Summary
Ett protokoll för syntes och karakterisering av diffusiv rörelse av cykliska polymerer vid enda molekyl nivå presenteras.
Protocol
1. Syntes av Monofunktionell och bifunktionella Poly (THF)
- Monofunktionell poly (THF)
- Flamma torka en 2-halsad 100 ml rundbottnad kolv. Dammsug och fyll kolven med kväve (3 cykler).
- Tillsätt destillerat tetrahydrofuran (THF) (50 ml) till kolven. Sätta kolven i ett vattenbad vid 20 ° C och ekvilibrera temperaturen.
- Lägg metyltriflat (0,5 mmol) till kolven med en spruta. Rör om blandningen under 5-10 min vid 20 ° C.
- Tillsätt N-fenyl pyrrolidin (4-6 ekv.) Till kolven med en spruta. Rör om blandningen under 30 till 60 min.
- Fullständigt avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck (ca 100 torr). Lös återstoden i 3-5 ml aceton. Lägg acetonlösningen i 300-500 ml n-hexan. Filtrera fällningen och torka den under reducerat tryck.
- Bifunktioneli poly (THF)
- Flamma torka en 2-halsad 100 ml rundbottnad kolv. vacuum och fyll kolven med kväve (3 cykler).
- Tillsätt destillerat THF (50 ml) till kolven. Sätta kolven i ett vattenbad vid 20 ° C och ekvilibrera temperaturen.
- Lägga trifluormetansulfonsyraanhydrid (0,3 mmol) till kolven med en spruta. Rör om blandningen under 5-10 min vid 20 ° C.
- Tillsätt N-fenyl pyrrolidin (4-6 ekv.) Till kolven med en spruta. Rör om blandningen under 30 till 60 min.
- Fullständigt avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck (ca 100 torr). Lös återstoden i 3-5 ml aceton. Lägg acetonlösningen till 300-500 ml n-hexan. Filtrera fällningen och torka den under reducerat tryck.
2. Syntes av perylen diimid-inkorporerade fyra beväpnade Star och åtta-formade dicyklisk Poly (THF)
- Beväpnad stjärn poly (THF)
- Jonbytare
- Upplösa perylen diimid tetrakarboxylat natriumsalt i vatten (10 mg / ml, 150 ml). Lösa uppmonofunktionell poly (THF) i aceton (160 mg / ml, 4 ml). Lägga acetonlösningen droppvis till den kraftigt omrörda vattenlösningen. Samla in den bildade fällningen genom filtrering.
- Upprepa proceduren ovan med den utvunna fällningen (2.1.1.1) fyra gånger.
- kovalent fixering
- Lös upp den erhållna fällningen i toluen (5 mg / ml). Återloppskoka lösningen under 4 timmar.
- Fullständigt avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck (ca 100 torr). Filtrera återstoden genom en plugg av silikagel med n-hexan / aceton (01/02 volym / volym). Tillsätta lösningen i is-kylt vatten (300-500 ml) för utfällning av produkten. Samla upp fällningen genom filtrering.
- Jonbytare
- Dicyklisk 8-formad poly (THF)
- Jonbytare
- Upplösa perylen diimid tetrakarboxylat natriumsalt i vatten (6 mg / ml, 50 ml). Upplös bifunktioneli poly (THF) (0,5 g) I 30-50 ml aceton. Lägga acetonlösningen droppvis till den kraftigt omrörda vattenlösningen vid 0 ° C. Samla in den bildade fällningen genom filtrering.
- Upprepa proceduren ovan med den utvunna fällningen (2.2.1.1).
- kovalent fixering
- Lös upp den erhållna fällningen i toluen (0,05 g / L). Återloppskoka lösningen under 4 timmar.
- Fullständigt avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck (ca 100 torr). Lägg toluen delvis lösa återstoden. Åter fälla i 300-500 ml n-hexan.
- Filtrera den bildade fällningen genom en plugg av silikagel med n-hexan / aceton (01/02 volym / volym). Åter fälla i 300-500 ml vatten.
- Rena den bildade fällningen genom kolonnkromatografi 18 med användning av en polystyren-gel. Ytterligare rena den råa produkten genom preparativ gelpermeationskromatografi (GPC) 19 med ett elueringsmedel av CHCI3 till REMove biprodukter genom att övervaka brytningsindex (RI) och UV-detektorer.
- Jonbytare
3. enda molekyl fluorescens avbildning experiment
- provberedning
- Rengöring av mikroskoptäckglas
- Plats nr 1,5 24 x 24 mm mikroskop täckglas i en färgning burk.
- Lägg 1 M kaliumhydrid lösning (100 ml) i burken och sonikeras under 15 min. Häll av kaliumhydroxidlösning genom dekantering och skölj de täckglas med ultra-rent vatten i flera gånger. Lägg spektroskopisk kvalitet etanol (100 ml) i burken och sonikeras under 15 min.
- Häll av etanol genom dekantering och skölj de täckglas med ultra-rent vatten i flera gånger. Efter att ha hällt av ultrarent vatten genom dekantering, upprepa steg 3.1.1.2.
- Lägga ultra-rent vatten i burken och sonikeras under 15 min. Skölj de täckglas med ultra-rent vatten i flera gånger. Ta ut de täckglas från burken genom en plastpincett och torka dem genom antingen torr luft eller torrt kväve.
- Framställning av polymersmältprover 14,15
- Tillsätt 100 | il av icke-märkta linjära poly (THF) i en glasflaska och värm till en temperatur över smältpunkten (ca 25 ° C) med användning av en hårtork.
- Lös fluoroforen inkorporerade polymer (linjär, 4-armad stjärna, cyklisk, eller 8-formad dicyklisk syntetiseras i 2,1 och 2,2) i kloroform (1 ml, 10 -6 M). Tillsätt 1 pl av lösningen till de 100 pl av smälta av den icke-märkta linjära poly (THF).
- Efter noggrann blandning av provet med en pipettspets, indunsta kloroform genom upphettning av provet med användning av en tork.
OBS: Detta ger en smälta av den icke-märkta linjära poly (THF) innehållande 10 -8 M av fluoroforen införlivas polymerer. - Ta 10 ul av provet med användning av en mikro-pipett och dROP det på en rengjord täckglas. Annorlunda rengjorda täckglas på provet och smörgås provet mellan de två täckglas.
- Tryck på provet försiktigt med en plast pincett.
- Rengöring av mikroskoptäckglas
- Brett fält fluorescens avbildning installation 15
- Införande av en excitation laser (488 nm) i den bakre porten på inverterat mikroskop
- Sätt en exciteringsbandpassfilter och polarisatorn i strålgången.
- Expandera strålen till cirka 1 cm i diameter med en balk expander.
- Sätt kvart våg plattan i strålgången. Ställ den optiska axeln för den våg plattan vid 45 grad med avseende på den hos polarisatorn. Alternativt, infoga en Berek kompensator och ställa den optiska fördröjningen med X / 4.
- Infoga en diafragma i exciteringsstrålens väg för att justera strålens storlek.
- Innan införandet av laserstrålen i den bakre porten på inverterade optiska microscope, sätt en fokuseringslins (plan-konvex lins, brännvidd ≈ 300 mm) vid en position där laserstrålen av objektivlinsen kollimeras.
- Efter reflektera laserstrålen med hjälp av en dikroisk spegel monterad på en filter kub, introducera laserstrålen till provet genom en hög numerisk apertur (NA) objektivlins (t.ex. NA 1,3, 100 gångers förstoring, oljeimmersion).
- Fäst en objektiv värmaren till objektiv och ställa in temperaturen till 30 ° C.
- Montering av provet på scenen i inverterat mikroskop
- Släppa en droppe immersionsolja på objektiv och montera provet på mikroskop tillstånd.
- Säkerställa att provet tjocklek av ca 10 ^ m erhålls genom att kontrollera det axiella läget av botten och toppytan av provet.
- Justera mikroskopets fokus till ett fåtal mikrometer ovanför bottenytan av provet.
- Infoga en polarisator i den kollimerade laserstrålen ut ur objektivlinsens.
- Registrera intensiteten hos lasern transmitteras genom polarisatorn genom att sätta in en kraftmätare efter polarisatorn. Anteckna överförda lasereffekt vid olika polariserings vinklar genom att vrida polarisatorn.
- Om den överförda lasereffekt är inte konstant på alla polariserings vinklar, rotera kvartsvågplattan eller Berek kompensator in i exciteringsstrålens väg något.
- Upprepa steg 3.2.5.2 och 3.2.5.3 tills konstant överförda lasereffekt uppnås vid alla polariserings vinklar. Säkerställa att det cirkulärt polariserade ljuset erhålls vid provet.
- Ställ in EM (elektron multiplicerande) -charge coupled device (CCD) kamera
- Fäst EM-CCD-kamera till sidoingången av mikroskop och anslut den till than bilden förvärvet programvara.
- Om så är nödvändigt, synkronisera kameran exponeringen för en mekanisk slutare eller akusto-optiska avstämbara filtret insatt i exciteringsstrålens bana, genom att överföra den transistor-transistorlogik (TTL) signaler som genereras av EM-CCD-kamera till anordningarna. Alternativt synkronisera kameran exponeringen för laserutsignalen genom att sända de TTL-signaler som genereras av EM-CCD-kamera på lasern.
OBS: Det senare alternativet är tillämplig endast när en halvledarlaser vars uteffekt kan moduleras genom ingångs transistor-transistorlogik (TTL) signaler används för experimentet. - Applicera en EM förstärkning (typiskt ca 300) till CCD-kameran med hjälp av mjukvaran som styr kameran för att få en hög kvalitet fluorescens bild av den inre fluoroforen.
- Ställ ett område av intresse (ROI) (typiskt 128 x 128 pixlar i mitten av synfältet) med mjukvaran som styr kameran.
OBS: Detta gör det möjligt att imaging experiment vid bildhastigheter på 100 - 200 Hz i ramen överföringsläget, vilket krävs för att visualisera rörelse av fluoroforen införlivade polymerkedjor i provsmältan.
- Införande av en excitation laser (488 nm) i den bakre porten på inverterat mikroskop
- Kör experimentet
- Optimering av experimentella betingelser
- Justera belysningsområdet av provet till cirka 20 ^ m i diameter med användning av membranet införd i exciteringsstrålens väg.
- Ställ in excitation lasereffekt på provet till 4-8 mW genom att manuellt välja en lämplig neutral densitet (ND) filter insatt i exciteringsstrålens väg.
OBS: Detta ger medelvärdet lasereffekt av 1 - 2 kW cm -2 vid provet. - Spela fluorescensbilder av provet vid bildhastigheter på 100 - 200 Hz. Om fluorescensintensiteten som erhållits från de enskilda fluoroforenhetema-införlivas polymerer är för låg, gradvis öka excitation strömmen med the ND-filter tills den når ungefär 100 mW vid provet.
- Om kvaliteten på den enda molekyl fluorescens bild fortfarande är dålig, ta fluorescens föroreningar i provet genom att spela in fluorescensbilder av en ren smälta av den icke-märkta poly (THF). I det fall en hög fluorescens bakgrund observeras, använda olika icke-märkt poly (THF).
- Om densiteten hos den fluorescens plats erhålles från fluoroforen-införlivas polymerer i smälta är för hög för att rumsligt isolera dem (detta orsakar fel i analysen av det diffusiva rörelse), minska koncentrationen av fluoroforen-införlivas polymerer i provet tills rumsligt isolerade fläckar observeras.
- Om densiteten hos den fluorescens plats erhålles från fluoroforen-införlivas polymerer i smältan är för låg (detta orsakar en låg genomströmning av avbildningsexperiment), öka koncentrationen av fluoroforen-införlivas polymerer i provet tills en approprIATE densiteten hos fluorescens fläcken har uppnåtts.
- Om fluorescens bilder som erhållits från fluoroforen införlivade polymererna i smältan är suddiga, öka frame rates i scanning.
OBS: Detta kräver ofta en mindre ROI, typiskt 64 x 64 pixlar.
- Optimering av experimentella betingelser
- bildinsamlande
- När de experimentella betingelserna är optimerade, lämna den monterade provet på mikroskopställningen i en timme så att provet når jämviktsförhållanden.
- Spela 500 - 1000 fluorescens bildsekvenser av fluoroforen införlivade polymererna i smält tillstånd vid 100 - 200 Hz bildfrekvens. Om standardfilformat är inte TIFF, konvertera alla bildsekvenser till TIFF-format.
4. Analys av Diffusiv Motion
- Mean-kvadrat förskjutning (MSD) analys
- Beskära fluorescens bildsekvenser på ett sådant sättatt varje bildsekvens innehåller en enda och väl fokuserad spridande fluorofor-införlivad polymer med hjälp av bildbehandlingsprogram, såsom ImageJ.
- När den beskurna bilden sekvenserna innehåller mer än 10 bilder, dela bildsekvenser i flera sekvenser så att varje sekvens består av 10 ramar.
- Bestämma positionerna för de molekyler i varje bildsekvenser noggrant genom tvådimensionell Gauss-montering av bilderna.
- Bestämma diffusionskoefficienten (D) bestående av enskilda molekyler genom mean-squared förskjutning (MSD) analys av de diffusion banor (dvs. tidsberoende positioner av molekylen) med användning av en ekvation 20
där x i och yi är positionerna hos molekylen i bildramen i, och n betecknar ramnumret med time lapse At från ram i. - Plotta diffusionskoefficienter ien frekvens histogram.
OBS: Normalt är histogrammet konstruerat från mer än 100 molekyler.
- Kumulativa fördelningsfunktionen (CDF) analys
OBS! En CDF, P (r 2, i Δ t) motsvarar den kumulativa sannolikheten att hitta de diffunderande molekyler inom en radie r från utgångspunkten efter en viss fördröjning i At.- Beräkna kvadrat-förskjutningen som inträffar under tidsfördröjningar av 1Δt, 2At, ····, iΔt för alla spridnings banor som erhållits i 4.1.3.
OBS: Dessa beräkningar ger total m i kvadrat-förskjutningar för tidsfördröjningar av iΔt. - Beräkna numren på de kvadrerade-förskjutningar (Li) inom den totala m i datauppsättning som är mindre än r 2 vid olika r 2 värden (0 <r2 <∞). Normaliserad L vs r 2 tomter motsvarar CDF, P (r 2, iΔt).
- Beräkna kvadrat-förskjutningen som inträffar under tidsfördröjningar av 1Δt, 2At, ····, iΔt för alla spridnings banor som erhållits i 4.1.3.
- Analys av CDFS med distinkta diffusionsmodeller
Obs: De erhållna CDFS monteras av olika spridningsmodeller; homogen diffusion modell, flera diffusion lägen där D fördelningen beskrivs enligt en Gauss (enda Gauss modell), och flera spridningssätt där D fördelningen beskrivs av flera Gauss (multipel Gauss modell).- I den homogena diffusion modellen bestämma ett medelvärde D genom att montera CDF med hjälp av en ekvation 21
OBS: Varje avvikelse från ekvationen föreslår heterogena diffusion av molekylen. - I det enda gaussisk modell, fastställa vilken sannolikhetsfördelningen för D beskrivs enligt en Gauss (f (D)) genom att passa den CDF med användning av 15
On3 "src =" / filer / ftp_upload / 54.503 / 54503equation3.jpg "/>
där A, W och D 0 är amplituden, bredd, och centrum för Gauss. - I den dubbla gaussisk modell, fastställa vilken sannolikhetsfördelningen för j: te komponenten i D beskrivs enligt en Gauss (f (D)) genom att passa den CDF med användning av 14
där A j är den fraktion av varje diffusion komponent och α j, w j, och D 0 j är amplituden, bredd och centrum av den j: te komponenten av Gaussisk.
- I den homogena diffusion modellen bestämma ett medelvärde D genom att montera CDF med hjälp av en ekvation 21
- Beräkning av den teoretiska sannolikhets distribubution av diffusionskoefficienten
OBS! Sannolikhetsfördelningar av D förekommer på grund av de statistiska fel (p (D) d D) beräknas för de olika spridningsmodeller; homogen diffusion modell, flera diffusion lägen där D fördelningen beskrivs enligt en Gauss (enda Gauss modell), och flera spridningssätt där D fördelningen beskrivs av flera Gauss (multipel Gauss modell).- I den homogena diffusionsmodell, beräkna den statistiska fördelningen av D sannolikhet med användning av en ekvation 22
där N är antalet datapunkter i en diffusion bana (N = 10, se 4.1.2), D 0 är medel diffusionskoefficienten (bestäms av CDF analys, se 4.2.3.1), och D är den experimentellt erhållna diffusionskoefficienten för en enskild bana. - ienda gaussisk diffusionsmodell, beräkna den statistiska fördelningen av D sannolikhet med användning av en ekvation 15
där f (D) betecknar sannolikhetsfördelning av D bestäms av CDF-analys (se 4.2.3.2), och D 0 är medel diffusionskoefficienten (bestäms av CDF analys, se 4.2.3.2). - I den dubbla Gaussisk diffusionsmodell, beräkna den statistiska fördelningen av D sannolikhet med användning av en ekvation 14
där f (D j) betecknar sannolikhetsfördelning av den j: te komponenten av D (D j) bestäms av den CDF-analys (se 4.2.3.3), och D 0J är medelvärdet diffusionskoefficienten för det j: te komponenten (bestämd av CDF analys, se 4.2.3.3).
- I den homogena diffusionsmodell, beräkna den statistiska fördelningen av D sannolikhet med användning av en ekvation 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den perylen diimid-inkorporerade fyra beväpnade stjärna och 8-formad dicyklisk poly (THF) s syntetiserades med hjälp av elektrosjälvorganisering och kovalent fixering (ESA-CF) process (Figur 1, Figur 2). Time-lapse enda molekyl fluorescensbilder mättes för fyra-armad (figur 3a) och 8-formade (figur 3B) polymerer. De tidsförlopp fluorescensbilder (Figur 3) visar rums isolerade ljusa och skarpa fläckar på grund av införandet av den mycket fluorescerande perylen diimid fluoroforen 23 i kedjorna. Frekvens histogram av diffusionskoefficienten beräknades för fyra-beväpnade (figur 4a) och 8-formade (figur 4b) polymerer av medelvärdet-squared förskjutning (MSD) analys av tidsförlopp bilder. Beräkningarna av MSD tomter och CDFS genomförs med hjälp rutiner skrivna i MATLAB. beslagetav CDFS erhållits från experimenten utförs med hjälp av databehandling program som Origin Pro. Frekvens histogram av diffusionskoefficienten bestäms av MSD analys visar breda distributioner (Figur 4) till följd av såväl statistiska fel i analysen och heterogenitet diffusion. Frekvens histogrammen visar tydliga avvikelser från den homogena diffusionsmodell (grön linje i figur 4), vilket visar heterogena diffusion av polymermolekylerna. 14 kumulativ fördelningsfunktion (CDFS) beräknades för 4-armad (figur 5a) och 8-formad (Figur 5b) polymerer och monteras av en enda Gauss (figur 5a) och dubbel Gauss (figur 5b) modeller. De statistiska sannolikhetsfördelningar av diffusionskoefficienten beräknades för 4-armad (figur 4a) och 8-formade (figur 4b) pol Ymers av den enda Gauss, eller dubbla Gaussiska modeller. Den enda (figur 5a) och dubbel (figur 5b) Gaussiska modeller passar experimentellt erhållna CDFS väl. Dessa resultat visar att diffusionen av det 4-armad polymer beskrivs av den breda fördelningen av diffusionskoefficienten, medan den 8-formade polymeren uppvisar två distinkta spridningslägen.
Figur 1. Syntes vägen perylen diimid införlivade poly (THF) s. Syntes vägen (a) 4-beväpnade stjärnpolymerer och (b) 8-formade dicykliska polymerer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
54503fig2.jpg "/>
Figur 2. Karakterisering av de syntetiserade polymererna. NMR-spektra av (a) 4-beväpnade stjärnpolymerer och (b) 8-formade dicykliska polymerer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 (filmer). Enda molekyl fluorescens avbildning av perylen diimid-inkorporerade poly (THF) s. Time-lapse fluorescensbilder av (a) 4-beväpnade stjärnpolymerer och (b) 8-formad dicykliska polymerer i smältan av icke-märkta linjära poly (THF ). Skalstreck = 5 | j, m. Klicka här för att se filmer (a) och3 / Figure_3b_submit.mov "target =" _ blank "> (b).
Figur 4. MSD-analys av perylen diimid-inkorporerade poly (THF) s diffunderar i smältan. Frekvens histogram av diffusionskoefficienten bestäms för individuella (a) 4-beväpnade stjärnpolymerer och (b) 8-formade dicykliska polymerer i smältan av icke-märkt linjära poly (THF). De heldragna linjerna visar teoretiskt beräknade sannolikhetsfördelningar av diffusionskoefficienten baserat på de tre olika spridningsmodeller; homogen diffusion modell (gröna linjer, se 4.3.1), enkel Gauss modell (redlines, se 4.3.2) och dubbel Gaussisk modell (blå linje, se 4.3.3). 14 Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. CDF analys av perylen diimid-inkorporerade poly (THF) s diffunderar i smältan Experimentellt erhållna kumulativ fördelningsfunktion (iΔt = 7,5-75 ms). I form av en-P för (a) 4-beväpnade stjärnpolymerer och (b) 8-formad dicykliska polymerer i smältan av icke-märkta linjära poly (THF). Streckade linjerna visar armaturer med (a) ekvationer i 4.2.3.2 (b) ekvationer i 4.2.3.3. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fyra beväpnade och 8-formade polymerer framställdes via ESA-CF-protokollet (Figur 1), som är ett kritiskt steg för syntesen. 12,24 Monofunktionell och bifunktioneli linjär poly (THF) s med N -phenylpiperidinium ändgrupper var syntetiserades enligt den föregående proceduren. ades 11 jonbytet utförs genom återutfällning av en acetonlösning av en polymer prekursor med triflat motanjoner i en vattenlösning innehållande en överskottsmängd av karboxylat.
Den kovalenta omvandling av jonbytar-produkt för de 4-beväpnade stjärnpolymerer genomfördes i toluen (4,9 g / L) av återloppskokning under 4 timmar. Om konverteringen inte är tillräcklig, förlänga reaktionstiden. Den kovalent bundna produkten erhölls genom kolonnkromatografi på silikagel med aceton / n-hexan och återutfällning i vatten. Den 1 H-NMR av de 4-beväpnade polymerer visas i figur 2a. This ESA-CF förfarande möjliggör effektiv syntes av cykliska polymerer. Emellertid är detta protokoll begränsat till polymerer som har cykliska onium ändgrupper.
För 8-formade polymerprodukt, utfördes reaktionen utfördes i toluen i utspädning (0,2 g / L) under återflöde under 4 h och resulterade i bildandet av en stor del av en olöslig fraktion, förmodligen beroende på den intermolekylära reagerade produkter. En löslig portion återutfälldes i n-hexan, utsattes för silikagelkolonnkromatografi med aceton / n-hexan, och återutfälldes i vatten. Den erhållna råprodukten underkastades kolonnkromatografi med storleksuteslutning pärlor och återvinna GPC för att möjliggöra isolering av den 8-formade polymerprodukten. Den 1 H-NMR av de åtta-formade polymerer visas i figur 2b. Detta ESA-CF-protokollet kan tillämpas på ytterligare komplexa topologiska polymerer.
Fluorescens bilder av hög kvalitet är essential för noggrann analys av det diffusiva rörelse av molekylerna. Fluorescensbilder avsevärt försämras när 1) fluorescens föroreningar är närvarande i provet, 2) fluorescenskvantutbyte av en inbyggd fluoroforen är låg, och 3) bildfrekvens på bild är långsammare än det diffuserande rörelse av polymermolekylerna. Inställning av temperaturen under rumstemperatur (20 ° C) eller över 37 ° C kommer att orsaka ett brytningsindex obalans, som också kommer att försämra kvaliteten på inspelade fluorescensbilder. Med användning av ett smalare band emissionsbandpassfilter monterat på ett filter kub some förbättrar kvaliteten på den fluorescensbild. Eftersom exponeringstiden för EM-CCD-kamera som används i avbildningsexperiment är vanligtvis begränsad till millisekunder, kan det diffusiva rörelse snabbare än denna tidsskala inte fångas upp av denna metod.
Utvärderingen av effekten av den statistiska fel i MSD analysen är det kritiska steget for karakteriseringen av den heterogena diffusion. Den statistiska felet bör noggrant utvärderas genom att beräkna sannolikhetsfördelningen av diffusionskoefficienten med den homogena diffusion modellen 22 Innan vi diskuterar den heterogena diffusion. Den heterogena spridning bör också noggrant utvärderas av CDF analys. När CDFS visar tydliga avvikelser från den homogena diffusion modellen (dvs., single-exponentiell ruttnande kurva), tyder detta närvaron av multipla diffunderande komponenter. Den kvantitativa karakteriseringen av heterogena diffusion kräver kombinerad MSD, CDF, och sannolikhetsfördelning analyser. 14,15
Polymerdynamik, inklusive diffusiv rörelse, har beskrivits som ensemblemedelvärdes värden i de konventionella metoder såsom NMR, 7 ljusspridning, 8 och viskositetsmätningar. 9 Faktum är att den heterogena diffusiv rörelse avslöjas av single-molekyl avbildning 16 är ofta mycket svåra att upptäcka i ensemblen-genomsnitt metoder. Med tanke på den inneboende heterogena karaktären av polymerer, är 25-27 metoden redovisas i detta protokoll inte begränsad till karakteriseringen av topologiska polymerer, men är tillämplig på alla typer av polymerer enligt intrasslade förhållanden. 28 Vidare kommer metoden redovisas i detta protokoll hitta en bred tillämpning vid analys av heterogena diffusion i komplexa system, såsom molekylär diffusion genom mesoporösa material. 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
- Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
- McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
- McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
- Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
- Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
- Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
- von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
- Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
- Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
- Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
- Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
- Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
- Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
- Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
- Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
- Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
- Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
- Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
- Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
- Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
- Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
- Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
- Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).
