Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Summary

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Abstract

Aunque la neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo un problema importante de salud pública, los modelos murinos de neumonía bacteriana han facilitado recientemente importantes avances preclínicos en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular subyacente. En vivo modelos de ratón capturan la fisiología integrada y capacidad de recuperación de la respuesta de defensa del huésped en de una manera no reveló por enfoques alternativos, simplificados ex vivo. Varios métodos han sido descritos en la literatura para la inoculación intrapulmonar de bacterias en ratones, incluyendo la aerosolización, la administración intranasal, la canulación endotraqueal peroral en condiciones "ciego" y visualizados, y la canulación endotraqueal transcutánea. Todos los métodos tienen ventajas relativas y limitaciones. En este documento, se describe en detalle un método no invasivo, técnicamente no intensiva, barato y rápido para la entrega intratraqueal de bacterias que consiste en la aspiración (es decir, inhalación) por el ratónde un inóculo infeccioso pipeteó en la orofaringe, mientras que bajo anestesia general. Este método se puede utilizar para la administración pulmonar de una amplia variedad de agentes biológicos y químicos no cáusticos, y es relativamente fácil de aprender, incluso para los laboratorios con experiencia previa mínima con procedimientos pulmonares. Además de describir el método de la neumonía por aspiración, también ofrecemos procedimientos paso a paso para ensayar la posterior in vivo la respuesta inmune innata pulmonar del ratón, en particular, los métodos para cuantificar la eliminación de bacterias y la respuesta inmune celular de las vías respiratorias infectadas. Este enfoque integrado y sencillo de evaluación neumonía permite la evaluación rápida y robusta de los efectos de las manipulaciones genéticas y ambientales en la inmunidad innata pulmonar.

Introduction

Neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo la causa principal de muerte por infección en los EE.UU., con poco cambio en las tasas de mortalidad en los últimos 40 años a pesar de las mejoras en la vacunación y estrategias de antibióticos ^1,2. A pesar de la falta de progresos importantes en el ámbito de la salud pública, en los últimos años dramáticos avances se han hecho en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular de la neumonía, con muchos de estos avances hechos posibles por el uso de modelos de ratón de infección pulmonar. La trazabilidad genética del ratón, la similitud de la murina y el sistema inmunológico humano, y la gran variedad de reactivos inmunológicos murinos-dirigida que se han convertido en disponible en el mercado en su conjunto han facilitado el rápido progreso del campo.

Los modelos de ratón de la neumonía bacteriana descrita en la literatura en general, se han basado en una de las cuatro rutas técnicas para la inoculación de patógenos: i) aerosolización; ii) intrAnasal entrega; iii) la entrega por vía oral; y iv) la inyección intratraqueal quirúrgico (es decir, traqueotomía) ^3. Todas las vías de infección tienen ventajas y desventajas ^3. En particular, la exposición, relativa de la vía aérea superior, el potencial para la mezcla de la flora oronasales, los requisitos para la anestesia general, la variabilidad del inóculo entregado al pulmón distal, distribución lobular de los patógenos entregados, los requisitos de pericia técnica, y la morbilidad de procedimiento varían ampliamente entre éstos enfoques.

Comúnmente usadas técnicas de infección perorales incluyen endotraqueal canulación (translaríngea), ya sea a través de un enfoque "a ciegas" (no visualizado), o bajo visualización directa de la laringe ^3-5. Ambos métodos, mientras robusto, requieren una formación sustancial y también conllevan un riesgo de traumatismo en la vía aérea superior. En el presente informe se describe un método técnicamente no intensiva, no invasiva, barata y rápida de la infección por vía oral, wdeclara bacterias (Klebsiella pneumoniae en el ejemplo proporcionado) pipetearon en la orofaringe de un ratón anestesiado se entregan a los pulmones a través de aspiración (es decir, la inhalación). Nosotros y otros han utilizado la técnica de la neumonía por aspiración con éxito ^6-9. Este método de pulmón de entrega versátil y fácil de aprender puede extenderse a la entrega de muchos agentes no cáusticos adicionales a los pulmones, incluyendo citoquinas y otras proteínas, moléculas asociados a patógenos (por ejemplo, lipopolisacáridos), células (es decir, la transferencia adoptiva), y toxinas (por ejemplo, bleomicina). Además de discutir las consideraciones técnicas importantes, como la descripción de un enfoque integrado, cuantitativo para evaluar la respuesta del huésped después de la neumonía, incluyendo la medición aguas abajo de la eliminación de bacterias (es decir, unidades formadoras de colonias [UFC] cuantificación de los órganos pulmonares y periféricos) y leucocitos acumulación en el espacio aéreo.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública de Estados Unidos sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio después de la revisión por el Cuidado de Animales y el empleo del NIEHS.

1. Preparación de K. pneumoniae Cultura

Precaución: Realizar todos los pasos del 2 campana (BSL2) nivel de bioseguridad u otra área designada BSL2 y desechar los residuos según las pautas BSL2 instituto.

1. Para el crecimiento suspensión de K. pneumoniae, descongelar un stock de glicerol de bacterias y inocular un cultivo de trabajo mediante la transferencia de 1 ml de K. pneumoniae acciones a 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB) en un 500 ml o más grande matraz.
2. Hacer reservas de glicerina mediante la adición de 900 l de registro de la fase cultivaron K. pneumoniae a 100 l de glicerol estéril y congelar a -20 ° C o -80 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda -80 ° C.
3. bacterias del cultivo de sTEP 1.1 por matraz de agitación durante la noche (14 - 18 horas) a 37 ° C a 200-225 rpm.In fin de promover el crecimiento de fase logarítmica, diluir 1-5 ml de este cultivo durante la noche en un matraz que contenía 50 ml de TSB por la mañana y el lugar de nuevo a 37 ° C con agitación durante ~ 2,5 h.
4. Transferir 1 ml de K. cultura pneumoniae de la última etapa en un tubo de 1,5 ml y centrifugado a 7500 xg durante 2 min. Una pastilla blanca debe ser visible. Extraer el sobrenadante sin perturbar el sedimento, resuspender suavemente las bacterias con la pipeta en 1 ml de solución salina estéril, y girar de nuevo a 7500 x g durante 2 min.
   1. Realice este paso de lavado 2x, con lo que el sedimento final, se lavaron en 1 ml de solución salina estéril.
5. Realizar diluciones seriadas log-sabia de este inóculo ordenada. Por ejemplo, añadir 400 l de inóculo en 3,6 ml de solución salina estéril en serie para hacer una serie 10 ^-1 -10 ^-9 dilución.
6. Determinar la densidad óptica de ₆₀₀ K. lavada pneumoniae mediante la colocación de 1 ml de la01:10 y 1: 100 diluciones en cubetas desechables y midiendo la OD _600, blanking primero con solución salina estéril. Medir duplicados para garantizar la precisión. Un OD ₆₀₀ de 1,0 es aproximadamente equivalente a 4-7 x 10 ⁸ UFC / ml. Tenga en cuenta que la relación entre OD y CFU / ml puede no ser lineal.
   1. Utilice el OD ₆₀₀ de las diluciones para calcular la concentración de K. pneumoniae, la aplicación de la OD: conversión de UFC / ml de arriba, y el factoring en la dilución.
7. Utilice la K. concentración pneumoniae para preparar la dosis de inóculo CFU deseado en un <100 l de volumen para la entrega a los ratones (véase más adelante).
8. También la placa 100 l de 10 ^-6 -10 ^-9 diluciones y 100 l de solución salina estéril en placas de agar individuales de soja tríptico (TSA) a TA. Incubar a 37 ° C durante la noche y enumerar las colonias de bacterias con el fin de calcular la concentración exacta que se utilizó en el experimento y para controlar la contaminación.
   NOTA: concentración bacteriana real de inóculo final puede ser de ± 500 UFC / ml que se predijo por absorbancia. Los experimentadores deben confirmar idealmente el OD _600: / ml CFU relación en estudios piloto antes de su uso in vivo en ratones, empíricamente el reajuste de la DO _600: UFC conversión / ml en base a su experiencia personal.

2. murino intratraqueal (it) La aspiración de K. pneumoniae en Orofaringe

1. Asegurar que los ratones se identifica de forma exclusiva por la marca de cola, tatuaje, u otro identificador aprobado.
2. Elaborar dosificación inóculo de bacterias usando la pipeta P200 antes de retirar los ratones de isoflurano con el fin de agilizar el procedimiento. Para obtener los mejores resultados con ella aspiración, utilizar un volumen de 100 l <para evitar desbordamiento. En este documento, utilizar 2000 UFC / l de 50 K. pneumoniae.
3. Anestesiar los ratones en una cámara transparente con gas isoflurano (por ejemplo, 2% de isoflurano a un caudal de 1 L / min) o según Institdirectrices utional. El número de ratones para anestesiar juntos se determina por el nivel de comodidad del experimentador, típicamente 1 a 2 a la vez. Observar la respiración y el nivel de anestesia confirmar una vez respiraciones profundas son visibles y 2-3 seg pueden contarse entre las respiraciones.
   NOTA: Si existe la preocupación acerca de los posibles efectos de confusión de los anestésicos volátiles (inhalados), la anestesia puede lograrse en lugar de la inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina. Con el método descrito anteriormente, la anestesia profundas sólo dura unos minutos. Si se induce la anestesia más prolongada, pomada para los ojos debe ser utilizado para prevenir la desecación ocular.
4. Una vez que se anestesia ratón, coloque en una posición supina semisentada, suspendido por los incisivos superiores de una banda de goma estirada entre las clavijas en un tablero inclinado plexiglás (Figura 1).
5. Tire suavemente de la lengüeta del ratón a un lado con un par de pinzas no camellones romos y la dosis de depósito en la cavidad oral con una pipetee P200mi. Tenga mucho cuidado para evitar la inducción de un trauma ya sea a la lengua o la orofaringe.
6. Mientras se mantiene la lengua retraída, ocluir suavemente la nariz con un dedo enguantado hasta que inhala el ratón. Continúe cubriendo la nariz hasta que el ratón ha tomado dos o más inhalaciones, y el líquido no es visible en la cavidad oral. Cubrir la nariz ayuda a asegurar que el ratón se inhalan las bacterias en los pulmones, ya que los ratones son respiradores nasales obligados.
7. Retire el ratón de la placa de la inoculación y volver a su jaula, colocando el puntero del ratón sobre su espalda para evitar que la ropa de cama o escombros bloqueen las fosas nasales mientras que el ratón se está recuperando de la anestesia.
8. Una vez que todos los ratones han sido dosificados y han despertado de la anestesia, los ratones domésticos en un cubículo / habitación que contienen sólo los ratones que han sido dosificados con K. pneumoniae. Monitorear los ratones diariamente, incluyendo los pesos corporales, si se va más allá de 48 horas después de la infección.
9. Use puré diario y / o calor suplementario si lo que permite a los ratones para ir más allá de 48hora

3. Lavado broncoalveolar fluido (BALF) Recogida y análisis

1. La eutanasia a los ratones acuerdo con la normativa. Aquí, utilizar una inyección letal de 150 mg / kg de pentobarbital sódico o dosis equivalente de solución de eutanasia comercial seguido por desangramiento, ya que esto evita posibles complicaciones a los pulmones asociadas con inhalación de _CO2 y dislocación cervical.
2. Posición del ratón en la parte posterior del ratón y esterilizar mediante pulverización de piel con 70% de etanol sobre todo en la zona del pecho y el cuello.
3. Haga un corte longitudinal justo debajo del esternón, a continuación, sostiene el esternón con fórceps, mella del diafragma, lo que permite que el pulmón se vuelven a caer en la cavidad torácica. Cortar a través de la cavidad del pecho a cada lado de la vasculatura y luego hacia arriba a través del cuello, exponiendo la tráquea.
4. A medida que la tráquea está rodeada de músculos longitudinales a cada lado, cortar con cuidado por el medio y empujar el tejido hacia los lados, comoesto evita el corte de la vasculatura circundante, que podría introducir sangre en la tráquea. Si se mella la vasculatura, limpiar la zona de los alrededores con una gasa antes de acceder a la luz traqueal.
5. Use las tijeras quirúrgicas o una aguja para nick la tráquea alrededor de ¼ del camino hacia abajo desde la cabeza e insertar una cánula unida a una jeringa de 1 ml precargada con 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) caudalmente en la tráquea. Si utilizan ratones <8 semanas de edad o hembras, reducir el volumen lavaging a 600-800 l.
6. Empuje el volumen en el pulmón lentamente, permitiendo que todos los lóbulos para inflar y luego tirar el volumen de vuelta con la jeringa, repetir 3 veces. Si PBS está saliendo de las ventanas de la nariz de la cánula no se ha introducido lo suficiente en la tráquea o la inflación está ocurriendo demasiado rápido. Alternativamente, si los pulmones no están inflando así, la cánula ha sido empujado demasiado lejos, por lo que retirar ligeramente.
7. Recoger lavados combinados en un tubo de 15 ml en hielo.
8. Girarel líquido de lavado del espacio aéreo a 1200 xg durante 5 min, recoger el líquido sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y se congela a -80 ° C. Posteriormente, utilizar el sobrenadante (es decir, BALF) para la medición de proteínas, citoquinas, y para varios otros ensayos bioquímicos. El sedimento representa las células de el espacio broncoalveolar.
9. Si los glóbulos rojos (GR) son evidentes en el sedimento de células basada en el color, se lisan con 1 ml de tampón de lisis ACK de 1 min seguido de la adición de 5 ml de PBS 1x para detener la reacción de lisis y diluir la memoria intermedia. Manipular todas las muestras de forma idéntica, ya sea tratada o no con tampón de lisis ACK.
10. Centrifugar las células a 1200 xg durante 5 minutos, decantar el sobrenadante, y traer las células en 1 ml de PBS 1x.
11. células de vórtice y cuentan con un hemocitómetro para el recuento de células totales del espacio aéreo.
12. Sobre la base de la densidad de las células de añadir aproximadamente 80-150 l (~ 80 l para un ratón infectado y ~ 150 para un ratón ingenuo) a una cámara de diapositivas en una centrífuga cytospin. celda de hilados en portaobjetos para la tinción posterior para determinar las poblaciones de células diferenciales.
13. Permiten que las células se sequen en las diapositivas durante la noche. Las células se tiñen con tri-manchas (por ejemplo, Hema 3 [ver tabla]) sumergiendo los portaobjetos 7 veces en fijador, 9 veces en la mancha 1, y 7 veces en la mancha 2 (sin enjuagues entre las manchas), y dejar secar. Después de mancha se ha secado, se desliza manualmente cubreobjetos y cuentan diferenciales por microscopio. En general, los neutrófilos y los monocitos / macrófagos se distinguen fácilmente por su tamaño y la morfología nuclear.

4. Determinación de la carga bacteriana en el pulmón y los tejidos periféricos

1. Antes de comenzar: preparar tubos de dilución con 900 l de PBS 1x para pulmón y el bazo y 90 l de PBS 1x para la sangre. Las placas de identificación para el cultivo de bacterias y fijados a temperatura ambiente; Por lo tanto, el tiempo una vez que el tejido que se ha recogido se reducirán al mínimo entre la homogeneización y de las planchas para el crecimiento bacteriano.
   Nota: Debido a la heterogeneidad deposición de bacterias en los pulmones que pueden ocurrir con la aspiración, se recomienda que los ratones individuales se utilizaron para el análisis de cualquiera de las vías respiratorias celularidad, total o la carga bacteriana (bilateral) pulmonar total.
2. La eutanasia el ratón como en el paso 3.1 y posteriormente recoger la sangre desde el ventrículo izquierdo, colocando en un tubo heparinizado para evitar la coagulación. Retirar todos los lóbulos pulmonares y lugar en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de 1 x PBS, seguido de la eliminación del bazo y la colocación en 2 ml de 1x PBS. Colocar los tubos en hielo. Tenga cuidado de limpiar los instrumentos con etanol entre cada tejido / ratón.
3. Homogeneizar el tejido en hielo, de preferencia con homogeneizadores desechables que se pueden cambiar entre cada muestra. consejos homogeneizador desechables pueden ser esterilizados en autoclave para su reutilización entre los experimentos.
4. Una vez que el tejido ha sido homogeneizada, realizar diluciones seriadas y placa. Las muestras de placa de un tejido / dilución dada por duplicado en una sola placa de TSA al trazar una línea divisoria en el plástico. Galvanoplastia y disugerencias Lution se muestran a continuación (en todos los casos, 10 l de muestra se extiende sobre la placa) y se basan en un 24 hr necropsia post-infección. Si el análisis de muestras de 48-72 hr, puede necesitar ser chapado debido al aumento de la carga bacteriana en puntos de tiempo posteriores a un mayor número de diluciones.
   1. Por Sangre - diluir 1:10 añadiendo 10 l de sangre en 90 l de PBS estéril 1x. Placa ordenada y 1:10 muestras diluidas por duplicado. Una vez que la sangre ha sido chapado, girar la sangre residual a 9.300 xg durante 10 min para extraer plasma para la medición de citocinas y quimiocinas.
   2. Para pulmón - diluir 1:10 - 1: 100 añadiendo 100 l de homogeneizado de pulmón en 900 l de PBS estéril 1x en serie. Placa ordenada homogeneizado y todas las diluciones por duplicado.
   3. Para Bazo - diluir 1: 10-1: 100 mediante la adición de 100 l de bazo homogeneizado en 900 l de PBS estéril 1x en serie. Placa ordenada homogeneizado y las dos diluciones por duplicado.
5. Dejar que las muestras se sequen propagación brevemente. Invertir placas TSA y el lugar de forma estática a 37ºC durante la noche.
6. Determinar el número de bacterias que colonizan el promedio de las colonias bacterianas de ambos lados de la placa y de cada dilución. Factor en las diluciones iniciales de 5 ml para los pulmones y el bazo 2 ml para determinar las UFC total del tejido.

Representative Results

C57BL / 6 ratones fueron infectados con 2000 UFC de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2) a través de la aspiración orofaríngea en los pulmones. A esta dosis, los ratones normalmente comienzan a mostrar síntomas clínicos 12-24 horas después de la infección, incluyendo letargo, pelo erizado, y la pérdida de peso del 5-10% (Figura 2). Dentro de 48-72 horas después de la infección, muchos de los ratones muestran síntomas de la enfermedad y la morbilidad que por lo general es precedida por un promedio de pérdida de peso del 20% y los resultados en posturas encorvadas con disminución de la actividad y la disminución de la respuesta a la estimulación. Los estudios de mayor duración pueden requerir una dosis más baja de K. pneumoniae. La infección con 500 UFC de K. pneumoniae resulta en la enfermedad más leve alcanzando un máximo de 3-5 d después de la infección que se caracteriza por una pérdida de peso de 10 a 15% con la recuperación y el aumento de peso por día a partir de 5-6 (Figura 2B). El peso corporal suele ser predictivos de la supervivencia, con una pérdida de peso del 20% raraLy asociado con la recuperación.

El éxito final de la respuesta del huésped puede ser el más indicado por los estudios de supervivencia, en el que los ratones son monitoreados durante 10-14 días y sacrificados (según las directrices aprobadas institucionalmente) para detectar signos de moribundity, tales como la capacidad de respuesta mínima a la estimulación táctil y / o pérdida de peso > 20%. Estudios de supervivencia son a menudo más eficaz si uno se dirige a un inóculo infectante que se aproxima a 50% de letalidad (es decir, dosis LD50) en el grupo control (Figura 2C). Una dosis DL50 permite la detección de ambos relativamente aumento y disminución de la supervivencia en el grupo experimental. la supervivencia diferencial de inóculo puede ser dependiente, por lo que varias dosis de infección a veces pueden ser necesarias para detectar un fenotipo alterado la defensa del huésped.

Infección del tracto respiratorio inferior con K. pneumoniae se caracteriza por una robusta afluencia de leukocytes en la vía aérea. Enumeración de células inmunes y la diferenciación de tinción de los pellet de células BAL demuestra un aumento en las células inmunes dentro de las vías respiratorias 6h después de la infección (Figura 3A). Picos celularidad por 24 hr, con neutrófilos siendo la célula inmune predominante en la vía aérea (Figura 3A-B). Ambos sexos de ratones C57BL / 6 demuestran leucocitosis vía aérea equivalente en respuesta a K. pneumoniae a las 24 horas y 48 horas después de la infección (Figuras 3C-D).

La neumonía bacteriana induce local (intrapulmonar) y mediadores pro-inflamatorios sistémicos, que incluyen citocinas y quimiocinas. Los niveles de citocinas / quimiocinas locales pueden ser detectados en el BALF con un ELISA convencional o mediante el uso de un sistema de citoquinas multiplex. Las citoquinas incluyendo IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, y otros son detectables tanto a las 24 horas y 48 horas después de la infección por K. pneumoniae y dar una idea de la lung microambiente y el reclutamiento de células inmunes (Figura 4).

Colección de pulmón, la sangre y el tejido periférico (s), tales como el bazo permite la cuantificación de la carga bacteriana del tejido, proporcionando información sobre tanto aclaramiento pulmonar local de los microbios así como la difusión de las bacterias extrapulmonar. Dilución en serie y cultivo de pulmón demuestra la expansión de la carga microbiana entre 24 hr y 48 hr después de la infección (Figura 5A). Similares resultados se observan en la sangre y el bazo (Figura 5B - C). Es de destacar que una carga bacteriana bimodal puede observarse en la sangre y el bazo a las 24 horas después de la infección, con algunos ratones que tienen diseminación bacteriana de alto grado, y otros, incluso en la cara de la carga bacteriana de alto grado en el pulmón, se presentan sin bacterias detectables en la sangre o el bazo. K. pneumoniae carga bacteriana en ratones C57BL / 6 no se gend-er específica, como machos y hembras demuestran carga equivalente en diversos tejidos después de la inoculación (Figura 5D-F).

Figura 1:. Junta Procedimiento para la neumonía por aspiración en ratones Estudio de los ratones se colocan, cabeza arriba y volver a la junta (es decir, semisentada), suspendido por los incisivos de una banda de goma estirada entre dos clavijas montadas en un plexiglás o tableros similares.

Figura 2: Evaluación de la pérdida de peso y morbilidad pulmonar Tras aspiración de K. / 6 ratones pneumoniae. C57BL (N = 10-20 por condición) estaban infectados por la aspiración de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2). (A) Pesos diarios, indexada peso comprobar la validez de la infección, a partir de ratones infectados con 2000 UFC. En este estudio, sin ratones sobrevivieron pasado día 6. Infección (B) con 500 CFU resultados en la pérdida de peso todos los días hasta el día 4 después de la infección con una transición hacia el aumento de peso que comienza el día 5. curvas (C) Supervivencia de 150 UFC, 500 CFU, y las infecciones de 2000 de formación de colonias (UFC) de la unidad, lo que indica que 500 CFU se aproxima a la LD50. Los datos en los paneles A y B son la media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La infección por K. pneumoniae resultados en tiempo-dependiente de las vías respiratorias leucocitosis. C57BL / 6 ratones se les dio la infección intrapulmonar con 2.000 UFC de K. neumoníae. (A) Recuento de leucocitos totales (WBC), neutrófilos (PMN) y macrófagos (Mφ) en el líquido del espacio aéreo en varios puntos de tiempo después de la infección. (B) En el momento de tinción, los PMN y macrófagos pueden ser fácilmente identificados por la morfología y el tamaño nuclear en campos Cytospin y contó. (C - D) Infección en hombres y mujeres se traduce en un número similar de células inflamatorias reclutadas a las 24 horas post-infección y 48 hr. Los datos se derivan de 6-25 / ratones por condición y son la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: citocinas y quimiocinas son inducidas en el espacio aéreo en respuesta a la infección bacteriana ratones C57BL / 6 se les dio intrapulmon.infección ary con 2000 UFC de K. pneumoniae. citocinas y quimiocinas BALF se cuantificaron mediante un ensayo multiplex a las 24 horas y después de la infección de 48 h. Los datos se derivan 5-15 ratones / condición y son la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5:. Expansión dependiente del tiempo de la carga bacteriana en el pulmón y periféricos tejidos durante la neumonía ratones C57BL / 6 se les dio la infección intrapulmonar con 2000 UFC de K. pneumoniae. parénquima carga bacteriana (A) pulmonar se midió mediante siembra de diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón en TSA 24 horas después de la infección y 48 horas. (B) del torrente sanguíneo y (C) la carga bacteriana del bazo fueron cuantificados de manera similar. ( F) la carga bacteriana en diversos tejidos es equivalente en ratones macho y hembra después de la inducción de la neumonía. Los datos se derivan de 10 ratones / condición y son la media ± SEM. Los valores de cero en los paneles B, C, E, y F se les asignó un valor de 0,1 para permitir la representación gráfica en una escala logarítmica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los modelos murinos de neumonía bacteriana, se asociaron con la orientación de genes y en las intervenciones biológicas y farmacológicas in vivo, han proporcionado una perspectiva crítica en la respuesta de defensa del huésped pulmonar. Grandes avances se han hecho en particular en nuestra comprensión de las quimiocinas y moléculas de adhesión que rigen el reclutamiento de neutrófilos al espacio aéreo infectada ^10,11. En modelos in vivo de neumonía, a diferencia de los enfoques basados en células o alternativas, también han proporcionado información clave en endocrina comunicaciones que se producen entre el pulmón infectado y otros órganos, tales como el hígado (respuesta de fase aguda) ¹² y las glándulas suprarrenales (glucocorticoides estrés) ^13. Por último, un punto crítico y clínicamente muy relevante que se revela en los modelos in vivo de neumonía es que, la remoción de patógenos no es equivalente al éxito del huésped. En muchos casos, una respuesta inmune overexuberant puede conducir a la muerte del huéspeddebido a una lesión de pulmón espectador excesiva, incluso en la cara de éxito aclaramiento patógeno ^8,14. Dado esto, mediciones paralelas de espacio libre de patógenos y de la respuesta inmune son generalmente más informativos, y en última instancia, pueden ser necesarios estudios de supervivencia para revelar la resistencia integrada del host.

En este documento, hemos descrito un método simple y no invasiva para la entrega de las bacterias en el pulmón murino a través de aspiración. En comparación con la aerosolización, este método lleva a un menor riesgo potencial de exposición respiratoria de personal del estudio, proporciona para la entrega inóculo mayor concentrada al pulmón profundo, y evita el potencial de confusión por oculares y las vías respiratorias superiores respuestas inmunes. Inoculación intranasal también lleva la preocupación de confusión potencial de infección superior de las vías respiratorias, incluyendo la posibilidad de infección localmente invasivo del sistema nervioso central ^4, y también se ha informado de que resulte en inóculos muy variable en el pulmón^5. En comparación con la intubación endotraqueal a través de ya sea el peroral o vía transcutánea, este método requiere un mínimo de entrenamiento, es más rápido (~ 1 min por ratón), y, al menos en comparación con el último método, tiene menor morbilidad. Entre las posibles desventajas del método de aspiración orofaríngea - algunos de los cuales son compartidos por otros métodos - incluyen la necesidad de anestesia general, la probabilidad de parches (es decir, asimétrica y heterogénea) de entrega de patógenos, la infección predominante de los lóbulos inferiores ^15, y la incapacidad para dirigir el patógeno unilateralmente a un solo pulmón. Debido a la distribución irregular en los pulmones después de la aspiración (datos no mostrados) - un resultado que se encontró con todos los métodos de infección pulmonar distintos de aerosolización ¹⁵ - por lo general no realizan ensayos pulmonares unilaterales en los ratones infectados. Ambos pulmones o bien se lavaron juntos para evaluar la respuesta inmune, o la necropsia juntos por quant bacteriana agrupadasanea- y / o análisis molecular (por ejemplo, la expresión génica, ensayo de la mieloperoxidasa, citoquina ELISA). Particularmente pasos críticos del protocolo son el paso 1.8 -confirming los ₆₀₀ OD: relación UFC / ml antes de la infección in vivo y también confirmar la concentración de inóculo a través de la siembra en todos los experimentos; así como el paso 3.6 - garantizar un lavado no traumática de la vía aérea con un buen rendimiento de volumen en la jeringa.

A pesar de que la coinfección con la flora oral (es decir, la neumonía polimicrobiana) es una preocupación teórica, no hemos encontrado colonias bacterianas polimórficos en homogeneizado de pulmón de ratones infectados con K. pneumoniae o S. pneumoniae. Para los investigadores de que se trate sobre esta posibilidad, sin embargo, los ratones de control pueden estar expuestos a vehículo de aspiración (es decir, tampón), si se desea. Aunque algo de contaminación del lumen del estómago (a través de ingestión de bacterias residuales no aspiradas) es posible ingenioh el método que describimos, que nunca se han encontrado con signos clínicos gastrointestinales o cambios en la patología general. Por otra parte, esta posibilidad es común a los métodos de formación de aerosol e intranasal, e incluso puede ocurrir después de la tos en el método de inoculación intratraqueal.

Algunos problemas metodológicos son universales para todos los modelos de neumonía. Los grupos de control y experimental de ratón deberían ser idealmente dentro de las 2-3 semanas de diferencia de edad comparable. Aunque no hemos encontrado diferencias de género abiertas en el aclaramiento patógeno o inflamación de las vías en el K. pneumoniae modelo, los ratones debe ser emparejado en el género, ya que las diferencias significativas entre sexos en la respuesta inmune innata se han reportado ^16. Una cuidadosa consideración al origen de los ratones de control debe ser administrada. littermate controles son generalmente preferibles a los controles adquiridos comercialmente como retrocruzamiento incompleta, diferencias relacionadas con el microbioma-en poblaciones de células inmunes, y otra epigenetlas diferencias económicas son todas las posibles factores de confusión que pueden afectar a la respuesta inmune ^17,18. Debe prestarse una especial atención al serotipo específico y el cultivo de la historia de la bacteria que infecta las diferencias existentes en la virulencia puede ser visto. Sobre la base de nuestra experiencia con K. pneumoniae, se recomienda la realización de estudios piloto iniciales usando una gama de infectar inóculos (por ejemplo, 500-2.000 CFU) como la morbilidad / mortalidad de dosis bacterianos específicos descritos en la literatura - incluso con el mismo serotipo y el ratón cepa bacteriana - puede no traducirse bien al propio laboratorio, probablemente debido a una variedad de discrepancias técnicas. entre los grupos diferencias entre el control y los ratones experimentales en los resultados inflamatorios y la defensa del huésped pueden ser dependientes del inóculo. Debido a las realidades logísticas de la cría de animales y la dotación de personal, que suelen llevar a cabo experimentos con 5-6 ratones por grupo experimental. Aunque esta vez en cuando ofrece un poder estadístico adecuado para CFU y los resultados del recuento de células, encontramos que a menudo hay que repetir un estudio de este tamaño una o más veces con el fin de alcanzar una potencia adecuada.

Para algunos ratones en un experimento dado, no hay crecimiento de bacterias detectable en la sangre y el bazo puede encontrarse 24 horas después de la infección (Figura 5). Interpretamos esto para indicar que el 24 hr puede aproximarse al umbral cinética de difusión extrapulmonar detectable. Si se observa el crecimiento bajo / indetectable en la sangre / bazo, pulmón UFC desde el mismo ratón siempre debe ser examinado para hacer frente a la posibilidad de un error técnico (es decir, infección muy baja / indetectable pulmón posiblemente indicando un error en la dosificación del ratón).

En el cierre, el método de entrega aspiración orofaríngea de neumonía bacteriana en ratones es una técnica robusta que es relativamente fácil de adquirir de un coste, entrenamiento y equipo punto de vista, y es realista, incluso para los laboratorios sin una amplia experienciaen procedimientos pulmonares. El método se acopla fácilmente a ensayos microbiológicos e inmunológicos de aguas abajo de la respuesta de defensa del huésped, y por otra parte se puede utilizar como un método de entrega de pulmón para una amplia gama de exposiciones no cáusticos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4