakın.
- 200 Hz kare hızı - 100 eriyik halde fluorofor dahil polimerlerin 1000 floresan görüntü dizileri - 500 kaydediniz. varsayılan dosya biçimi TIFF değilse, TIFF formatında tüm resim dizilerini dönüştürmek.
Pasif Hareket 4. Analizi
- Ortalama kare deplasman (MSD) analizi
- bu şekilde floresan görüntü dizilerini kırpmaHer görüntü sırası gibi ImageJ gibi tek ve iyi odaklanmış difüzyon fluorofor-dahil polimer kullanılarak görüntü işleme yazılımı içerdiğini.
- kırpılan görüntü dizileri 10'dan fazla kare içerdiğinde, her dizi 10 kare oluşur, öyle ki birçok dizinin içine resim dizileri ayrıldı.
- doğru görüntü iki boyutlu Gauss geçme ile, her resim dizilerinin molekül konumlarını belirler.
- Denklem 20 Difüzyon katsayısı (D), ayrı ayrı moleküllerin difüzyon yörüngeleri (molekül, yani zamana bağlı pozisyonları) ortalama-kare yer değiştirme (MSD) analizi ile belirlemek
x i ve y ı resim çerçevesi i molekülün pozisyonları ve n çerçeve i dan time lapse ¨ t çerçeve numarasını ifade etmektedir. - difüzyon katsayıları arsabir frekans histogramı.
Not: Genellikle, histogram 100'den moleküllerden yapılmıştır.
- Kümülatif dağılım fonksiyonu (CDF) analizi
NOT: Bir CDF, P (r 2 i Δ t) i t ö belli bir zaman gecikmesi sonrası kökenli bir yarıçap r içinde difüzyon molekülleri bulmak kümülatif olasılık karşılık gelir.- Zaman 4.1.3'de elde edilen tüm difüzyon yörüngeleri için 1Δt, 2Δt, ····, iΔt arasında gecikme sırasında ortaya çıkan kareli-yer değiştirme hesaplayın.
NOT: Saat iΔt ve gecikme için bu hesaplamalar toplam i karesi-yer değiştirmeleri m verir. - Farklı r 2 değerlerinde r 2 daha küçük olan toplam m i veri kümesi içinde karesi-değiştirmeler (l i) sayıları hesaplamak (0 <r2 <∞). R 2 vs normalize l i araziler CDF, P (r 2, iΔt) karşılık gelmektedir.
- Zaman 4.1.3'de elde edilen tüm difüzyon yörüngeleri için 1Δt, 2Δt, ····, iΔt arasında gecikme sırasında ortaya çıkan kareli-yer değiştirme hesaplayın.
- Tat difüzyon modelleri ile TDF analizi
Not: Elde edilen CDFs farklı difüzyon modelleri ile donatılmıştır; Homojen difüzyon modeli, D dağılımı Gauss (tek Gauss modeli) tarafından tarif edildiği birden fazla difüzyon modları ve birden fazla difüzyon modları, D dağılımı çok Gauss (çoklu Gauss modeli) ile ifade edilir.- Homojen difüzyon modelde, bir denklem 21 kullanılarak CDF takarak ortalama D belirlemek
NOT: denklemin herhangi bir sapma molekülünün heterojen difüzyon göstermektedir. - Tek Gauss modelde, 15 kullanılarak CDF uydurma bir Gauss (f (D)) tarafından açıklanan D olasılık dağılımını belirlemek
On3 "src =" / files / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
A, W ve D 0 Gauss genlik, genişlik ve merkez olduğu. - Çift Gauss modelde, 14 kullanılarak CDF uydurma bir Gauss (f (D)) tarafından açıklanan D bileşeni inci j olasılık dağılımını belirlemek
Bir j her bir difüzyon bileşen fraksiyonu ve α j, j B ve D 0 burada, j, Gauss bileşeni j nolu amplitüd, genişlik, ve merkez vardır.
- Homojen difüzyon modelde, bir denklem 21 kullanılarak CDF takarak ortalama D belirlemek
- Teorik olasılık göre dağılımın hesaplanmasıDifüzyon katsayısı Katkı
NOT: nedeniyle farklı difüzyon modelleri için hesaplanan istatistiksel hatalar (p (D) d D) oluşan D olasılık dağılımları; Homojen difüzyon modeli, D dağılımı Gauss (tek Gauss modeli) tarafından tarif edildiği birden fazla difüzyon modları ve birden fazla difüzyon modları, D dağılımı çok Gauss (çoklu Gauss modeli) ile ifade edilir.- Homojen difüzyon modelde, bir denklem 22 kullanılarak D istatistiksel olasılık dağılımını hesaplamak
N difüzyon yörünge veri noktalarının sayısı (n = 10, 4.1.2) olduğu, D, 0 ortalama difüzyon katsayısı (CDF analizi ile tespit, 4.2.3.1 bakınız) ve D, deneysel olarak elde edilen bir bağımsız bir yörünge için difüzyon katsayısı. - içindeTek Gauss difüzyon modeli, bir denklem 15 kullanılarak D istatistiksel olasılık dağılımını hesaplamak
F (d) CDF analizi ile belirlenir D olasılık dağılımını (4.2.3.2 bakınız) temsil eder ve d, 0, ortalama difüzyon katsayısıdır (CDF analizi ile tespit, 4.2.3.2 bakınız). - Çift Gauss difüzyon modelinde, bir denklem 14 kullanılarak D istatistiksel olasılık dağılımını hesaplamak
F (d, J) CDF analizi ile belirlenmiştir D (d, J) bileşeni j nolu olasılık dağılımını ifade etmektedir (4.2.3.3 bakınız) ve D 0j CDF tarafından belirlenen bir bileşen TH J (ortalama difüzyon katsayısıdır analiz) 4.2.3.3 bkz.
- Homojen difüzyon modelde, bir denklem 22 kullanılarak D istatistiksel olasılık dağılımını hesaplamak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perilen 4 kollu yıldız ve diimid-dahil 8 şeklinde disiklik poli (THF) s elektrostatik kendini montaj ve kovalent tespit (ESA CF) işlemi (Şekil 1, Şekil 2) kullanılarak sentezlendi. Zaman atlamalı tek moleküllü Fluoresans görüntüleri 4-kollu (Şekil 3a) için ölçülmüş ve (Şekil 3b) polimerleri 8-şekillendirildi. Zaman atlamalı floresan görüntüleri (Şekil 3) mekansal nedeniyle zincirleri içine yüksek floresan perilen etitkarbodiimit fluorofor 23 birleşmesiyle izole parlak ve keskin noktalar gösterir. Difüzyon katsayısı Frekans histogramları 4 silahlı (Şekil 4a) için hesaplanan ve (Şekil 4b) time-lapse görüntüleri ortalama karesel deplasman (MSD) analizi ile polimerler 8-şekillendi. MSD araziler ve TDF hesaplamaları MATLAB yazılmış rutinleri kullanılarak yapılmaktadır. uydurmadeneylerden elde edilen TDF gibi Kökeni Pro gibi veri işleme yazılımı kullanılarak yapılır. MSD analizi ile belirlenen difüzyon katsayısı frekans histogramları difüzyon analizi ve heterojen istatistiksel hatasını kaynaklanan geniş bir dağılımı (Şekil 4) gösterir. Frekans histogramları net homojen difüzyon modeli sapmaları polimer moleküllerinin heterojen difüzyonunu gösteriyor (Şekil 4'te yeşil çizgi). 14 Kümülatif dağılım fonksiyonları (CDFs) 4-silahlı (Şekil 5a) hesaplandı ve göstermek 8-şekilli (Şekil 5b) polimerler ve tek Gauss (Şekil 5a) tarafından takılmıştır ve çift Gauss (Şekil 5b) modelleri. Difüzyon katsayısı istatistiksel olasılık dağılımları 4-kollu (Şekil 4a) için hesaplanmıştır ve 8-şekilli (Şekil 4b) PO Tek Gauss, veya çift Gauss modelleri tarafından polimerlerinin. Tek (Şekil 5a) ve çift (Şekil 5b) Gauss modeller de deneysel olarak elde CDFS uygun. Bu sonuçlar, 8-şekilli bir polimer iki farklı difüzyon işlemi görüntülemeye ise 4 kollu bir polimer difüzyon, difüzyon katsayısı geniş dağılımı ile tanımlanır göstermektedir.
Perilen etitkarbodiimit-dahil poli Şekil 1. Sentez yolu (THF) s. (A) 4 kollu yıldız polimerler ve (b) 8-şekilli disiklik polimerlerin sentezi güzergahı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
54503fig2.jpg "/>
Sentezlenen polimerlerin Şekil 2. Karakterizasyonu. (A) 4 kollu yıldız polimerler ve (b) 8-şekilli disiklik polimerlerin NMR spektrumları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3 (film) Şekil. Perilen diimid-dahil poli (THF) s. (A) 4-kollu yıldız polimerler ve (b) 'nin zaman atlamalı floresan resim tek moleküllü flüoresan görüntüleme THF (etiketli olmayan lineer poli eriyikte disiklik polimerleri, 8-şekilli ). Ölçek çubuğu = 5 mikron. Filmleri görmek için tıklayınız (a) ve3 / Figure_3b_submit.mov "target =" _ blank "> (b).
Şekil 4. perilen diimid-dahil poli MSD analizi (THF) eriyik içinde difüzyon s. Eriyik tek tek (a) 4-kollu yıldız polimerler ve (b) 8-şekilli disiklik polimerler için belirlenen difüzyon katsayısı frekans histogramları lineer poli (THF) etiketli olmayan. düz çizgiler teorik üç farklı difüzyon modellerine dayanan difüzyon katsayısı olasılık dağılımları hesaplanmış göstermek; homojen difüzyon modeli (yeşil çizgiler, 4.3.1 bakınız), tek Gauss modeli (redlines, 4.3.2 bakınız), ve çift Gauss modeli (mavi çizgi, 4.3.3 bakınız). 14 Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.
Perilen diimid-dahil poli (THF) Şekil 5. CDF analizi erimiş difüzyon s deneysel olarak bulunan kümülatif dağılım fonksiyonları (iΔt = 7,5-75 msn). (A) 4-kollu yıldız polimerler için 1-P formunda ve (b) etiketli olmayan lineer poli (THF) eriyik içinde disiklik polimerler 8-şekilli. Kesik çizgiler 4.2.3.3 yılında 4.2.3.2 ve (b) denklem (a) denklemler parçaları gösteriyor. 14 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4 kollu 8-şekilli polimerleri içerir. Sentez için önemli bir adımdır ESA CF protokolü (Şekil 1) yoluyla elde 12,24 tek fonksiyonlu ve iki fonksiyonlu lineer poli (THF) N S -phenylpiperidinium uç grupları olan edildi önceki edilen prosedüre göre sentezlendi. 11 iyon değişim karboksilat aşırı miktarını içeren bir sulu çözelti içine triflat karşı-bir polimer öncüsünün bir aseton çözeltisinin tekrar çökeltme işlemi ile gerçekleştirilmiştir.
4-kollu yıldız polimerleri için iyon değiştirme ürününün kovalent dönüşüm 4 saat geri akış ile, tolüen (4.9 g / L) içinde gerçekleştirilmiştir. Dönüşüm yeterli değilse, reaksiyon süresini uzatır. Kovalent şekilde bağlanmış bir ürün su içinde aseton / n-heksan ve yeniden çökeltme ile silika jel kolon kromatografisi ile elde edilmiştir. 4 kollu polimer 1H NMR Şekil 2a'da gösterilmiştir. This ESA-CF prosedürü döngüsel polimerlerin etkili sentezi için izin verir. Bununla birlikte, bu protokol siklik onyum uç gruplarına sahip olan polimerler ile sınırlıdır.
8 şeklinde polimer ürünü, reaksiyon 4 saat geri akış altında seyreltme (0.2 g / L) içinde, toluen içinde gerçekleştirildiği ve moleküller arası ürünler reaksiyona tahminen nedeniyle, bir çözünmeyen fraksiyon büyük bir kısmının oluşmasına neden oldu. Bir çözünür bölümü aseton / n-heksan ile silika jel kolon kromatografisine tabi tutuldu, n-heksan içinde tekrar çökeltilmiş ve su içinde yeniden çökeltildi. Elde edilen ham ürün, boyut dışlama boncuklar ile kolon kromatografisine tabi tutulur ve 8, şekil verilmiş polimer ürününün izolasyonuna izin vermek için GPC geri edildi. 8-şekilli polimerleri 1H NMR Şekil 2b'de gösterilmektedir. Bu ESA-CF protokol daha karmaşık topolojik polimerler için geçerli olabilir.
yüksek kaliteli floresan görüntüleri aslî olanmoleküllerin pasif hareket doğru analiz için diğ. 1) floresans yabancı maddeler numunede mevcut olduğunda Fluoresans görüntüleri önemli ölçüde bozulur, 2) dahil fluorofor flüoresan verim düşüktür ve 3) görüntüleme kare hızı polimer moleküllerinin pasif hareket daha yavaştır. oda sıcaklığının altında sıcaklık (20 ° C) veya 37 ° C'nin üzerinde ayarlama de kaydedildi floresan görüntülerin kalitesini bozacak bir kırılma endeksi uyumsuzluğu, neden olacaktır. Bir filtre küp üzerine monte edilmiş bir dar bant emisyon bant geçiren filtre kullanarak bazen floresan görüntü kalitesini artırır. Görüntüleme deneyde kullanılan EM-CCD kamera poz süresi genellikle milisaniye ile sınırlı olduğundan, daha hızlı, bu zaman ölçeği daha pasif hareket bu yöntemle ele alınamaz.
MSD analizinde istatistiksel hata etkisinin değerlendirilmesi fo kritik adımdırheterojen difüzyon karakterizasyonu r. İstatistiksel hata dikkatli heterojen difüzyon tartışmadan önce homojen difüzyon modeli 22 kullanılarak difüzyon katsayısı olasılık dağılımı hesaplanarak değerlendirilmelidir. heterojen difüzyon de dikkatle CDF analizi ile değerlendirilmesi gerekir. CDFs homojen difüzyon modeli (yani, tek üstel çürüyen eğrisi) net sapmalar gösterir, bu çoklu difüzyon bileşenlerin varlığını düşündürmektedir. Heterojen difüzyon kantitatif karakterizasyonu kombine MSD, CDF gerektirir ve olasılık dağılım analizleri. 14,15
Pasif hareket de dahil olmak üzere polimer dinamiği, NMR, 7 ışık saçma, 8 ve viskozite ölçümleri gibi geleneksel yöntemler Ensemble-ortalama değerler olarak tanımlanmıştır. 9 Gerçekten de, singl ortaya heterojen pasif hareketE-molekül görüntüleme 16 topluluk-ortalama yöntemleri tespit etmek genelde çok zordur. Polimerlerin doğasında heterojen doğası göz önüne alındığında, bu protokolde bildirilen 25-27 yöntem topolojik polimerlerin karakterizasyonu sınırlı, ama dolaşmış koşullar altında polimerlerin her türlü uygulanabilir değildir. 28 Dahası, bu protokolde bildirilen yaklaşım bulacaksınız Bu tür gözenekli malzemeler ile moleküler difüzyon gibi karmaşık sistemlerin, heterojen difüzyon analizinde geniş bir uygulama. 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
- Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
- McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
- McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
- Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
- Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
- Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
- von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
- Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
- Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
- Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
- Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
- Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
- Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
- Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
- Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
- Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
- Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
- Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
- Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
- Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
- Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
- Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
- Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).
