Summary
一种用于合成和在单分子水平的环状聚合物的扩散运动的表征协议提出。
Protocol
1.单功能和双功能合成聚（THF）
- 单官能聚（THF）中
- 火焰干燥的2颈100毫升圆底烧瓶中。真空和填充氮气（3次）的烧瓶中。
- 蒸馏的四氢呋喃（THF）（50毫升）添加到该烧瓶中。把烧瓶的水浴中在20℃和平衡的温度。
- 通过注射器甲基三氟甲磺酸酯（0.5毫摩尔）添加到该烧瓶中。搅拌在20℃下5-10分钟的混合物。
- 通过注射器加入正 -苯基吡咯烷（4-6当量）的烧瓶中。搅拌30-60分钟该混合物。
- 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。溶解残留物在3-5毫升丙酮中。丙酮溶液加入到300-500毫升正己烷的。过滤沉淀物，并减压干燥。
- 双官能的聚（四氢呋喃）
- 火焰干燥的2颈100毫升圆底烧瓶中。弗吉尼亚州cuum和填充氮气（3次）的烧瓶中。
- 蒸馏过的THF（50毫升）添加到该烧瓶中。把烧瓶的水浴中在20℃和平衡的温度。
- 通过注射器添加三氟甲磺酸酐（0.3毫摩尔）至该烧瓶中。搅拌在20℃下5-10分钟的混合物。
- 通过注射器加入正 -苯基吡咯烷（4-6当量）的烧瓶中。搅拌30-60分钟该混合物。
- 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。溶解残留物在3-5毫升丙酮中。丙酮溶液加入到300-500毫升正己烷的。过滤沉淀物，并减压干燥。
2.苝的合成二酰亚胺注册成立的4星武装和8字形双环聚（THF）
- 臂的星形聚（THF）中
- 离子交换
- 溶于水（10毫克/毫升，150毫升）中的苝酰亚胺四甲酸二钠盐。溶解在丙酮单官能聚（THF）（160毫克/毫升，4ml）中。添加丙酮溶液逐滴加入剧烈搅拌的水溶液。通过过滤收集形成的沉淀。
- 重复上述过程以将回收的沉淀物（2.1.1.1）的四倍。
- 共价固定
- 溶解在甲苯中所获得的沉淀物（5毫克/毫升）。回流4小时的溶液中。
- 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。通过硅胶用正己烷 /丙酮（2/1体积/体积）的插头过滤残余物。将溶液加入到冰冷却的水（300-500毫升）以沉淀产物。通过过滤收集沉淀物。
- 离子交换
- 二环8字形聚（THF）中
- 离子交换
- 溶解在水（6毫克/毫升，50ml）中的苝酰亚胺四甲酸二钠盐。溶解双官能的聚（四氢呋喃）（0.5克）在30-50毫升丙酮。添加丙酮溶液滴加到在0℃下剧烈搅拌的水溶液。通过过滤收集形成的沉淀。
- 重复上述过程以将回收的沉淀物（2.2.1.1）。
- 共价固定
- 溶解在甲苯中所获得的沉淀物（0.05克/升）。回流4小时的溶液中。
- 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。添加甲苯，以部分溶解残留物。再沉淀成300-500毫升正己烷的。
- 通过硅胶用正己烷 /丙酮（2/1体积/体积）的插头过滤形成的沉淀。重新沉淀到300-500毫升的水。
- 纯化通过柱色谱法18使用聚苯乙烯凝胶所形成的沉淀物。用CHCl 3洗脱剂，对物进一步纯化用制备凝胶渗透色谱（GPC）粗产物19OVE副产物通过监测折射率（RI）和UV检测器。
- 离子交换
3.单分子荧光成像实验
- 样品制备
- 显微镜盖玻片清洗
- 地方第1.5 24 x 24毫米显微镜盖玻片在染色缸。
- 添加1M的氢化钾溶液（100ml）中放入罐子和超声处理15分钟。倒出通过倾析的氢氧化钾溶液和冲洗用的超纯水的盖玻片数次。添加光谱级乙醇（100ml）插入罐子和超声处理15分钟。
- 倒出通过倾析乙醇和漂洗用超纯水的盖玻片数次。通过倾析倒出关闭超纯水之后，重复步骤3.1.1.2。
- 添加超纯水的罐子和超声处理15分钟。用超纯水多次盖玻片。用塑料镊子取出从罐子盖玻片，并且由干燥的空气或干燥的氮气干燥。
- 聚合物熔体样品14,15的研制
- 在玻璃瓶中加入100μl非标记的线性聚（THF）中，并加热到使用吹风机的熔点（约25℃）以上的温度。
- 溶解荧光团并入聚合物（线性，4臂的星形的，环状的，或8字形二环在2.1和2.2合成）在氯仿（1毫升，10 -6 M）。加入1微升溶液到100微升的非标记的线性聚（THF）中的熔融的。
- 彻底将样品与一个枪头混合后，通过使用干燥机加热样品蒸发氯仿。
注意：此提供含有荧光团引入聚合物的10 -8 M的非标记的线性聚（THF）中的熔体。 - 采取用微型移液器以及d样品的10微升ROP它在清洁的盖玻片。把在样品另一清洗盖玻片夹心两个盖玻片之间的样本。
- 轻轻按下用塑料镊子样品。
- 显微镜盖玻片清洗
- 宽视场荧光成像设置15
- 激励激光器（488纳米）的引入倒置显微镜的背面端口
- 插入一个励磁带通滤波器和起偏器进入光束路径。
- 由光束扩展器扩大光束的直径约1厘米。
- 插入一个四分之一波板进入光束路径。在45度的相对于该偏振片的设置波片的光轴。可替代地，插入Berek补偿，并设置光延迟λ/ 4。
- 插入在激励光束路径的膜片来调整光束的大小。
- 前引入的激光束进入倒置光学microsco的背面端口PE，插入一个聚焦透镜（平面凸透镜，焦距≈300毫米）在激光束出物镜的被准直的位置上。
- 反射用安装在过滤器立方体的分色镜的激光束后，通过高数值孔径（NA）的物镜引入的激光束到样品（ 例如，NA 1.3，放大100倍，浸油）。
- 附加一个目标加热器到物镜和设定温度至30℃。
- 安装样品在倒置显微镜的阶段
- 滴在物镜上浸油一滴和安装在显微镜状态的样品。
- 确保约10微米的样品的厚度是通过检查样品的底部和顶部表面的轴向位置得到的。
- 调整显微镜的焦点到样品的底面之上几微米。
- 插入一个偏振器成准直的激光束出物镜。
- 记录由偏振后插入一个功率计透过偏振片传输的激光的强度。通过旋转偏振器记录在不同的偏振角的发射激光功率。
- 如果发射的激光功率是不是在所有的偏振角恒定，稍微旋转插在激发射束路径的四分之一波片或Berek补偿。
- 重复步骤3.2.5.2 3.2.5.3和直到恒发射激光功率在所有的极化角获得。确保该圆偏振光在样品中获得。
- 设置的EM（电子乘法） -电荷藕合器件（CCD）摄像机
- 在EM-CCD相机连接到显微镜的侧端口，并将其连接到t他的图像采集软件。
- 如果需要的话，通过发送由EM-CCD照相机的设备所产生的晶体管 - 晶体管逻辑（TTL）信号同步照相机暴露于机械快门或插在激发射束路径的声光可调滤波器。可替代地，通过发送由EM-CCD照相机的激光器产生的TTL信号同步照相机暴露于激光输出。
注意：只有在一个固态激光器，其输出功率可以通过输入晶体管 - 晶体管逻辑来调制用于实验（TTL）信号后一种选择是适用的。 - 施加EM增益（通常为约300），以使用软件控制相机以获得单荧光团的高品质的荧光图像的CCD照相机。
- 设定感兴趣区域（ROI）的区域使用软件控制照相机（在视场的中心通常为128×128像素）。
注意：这允许意马在帧传输模式，这是需要用于可视化熔融样品中的荧光团引入聚合物链的运动200赫 - 在100的帧速率纳克实验。
- 激励激光器（488纳米）的引入倒置显微镜的背面端口
- 运行试验
- 优化实验条件
- 利用插入在激励光束路径隔膜调整样本的照明区域到大约20微米的直径。
- 通过手动选择插入在激发束路径的适当的中性密度（ND）滤光器8毫瓦 - 在样品4中设置的激发激光功率。
注：此为1的平均激光功率- 2千瓦厘米-2的样本。 - 200赫兹 - 在100的帧速率的样本的记录荧光图像。如果从各荧光团并入聚合物中得到的荧光强度过低，使用第逐渐增加的激励功率ËND滤镜，直到样品达到约100毫瓦。
- 如果单分子荧光图像的质量仍不能令人满意，通过记录的非标记的聚（四氢呋喃）的纯熔体荧光图像检查样品中的荧光杂质。在高荧光背景观察的情况下，使用不同的非标记的聚（THF）中。
- 如果在熔体从荧光团并入聚合物中得到的荧光斑点的密度太高，以在空间上隔离它们（这将导致在扩散运动的分析错误），降低样品直至荧光团引入聚合物的浓度空间隔离的斑点观察。
- 如果在熔体从荧光团并入聚合物中得到的荧光斑点的密度太低（这会导致成像实验的低吞吐量），增加样品中的荧光团引入聚合物的浓度直到appropr到达荧光点的莱特密度。
- 如果从熔融物中的荧光团并入聚合物中得到的荧光图像被模糊，提高了成像采集的帧速率。
注：这通常需要一个小的投资回报率，通常为64×64像素。
- 优化实验条件
- 图像采集
- 一旦实验条件进行了优化，离开显微镜舞台上所安装的样品为一个小时，使样品达到平衡的条件。
- 记录500 - 在熔融状态下的荧光团引入聚合物的1000荧光图像序列在100 - 200赫兹帧频。如果默认的文件格式不TIFF，所有的图像序列转换为TIFF格式。
4.扩散运动分析
- 均方位移（MSD）分析
- 裁剪荧光图像序列以这样的方式每个图像序列包含单个和良好聚焦扩散荧光团结合使用的聚合物的图像处理软件，如ImageJ的。
- 当裁切后的图像序列包含超过10帧，分割图像序列成多个序列，每个序列包含10帧。
- 准确的图像的二维高斯拟合确定在每个图像序列的分子的位置。
- 确定使用方程式20的扩散系数（D）的单个分子通过扩散轨迹（分子即时间依赖性的位置）的均方位移（MSD）分析
其中，x i和Y I是在图像帧i的分子的位置，并且n在帧i表示与时间经过Δt的帧号。 - 情节扩散系数频率直方图。
注：通常，直方图从超过100个分子构成。
- 累积分布函数（CDF）的分析
注：CDF，P（R 2，IΔt）的对应于一定的时间差Iδ 吨后发现从原点的半径r内扩散分子的累积概率。- 计算过程中出现的时间滞后1Δt，2Δt，····，iΔt为4.1.3中获得的所有扩散轨迹平方位移。
注意：这些计算给总M I平方位移的时间滞后iΔt的。 - 计算在不同R 2值比R 2小的总M I数据集内平方位移（L I）的数字（0 <R2 <∞）。归L I VS R 2地块对应CDF，P（R 2，iΔt）。
- 计算过程中出现的时间滞后1Δt，2Δt，····，iΔt为4.1.3中获得的所有扩散轨迹平方位移。
- 两者结合起来分析具有鲜明的扩散模型
注：获得CDF是由不同的扩散模型拟合;均匀扩散模型，其中对D分布通过高斯（单高斯模型）中所描述的多个扩散模式和多个扩散模式，其中对D分布由多个高斯（多高斯模型）中所述。- 在均匀扩散模型，确定平均D将使用公式21拟合CDF
注意：从等式任何偏差暗示该分子的异质扩散。 - 在单高斯模型，确定一高斯（F（D））中所述通过拟合使用15 CDF D的概率分布
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其中A，W和D 0是振幅，宽度和高斯的中心。 - 在双高斯模型，通过拟合使用14 CDF确定j 个由高斯（F（D））中所描述的D分量的概率分布
其中，A j是每个扩散组分的分数，并且αJ，w j的和D 0 j是幅度，宽度，和第 j 个高斯分量的中心。
- 在均匀扩散模型，确定平均D将使用公式21拟合CDF
- 理论概率DISTRI计算扩散系数的bution
注：D的发生是由于统计误差（P（D）D D）基于上不同的扩散模式的概率分布;均匀扩散模型，其中对D分布通过高斯（单高斯模型）中所描述的多个扩散模式和多个扩散模式，其中对D分布由多个高斯（多高斯模型）中所述。- 在均质扩散模型，使用等式22计算D的统计概率分布
其中N是数据点的一个扩散的轨迹的数量（N = 10，见4.1.2）中，D 0是平均扩散系数（由CDF分析确定，见4.2.3.1），D是实验获得的针对单独的轨迹扩散系数。 - 在里面单一高斯扩散模型，使用等式15计算D的统计概率分布
其中f（D）表示由CDF分析测定的D概率分布（见4.2.3.2）和D 0是平均扩散系数（由CDF分析确定，见4.2.3.2）。 - 在双高斯扩散模型，使用等式14计算D的统计概率分布
其中f（D j）表示第 j 个由CDF分析确定D（D，J）的成分的概率分布（见4.2.3.3）和D 0J是第 j 个成分（由CDF测定的平均扩散系数分析见4.2.3.3）。
- 在均质扩散模型，使用等式22计算D的统计概率分布
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Representative Results
苝二酰亚胺-掺入4臂的星形和8字形二环聚（四氢呋喃）■用的静电自组装和共价固定（ESA-CF）的过程（ 图1， 图2）合成的。测量时间推移单分子荧光图像为4武装（ 图3a）和8字形（ 图3b）的聚合物。时间推移荧光图像（ 图3）显示空间隔离的清晰明亮的斑点是由于高荧光苝酰亚胺荧光团23的纳入链。计算的扩散系数的频率直方图为4武装（ 图4a）和8字形（ 图4b）由时间推移图象的均方位移（MSD）分析聚合物。 MSD地块和两者结合起来的计算是使用MATLAB写的程序进行。拟合从实验中获得的两者结合起来的是用数据处理软件，如原产地临进行。通过将MSD分析确定扩散系数的频率直方图显示广泛分布（ 图4）从两个扩散的分析和异质性的统计误差所得。频率直方图示出了从该均匀扩散模型清晰的偏差，这表明在聚合物分子的异质扩散（ 图4中绿线）。14累积分布函数（CDF）分别计算的4-武装（ 图5a）和8形（ 图5b）的聚合物和由单一的高斯（ 图5a）装配并双高斯（ 图5b）的模型。计算扩散系数的统计概率分布为4武装（ 图4a）和8字形（ 图4b）聚合酶由单一高斯，或双高斯模型ymers。单（ 图5a）和双（ 图5b）的高斯模型拟合实验获得的CDF好。这些结果表明，4-武装聚合物的扩散由扩散系数的广泛分布来描述，而8字形聚合物显示两个不同的扩散模式。
图1.苝酰亚胺注册成立的聚合成路线（THF）第 （ 一 ）4臂的星形聚合物和（b）8字形双环聚合物的合成路线。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2.表征合成聚合物。（ 一 ）4臂的星形聚合物和（b）8字形双环聚合物的NMR谱。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3（动画）。在非标记线性聚熔体苝二酰亚胺-掺入聚（四氢呋喃）第 （ 一 ）4臂的星形聚合物和（b）的时间推移的荧光图像的单分子荧光成像 8字形二环聚合物（THF ）。比例尺=5μm以下。请点击此处观看电影（一）和3 / Figure_3b_submit.mov“目标=”_空白“>（B）。
图4.苝二酰亚胺-掺入聚MSD分析（THF）S扩散在熔体中。在熔体个体（ 一个 ）4-臂的星形聚合物和（b）8字形二环聚合物确定扩散系数的频率直方图的非标记的线性聚（THF）中。实线表示理论计算基于三个不同的扩散模式的扩散系数的概率分布;均匀扩散模型（绿线，见4.3.1），单高斯模型（红线，见4.3.2），和双高斯模型（蓝线，见4.3.3）。14 ，请点击这里查看这个大版本数字。
在1-P为（ 一 ）4臂的星形聚合物的形式- 苝酰亚胺掺入的聚（四氢呋喃）的图5的CDF分析š扩散在熔融实验得到累积分布函数（75毫秒iΔt= 7.5）。和（b）在非标记线性聚（THF）中的熔融8字形双环聚合物。虚线显示有（一）4.2.3.2及（b）方程等式配件在4.2.3.3。14 ，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
4武装和8字形聚合物进行经由ESA-CF协议（ 图1），它是用于合成的关键步骤制备。12,24的单官能和双官能的线性聚（四氢呋喃）■用N- -phenylpiperidinium端基根据前述方法合成11的离子交换是通过用三氟甲磺酸酯抗衡聚合物前体的丙酮溶液的再沉淀进行到含羧酸盐的过量的水溶液。
对于4臂的星形聚合物的离子交换产物的共价转化在甲苯（4.9克/升）回流4小时进行。如果转换不充分，延长反应时间。用硅胶柱色谱法用丙酮/ 正己烷和再沉淀于水中得到的共价键合产品。 4武装聚合物的1 H NMR示于图2a。氏小号ESA-CF程序允许环状聚合物的有效合成。然而，该协议被限制为具有环状鎓末端基团的聚合物。
为8字形聚合物产物，该反应在甲苯中在回流下稀释（0.2克/升）中进行4小时，导致了不溶性级分的大部分的形成，这可能是由于分子间的反应产物。可溶性部分再沉淀在正己烷 ，进行硅胶柱层析，用丙酮/ 正己烷 ，并在水中再沉淀。得到的粗产物进行用大小排阻珠粒柱层析并回收GPC以允许8字形聚合物产物的分离。 8形聚合物的1 H NMR示于图2b。此ESA-CF协议可以适用于进一步复杂拓扑的聚合物。
高品质的荧光图像essenti人的分子的扩散运动的准确的分析。 1）荧光杂质是存在于样品中时，荧光图像被显著恶化，2）一种掺入荧光团的荧光量子产率低，以及3）成像的帧速率小于聚合物分子的扩散运动慢。设定低于室温的温度（20℃）或高于37℃，会造成折射率不匹配，这也将恶化记录荧光图像的质量。使用安装在一过滤器立方体一较窄频带发射带通滤波器的某个时候提高了荧光图像的质量。因为在成像实验中使用的EM-CCD照相机的曝光时间通常限制在毫秒，扩散运动超过此时间尺度速度不能用这种方法捕获。
的在MSD分析的统计误差的效果评价为fo的关键步骤r是异质扩散的特征。统计误差应通过讨论异质扩散之前计算使用均匀扩散模型22的扩散系数的概率分布进行仔细的评估。异构扩散也应由CDF分析进行仔细的评估。当两者结合起来显示来自均匀扩散模型（ 即单指数衰减曲线）明确的偏差，这表明多个扩散成分的存在。异质扩散的定量表征需要综合MSD，CDF和概率分布分析。14,15
聚合物动力学，包括扩散运动，已经确实描述为在常规方法如核磁共振，7光散射，8和粘度测量整体平均值。9，由SINGL揭示异构扩散运动电子分子成像16常常是非常困难的整体平均的方法来检测。考虑聚合物的固有异质性质，25-27在这个协议中报道的方法并不限于拓扑聚合物的表征，但也适用于各种缠结条件下的聚合物。28此外，在该协议报告的方法将找到在复杂的系统中，如通过孔材料分子扩散异构扩散的分析具有广泛的应用。29
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
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