Summary
מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.
Abstract
למרות דלקת ריאות הנרכשת בקהילה נשארת אחת בעיות עיקריות בריאות הציבור, מודלים בעכברים של דלקת ריאות חיידקית הקלו התקדמות פרה-קלינית משמעותית לאחרונה בהבנתנו בפתוגנזה התאית והמולקולרית הבסיסית. בעכברי מודל vivo ללכוד פיזיולוגיה המשולבת ואיתנות תגובת ההגנה המארחת ב באופן לא נחשף על ידי גישות vivo לשעבר חלופיות, פשוט יותר. כמה שיטות תוארו בספרות עבור חיסון intrapulmonary של חיידקים בעכברים, כולל aerosolization, משלוח אפי, cannulation endotracheal Peroral תחת 'עיוור' ו דמיינו ההתניות cannulation endotracheal transcutaneous. כל השיטות יתרונות ומגבלות יחסית. בזאת, אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לא פולשנית, טכני שאינו עתירה, זולות, מהירה למסירת intratracheal של חיידקי מערבת שאיפה (כלומר, שאיפה) על ידי העכברשל בידוד זיהומיות pipetted לתוך הלוע התחתון בעוד תחת הרדמה כללית. שיטה זו יכולה לשמש למסירה ריאתי של מגוון רחב של גורמים ביולוגיים וכימיים שאינם מאכלים, והוא קל יחסית ללמוד, אפילו למעבדות עם ניסיון קודם מינימאלי לנהלים ריאתי. בנוסף לתיאור שיטת דלקת ריאות שאיפה, כמו כן אנו מספקים נהלים צעד-אחר-צעד עבור assaying את הפעולות הבאות in vivo התגובה החיסונית המולדת ריאתי של העכבר, בפרט, שיטות לכימות אישור חיידקים התגובה החיסונית התאית של דרכי האוויר הנגוע. גישה משולבת ופשוט זה להערכת דלקת ריאות מאפשרת הערכה מהירה וחזקה של השפעת מניפולציות גנטיות וסביבתיות על חסינות מולדת ריאתי.
Introduction
קהילה רכשה דלקת ריאות נשארת הגורם המוביל למוות כתוצאה מהזיהום בארה"ב, עם שינוי הכולל מעט בשיעורי תמותה ב -40 השנים האחרונות למרות שיפורי חיסון ואסטרטגיות אנטיביוטיות 1,2. למרות חוסר התקדמות ניכרת ברמת בריאות הציבור, בשנים האחרונות התקדמות דרמטית נעשתה הבנתנו בפתוגנזה המולקולרית התאית של דלקת ריאות, עם רבים של פעולות הבאות קדימה מתאפשרות על ידי השימוש במודלים של עכברים של דלקת ריאות. העקיבות הגנטיות של העכבר, הדמיון של murine ומערכות חיסון אנושיות, ואת המערך העצום של חומרים כימיים אימונולוגית במיקוד murine שהפך זמין מסחרי יחד הקלו התקדמות מהירה של השדה.
מודלי עכבר של דלקת ריאות חיידקית המתוארות בספרות יש לסמוך כלל על אחד ארבעה מסלולים טכניים עבור חיסון הפתוגן: אני aerosolization); ii) Intrמשלוח anasal; iii) משלוח Peroral; ו- IV) הזרקת intratracheal כירורגית (כלומר, קנה) 3. כל המסלולים של זיהום יתרונות וחסרונות 3. בפרט, חשיפה היחסית של דרכי הנשימה העליונות, פוטנציאל תערובת של צמחים oronasal, דרישות עבור הרדמה כללית, השתנות של הבידוד נמסר אל הריאות דיסטלי, הפצה אוֹנִי של פתוגנים נמסר, דרישות מומחיות טכנית, ותחלואה פרוצדורליים להשתנות משמעותית על פני אלה גישות.
נפוץ טכניקות זיהום Peroral כוללות endotracheal (translaryngeal) cannulation דרך או גישה 'עיוורת' (לא דמיין), או תחת ויזואליזציה בגרון ישירה 3-5. שני שיטות, תוך חזק, דורשות הכשרה משמעותית וגם לשאת בסיכון של טראומה על דרך הנשימה העליונה. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה טכנית שאינם עתירה, לא פולשנית, לא יקרה, ומהירה של זיהום Peroral, wחיידקים בזאת (Klebsiella pneumoniae בדוגמא המסופקת) pipetted לתוך הלוע התחתון של עכבר הרדים מועברים אל הריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה). אנו ואחרים השתמשנו בטכניקת דלקת ריאות שאיפה בהצלחה 6-9. שיטת ריאות-משלוח תכליתי ובקלות לומדת זה יכול להתארך עד המסיירת הרבה סוכנים שאינם מאכלים נוספים אל הריאות, כולל ציטוקינים וחלבונים אחרים, מולקולות הקשורים הפתוגן (למשל, lipopolysaccharide), תאים (כלומר, העברת מאמצת), ורעלים (למשל, בליאומיצין). בנוסף לדיון שיקולים טכניים חשובים, אנחנו גם לתאר גישה משולבת, כמוני להערכת התגובה המארחת לאחר דלקת ריאות, כוללים מדידה במורד זרם של שחרור חיידקים (כלומר, יחידת מושבה להרכיב [CFU] quantitation באיברי הריאות היקפיות) ו לויקוציטים הצטברות במרחב האווירי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי חיים ואת מדיניות שירות הבריאות האמריקני על טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה לאחר בדיקה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש של NIEHS.
1. הכנת ק pneumoniae תרבות
זהירות: בצע את כל השלבים ברדס 2 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL2) או באזור BSL2 המיועד אחרים וזורקים פסולת בהתאם להנחיות המוסד BSL2.
- לצמיחה השעיית ק pneumoniae, להפשיר מלאי גליצרול של חיידקים לחסן תרבות העבודה על ידי העברת 1 מ"ל של ק pneumoniae המניות ל -50 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) בבקבוק 500 מ"ל או יותר.
- הפוך מניות גליצרול על ידי הוספת 900 μl של יומן-שלב תרבותי ק pneumoniae 100 μl של גליצרול סטרילי והקפאה ב -20 ° C או -80 מעלות צלזיוס. עבור אחסון לטווח ארוך, C ° -80 מומלץ.
- חיידקי תרבות מסעיףTEP 1.1 ידי ניעור הבקבוק לילה (14 - 18 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס ב 200-225 rpm.In כדי לקדם צמיחה שלב יומן, לדלל 1-5 מ"ל של תרבות לילה זה לתוך בקבוק המכיל 50 מ"ל TSB בבוקר למקם בחזרה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך ~ 2.5 שעות.
- העבר 1 מ"ל של ק תרבות pneumoniae מהשלב האחרון לתוך צינור 1.5 מ"ל ו ספין ב 7500 XG במשך 2 דקות. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה. הסר supernatant מבלי להפריע גלולה, בעדינות resuspend חיידקים עם פיפטה 1 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית, ספין שוב ב 7500 XG במשך 2 דקות.
- בצע 2x שלב זה לשטוף, העלאת הגלולה הסופית, השטף ב 1 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית.
- בצע דילולים סדרו יומן חכם של בידוד מסודר זה. לדוגמה, להוסיף 400 μl של הבידוד לתוך 3.6 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית סדרתי לבצע 10 -1 -10 -9 סדרה דילול.
- לקבוע את OD 600 של שטף ק pneumoniae ידי הצבת 1 מ"ל של1:10 ו 1: 100 דילולים לתוך cuvettes הפנוי ומדידת OD 600, וממסך ראשון עם תמיסת מלח סטרילית. מדוד כפילויות כדי להבטיח דיוק. OD של 600 1.0 שווה בערך 4-7 x 10 8 CFU / ml. ראוי לציין, כי מערכת היחסים בין OD ו CFU / ml לא יכול להיות ליניארי.
- השתמש OD 600 מ הדילולים לחשב ריכוז של ק pneumoniae, החלת OD: המרה CFU / ml לעיל, ופעילות בתחום הפקטורינג של דילול.
- השתמש ק ריכוז pneumoniae להכין את המנה CFU הבידוד הרצוי בנפח <100 μl למסירה עכברים (ראה להלן).
- גם צלחת 100 μl של 10 -6 -10 -9 דילולים ו 100 μl של תמיסת מלח סטרילית על אגר סויה הפרט tryptic (TSA) צלחות ב RT. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולפקידה מושבות חיידקים על מנת לחשב ריכוז מדויק ששימש בניסוי ולשלוט על זיהום.
הערה: ריכוז חיידקי בפועל של בידוד סופי עשויה להיות ± 500 CFU / ml כי ניבא על ידי ספיג. מבצעי הניסוי רצוי לאשר את OD 600: CFU / יחסים מ"ל במחקרים טייס לפני השימוש in vivo בעכברים, באופן אמפירי מתקנים את OD 600: CFU / המרה מ"ל מבוסס על הניסיון האישי שלהם.
2. Murine intratracheal (זה) שאיפה של ק pneumoniae מן הלוע התחתון
- ודא כי עכברים מזוהים באופן ייחודי על ידי זנב סימן, קעקוע, או מזהים מאושרים אחרים.
- צייר את מינון בידוד של חיידקים באמצעות פיפטה P200 לפני הסרת עכברים מן isoflurane כדי לזרז הליך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם שאיפה זה, להשתמש בהיקף של <100 μl כדי למנוע הצפה. בזאת, להשתמש 2000 CFU / 50 μl של ק pneumoniae.
- להרדים עכברים בתא ברור עם גז isoflurane (למשל, 2% isoflurane בקצב הזרימה של 1 ליטר / דקה) או לפי institהנחיות utional. מספר העכברים להרדים יחד נקבע לפי רמת נוחות של הנסיין, בדרך כלל 1-2 בכל פעם. שים נשימה ולאשר רמת ההרדמה פעם נשימות עמוקות גלויות ו 2-3 שניות ניתן לספור בין נשימות.
הערה: אם קיים חשש לגבי תופעות בלבול אפשריות של הרדמה נדיפים (בשאיפה), הרדמה יכולה להיות מושגת במקום עם זריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine. בשיטה המתוארת לעיל, הרדמה עמוקה נמשכת רק כמה דקות. אם הרדמה ממושכת יותר מושרה, משחת עיניים צריך לשמש כדי למנוע התייבשות העין. - לאחר העכבר הוא הרדים, למקם אותו בתנוחה אופקית semirecumbent, הושעה על ידי החותכות לסתי מן גומייה מתוחה בין יתדות על לוח פרספקס מלוכסנת (איור 1).
- משוך בעדינות את לשון העכבר לצד עם זוג מלקחיים הלא חרוש בוטה מנת פיקדון לחלל הפה עם pipett P200דואר. עושה מאמצים גדולים על מנת להימנע גרימת טראומה או הלשון או הלוע התחתון.
- תוך שמירה על הלשון חזר בו, לחסום את האף בעדינות באצבע בכפפות עד שהעכבר שואף. המשך כדי לכסות את האף עד שהעכבר נקט שתיים או יותר שאיפות, ולא נוזל גלוי חלל הפה. כיסוי האף מסייע להבטיח כי העכבר יהיה לשאוף את החיידקים אל תוך הריאות, כמו עכברים הם נושמים אף מחייב.
- הסר את העכבר מלוח חיסון ולחזור לכלוב שלה, הצבת העכבר על גבו כדי למנוע מצעים או פסולת מחסימת nares בזמן שהעכבר מתאושש מן ההרדמה.
- לאחר כל העכברים כבר במינון ויש לי שהתעוררו מהרדמה, עכברי בית בתוך חדרון / חדר המכילים עכברים רק כי כבר במינון עם ק pneumoniae. צג עכברים יומי, כולל משקולות הגוף אם הולך מעבר 48 שעות לאחר ההדבקה.
- השתמש מחיה יומית ו / או חום משלים אם המאפשר העכברים ללכת מעבר 48hr.
3. נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (BALF) איסוף וניתוח
- להרדים עכברים בהתאם להנחיות מוסדיות. הנה, להשתמש זריקה קטלנית של 150 מ"ג / נתרן pentobarbital ק"ג או במינון שווה ערך של פתרון המתת חסד מסחרי ואחריו exsanguination, כמו זה ימנע סיבוכים אפשריים לריאות הקשורים משאיפת CO 2 ו נקע בצוואר הרחם.
- עכבר עמד על גב לעקר עכבר על ידי ריסוס פרווה עם אתנול 70%, בעיקר על אזור החזה והצוואר.
- ביצוע חתך אורכי ממש מתחת לעצם החזה, אז מחזיק את החזה עם מלקחיים, ניק הסרעפת, המאפשר הריאה ליפול חזרה לתוך חלל החזה. לחתך דרך חלל החזה משני צדי בכלי הדם ולאחר מכן, דרך הצוואר, חשיפת קנה הנשימה.
- כמו קנה הנשימה מוקפת שרירי אורך משני הצדים, לחתוך בזהירות דרכה במרכז לדחוף רקמות לצדדים, כמוזה ימנע חיתוך כלי הדם שמסביב, אשר יכול להציג את הדם לתוך קנה הנשימה. אם כלי הדם הוא חתוכות, לנקות את האזור שמסביב עם גזה לפני גישת לומן קנה הנשימה.
- השתמש במספריים כירורגית או מחט ולחתוך את קנה הנשימה על ¼ של הדרך למטה מהראש ולהכניס צינורית מצורף מזרק 1 מ"ל מראש עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו 1x (PBS) caudally לתוך קנה הנשימה. אם עכברים באמצעות <8 שבועות של גיל או נקבות, לצמצם את היקף lavaging כדי 600-800 μl.
- דחוף את נפח לתוך הריאות לאט, מה שמאפשר את כל האונות לנפח ולאחר מכן משוך את נפח בחזרה החוצה עם המזרק, לחזור 3x. אם PBS יוצא נחירי הצינורית לא נדחפה רחוק מספיק לתוך קנה הנשימה או אינפלציה מתרחשת מהר מדי. לחלופין, אם הריאות אינן ניפוח היטב, הצינורית נדחקה ב רחוק מדי, וכך למנוע מעט.
- אסוף שוטף נקווה בתוך שפופרת 15 מ"ל על הקרח.
- סיבובהנוזל האווירי שטיפה 1,200 XG במשך 5 דקות, לאסוף supernatant לתוך צינור 1.5 מ"ל ולהקפיא ב -80 ° C. בהמשך, השתמש supernatant (כלומר, BALF) למדידת חלבון, ציטוקינים, ו עבור מבחני ביוכימיים שונים אחרים. הגלולה מייצגת תאים מהמרחב ברונכואלוואולרית.
- אם תאי הדם האדומים (RBCs) ניכרים התא גלולה על בסיס צבע, lyse עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה ACK עבור 1 דקות ואחריו תוספת של 5 מ"ל של 1x PBS כדי לעצור את התגובה תמוגה לדלל למאגר. טיפול בכל הדגימות זהות, בין אם מטופל או לא עם חיץ תמוגה ACK.
- תאים ספין 1,200 XG במשך 5 דקות, למזוג supernatant, ולהביא את התאים עד 1 מ"ל של PBS 1x.
- תאים וורטקס וספירה על hemocytometer עבור ספירה של תא אווירי הכולל.
- בהתבסס על צפיפות של תאים להוסיף כ 80-150 μl (~ 80 μl עבור עכבר נגוע ~ 150 עבור עכבר נאיבי) אל חדר שקופיות על צנטריפוגות cytospin. תא ספיןים על שקופיות מיקרוסקופ מכתים המשך כדי לקבוע אוכלוסיות תאי הפרש.
- אפשר תאים להתייבש בשקופיות לילה. כתם תאים עם כתם תלת (למשל, המיתי 3 [ראה טבלה]) על ידי טבילת השקופיות 7 פעמים ב מקבע, 9 פעמים כתם 1, ו -7 פעמים כתם 2 (לא שטיפות בין כתמים), ולאפשר לו להתייבש. אחרי הכתם התייבש, מגלשות coverslip באופן ידני לספור הפרשים ידי מיקרוסקופ. באופן כללי, נויטרופילים מונוציטים / מאקרופאגים נבדלים בקלות על ידי גודלם ומורפולוגיה גרעינית.
4. קביעת עומס חיידקים ברקמות ריאות היקפיות
- לפני שמתחילים: להכין צינורות דילול עם 900 μl של 1x PBS עבור הריאות והטחול ו -90 μl של 1x PBS לדם. צלחות לייבל עבור culturing חיידקים ולהגדיר בטמפרטורת החדר; ולכן, ברגע רקמות נאספו זמן יהיה ממוזער בין המגון ציפוי התפתחות חיידקים.
הערה: בשל deposi הטרוגניתtion של חיידקים בתוך הריאות שעלולות להתרחש עם שאיפה, מומלץ כי עכברים בודדים לשמש לניתוח או של cellularity דרכי נשימה המוחלטת או מוחלט ניטלת חיידקים (דו-צדדיות) ריאות. - להרדים את העכבר לפי צעד 3.1 ובהמשך לאסוף דם מן החדר השמאלי, צבת לתוך צינור heparinized כדי למנוע קרישה. הסר את כל אונה של הריאות ומכניסים צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS 1x, ואחריו הסרת הטחול והשמה לתוך 2 מ"ל של 1x PBS. מניחים צינורות על הקרח. תשמור על עצמך כדי לנקות מכשירים עם אתנול בין כל רקמה / עכבר.
- Homogenize רקם על קרח, רצוי עם homogenizers הפנוי כי ניתן לשנות בין כל דגימה. טיפי homogenizer פנויים ניתן autoclaved לשימוש חוזר בין ניסויים.
- לאחר רקמות כבר הומוגני, לבצע דילולים צלחת סדרתי. דגימות פלייט של רקמות / דילול נתון בשני עותקים בצלחת TSA יחידה על ידי ציור קו הפרדה על הפלסטיק. ציפוי diהצעות lution מוצגים להלן (בכל המקרים, 10 μl של המדגם היא התפשטה לצלחת) ומבוססים על necropsy 24 שעות לאחר ההדבקה. אם לנתח 48-72 דגימות hr, מספר רב יותר של דילולים ייתכן שיהיה צורך מצופה בשל ניטל חיידקים מוגבר בנקודות מאוחר יותר זמן.
- לדם - לדלל 01:10 על ידי הוספת 10 μl של דם לתוך 90 μl של PBS 1x סטרילי. פלייט מסודר 01:10 דגימות מדוללות כפול. ברגע הדם כבר מצופה, ספין דם שיורית 9,300 XG במשך 10 דקות כדי לחלץ פלזמה למדידת ציטוקינים chemokines.
- עבור ריאות - לדלל 01:10 - 1: 100 על ידי הוספת 100 μl של הריאות הומוגני לתוך 900 μl של PBS 1x סטרילי סדרתי. פלייט homogenate מסודר וכל דילולים בשני עותקים.
- עבור טחול - לדלל 1: 10-1: 100 על ידי הוספת 100 μl של הטחול הומוגני לתוך 900 μl של PBS 1x סטרילי סדרתי. פלייט homogenate המסודר הוא הדילולים בשני עותקים.
- אפשר דגימות התפשטות להתייבש בקצרה. הפוך צלחות TSA ומניח C חממת סטטי 37 מעלות למשך הלילה.
- לקבוע את מספר חיידקים מיישבים על ידי חישוב ממוצע מושבות חיידקים משני צידי הצלחת ומכל דילול. גורמים דילולים הראשוניים של 5 מיליליטר עבור ריאות ו -2 מיליליטר עבור טחול לקבוע CFUs רקמות מוחלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים C57BL / 6 נדבקו עם 2000 CFU של ק pneumoniae 43,816 (סרוטיפ 2) דרך שאיפת לוע תחתונה לריאות. במינון זה, עכברים בדרך כלל מתחילים להראות תסמינים קליניים 12-24 שעות לאחר פגיעה כולל עייפות, פרווה פרועה, וירידה במשקל של 5-10% (איור 2 א). בתוך 48-72 שעות לאחר פגיעה, רב של העכברים להראות תסמינים של מחלה ותחלואה קדם בדרך כלל בשיעור ממוצע של ירידה במשקל 20% ותוצאות בתנוחות רכון עם ירידה בפעילות וירידת היענות לגירוי. מחקרים על משך זמן ארוך יותר עשויים לדרוש מינון נמוך יותר של ק pneumoniae. זיהום עם 500 CFU של ק pneumoniae התוצאה מחלה מתונה לשיא 3-5 לאחר הפגיעה ד כי מאופיין במשקל של 10-15% עם התאוששות ועלייה במשקל החל ביום 5-6 (איור 2 ב). משקל גוף הוא בדרך כלל חיזוי של הישרדות, עם ירידה במשקל של 20% נדיריםly הקשורים התאוששות.
ההצלחה האולטימטיבית של תגובת המארח ניתן להצביע הטוב ביותר על ידי מחקרי הישרדות, שבו עכברים מנוטרים במשך 10-14 ימים, ו מורדמים (בהתאם להנחיות שאושרו ומוסדי) עבור סימנים של moribundity, כגון היענות מינימאלית לגירוי חוש מישוש ו / או ירידה במשקל > 20%. מחקרים הישרדות הם לעתים קרובות יעיל ביותר אם אחד ממקדת הבידוד מדביק המדמה 50 הקטלניות% (כלומר, LD50 מנה) בקבוצת הביקורת (איור 2 ג). מנת LD50 מאפשרת זיהוי של השני גדל יחסית וירידת הישרדות בקבוצת הניסוי. הישרדות הפרש עשויה להיות בידוד תלוי, כך מספר מנות זיהום עלולות לפעמים להיות נחוצות כדי לזהות פנוטיפ הגנה מארחת שינה.
זיהום בדרכי הנשימה התחתונה עם ק pneumoniae מאופיין זרם חזק של Leukocytes לתוך דרכי הנשימה. ספירת תא חיסון והבחנה ידי מכתים של התא הגלול BAL מדגימים גידול תאים חיסוניים דרכי נשימה בתוך שלאחר זיהום 6 שעות (איור 3 א). פסגות Cellularity ב -24 שעות, עם נויטרופילים להיות תא החיסון השולט בדרכי הנשימה (איור 3A-B). שני המינים של עכברים C57BL / 6 להפגין leukocytosis דרכי הנשימה המקבילה בתגובה ק pneumoniae ב 24 שעות ו -48 שעות לאחר ההדבקה (3C-D איורים).
דלקת ריאות חיידקית גורם מקומי (intrapulmonary) ומגשר פרו-דלקתי מערכתי כולל ציטוקינים chemokines. רמות ציטוקינים / chemokine מקומי ניתן לאתר את BALF עם קונבנציונאלי ELISA או באמצעות מערכת ציטוקינים זמנית. ציטוקינים כולל IL-6, וטווחים, TNFα, G-CSF, ואחרים הם detectible בשני 24 שעות ו -48 שעות לאחר ההדבקה עם ק pneumoniae ולספק תובנה לוןהמיקרו-סביבה גרם וגיוס של תאי מערכת החיסון (איור 4).
אוסף של ריאות, דם, ורקמות היקפיות (ים) כגון טחול מאפשר אלקטרוני כדי לכמת את עומס רקמות בקטריאלי, מתן תובנה הוא האישור ריאתי מקומי של חיידקים, כמו גם הפצת extrapulmonary של חיידקים. דילול culturing סידורי של הריאה מדגים הרחבת נטל חיידקים בין 24 שעות ו -48 שעות לאחר ההדבקה (איור 5 א). ממצאים דומים, כפי שמראה דם הטחול (איור 5 ב - C). מן הראוי לציין כי נטל חיידקי bimodal ניתן לציין בדם והטחול ב 24 שעות לאחר ההדבקה, עם כמה עכברים שיש הפצת חיידקי בדרגה גבוהה, ואחרים, אפילו לנוכח הנטל חיידקי בדרגה גבוהה ריאות, מוצגות לא חיידקים לזיהוי בדם או הטחול. ק pneumoniae עומס חיידקי בעכברים C57BL / 6 אינו Gendאה ספציפיים, כמו זכרים ונקבות להפגין נטל שווה ברקמות שונות חיסון פוסט (איור 5D-F).
איור 1:. נוהל דירקטוריון שאיפה דלקת הריאות בעכברי מחקר בעכברים מוצב, ראש למעלה חזרה אל לוח (כלומר, semirecumbent), הושעה על ידי החותכות מן גומייה מתוחה בין שתי יתדות רכובות על פרספקס או לוח דומה.
איור 2: הערכה של הרזיה ותחלואה בעקבות ריאתי שאיפה של ק pneumoniae. C57BL / 6 עכברים (N = 10-20 לכל מצב) נדבקו על ידי שאיפה של ק pneumoniae 43,816 (סרוטיפ 2). (אמשקולות יומיות), צמוד טרום זיהום משקל, מעכברים נגועים עם 2000 CFU. במחקר זה, לא עכברים שרדו יום 6. בעבר (ב) זיהום עם 500 תוצאות CFU לירידה במשקל יומית דרך יום 4 לאחר הדבקה עם מעבר לקראת במשקל החל ביום 5. (ג) עקומות הישרדות מ 150 CFU, 500 CFU, ויוצרי יחידת מושבה 2000 (CFU) זיהומים, המציין 500 CFU קירוב LD50. נתוני לוחות A ו- B הם ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: זיהום ב- K. pneumoniae תוצאות בזמן תלוי Airway leukocytosis. C57BL / 6 עכברים קבלו זיהום intrapulmonary עם 2000 CFU של ק דלקת ריאותה. (א) ספירה לויקוציטים כולל (WBC), נויטרופילים (PMN), מקרופאגים (Mφ) בנוזל אווירי בשלב שונה מצביעה שלאחר זיהום. (ב) לאחר מכתים, PMNs מקרופאגים ניתן לזהות בקלות על ידי המורפולוגיה וגודל גרעינית בתחומים cytospin ומנה. (C - D) זיהום זכרים ונקבות התוצאה מספר דומה של תאים דלקתיים גויס ב 24 שעות ו -48 שעות לאחר הפגיעה. נתונים נובעים 6-25 / עכברים בכל מצב הם ממוצעים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ציטוקינים chemokines הם המושרה במרחב האווירי בתגובה לזיהום בקטריאלי C57BL / 6 העכברים קיבלו intrapulmon.זיהום האר"י עם 2000 CFU של ק pneumoniae. ציטוקינים chemokines BALF כומתו על ידי assay זמנית ב 24 שעות ו -48 שעות לאחר הפגיעה. נתונים נובעים 5-15 עכברים / מצב הם ממוצעים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. התלויה בזמן הרחבת נטל בקטריאלי ברקמות ריאות היקפיים במהלך דלקת ריאות C57BL / 6 העכברים קיבלו זיהום intrapulmonary עם 2000 CFU של ק pneumoniae. (א) הנטל חיידקי parenchymal ריאות נמדדה על ידי ציפוי דילולים הסידורי של homogenate ריאות על hr 24 TSA ו -48 שעות לאחר הפגיעה. (ב) לזרם הדם (C) הנטל חיידקי הטחול כומתו באופן דומה. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים Murine של דלקת ריאות חיידקית, שותפות עם מיקוד גנים in vivo התערבויות ביולוגיות תרופתי, סיפקו תובנות קריטיות לתוך התגובה ההגנה המארחת ריאתי. התקדמות גדולה נעשתה בפרט בהבנתנו של כמוקינים ומולקולות דבקות השולטים גיוס של נויטרופילים הכניסה למרחב האוירי הנגועה 10,11. בשנת vivo מודלים של דלקת ריאות, בניגוד לגישות מבוססי תאים או אלטרנטיביים, גם ספק תובנה חשובות האנדוקרינית תקשורת המתרחשים בתקופה שבין הריאות הנגועות ואיברים אחרים, כגון כבד (בתגובה בשלב חריף) 12 יותרת כליה (גלוקוקורטיקואידים מתח) 13. לבסוף, נקודה קריטית וקליני רלוונטית כי מתגלה על ידי מודלי דלקת ריאות in vivo היא כי אישור הפתוגן מוצלח אינו שקול להצלחה של המארח. במקרים רבים, תגובה חיסונית overexuberant עלולה לגרום למוות של המארחעקב פציעה ריאות עובר אורח מוגזם, אפילו לנוכח אישור הפתוגן מוצלח 8,14. לאור זאת, מדידות מקבילות של פינוי הפתוגן של התגובה החיסונית בדרך כלל אינפורמטיבי ביותר, ומחקרי הישרדות עשויים בסופו של דבר יידרשו לחשוף את החוסן המשולב של המארח.
בזאת, תיארו לנו שיטה פשוטה ולא פולשנית למסירה של חיידקים אל הריאות בעכברים באמצעות שאיפה. לעומת aerosolization, שיטה זו נושאת סיכון פוטנציאלי נמוך יותר עבור בחשיפה נשימתית של אנשי מחקר, מספקת למסירת בידוד מרוכזת גבוהה אל הריאות העמוקות, ונמנעה בלבול פוטנציאלי בתגובות עיניות ועליונה דרכי נשימה חיסוניות. חיסון intranasal גם נושא את הדאגה בלבול פוטנציאלי לזיהום בדרכי הנשימה העליונות, כולל אפשרות של זיהום פולשני מקומית של מערכת העצבים המרכזית 4, ו דווחה גם לגרום inocula משתנה מאוד בריאה5. לעומת אינטובציה endotracheal באמצעות גם את Peroral או מסלול transcutaneous, שיטה זו דורשת הכשרה מינימלית, הוא יותר מהיר (~ 1 דקות לכל עכבר), וכן, לפחות לעומת השיטה השנייה, יש תחלואה נמוכה יותר. חסרונות פוטנציאליים של שיטת שאיפת הלוע התחתונה - שחלקם משותפות בשיטות אחרות - כוללים את דרישת הרדמה כללית, הסתברות בלתי סדיר (כלומר, אסימטרי הטרוגנית) משלוח הפתוגן, זיהום שולט של האונות הנמוכה 15, וחוסר יכולת לכוון הפתוגן באופן חד צדדי ריאה אחת. בשל הפצה אחידה בתוך הריאות לאחר שאיפה (מידע לא מוצג) - תוצאה אשר הוא נתקל עם כל השיטות דלקת ריאות מלבד aerosolization 15 - אנחנו בדרך כלל לא לבצע מבחני ריאות חד-צדדיים על עכברים נגועים. ריאות שניהם lavaged ביחד או להעריך את התגובה החיסונית, או necropsied יחד קוואנט חיידקים יקווהitation ו / או ניתוח מולקולרי (למשל, ביטוי גנים, assay myeloperoxidase, ציטוקינים ELISA). במיוחד שלבים קריטיים של הפרוטוקול הם צעד 1.8 -confirming 600 OD: CFU / mL היחסים לפני in vivo זיהום וגם המאשר את ריכוז הבידוד באמצעות ציפוי בכל ניסוי; כמו גם צעד 3.6 - הבטחת שטיפה הלא-טראומטי של דרכי הנשימה עם תשואות נפח טוב לתוך המזרק.
למרות שיתוף זיהום עם פלורה אוראלי (כלומר, דלקת ריאות polymicrobial) היא דאגה תיאורטית, לא נתקלנו מושבות חיידקים פולימורפיים ב homogenates ריאות של עכברים נגועים עם ק pneumoniae או ס pneumoniae. עבור חוקרים המודאגים מן האפשרות הזו, לעומת זאת, עכברי שליטה יכולים להיחשף רכב aspirated (כלומר, חיץ), אם ירצו בכך. למרות שחלק הזיהום של לומן הקיבה (באמצעות בליעה של חיידקי unaspirated שיורית) היא שנינות אפשריתh השיטה אנו מתארים, אנחנו אף פעם לא נתקלנו סימנים קליניים עיכול או שינויים על פתולוגיה ברוטו. יתר על כן, האפשרות הזאת שכיחה לשיטות aerosolization ואת האף, והוא יכול גם להתרחש בעקבות שיעול בשיטת חיסון intratracheal.
כמה חששות מתודולוגיים הם אוניברסליים לכל דגמי דלקת הריאות. קבוצות בקרה ועכבר ניסוי צריכות להיות בגיל בהתאמה אידיאלית תוך 2-3 שבועות זה מזה. למרות שאנו לא מצאנו הבדלים בין מינים גלויים בסילוק הפתוגן או דלקת דרך נשימה של ק מודל pneumoniae, עכברים צריך להיות בהתאמה מגדרית, כמו הבדלים משמעותיים בין המינים בתגובת החיסון המולדת דווחו 16. בחינה קפדנית למקור של עכברי שליטה צריכה להינתן. שולט להמלטה עדיפה בדרך כלל מעל שולטת לרכוש מסחרי כמו backcrossing שלם, הבדלים הקשורים Microbiome אוכלוסיות תאים חיסוניים, epigenet האחרההבדלים ic כולם לערפלנים אפשריים שעשויים להשפיע על התגובה החיסונית 17,18. תשומת לב קפדנית צריך להינתן סרוטיפ הספציפי והיסטורית culturing של החיידק מדביק כמו הבדלים משמעותיים ארסי ניתן לראות. בהתבסס על הניסיון שלנו עם ק pneumoniae, אנו ממליצים על ביצוע מחקרים פיילוט ראשוני תוך שימוש במגוון של הדבקת inocula (למשל, 500-2,000 CFU) כמו תחלואה / תמותה של מינונים חיידקי ספציפי מהמדווח בספרות - אפילו באותו זן סרוטיפ ועכבר חיידקי - לא יכול לתרגם טוב למעבדה של האדם עצמו, ככל הנראה בשל מגוון של התאמות טכניות. הבדלים בין חברות קבוצה בין מלא עכבר ניסוי בתוצאות הגנה דלקתיות מארחות עשויים להיות תלוי בידוד. בשל המציאות הלוגיסטית של גידול בעלי חי איוש, לעתים קרובות אנו עורכים ניסויים עם 5-6 עכברים לכל קבוצת ניסוי. אמנם זה מספק עוצמה סטטיסטית מספקת מדי פעם עבור CFתוצאות U ותא ספירה, אנו מוצאים כי לעתים קרובות אנו צריכים לחזור על מחקר בהיקף זה פעם אחת או יותר על מנת להשיג כוח נאות.
עבור העכברים חלקים בניסוי נתון, אין התפתחות חיידקים לזיהוי בדם וטחול ניתן נתקלה 24 שעות לאחר הדבקה (איור 5). אנו מפרשים זאת כדי לציין 24 hr עשויים להיות קרובים לסף הקינטית להפצת extrapulmonary לזיהוי. אם צמיחה נמוכה / לגילוי טחול דם / הוא ציין, ריאות CFUs מאותו העכבר יש לבחון תמיד להתייחס לאפשרות של טעות טכנית (כלומר, נמוכה מאוד / דלקת ריאות לגילוי מה שיכול לרמז שגיאת המינון של העכבר).
לסיכום, שיטת מסירת שאיפת הלוע התחתונה עבור דלקת ריאות חיידקית בעכברים היא טכניקה חזקה כי הוא קל יחסית לרכוש מבעלי בעלות, הדרכה מבחינת ציוד, והוא מציאותי אפילו למעבדות ללא מומחיותבנהלים ריאתי. השיטה מצמידה בקלות מבחני מיקרוביולוגיות אימונולוגיים במורד זרם של תגובת ההגנה המארחת, והוא יכול יתר על כן לשמש כשיטה משלוח ריאות עבור מגוון רחב של חשיפות שאינן מאכלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
