Summary
En protokol til syntese og karakterisering af diffusiv bevægelse af cykliske polymerer på enkelt molekyle niveau præsenteres.
Protocol
1. Syntese af Monofunktionelle og bifunktionel Poly (THF)
- Monofunktionelle poly (THF)
- Flame tørre en 2-halset 100 ml rundbundet kolbe. Støvsug og kolben med kvælstof (3 cykler) udfylde.
- Tilsæt destilleret tetrahydrofuran (THF) (50 ml) til kolben. Sæt kolben i et vandbad ved 20 ° C og tempereres temperaturen.
- Tilføj methyltriflat (0,5 mmol) til kolben med en sprøjte. Blandingen omrøres i 5-10 minutter ved 20 ° C.
- Tilføj N-phenyl pyrrolidin (4-6 ækv.) Til kolben med en sprøjte. Blandingen omrøres i 30-60 min.
- Helt at fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk (ca. 100 Torr). Opløs resten i 3-5 ml acetone. Tilsæt acetone opløsning i 300-500 ml n-hexan. Filtrer bundfaldet og tørres under reduceret tryk.
- Bifunktionelt poly (THF)
- Flame tørre en 2-halset 100 ml rundbundet kolbe. Vacuum og kolben med kvælstof (3 cykler) udfylde.
- Tilsæt destilleret THF (50 ml) til kolben. Sæt kolben i et vandbad ved 20 ° C og tempereres temperaturen.
- Tilføj trifluormethansulfonsyreanhydrid (0,3 mmol) til kolben med en sprøjte. Blandingen omrøres i 5-10 minutter ved 20 ° C.
- Tilføj N-phenyl pyrrolidin (4-6 ækv.) Til kolben med en sprøjte. Blandingen omrøres i 30-60 min.
- Helt at fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk (ca. 100 Torr). Opløs resten i 3-5 ml acetone. Tilsæt acetone løsning på 300-500 ml n-hexan. Filtrer bundfaldet og tørres under reduceret tryk.
2. Syntese af perylen diimid-inkorporeret 4-armet stjerne og 8-formet dicykliske Poly (THF)
- Væbnet stjerne poly (THF)
- ionbytning
- Opløs perylen diimid tetracarboxylat natriumsalt i vand (10 mg / ml, 150 ml). Opløsemonofunktionelle poly (THF) i acetone (160 mg / ml, 4 ml). Tilsæt acetoneopløsning dråbevis til kraftigt omrørt vandig opløsning. Opsaml det dannede bundfald ved filtrering.
- Gentag ovenstående procedure med den genvundne bundfald (2.1.1.1) fire gange.
- kovalent binding
- Opløs bundfaldets i toluen (5 mg / ml). Tilbagesval opløsningen i 4 timer.
- Helt at fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk (ca. 100 Torr). Filtreres remanensen gennem en prop af silicagel med n-hexan / acetone (2/1 vol / vol). Tilsæt opløsningen i isafkølet vand (300-500 ml) til udfældning af produktet. Bundfaldet filtrering.
- ionbytning
- Dicyclisk 8-formet poly (THF)
- ionbytning
- Opløs perylen diimid tetracarboxylat natriumsalt i vand (6 mg / ml, 50 ml). Opløs bifunktionel poly (THF) (0,5 g) I 30-50 ml acetone. Tilsæt acetoneopløsning dråbevis til kraftigt omrørt vandig opløsning ved 0 ° C. Opsaml det dannede bundfald ved filtrering.
- Gentag ovenstående procedure med den genvundne bundfald (2.2.1.1).
- kovalent binding
- Opløs bundfaldets i toluen (0,05 g / l). Tilbagesval opløsningen i 4 timer.
- Helt at fjerne opløsningsmidlet under reduceret tryk (ca. 100 Torr). Tilføj toluen til delvis opløse remanensen. Re-udfældning i 300-500 ml n-hexan.
- Filtrer det dannede bundfald gennem en prop af silicagel med n-hexan / acetone (2/1 vol / vol). Re-udfældning i 300-500 ml vand.
- Oprens det dannede bundfald ved søjlekromatografi 18 under anvendelse af en polystyren gel. Yderligere at oprense råproduktet ved præparativ gelpermeationschromatografi (GPC) 19 med en eluent af CHCl3 til REMove biprodukter ved at overvåge brydningsindeks (RI) og UV-detektorer.
- ionbytning
3. Single-molekyle fluorescens Imaging Experiment
- Prøveforberedelse
- Rengøring af mikroskop dækglas
- Sted No. 1.5 24 x 24 mm mikroskop dækglas i en farvning krukke.
- Tilsæt 1 M kaliumhydrid opløsning (100 ml) ned i glasset og sonikeres i 15 minutter. Hæld kaliumhydroxidopløsning ved dekantering og skyl dækglas med ultrarent vand i flere gange. Tilføj spektroskopisk kvalitet ethanol (100 ml) ned i glasset og sonikeres i 15 minutter.
- Hæld ethanol ved dekantering og skyl dækglas med ultrarent vand i flere gange. Efter at hælde ud for den ultra-rent vand ved dekantering, gentag trin 3.1.1.2.
- Tilføj ultra-rent vand til krukken og sonikeres i 15 minutter. Skyl dækglas med ultra-rent vand i flere gange. Tag ud dækglas fra krukken med en plastik pincet og tørre dem ved enten tør luft eller tørt nitrogen.
- Fremstilling af polymer melt prøver 14,15
- Tilsæt 100 pi umærket lineær poly (THF) i en glasflaske og opvarme det til en temperatur over smeltepunktet (ca. 25 ° C) under anvendelse af en hårtørrer.
- Opløs fluorofor-inkorporeret polymer (lineær, 4-armet stjerne, cyklisk eller 8-formet dicyclisk syntetiseret i 2.1 og 2.2) i chloroform (1 ml, 10 -6 M). Tilsæt 1 pi af løsningen på de 100 pi smelten af den ikke-mærkede lineære poly (THF).
- Efter grundig blanding af prøven med en pipettespids, fordampe chloroform ved opvarmning af prøven ved anvendelse af en tørretumbler.
BEMÆRK: Dette tilvejebringer en smelte af den ikke-mærkede lineære poly (THF) indeholdende 10 -8 M af fluoroforen inkorporeret polymerer. - Tage 10 pi af prøven under anvendelse af en mikro-pipette og dROP det på en renset dækglas. Sætte en anden renset dækglas på prøven og sandwich prøven mellem de to dækglas.
- Tryk prøven forsigtigt ved hjælp af en plastik pincet.
- Rengøring af mikroskop dækglas
- Wide-field fluorescens imaging setup 15
- Indførelse af en excitation laser (488 nm) i bagsiden porten på omvendt mikroskop
- Indsæt et magnetisering båndpasfilter og polarisator strålegangen ind.
- Udvide strålen til ca. 1 cm i diameter ved en stråleudvider.
- Indsæt en kvart bølge plade strålegangen ind. Indstil den optiske akse af den bølge plade ved 45 grader i forhold til den for polarisatoren. Alternativt, indsætte en Berek kompensator og indstille den optiske forsinkelse Å / 4.
- Indsæt en membran i excitationsstrålen stien for at justere strålen størrelse.
- Forud for indførelse af laserstrålen ind bag porten på den omvendte optiske microscope, indsætte en fokusering linse (plan-konveks linse, brændvidde ≈ 300 mm) i en position, hvor laserstrålen ud af objektivlinsen er kollimeret.
- Efter afspejler laserstråle ved anvendelse af en dikroisk spejl monteret på et filter terning, indføre laserstrålen til prøven gennem en høj numerisk apertur (NA) objektivlinse (f.eks NA 1.3, 100X forstørrelse, nedsænkning olie).
- Vedhæft en objektiv varmelegeme til objektivlinsen og sæt temperaturen til 30 ° C.
- Montering af prøven på scenen af den omvendt mikroskop
- Drop en dråbe immersionsolie på objektivlinsen og montere prøven på mikroskopet tilstand.
- Sikres, at prøven tykkelse på ca. 10 um opnås ved at kontrollere den aksiale position af bunden og øvre overflade af prøven.
- Justere fokus af mikroskopet til nogle få mikrometer over bundfladen af prøven.
- Sæt en polarisator i kollimeret laserstråle ud af objektivlinsen.
- Optag intensiteten af laseren transmitteres gennem polarisatoren ved at indsætte en effektmåler efter polarisatoren. Optag den transmitterede lasereffekt ved forskellige polarisering vinkler ved at dreje polarisatoren.
- Hvis den transmitterede lasereffekt ikke er konstant på alle polarisering vinkler, let rotere kvartbølgepladen eller Berek kompensator indsat i excitation strålegangen.
- Gentag trin 3.2.5.2 og 3.2.5.3, indtil den konstante transmitterede lasereffekt opnås på alle polarisering vinkler. Sørg for, at cirkulært polariseret lys opnås ved prøven.
- Opsætning EM (elektron multiplikation) Debitere coupled device (CCD) kamera
- Fastgør EM-CCD-kamera til siden porten af mikroskopet og tilslut det til than erhvervelse billede software.
- Hvis det er nødvendigt, synkronisere eksponeringen kamera til en mekanisk lukker eller akustisk-optisk afstemmelige filter indsat i excitation strålegangen ved at sende transistor-transistor logik (TTL) signaler genereret af EM-CCD-kamera til enhederne. Alternativt synkronisere eksponeringen kameraet til laser output ved at sende TTL signaler genereret af EM-CCD-kamera til laseren.
BEMÆRK: Den sidstnævnte mulighed gælder kun, når (TTL) signaler bruges en solid-state laser, hvis udgangseffekt kan moduleres af input transistor-transistor logik for eksperimentet. - Påfør en EM gevinst (typisk ca. 300) til CCD-kameraet ved hjælp af software styrer kameraet for at opnå en høj kvalitet fluorescens billede af det indre fluorofor.
- Sæt et område af interesse (ROI) (typisk 128 x 128 pixel ved midten af synsfeltet) ved hjælp software styrer kameraet.
BEMÆRK: Dette giver mulighed for imaging eksperimenter ved de frame rates på 100 - højst 200 Hz i rammen transfer mode, der er påkrævet for at visualisere bevægelsen af fluoroforen-inkorporeret polymerkæder i smelten prøven.
- Indførelse af en excitation laser (488 nm) i bagsiden porten på omvendt mikroskop
- Kørsel af eksperimentet
- Optimering af de eksperimentelle betingelser
- Juster belysningen område af prøven til ca. 20 um i diameter ved anvendelse af membranen indsat i excitation strålegangen.
- Indstil excitation laser effekt ved prøven til 4-8 mW ved manuelt at vælge en passende neutral density (ND) filter indsat i excitation strålegangen.
BEMÆRK: Dette giver den gennemsnitlige lasereffekt af 1 - 2 kW cm -2 mod prøven. - Optag fluorescens billeder af prøven på rammen satser på 100-200 Hz. Hvis fluorescensintensiteten opnået fra de enkelte fluorofor-inkorporeret polymerer er for lav, gradvist øge magnetiseringseffekt hjælp the ND filter, indtil den når ca. 100 mW ved prøven.
- Hvis kvaliteten af det enkeltstrengede molekyle fluorescens billede stadig ikke er tilfredsstillende, kontrollere fluorescens urenheder i prøven ved at registrere fluorescens- billeder af en ren smelte af det ikke-mærkede poly (THF). Hvis der observeres en høj fluorescens baggrund, bruger forskellige ikke-mærket poly (THF).
- Hvis densiteten af fluorescensen spot opnået fra fluoroforen-inkorporeret polymerer i smelten er for høj til rumligt isolere dem (dette forårsager fejl i analysen af den diffusive bevægelse), reducere koncentrationen af fluoroforen-inkorporeret polymerer i prøven, indtil rumligt overholdes isolerede pletter.
- Hvis densiteten af fluorescensen spot opnået fra fluoroforen-inkorporeret polymerer i smelten er for lav (dette forårsager en lille produktion af afbildningseksperiment), øge koncentrationen af fluoroforen-inkorporeret polymerer i prøven indtil en approprIATE densitet af fluorescensen stedet er nået.
- Hvis fluorescens billeder opnået fra fluoroforen-inkorporeret polymerer i smelten er sløret, øge billedfrekvens for erhvervelse billeddannelse.
BEMÆRK: Denne kræver ofte en mindre ROI, typisk 64 x 64 pixels.
- Optimering af de eksperimentelle betingelser
- Billede erhvervelse
- Når de eksperimentelle betingelser optimeres, lade monterede prøve på objektbordet i en time, således at prøven når frem ligevægtsbetingelser.
- Optag 500 - 1.000 fluorescens billedsekvenser af fluoroforen-inkorporeret polymerer i smeltet tilstand ved 100 - højst 200 Hz frame rate. Hvis standard filformatet ikke er TIFF, konvertere alle de billedsekvenser til TIFF-format.
4. Analyse af den diffusive Motion
- Mean-squared forskydning (MSD) analyse
- Beskær de fluorescens billedsekvenser på en sådan mådeat hvert billede sekvens indeholder et enkelt og godt fokuseret spredende fluorophor-inkorporeret polymer hjælp billedbehandling software, såsom ImageJ.
- Når de beskårne billedsekvenser indeholder mere end 10 frames, opdele billedsekvenser i flere sekvenser, således at hver sekvens består af 10 frames.
- Bestemme positionerne af molekylerne i hver billedsekvenser præcist ved todimensional Gaussisk montering af billederne.
- Bestem diffusionskoefficienten (D) af individuelle molekyler ved middelværdi-kvadreret forskydning (MSD) analyse af diffusions- baner (dvs. tidsafhængige positioner af molekylet) under anvendelse af en ligning 20
hvor x i og y i er positionerne af molekylet i billedramme i den, og n betegner rammenummer med tidsforløbet AT fra ramme i. - Plot diffusionskoefficienter ien frekvens histogram.
BEMÆRK: Typisk histogram konstrueret af mere end 100 molekyler.
- Kumulative fordelingsfunktion (CDF) analyse
BEMÆRK: En CDF, P (r 2, i Δ t) svarer til den kumulative sandsynlighed for at finde de spredende molekyler inden for en radius r fra oprindelsen efter en vis forsinkelse i A T.- Beregn kvadreret-forskydning forekommer under tidsforskydninger af 1Δt, 2Δt, ····, iΔt for alle diffusions baner opnået i 4.1.3.
BEMÆRK: Disse beregninger giver total m jeg kvadreret-forskydninger for tidsforskydninger af iΔt. - Beregn numrene på de kvadrerede-forskydninger (Li) i alt m i datasæt, der er mindre end r 2 ved forskellige r 2 værdier (0 <r2 <∞). Normaliseret l i vs r 2 plots svarer til CDF, P (r 2, iΔt).
- Beregn kvadreret-forskydning forekommer under tidsforskydninger af 1Δt, 2Δt, ····, iΔt for alle diffusions baner opnået i 4.1.3.
- Analyse af CDFS med distinkte diffusionsmodeller
Bemærk: De opnåede CDFS er monteret ved distinkte diffusionsmodeller; homogen diffusion model, flere diffusion tilstande, hvor D fordeling beskrives af en Gauss (enkelt Gaussisk model), og multiple diffusions tilstande, hvor D fordelingen er beskrevet af flere Gauss (multiple Gaussisk model).- I den homogene diffusion model, bestemme en gennemsnitlig D ved at montere CDF ved hjælp af en ligning 21
BEMÆRK: Enhver afvigelse fra ligningen foreslår heterogene diffusion af molekylet. - I den eneste Gaussisk model, bestemme sandsynlighedsfordelingen for D beskrives ved en Gaussisk (f (D)) ved tilpasning CDF anvendelse af 15
ON3 "src =" / files / ftp_upload / 54.503 / 54503equation3.jpg "/>
hvor A, W og D 0 er amplituden, bredde, og centrum for den gaussiske. - I den dobbelte Gaussisk model, bestemme sandsynlighedsfordelingen for j'te komponent af D beskrives ved en Gaussisk (f (D)) ved tilpasning CDF hjælp 14
hvor A j er den del af hver diffusion bestanddel og α j, w j, og D 0 j er amplituden, bredde og centrum af j'te element af Gauss.
- I den homogene diffusion model, bestemme en gennemsnitlig D ved at montere CDF ved hjælp af en ligning 21
- Beregning af den teoretiske sandsynlighed distribution af diffusionskoefficient
BEMÆRK: sandsynlighedsfordelinger D forekommende på grund af de statistiske fejl (p (D) d D) beregnes for de forskellige diffusionsmodeller; homogen diffusion model, flere diffusion tilstande, hvor D fordeling beskrives af en Gauss (enkelt Gaussisk model), og multiple diffusions tilstande, hvor D fordelingen er beskrevet af flere Gauss (multiple Gaussisk model).- I den homogene diffusion model, beregne den statistiske sandsynlighed fordeling af D ved anvendelse af en ligning 22
hvor N er antallet af datapunkter i en diffusion bane (N = 10, se 4.1.2), D 0 er middelværdien diffusionskoefficienten (bestemt ved CDF-analyse, se 4.2.3.1), og D er opnået ved forsøg diffusionskoefficient for en individuel bane. - ienkelt Gaussisk diffusion model, beregne den statistiske sandsynlighed fordeling af D ved anvendelse af en ligning 15
hvor f (D) angiver sandsynlighedsfordeling af D bestemmes af CDF-analyse (se 4.2.3.2), og D 0 er den gennemsnitlige diffusionskoefficienten (bestemt ved CDF-analyse, se 4.2.3.2). - I den dobbelte Gaussisk diffusion model, beregne den statistiske sandsynlighed fordeling af D ved anvendelse af en ligning 14
hvor f (D j) angiver sandsynlighedsfordeling af j th komponent D (D j) bestemt ved CDF analyse (se 4.2.3.3), og D 0j er middelværdien diffusionskoefficient j'te komponent (bestemt ved CDF analyse, se 4.2.3.3).
- I den homogene diffusion model, beregne den statistiske sandsynlighed fordeling af D ved anvendelse af en ligning 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den perylen diimid-inkorporeret 4-armet stjerne og 8-formet dicyclisk poly (THF) s blev syntetiseret under anvendelse af den elektrostatiske selvsamling og covalent fiksering (ESA-CF) proces (figur 1, figur 2). Time-lapse enkelt-molekyle fluorescens billeder blev målt for den 4-armet (figur 3a) og 8-formet (figur 3B) polymerer. De tidsforskudt fluorescens billeder (figur 3) viser rumligt isolerede lyse og skarpe pletter på grund af inkorporeringen af den meget fluorescerende perylen diimid fluorophor 23 ind kæderne. Frekvens histogrammer for diffusionskoefficienten blev beregnet for 4-armede (figur 4a) og 8-formet (figur 4b) polymerer ved middelværdien-squared forskydning (MSD) analyse af time-lapse billeder. Beregningerne af MSD plots og CDFS udføres med rutiner skrevet i MATLAB. beslagetaf CDFS opnået fra forsøgene udføres ved hjælp af databehandling software som Origin Pro. Frekvensen histogrammer for diffusionskoefficienten bestemt af MSD-analyse viser brede distributioner (figur 4) som følge af både den statistiske fejl i analysen og heterogenitet af diffusion. Frekvensen histogrammer viser klare afvigelser fra den homogene diffusion model (grøn linje i figur 4), som viser heterogen diffusion af de polymere molekyler. 14 fordelingsfunktion (CDFS) blev beregnet for de 4-armede (figur 5a) og 8-formet (figur 5b) polymerer og monteret af enkelt Gauss (figur 5a) og dobbelt Gauss (figur 5b) modeller. De statistiske sandsynlighedsfordelinger af diffusionskoefficienten blev beregnet for 4-armet (figur 4a) og 8-formet (Figur 4b) pol Ymers ved enkelt Gauss, eller dobbelt gaussiske modeller. Det indre (figur 5a) og dobbelt (figur 5b) Gauss modeller passer de eksperimentelt opnåede CDFS godt. Disse resultater viser, at diffusion af det 4-armet polymer er beskrevet af den brede fordeling af diffusionskoefficienten, hvorimod 8-formet polymer viser to forskellige diffusions tilstande.
Figur 1. Syntese rute perylen diimid-inkorporeret poly (THF) s. Syntese rute (a) 4-bevæbnede stjerne polymerer og (b) 8-formede dicykliske polymerer. Klik her for at se en større version af dette tal.
54503fig2.jpg "/>
Figur 2. Karakterisering af de syntetiserede polymerer. NMR spektre af (a) 4-bevæbnede stjerne polymerer og (b) 8-formede dicykliske polymerer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 (film). Enkelt molekyle fluorescens billeddannelse af perylen diimid-inkorporeret poly (THF) s. Time-lapse fluorescensbilleder af (A) 4-bevæbnede stjerne polymerer og (b) 8-formet dicykliske polymerer i smelten ikke-mærket lineær poly (THF ). Scale bar = 5 um. Klik her for at se film (a) og3 / Figure_3b_submit.mov "target =" _ blank "> (b).
Figur 4. MSD analyse af perylen diimid-inkorporeret poly (THF) r diffunderer i smelten. Frekvens histogrammer af diffusionskoefficienten bestemt for individuelle (a) 4-bevæbnede stjerne polymerer og (b) 8-formede dicykliske polymerer i smelten ikke-mærket lineær poly (THF). De fuldt optrukne linier viser teoretisk beregnede sandsynlighedsfordelinger af diffusionskoefficienten baseret på de tre forskellige diffusionsmodeller; homogen diffusion model (grønne linjer, se 4.3.1), enkelt Gaussisk model (redlines, se 4.3.2), og dobbelt Gaussisk model (blå linje, se 4.3.3). 14 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. CDF analyse af perylen diimid-inkorporeret poly (THF) r diffunderer i smelten opnået ved forsøg fordelingsfunktion (iΔt = 7,5 - 75 msek). I form af 1-P for (a) 4-bevæbnede stjernepolymerer og (b) 8-formet dicykliske polymerer i smelten ikke-mærket lineær poly (THF). Stiplede linjer viser fittings med (a) ligninger i 4.2.3.2 og (B) ligninger i 4.2.3.3. 14 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 4-bevæbnede og 8-formede polymerer blev fremstillet via ESA-CF-protokollen (figur 1), som er et afgørende skridt for syntesen. 12,24 Monofunktionelle og bifunktionelt lineær poly (THF) s med N -phenylpiperidinium endegrupper var syntetiseret ifølge det foregående procedure. 11 ionbytning blev udført ved genudfældning af en acetoneopløsning af en polymer precursor med triflat modanioner i en vandig opløsning indeholdende en overskydende mængde carboxylat.
Den kovalente omdannelse af ionbytning produkt for de 4-bevæbnede stjerne polymerer blev udført i toluen (4,9 g / l) med tilbagesvaling i 4 timer. Hvis konverteringen ikke er tilstrækkelig, forlænge reaktionstiden. Den kovalent bundet produkt blev opnået ved silicagelsøjlekromatografi med acetone / n-hexan og genudfældning i vand. 1H NMR af de 4-bevæbnede polymerer er vist i figur 2a. This ESA-CF procedure giver mulighed for en effektiv syntese af cykliske polymerer. Imidlertid er denne protokol begrænset til polymerer, der har cykliske onium endegrupper.
For 8-formet polymerprodukt blev reaktionen udføres i toluen i fortynding (0,2 g / l) under tilbagesvaling i 4 timer og resulterede i dannelsen af en stor del af en uopløselig fraktion, formodentlig på grund af den intermolekylære reagerede produkter. En opløselig portion blev genudfældet i n-hexan, underkastet silicagelsøjlekromatografi med acetone / n-hexan, og genudfældes i vand. Det opnåede råprodukt blev underkastet søjlekromatografi med størrelsesudelukkelseskromatografi perler og genbruge GPC at tillade isolering af 8-formet polymerprodukt. 1H NMR af de 8-formede polymerer er vist i figur 2b. Denne ESA-CF protokol kan finde anvendelse på yderligere komplekse topologiske polymerer.
Den høje kvalitet fluorescens billeder er essential til nøjagtig analyse af den diffusive bevægelse af molekylerne. De fluorescensbilleder er væsentligt forringet, når 1) fluorescens urenheder er til stede i prøven, 2) fluorescenskvantumudbytte af et inkorporeret fluorophor er lav, og 3) den billedhastighed på billedtromlen er langsommere end den diffusive bevægelse af polymermolekylerne. Indstilling af temperatur under stuetemperatur (20 ° C) eller over 37 ° C vil medføre et brydningsindeks mismatch, som også vil forringe kvaliteten af optagne fluorescens billeder. Ved hjælp af en smallere bånd emission bandpass filter monteret på et filter terning engang forbedrer kvaliteten af fluorescensen billedet. Da en eksponeringstid på EM-CCD-kamera, der anvendes i afbildningseksperiment sædvanligvis er begrænset til millisekunder, kan den diffusive bevægelse hurtigere end denne tidsskala ikke opfanges af denne metode.
Evalueringen af virkningen af den statistiske fejl i MSD-analyse er det kritiske trin for karakterisering af den heterogene diffusion. Den statistiske fejl bør vurderes omhyggeligt ved at beregne sandsynlighedsfordelingen for diffusionskoefficienten ved hjælp af den homogene diffusion model 22, før diskutere den heterogene diffusion. Den heterogene diffusion bør også nøje vurderet af CDF-analyse. Når CDFS viser klare afvigelser fra den homogene diffusion model (dvs. enkelt-eksponentiel rådnende kurve), antyder dette tilstedeværelsen af flere spredende komponenter. Den kvantitative karakterisering af heterogene diffusion kræver kombineret MSD, CDF, og sandsynlighedsfordeling analyser. 14,15
Polymer dynamik, herunder diffusiv bevægelse, er blevet beskrevet som ensemble-gennemsnit værdier i de konventionelle metoder, såsom NMR, 7 lysspredning, 8 og viskositetsmålinger. 9. Faktisk heterogene diffusiv bevægelse afsløret af den fÃe-molekyle billeddannelse 16 er ofte meget vanskeligt at opdage i ensemblet-gennemsnit metoder. I betragtning af den iboende heterogene karakter af polymerer, er 25-27 metoden rapporteret i denne protokol ikke begrænset til karakterisering af topologiske polymerer, men gælder for alle former for polymerer under sammenfiltrede forhold. 28. Endvidere vil den fremgangsmåde rapporteret i denne protokol finder en bred anvendelse i analysen af heterogene diffusion i komplekse systemer, såsom molekylær diffusion gennem mesoporøse materialer. 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
- Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
- McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
- McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
- Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
- Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
- Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
- von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
- Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
- Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
- Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
- Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
- Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
- Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
- Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
- Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
- Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
- Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
- Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
- Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
- Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
- Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
- Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
- Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).
