Summary
여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
지역 사회 획득 폐렴이 중요한 공중 보건 문제로 남아 있지만, 세균성 폐렴의 쥐 모델은 최근 기본 세포 및 분자 기전에 대한 우리의 이해에 중요한 임상 발전을 촉진하고있다. 생체 마우스 모델에서 호스트 방어 반응의 통합 생리학과 탄력성을 캡처 방식은 대안, 단순화 된 생체 접근 방식에 의해 공개되지. 여러 방법 폐내 에어로졸 포함 생쥐 박테리아의 접종, 비내 전달 '블라인드'및 가시 조건 경구 기관 내 삽관 한 경피 기관 내 삽관에 대한 문헌에 기술되어있다. 모든 방법은 상대적인 장점과 한계가 있습니다. 여기서, 우리는 상세히 마우스로 흡입 (즉, 흡입) 관련 박테리아의 기관 내 전달을위한 비 침습적 기술적 비 집약 저렴하고 빠른 방법을 서술동안 전신 마취하에 구강 인두로 피펫 감염성 접종의. 이 방법은 비 - 부식성 생물학 및 화학 물질의 다양한 폐 전달을 위해 사용되며, 심지어 폐 절차 최소한 이전 경험 실험실 학습 비교적 쉽게 할 수있다. 흡인 성 폐렴 방법을 설명하는 이외에, 우리는 또한, 특히, 생체 내 마우스 폐 선천성 면역 반응 후의을 분석하기위한 단계별 과정을 제공하는 박테리아 간극 감염된기도의 세포 성 면역 반응을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 폐렴 평가에이 통합 간단한 방법은 폐의 선천성 면역에 따라 유전 적, 환경 적 조작의 효과를 신속하고 강력한 평가를 할 수 있습니다.
Introduction
지역 사회 획득 폐렴은 예방 접종의 개선 및 항생제 전략 1, 2에도 불구하고 지난 40 년 동안 사망률이 거의 전반적인 변화, 미국의 감염으로 인한 사망의 주요 원인 남아있다. 보건 수준인지 진행의 부족에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 극적인 진보 순방향 폐 감염 마우스 모델의 사용에 의해 가능하게 이러한 많은 단계와, 폐렴 분자 세포 병인에 대한 이해 만들어왔다. 마우스의 유전 취급 용이성은 쥐와 인간의 면역 시스템, 상업적으로 사용할 수있게 한 쥐의 표적 면역 시약의 광대 한 배열의 유사성은 함께 필드의 급속한 발전을 촉진했다.
문헌에 기술 세균성 폐렴의 마우스 모델은 일반적 병원균 접종 1 내지 4의 기술 경로에 의존했다 : I)을 에어로졸; ⅱ) INTRanasal 전달; ⅲ) 경구 전달; 및 ⅳ) 수술 기관 내 주입 (즉, 기관 절개술) 3. 감염의 모든 노선 장점과 단점 3 있습니다. oronasal 식물, 전신 마취에 대한 요구 사항의 혼합물 특히, 상대적으로 상부기도의 노출 가능성에서, 말초 폐에 전달 접종, 전달 된 병원균의 엽성 분포, 전문 기술 요구 사항 및 절차 사망률의 변동이 걸쳐 다양 구혼.
일반적으로 사용되는 경구 감염 기법, 또는 직접 후두 시각화 3-5 아래 '블라인드'(비 시각) 접근법을 통해 기관 내 (translaryngeal) 삽관을 포함한다. 두 방법 모두 강력한 반면, 상당한 훈련이 필요하며 또한 상부기도에 외상의 위험을 수행한다. 본 보고서에서, 우리는 승, 경구 감염의 기술적, 비 집약적 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명이에 박테리아 (제공된 예에서 클레 브시 엘라 폐렴)을 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐에 전달 마취 된 쥐의 구강 인두로 피펫. 우리와 다른 사람은 성공적으로 6-9 흡인 성 폐렴 기술을 사용했다. 이 다양하고 쉽게 배울 폐 배달 방법은 사이토 카인과 다른 단백질, 병원체 관련 분자 (예를 들면, 리포 폴리 사카 라이드), 셀 (즉, 입양 전송)를 포함하여 폐, 많은 추가 비 부식성 요원의 전달에 확장 될 수있다 독소 (예컨대, 블레오 마이신). 중요한 기술적 사항을 논의에 더하여, 또한 하류 세균 클리어런스 측정 (즉, 집락 형성 단위 [CFU 상기 폐 및 말초 기관에서 정량) 백혈구를 포함한 폐렴 후속 호스트 응답을 평가하는 통합 정량 방법을 설명 영공에 축적.
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Protocol
모든 실험은 동물 관리 및 NIEHS의 사용위원회의 검토 후 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 미국 공중 보건 서비스 정책에 따라 수행 하였다.
K. 1. 준비 폐렴 문화
주의 : 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 후드 또는 다른 BSL2 지정된 지역의 모든 단계를 수행하고 연구소 BSL2 가이드 라인에 따라 폐기물을 폐기합니다.
- K.의 서스펜션 성장 폐렴, 세균의 글리세롤 주식을 해동 및 K. 1 ㎖를 전송하여 작업 문화를 접종 500 ml의 이상 플라스크에서 트립신 간장 국물 (TSB)의 50 ㎖에 폐렴 재고.
- 배양 로그 상 K. 900 μl를 추가하여 글리세롤 주식을 폐렴 멸균 글리세롤 100 ㎕ 및 -20 ° C 또는 -80 ° C ~에서 동결. 장기 저장을 위해, -80 ° C 권장합니다.
- s의 문화 박테리아밤새 진탕 플라스크에서 1.1 TEP - 200-225 rpm.In 로그 상 성장을 촉진하기 위해 37 ℃에서 (14-18 시간)를 아침에 50 ㎖ TSB를 함유하는 플라스크에이 밤새 배양 1-5 mL로 희석 ~ 2.5 시간 동안 진탕 37 ° C에서 다시 배치합니다.
- K. 1 ㎖로 이동 2 분 동안 7,500 XG에 1.5 ML 튜브와 스핀에 마지막 단계에서 폐렴 문화. 흰색 펠렛을 볼 수 있어야합니다. 부드럽게 멸균 생리 식염수 1 ㎖에 피펫으로 박테리아를 재현 탁, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 2 분 동안 7,500 XG에 다시 스핀.
- 이 세척 단계의 2 배를 수행 멸균 생리 식염수 1 ml의 최종 세척 펠릿을 가져.
- 이 깔끔한 접종의 로그 현명한 연속 희석을 수행합니다. 예를 들어, 직렬 10 -1 -10 -9 희석 시리즈를 만들기 위해 멸균 생리 식염수 3.6 ml의로 접종의 400 μl를 추가합니다.
- 세척 K.의 OD 600 결정 폐렴의 1 ml에 두어1:10 1 : 멸균 식염수 제 블랭킹 일회용 큐벳하고 OD 600 (100)로 측정 희석. 정확성을 보장하기 위해 중복 측정한다. 1.0의 OD (600)는 4-7 × 10 8 CFU / ㎖와 거의 동일합니다. OD 및 CFU 사이의 관계가 / ㎖ 선형하지 않을 수 있습니다.
- K.의 농도를 계산하기 위해 희석에서 OD (600)를 사용하여 폐렴의 OD를 적용 : CFU / ㎖의 위의 변환 및 인수 분해를 희석.
- K.를 사용하여 폐렴 농도 (아래 참조) 마우스에 전달하는 <100 μL 부피 원하는 접종 CFU 도즈를 제조 하였다.
- 또한 10-6 -10 -9 희석액 100 ㎕ 및 RT에서 개별 트립신 대두 한천 (TSA) 플레이트 상에 멸균 생리 식염수 100 ㎕를 접시. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 실험에 사용하고, 오염 제어하는 정확한 농도를 계산하기 위해 박테리아 콜로니를 열거.
참고 : 최종 접종의 실제 세균 농도는 500 CFU / 흡수에 의해 예측 ml의 ± 수있다. 개인의 경험을 바탕으로 CFU / ㎖ 변환 : 경험적으로 OD 600 재조정, 마우스의 생체 내에서 사용하기 전에 파일럿 연구에서 CFU / ㎖ 관계 : 실험자는 이상적으로 OD (600)를 확인해야합니다.
K. 2. 쥐 기관 내 (IT) 흡인 구강 인두에서 폐렴
- 그 쥐를 확인하는 고유 꼬리 마크, 문신, 또는 기타 승인 된 식별자에 의해 식별된다.
- 절차를 신속히 처리하기 위해 이소 플루 란에서 쥐를 제거하기 전에 P200 피펫을 사용하여 박테리아의 접종을 투여까지 그립니다. 그것은 열망과 최상의 결과를 얻으려면, 오버 플로우를 방지하기 위해 <100 μL의 볼륨을 사용합니다. 여기서, K. 2000 CFU / 50 μl를 사용 폐렴.
- 이소 플루 란 가스 (1 L / 분의 유량으로 예를 들면, 2 % 이소 플루 란)와 투명한 챔버 또는 instit 따라 마우스를 마취utional 가이드 라인. 함께 마취 된 마우스의 수는 실험자의 쾌적함 수준 한번에 전형적으로 1-2에 의해 결정된다. 호흡을 관찰하고 심호흡을 볼 수 있으며 2 ~ 3 초이 호흡 사이에 계산 될 수있다 일단 마취의 수준을 확인합니다.
주 : 휘발성 (흡입) 마취제 가능한 교란 영향에 대한 우려가있는 경우, 마취 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사로 대신 이루어질 수있다. 상술 한 방법에 깊은 마취는 몇 분 정도. 더 장기간 마취 유도되면, 안연고는 안구 건조를 방지하기 위해 사용되어야한다. - 마우스가 마취되면, 경사 플렉시 글라스 보드의 못 (그림 1) 사이에 뻗어 고무 밴드에서 상악 절치에 의해 중단 semirecumbent 부정사 위치에 놓습니다.
- 부드럽게 P200의 pipett와 구강에 무딘 비 래치의 집게 한 쌍의 예금 복용량 옆으로 마우스 혀를 당겨이자형. 혀 또는 구강 인두 하나에 외상을 유발하지 않도록 세심한주의를 운동.
- 수축 혀를 유지하면서 마우스를 흡입 할 때까지 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 코를 폐색. 마우스 둘 이상의 흡입제를 가지고 있으며, 어떠한 액체 구강 보이지까지 코를 덮도록 계속. 코를 커버하는 마우스는 의무적 코 숨을 쉬는만큼 마우스, 폐에 세균을 흡입 할 수 있도록하는 데 도움이됩니다.
- 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마우스가 마취에서 회복되는 동안 콧 구멍을 차단하는 침구 또는 파편을 방지하기 위해 뒷면에 마우스를 배치, 새장으로 돌아갑니다.
- 일단 모든 마우스는 투여 된 마취에서 해제 한 K. 투여 된 경우에만 마우스를 포함하는 칸막이 / 방에서 집 마우스 48 시간 게시물 감염을 넘어 경우 폐렴. 체중을 포함, 매일 쥐를 모니터링합니다.
- 마우스가 48을 넘어 할 수있는 경우 매일 매시 및 / 또는 보조 열을 사용하여시간.
3. 기관지 세척액 (BALF) 수집 및 분석
- 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 이 CO 2 흡입 자궁 전위와 관련된 폐 합병증을 피할 여기, 150 ㎎ / ㎏ 나트륨 펜토 바르 비탈 또는 방혈 다음에 상업 안락사 솔루션의 등가 선량의 독극물 주사를 사용합니다.
- 뒷면에 위치 마우스와 특히 가슴과 목 영역에 70 % 에탄올로 모피를 분사하여 마우스를 소독.
- 다음 집게로 흉골을 잡고, 바로 흉골 아래에 세로 컷을 확인, 닉은 폐를 허용 다이어프램은 흉강에 다시 가을. 기관을 노출, 혈관의 양쪽에 흉강을 통해 잘라 후 목을 통해입니다.
- 기관이 양쪽에 세로 근육으로 둘러싸여으로 조심스럽게 같이 중간의 실수로 측면에 조직을 밀어이 기관에 혈액을 소개 할 수있는 주변의 혈관을 절단 방지 할 수 있습니다. 혈관이 다친 경우, 이전 기관 루멘에 액세스하는 거즈와 주변 지역을 청소하십시오.
- 닉 기관 다운 헤드에서 길의 약 ¼을 수술 용 가위 또는 바늘을 사용하여 꼬리 쪽 기관에 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ml의 미리로드 1 mL의 주사기에 부착 된 캐 뉼러를 삽입한다. 사용 마우스는 연령이나 여성 8 주 <경우, 600-800 μL에 lavaging 볼륨을 줄일 수 있습니다.
- 모든 로브가 팽창하고 배를 반복, 주사기와 함께 다시 밖으로 볼륨을 풀 수 있도록 천천히 폐에 볼륨을 누릅니다. PBS는 콧 구멍에서 나오는 경우 캐 뉼러는 기관에 충분히 밀어되지 않았거나 인플레이션이 너무 빨리 발생한다. 폐이 잘 팽창되지 않은 경우 또는, 캐 뉼러 너무 멀리 밀어 된, 약간 철회.
- 얼음에 15 ML 튜브에서 풀링 세척를 수집합니다.
- 회전5 분 1,200 XG에 영공의 세척 유체는 1.5 ML 튜브에 뜨는 수집 및 -80 ° C에서 동결. 그 후, 단백질, 사이토 카인 등에 대한 다양한 생화학 적 분석의 측정에 뜨는 (즉, BALF)를 사용합니다. 펠렛은 기관지 공간에서 세포를 나타냅니다.
- 적혈구 (적혈구)의 색상에 기초하여 세포 펠렛에서 명백한 경우, 1X PBS 5ml를 첨가하여 1 분간 ACK 용해 완충액 1 ㎖로를 Lyse는 분해 반응을 중단하고 버퍼에 희석. ACK 용해 버퍼 처리 여부 역시 동일하게 모든 표본을 처리합니다.
- 스핀 셀을 5 분 동안 1,200 XG에서, 상청액을 가만히 따르다 및 1X PBS 1 ml의 세포를 가져온다.
- 총 영공 세포의 열거에 대한 혈구에 소용돌이 카운트 세포.
- 세포의 밀도를 바탕으로 (80 감염된 마우스 μL와 순진 마우스 ~ 150 ~)은 cytospin 원심 분리기에서 슬라이드 챔버에 약 80-150 μl를 추가합니다. 스핀 셀현미경 상으로의 세포 차동 인구를 결정하기 위해 다음 염색을 위해 슬라이드.
- 세포가 하룻밤 슬라이드에 건조하도록 허용합니다. 얼룩 얼룩 2 슬라이드를 정착의 7 배, 얼룩 1에서 9 번, 7 번 찍기로 트라이 얼룩 (예를 들어, 헤마 (3) [표 참조])와 세포 (얼룩 사이에 린스), 그리고 건조 할 수 있습니다. 얼룩 건조 후, 수동으로 커버 슬립 슬라이드 및 현미경에 의한 차이를 계산합니다. 일반적으로, 호중구 및 단핵 세포 / 대 식세포는 쉽게 크기 및 핵의 형태에 의해 구별된다.
4. 폐 및 주변 조직에 세균 부하 결정
- 시작하기 전에 : 폐와 비장에 대한 1X PBS 900 ㎕의 혈액에 대한 1X PBS의 90 μl를 희석 튜브를 준비합니다. 박테리아를 배양하고, 실온에서 설정 라벨 플레이트; 따라서, 조직이 수집 한 후 시간이 박테리아 성장을위한 균질화 및 도금 사이 최소화됩니다.
참고 : 인해 이종 deposi에흡인 발생할 수 있습니다 폐에 세균 기, 각각의 마우스는 총기도 세포 수 또는 총 (양자) 폐 세균 부담 중 하나의 분석을 위해 사용하는 것이 좋습니다. - 단계 3.1에 따라 마우스를 안락사이어서 응고를 방지하기 위하여 헤파린 튜브에 배치 좌심실로부터 혈액을 수집한다. 1X PBS 2 ㎖로 비장과 배치 제거하여 1X PBS 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 모든 폐 로브와 장소를 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 각 조직 / 마우스 사이의 에탄올로 악기를 청소주의하십시오.
- 바람직하게는, 각 샘플 사이에 변경 될 수 일회용 균질하여, 얼음 조직 균질화. 일회용 균질 팁 실험 사이의 재사용을 위해 멸균 할 수 있습니다.
- 조직이 균질화되면, 직렬 희석 및 플레이트를 수행합니다. 플라스틱에 분할 선을 그려서 하나의 TSA 접시에 중복 주어진 조직 / 희석의 플레이트 샘플. 도금 및 디lution 제안은 다음과 같습니다 (모든 경우에, 시료 10 μl를 접시에 퍼져)과 24 시간 후 감염 부검을 기반으로합니다. 48-72 시간 샘플을 분석하는 경우, 희석 더 많은 수의 나중 시점에서 세균 부담 증가로 인한 도금 될 필요가있다.
- 혈액 - 멸균 1X PBS의 90 μL에 혈액의 10 μl를 추가하여 1:10 희석. 플레이트 단정하고 중복 1:10 희석 샘플. 혈액이 도금 된 후 10 분 사이토 카인과 케모카인의 측정을 위해 플라즈마를 추출하기 위해, 9300 XG에 잔류 혈액을 회전.
- 직렬 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 폐의 100 μl를 추가하여 100 : 폐를 들어 - 1 - 1:10 희석. 플레이트 깔끔한 균질 중복의 모든 희석.
- 비장를 들어 1 - 희석 : 10-1 : (100)를 직렬로 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 비장의 100 μl를 추가하여. 플레이트 깔끔한 균질 중복 모두 희석.
- 확산 샘플을 간략하게 건조 할 수 있습니다. 밤새 정적 37 ° C 배양기에서 TSA 판과 장소를 반전.
- 상기 플레이트의 양측에서 각각 희석로부터 세균 콜로니를 평균하여 정착하고 박테리아의 수를 결정한다. 폐 5 mL 및 비장 2 ml의 초기 희석의 요인은 전체 조직 CFUs를 결정합니다.
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Representative Results
C57BL / 6 마우스 K. 2000 CFU에 감염되었다 폐에 인두 흡인을 통해 폐렴 43816 (혈청 형 2). 이 용량에서, 마우스는 일반적으로 임상 증상을 혼수, 프릴 모피, 및 5 ~ 10 % (그림 2A)의 체중 감소를 포함하여 12 ~ 24 시간 게시물 감염을 표시하기 시작합니다. 48 ~ 72 시간의 후 감염 내에서 마우스의 대부분은 일반적으로 감소 활동 구부리고 자세에서 20 %의 체중 감소 및 결과의 평균 앞에 자극에 응답을 감소 질병과 병적 증상을 보여줍니다. 오랜 기간의 연구는 K.의 낮은 복용량을 요구할 수있다 폐렴. K. 500 CFU 감염 폐렴 회수 및 체중 증가는 5-6 일 (도 2b)에 의해 처음 10-15 %의 중량 손실을 특징으로 3-5 D 감염 후 피킹 온화한 질병을 초래한다. 체중 드문 20 %의 중량 손실, 생존 종종 예측 인LY 복구와 관련.
숙주 반응의 최종 성공 가장 생쥐는 촉각 자극 및 / 또는 체중 감소를 최소화 응답으로서 사망 분석 징후, 10-14 일 동안 모니터링하고 (제도적으로 승인 된 가이드 라인에 따라) 안락사 상기 생존 연구에 의해 지시 될 수있다 > 20 %. 하나의 대조군 (도 2c) 중 50 % 치사 (즉, LD50 선량)와 가까운 감염 접종 물을 타겟팅하는 경우 생존 연구들은 가장 효과적이다. LD50 투여 량은 모두 상대적 증가의 검출을 허용하고 실험군 생존을 감소시켰다. 차동 생존하므로 여러 감염 량은 때때로 변경된 숙주 방어 표현형을 검출 할 필요가있을 수 있고, 접종 의존적 일 수있다.
K.와 하부 호흡기 감염 폐렴은 로이 크의 강력한 유입이 특징입니다기도로 ocytes. 기관지 폐포 세포 펠렛의 염색에 의한 면역 세포 열거 및 분화는 6 시간 후 감염 (그림 3A) 내기도 면역 세포의 증가를 보여줍니다. 호중구는기도 (그림 3A-B)의 주된 면역 세포 인 24 시간에 의해 세포 수의 봉우리. C57BL / 6 마우스의 두 남녀는 K.에 대한 응답으로 동등한기도 백혈구을 보여 24 시간 및 48 시간 게시물 감염 (도 3C-D)에서 폐렴.
세균성 폐렴은 로컬 (폐내) 및 사이토 카인과 케모카인을 포함한 전신 염증성 매개체를 유도한다. 로컬 사이토킨 / 케모카인의 농도는 통상의 ELISA와 BALF 또는 사이토킨 다중화 시스템을 사용하여 검출 할 수있다. IL-6, RANTES, TNFα, G-CSF 등을 포함하여 사이토 카인은 K.으로 모두 24 시간 및 48 시간 후 감염에서을 감지 할 수 있습니다 폐렴과 LUN에 대한 통찰력을 제공g의 미세 환경과 면역 세포의 모집 (그림 4).
폐, 혈액, 및 비장 등의 말초 조직 (들)의 컬렉션은 모두 미생물의 지역 폐 통관뿐만 아니라 박테리아의 폐외 보급에 대한 통찰력을 제공하고, 조직 세균 부하의 정량 수 있습니다. 직렬 희석 및 폐의 배양은 24 시간과 48 시간 포스트 감염 (그림 5A) 사이의 미생물 부담의 확장을 보여줍니다. 비슷한 연구 결과는 혈액과 비장 (- C도 5b)에 설명되어 있습니다. 참고로, 바이 모달 세균 부담없이 표시, 심지어 폐에서 고급 세균 부담에도 불구하고, 일부 고급 세균 확산을 갖는 마우스, 다른 사람과, 24 시간 후 감염에서 혈액과 비장에 알 수있다 혈액 또는 비장에서 검출 세균. K. C57BL / 6 마우스에서 폐렴 박테리아 부하가 gend되지 않습니다어 특정 남성과 여성이 다양한 조직 후 접종 (그림 5D-F)에 상응하는 부담을 보여으로,.
그림 1 :. 마우스의 흡인 폐렴 절차 보드 쥐를 공부 두 개의 못은 플렉시 유리 또는 이와 유사한 보드에 장착 사이에 고무 밴드가 뻗어에서 앞니에 의해 일시 중지, 머리를 다시 보드 (즉, semirecumbent)에, 위치한다.
그림 2 : 체중 감소 및 평가는 병적 K.의 폐 흡인에 따라 폐렴. C57BL / 6 마우스 (N = 조건 당 10 ~ 20)는 K.의 흡입에 의해 감염 폐렴 43816 (혈청 형 2). (A) 2,000 CFU에 감염된 마우스에서 매일 무게, 인덱스하기 위해 사전에 감염 무게. 본 연구에서는 더 마우스는 500 CFU (150)에서 하루 (5) (C) 생존 곡선을 시작 체중으로의 전환과 함께 4 일 후 감염을 통해 매일 체중 감소 500 CFU 결과와 과거 일 6 (B) 감염을 살아 없다 CFU, 2000 집락 형성 단위 (CFU) 감염은 500 CFU는 LD50에 근접 것을 나타내는. 패널 A와 B의 데이터는 평균 ± SEM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : K.와 감염 폐렴은 시간에 따른기도 백혈구 증가증에 결과. C57BL / 6 마우스 K. 2000 CFU와 폐내 감염을 받았다 폐렴다양한 시간에 영공 유체의 총 백혈구 (WBC), 호중구 (PMN), 및 대 식세포 (Mφ)의 전자. (A) 열거 후 감염을 가리 킵니다. 염색시 백혈구 및 대 식세포 (B)는 쉽게 cytospin 분야에서 핵의 형태와 크기에 의해 식별되고 계산 될 수있다. (C - D) 남성과 여성의 감염은 24 시간과 48 시간 게시물 감염에서 모집 염증 세포의 비슷한 숫자가 발생합니다. 데이터는 평균 ± SEM을 조건에 따라 6-25 / 마우스에서 파생하고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 사이토 카인과 케모카인은 세균 감염에 대한 응답으로 영공에 유도 C57BL / 6 마우스 intrapulmon을 받았다K. 2000 CFU와 진 감염 폐렴. BALF 사이토 카인과 케모카인은 24 시간과 48 시간 게시물 감염에서 다중 분석에 의해 정량화 하였다. 데이터가 5-15 마우스 / 조건에서 파생 ± SEM 의미입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 폐렴 C57BL 동안 폐 및 주변 조직에 세균 부담의 시간에 따른 확장 / 6 마우스는 K. 2000 CFU와 폐내 감염을 받았다 폐렴. (A) 폐 실질 세균 부담 TSA 24 시간 및 48 시간의 감염 후 폐에서 균질의 연속 희석을 도금함으로써 측정 하였다. (B)의 혈류 (C) 비장 세균 부담 마찬가지로 정량 하였다. (
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Discussion
세균성 폐렴의 쥐 모델은 폐 호스트 방어 반응에 중요한 통찰력을 제공하고, 유전자 타겟팅 및 생체 생물학 및 약리학 적 개입에 협력. 위대한 진보는 감염된 영공 10, 11에 호중구 모집을 지배하는 케모카인 및 접착 분자에 대한 우리의 이해에 특히되었습니다. 폐렴의 생체 모델을, 셀 기반 또는 대체 접근 방식과는 달리, 또한 내분비에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다 감염된 폐 및 간 (급성 위상 응답)과 같은 다른 기관 사이에 발생하는 통신 (12)와 부신 (스트레스 글루코 코르티코이드) 13. 마지막으로, 생체 폐렴 모델에 의해 밝혀 중요한 임상 적 관련성이 높은 점은 성공적인 병원체 간격이 호스트의 성공에 동등하지 않다는 것이다. 많은 경우에서, overexuberant 면역 반응은 호스트의 죽음의 원인때문에 심지어는 성공 병원체 통관 8, 14의 얼굴에 과도한 와키 폐 손상에. 이 주어 병원균 클리어런스 및 면역 반응의 평행 한 측정은 일반적으로 가장 유익하고 생존 연구 궁극적 호스트 통합 복원력을 표시해야한다.
여기서, 우리는 흡입을 통해 쥐의 폐에 박테리아의 전달을위한 간단하고 비 침습적 방법을 설명 하였다. 에어로졸에 비해,이 방법은 연구 인력의 호흡기 노출에 대한 낮은 위험을 운반 깊은 폐에 더 집중 접종 전달을 위해 제공하고, 눈과 상부 호흡기 면역 반응에 의해 잠재적 인 혼란을 방지 할 수 있습니다. 비내 접종은 중추 신경계 (4)의 국부적 침습 감염의 가능성을 포함하여, 상부기도 감염의 잠재적 교란 우려를 운반하고, 또한 폐 매우 가변적 접종 될 것으로보고되었다5. 경구 또는 경피 경로 중 하나를 통해 기관 내 삽관에 비해,이 방법은 최소의 훈련을 요구한다 (~ 1 마우스 당 분) 적어도 후자의 방법에 비해, 그리고, 하부 이환율을 가지고 더 빠르다. 다른 방법으로 공유하는 일부 - - 인두 흡인 방법의 잠재적 인 단점은 직접 일반 마취에 대한 요구 사항 (즉, 비대칭 및 이기종) 병원체 전달 누덕 누덕 기운의 확률, 하부 돌출부 (15)의 주된 감염과 무능력을 포함 하나의 폐에 일방적으로 병원균. 때문에 흡인 (도시되지 않은 데이터) 후 폐에 누덕 누덕 기운 분포 - 에어로졸 (15)를 제외한 모든 폐 감염 방법과 발생하는 결과는 - 우리가 일반적으로 감염된 쥐에 일방적 인 폐 분석을 수행하지 않습니다. 양쪽 폐 어느 면역 반응을 평가하기 위해 서로를 세척하거나 풀링 세균 정량적 함께 부검itation 및 / 또는 분자량 분석 (예를 들어, 유전자 발현, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 분석, 시토 킨 ELISA). 프로토콜의 특히 중요한 단계는 단계 1.8 OD 600 -confirming 있습니다 생체 내 감염 이전에 CFU / mL의 관계를 또한 모든 실험에서 도금을 통해 접종 농도를 확인하는 단계; 뿐만 아니라 단계 3.6 - 주사기에 좋은 볼륨 수익률과기도의 비 외상성 세척을 보장합니다.
구강 식물 (즉, polymicrobial 폐렴)와 공동 감염이 이론적 인 문제이지만, 우리는 K.에 감염된 쥐의 폐 균질에서 다형성 세균성 식민지가 발생하지 않은 폐렴 또는 S. 폐렴. 원하는 경우, 이러한 가능성에 대해 우려 수사관 그러나 대조군 마우스는 흡입 차량 (즉, 버퍼)에 노출 될 수있다. (잔류 unaspirated 박테리아 삼키는를 통해) 위 루멘의 일부 오염 가능 재치는 있지만시간 우리가 설명하는 방법은, 우리는 위장 임상 증상 또는 중대한 병리에 변화가 발생 적이 없다. 또한,이 가능성은 에어로졸 및 비강 방법에 공통적이며, 심지어는 기관 내 접종 방법 기침 다음 발생할 수있다.
어떤 방법 론적 문제는 모든 폐렴 모델에 보편적이다. 제어 및 실험 쥐 그룹은 연령 일치 서로 2 ~ 3 주 내에 이상적으로해야한다. 우리는 K.에서 병원균 통관 또는기도 염증의 명백한 성별 차이를 발견하지 않았습니다 있지만 선천성 면역 반응에서 남녀 간의 유의 한 차이가 16보고 된 바와 같이 폐렴 모델, 마우스, 성별 일치해야합니다. 제어 마우스의 기원에 대한주의 깊은 고려가 주어져야한다. 한배의 새끼 컨트롤은 불완전 교잡, 면역 세포 집단에서 마이크로 바이 옴과 관련된 차이 및 기타 epigenet 상업적으로 구입 한 컨트롤을 통해 일반적으로 바람직하다IC 차이 면역 반응 (17, 18)에 영향을 미칠 수있는 모든 가능한 교란 변수이다. 세심한주의가 특정 혈청 형에 부여해야하며, 독성 상당한 차이로 감염 세균의 배양 역사를 볼 수있다. K. 우리의 경험을 바탕으로 폐렴, 우리는 접종 감염의 범위를 사용하여 초기 파일럿 연구를 수행하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 500 ~ 2,000 CFU) 문헌에보고 특정 세균 용량의 이환율 / 사망률으로 - 심지어 같은 박테리아 혈청 형 및 마우스 변형에 - 잘 번역하지 않을 수 있습니다 자신의 실험실 가능성에 대한 기술적 차이의 다양한. 염증 및 호스트 방어의 결과에 제어 및 실험 쥐 사이의 그룹 간 차이가 접종에 의존 할 수있다. 때문에 동물 사육 및 인력의 물류 현실에, 우리는 종종 실험 그룹 당 5-6 생쥐로 실험을 실시하고 있습니다. 이 가끔 CF에 적합한 통계 전력을 제공하지만U 셀 카운트 결과가 우리가 흔히 충분한 전력을 달성하기 위해이 크기의 하나 이상의 시간 연구를 반복 할 필요가 있음을 발견.
주어진 실험에서 일부 마우스의 경우, 혈액과 비장에서 검출 가능한 박테리아의 성장은 24 시간 후 감염 (그림 5)가 발생 할 수 없습니다. 우리는 24 시간이 검출 폐외의 보급을위한 운동 임계 값 근처에있을 수 있습니다 것을 나타 내기 위해서 (때문에)이 해석한다. 혈액 / 비장 낮은 / 탐지 성장이 관찰되는 경우, 동일한 마우스에서 폐 CFUs 항상 기술 오류의 가능성을 해결하기 위해 조사되어야한다 (즉, 아마도 마우스 투여에 오류를 나타내는 매우 낮은 / 탐지 폐 감염).
마지막으로, 마우스에서의 세균성 폐렴 인두 흡입 전달 방법은 비용, 교육 및 장비의 관점으로부터 취득 비교적 용이 강력한 기술이다 심지어 광범위한없이 전문 실험실 현실적인폐 절차입니다. 이 방법은 쉽게 숙주 방어 반응의 하류 미생물과 면역 분석법에 연결되고, 또한 비 부식성 노출 광범위한 폐 전달 방법으로서 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
