En icke-invasiv och tekniskt icke intensiva metod för induktion och fenotypning av experimentell bakteriell lunginflammation hos möss

Summary

Flera metoder har beskrivits i litteraturen för modellering bakteriell lunginflammation hos möss. Häri beskriver vi en icke-invasiv, billig, snabb metod för att inducera lunginflammation via aspiration (dvs., inhalation) av ett bakteriellt inokulum pipetteras i orofarynx. Nedströms metoder för bedömning av lung medfödda immunsvaret är också detaljerad.

Abstract

Även samhällsförvärvad lunginflammation är fortfarande ett stort folkhälsoproblem, har musmodeller av bakteriell lunginflammation nyligen underlättat betydande prekliniska framsteg i vår förståelse av den underliggande cellulära och molekylära patogenes. In vivo-musmodeller fånga den integrerade fysiologi och motståndskraft i värdförsvarssvar i ett sätt som inte avslöjas av alternativa, förenklade ex vivo metoder. Flera metoder har beskrivits i litteraturen för intrapulmonell ympning av bakterier i möss, inklusive aerosol, intranasal leverans, peroral endotrakeal kanyle under "blinda" och synlig villkor, och transkutan endotrakeal kanyle. Alla metoder har relativa fördelar och begränsningar. Häri beskriver vi i detalj en icke-invasiv, tekniskt icke-intensiva, billig och snabb metod för intratrakeal leverans av bakterier som innebär aspiration (dvs inandning) av musenav en smittsam inokulum pipetterades i orofarynx medan under narkos. Denna metod kan användas för pulmonell tillförsel av ett stort antal olika icke-frätande biologiska och kemiska medel, och är relativt lätt att lära sig, även för laboratorier med minimal tidigare erfarenhet med lung förfaranden. Förutom att beskriva aspirationspneumoni metoden, vi ger också steg-för-steg-anvisningar för att analysera den efterföljande in vivo lung medfödda immunsvaret hos mus, i synnerhet metoder för att kvantifiera bakteriell clearance och cellulära immunsvar hos den infekterade luftvägarna. Detta integrerade och enkelt sätt att lunginflammation bedömning möjliggör snabb och robust utvärdering av effekten av genetiska och miljömässiga manipulationer på lung medfödd immunitet.

Introduction

Samhällsförvärvad pneumoni är fortfarande den vanligaste dödsorsaken från infektion i USA, med lite totala förändringen i dödlighet under de senaste 40 åren, trots förbättringar i vaccination och antibiotiska strategier ^1,2. Trots avsaknaden av märkbara framsteg på folkhälsonivå, under de senaste åren dramatiska framsteg har gjorts i vår förståelse av den molekylära och cellulära patogenesen av lunginflammation, med många av dessa framsteg som möjliggjorts genom användning av musmodeller av lunginfektion. Den genetiska spårbarhet musen har likheten mellan de murina och humana immunsystem, och det stora utbud av murina inriktade immunologiska reagens som har blivit kommersiellt tillgängliga tillsammans underlättas snabba framsteg på fältet.

Musmodeller av bakteriell lunginflammation som beskrivs i litteraturen har i allmänhet åberopas en av fyra tekniska vägar för patogen ympning: i) aerosolbildning; ii) intranasal leverans; iii) peroral leverans; och iv) kirurgisk intratrakeal injektion (dvs trakeotomi) ^3. Alla smittvägar har fördelar och nackdelar ^3. I synnerhet i förhållande exponering av de övre luftvägarna, risken för inblandning av oronasala flora, krav för narkos, variationen av inokulatet levereras till den distala lungan, lobära fördelning av de levererade patogener, tekniska krav expertis, och procedur sjuklighet varierar kraftigt mellan dessa tillvägagångssätt.

Vanligen används perorala infektionstekniker inkluderar endotrakeal (translaryngeal) kanyle via antingen en "blinda" (icke-visualiserade) tillvägagångssätt, eller under direkt struphuvud visualisering ^3-5. Båda metoderna, medan robust, kräver omfattande utbildning och även medföra risk för skada på övre luftvägarna. I denna rapport beskriver vi en tekniskt icke intensiva, icke-invasiv, billig och snabb metod för peroral infektion, wföljande bakterier (Klebsiella pneumoniae i exemplet) pipetteras i orofarynx av en sövd mus levereras till lungorna via aspiration (dvs inandning). Vi och andra har använt aspirationspneumoni tekniken framgångsrikt ^6-9. Denna mångsidiga och lättlärd lungleveransmetod kan utsträckas till leverans av många ytterligare icke-frätande medel till lungorna, inklusive cytokiner och andra proteiner, patogen-associerade molekyler (t.ex. lipopolysackarid), celler (dvs, adoptiv överföring), och toxiner (t.ex. bleomycin). Förutom att diskutera viktiga tekniska överväganden beskriver vi också ett integrerat, kvantitativ metod för att bedöma den efterföljande värd svar på lunginflammation, inklusive nedströms mätning av bakteriell clearance (dvs kolonibildande enhet [CFU] kvantifiering i lungan och perifera organ) och leukocyter ackumulering i luftrummet.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med djurskyddslagen och US Public Health Service Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur efter granskning av Animal Care och användning kommitté NIEHS.

1. Framställning av K. pneumoniae Kultur

Varning: Genomför alla steg i en skyddsnivå 2 (BSL2) huv eller annan BSL2 anvisad plats och kasta avfall per institutets riktlinjer BSL2.

1. För upphängning tillväxt K. pneumoniae, tina en glycerol lager av bakterier och ympa en arbetskultur genom att överföra 1 ml K. pneumoniae lager till 50 ml tryptisk sojabuljong (TSB) i en 500 ml eller större flaska.
2. Gör glycerolstam genom att tillsätta 900 pl odlade log-fas K. pneumoniae till 100 | il av steril glycerol och frysning vid -20 ° C eller -80 ° C. För långtidsförvaring, är -80 ° C rekommenderas.
3. Kulturbakterier från sTEP 1,1 genom att skaka kolven över natten (14-18 h) vid 37 ° C vid 200-225 rpm.In För att främja logfastillväxt, späd 1-5 ml av denna över natten odlade kulturen i en kolv innehållande 50 ml TSB på morgonen och placera tillbaka vid 37 ° C med skakning under ~ 2,5 timmar.
4. Överför 1 ml K. pneumoniae kultur från det sista steget i ett 1,5 ml rör och centrifugera vid 7500 xg under 2 minuter. En vit pellets ska vara synlig. Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten försiktigt återsuspendera bakterier med pipett i 1 ml steril saltlösning, och snurra igen vid 7500 xg under 2 minuter.
   1. Utför detta tvättsteg 2x, vilket den slutliga, tvättade pelleten i 1 ml steril saltlösning.
5. Utför log-wise serieutspädningar av denna snyggt inokulat. Till exempel lägga till 400 l av inokulatet i 3,6 ml steril saltlösning i serie för att göra en 10 ^-1 -10 ^-9 spädningsserie.
6. Bestäm OD ₆₀₀ av tvättat K. pneumoniae genom att placera 1 ml av01:10 och 1: 100 späd till engångskuvetter och mäta OD _600, blind först med steril koksaltlösning. Mät dubbletter för att säkerställa exakthet. En OD ₆₀₀ på 1,0 motsvarar ungefär 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml. Notera att förhållandet mellan OD och CFU / får ml inte vara linjär.
   1. Använd OD ₆₀₀ från spädningarna för att beräkna koncentrationen av K. pneumoniae, tillämpning av OD: CFU / ml konvertering ovan, och factoring i utspädnings.
7. Använd K. pneumoniae koncentration för att framställa den önskade inokulatet CFU dos i en <100 | il volym för leverans till möss (se nedan).
8. Också plattan 100 pl 10 ^-6 -10 ^-9 späd och 100 pl steril saltlösning på individuella tryptisk sojaagar (TSA) -plattor vid RT. Inkubera vid 37 ° C över natten och räkna bakteriekolonier för att beräkna exakta koncentration som användes i experimentet och att kontrollera för kontaminering.
   NOTERA: Faktiskt bakteriell koncentration av slut inokulum kan vara ± 500 CFU / ml som förutsägs av absorbans. Praktiker bör helst bekräfta OD _600: CFU / ml relation i pilotstudier före användning in vivo hos möss, empiriskt ställa om OD _600: CFU / ml konvertering baserat på deras personliga erfarenheter.

2. Murina Intratrakeal (det) aspiration av K. pneumoniae från orofarynx

1. Se till att möss identifieras genom svansmärke, tatuering, eller annan godkänd identifierare.
2. Upprätta doserings inokulum av bakterier med hjälp av P200 pipett innan du tar bort möss från isofluran för att påskynda förfarandet. För bästa resultat med det aspiration, använder en volym av <100 ^ för att förhindra spill. Häri använda 2000 CFU / 50 pl K. pneumoniae.
3. Söva möss i en klar kammare med isofluran gas (t.ex., 2% isofluran vid flödeshastighet av 1 l / min) eller som per Institutional riktlinjer. Antalet möss att söva tillsammans bestäms av komfort nivå av försöksledaren, typiskt 1-2 åt gången. Observera andning och bekräfta nivån av anestesi gång djupa andetag är synliga och 2-3 sekunder kan räknas mellan andetag.
   OBS: Om det finns oro för eventuella störande effekter av flyktiga (inhalerade) narkosmedel, kan bedövning uppnås istället med intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin. Med den ovan beskrivna metoden, djupa anestesi varar endast några min. Om mer långvarig anestesi induceras, bör ögonsalva användas för att förhindra okulär uttorkning.
4. När musen är sövda, placera den i en semirecumbent ryggläge, upphängd i maxillary framtänder från ett gummiband sträckt mellan pinnar på en lutande plexiglas styrelse (Figur 1).
5. Dra försiktigt ut musen tungan åt sidan med ett par trubbiga icke-räfflade pincett och insättning dos i munhålan med en P200 pipette. Iakttag stor försiktighet för att undvika att framkalla trauma antingen tungan eller orofarynx.
6. Samtidigt som tungan tillbaka, försiktigt täppa till näsan med en handske finger tills musen andas. Fortsätta att täcka näsan tills musen har tagit två eller flera inhalationer, och ingen vätska är synlig i munhålan. Täcker näsan hjälper till att säkerställa att musen kommer att andas in bakterier i lungorna, eftersom möss är obligata näsa andas.
7. Ta bort musen från ympning kortet och återgå till sin bur, placera musen på rygg för att förhindra strö eller skräp blockerar näsborrarna när musen återhämtar sig från anestesi.
8. När alla möss har doserats och har vaknat från anestesi, hus möss i ett skåp / rum innehållande endast möss som har doserats med K. pneumoniae. Övervaka möss dagligen, inklusive kroppsvikter om att gå längre än 48 timmar efter infektion.
9. Använd dagligen mäsk och / eller extra värme om att låta mössen att gå längre än 48h.

3. bronkoalveolär sköljvätska (BALF) Insamling och analys

1. Euthanize möss per institutionella riktlinjer. Här använder en dödlig injektion av 150 mg / kg natrium pentobarbital eller ekvivalent dos av kommersiella dödshjälp lösning följt av blodtappning, eftersom detta undviker möjliga komplikationer till lungorna i samband med _CO2 inandning och halsdislokation.
2. Position musen på rygg och sterilisera musen genom att spraya päls med 70% etanol i synnerhet över bröstet och halsen.
3. Göra ett längsgående snitt strax under bröstbenet, sedan hålla bröstbenet med pincett, hack membranet, vilket gör att lungorna att falla tillbaka in i brösthålan. Skär upp genom brösthålan på vardera sidan av kärlsystemet och sedan upp genom halsen, utsätta luftstrupen.
4. Som luftstrupen är omgiven av längsgående muskler på vardera sidan, försiktigt skära igenom i mitten och pressa vävnaden åt sidorna, somdetta undviker att skära den omgivande kärlsystemet, vilket skulle kunna införa blod in i luftstrupen. Om kärlen är trasiga, rengör det omgivande området med gasbinda innan åtkomst till luftrör lumen.
5. Använd kirurgisk sax eller en nål till nick luftstrupen ca ¼ av vägen ner från huvudet och sätta in en kanyl ansluten till en 1 ml spruta förladdad med 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kaudalt i luftstrupen. Om du använder möss <8 veckors ålder eller honor, minska lavaging volymen till 600-800 pl.
6. Tryck volymen i lungan långsamt, vilket gör att alla lober att blåsa upp och sedan dra volymen tillbaka ut med sprutan, upprepa 3x. Om PBS kommer ut ur näsborrarna kanylen inte har skjutits tillräckligt långt in i luftstrupen eller inflation sker för snabbt. Alternativt, om lungorna inte blåsa bra, kanylen har skjutits in för långt, så dra något.
7. Samla poolade tvättar i ett 15 ml rör på is.
8. Snurraluftrummet lavage vid 1200 xg under 5 min, supernatanten in i ett 1,5 ml rör och frys vid -80 ° C. Därefter använder supernatanten (dvs BALF) för mätning av protein, cytokiner, och för olika andra biokemiska analyser. Pelleten representerar celler från bronkoalveolär utrymme.
9. Om röda blodkroppar (RBC) är uppenbara i cellpelletten baserat på färg, för att lysera med 1 ml ACK lyserings-buffert under 1 min följt av tillsats av 5 ml av 1 x PBS stoppa lys reaktionen och späd bufferten. Hantera alla prover identiskt, antingen behandlas eller inte med ACK lyseringsbuffert.
10. Spin-celler vid 1200 xg under 5 min, dekantera supernatanten, och föra cellerna upp i 1 ml 1 x PBS.
11. Vortex och räkna celler på en hemocytometer för räkning av totala luftrumsceller.
12. Baserat på täthet av celler tillsätts ca 80-150 l (~ 80 l för en infekterad mus och ~ 150 för en naiv mus) till en bild kammare på en cytospin centrifug. spinncells på objektglas för efterföljande färgning för att bestämma celldifferential populationer.
13. Låt cellerna att torka på objektglas över natten. Stain celler med tri-bets (t.ex. Hema 3 [se tabell]) genom att doppa skivorna 7 gånger i fixativ, 9 gånger i fläcken 1 och 7 gånger i fläck 2 (inga sköljningar mellan fläckar), och låt torka. Efter fläcken har torkat, täckglas och manuellt räkna skillnader genom mikroskop. Generellt är neutrofiler och monocyt / makrofager lätt särskiljas genom deras storlek och nukleär morfologi.

4. Fastställande bakteriehalten i lunga och perifera vävnader

1. Innan du börjar: förbereda spädningsrör med 900 pl 1 x PBS för lunga och mjälte och 90 pl 1 x PBS för blod. Etikettplattor för odling av bakterier och som vid rumstemperatur; Därför kommer åter vävnad har samlats tid minimeras mellan homogenisering och plätering för bakterietillväxt.
   OBS: På grund av den heterogena depositariention av bakterier i lungorna som kan uppstå med aspiration, rekommenderas att enskilda möss användas för analys av antingen total luftvägs cellularitet eller totalt (bilateralt) lunga bakteriell belastning.
2. Avliva musen enligt steg 3,1 och därefter samla blod från vänster hjärtkammare, placera i ett hepariniserat rör för att undvika koagulering. Ta bort alla lunglober och lägg i en 15 ml rör innehållande 5 ml 1 x PBS, följt av avlägsnande av mjälten och placering i 2 ml 1 x PBS. Placera rören på is. Var noga med att rengöra instrument med etanol mellan varje vävnad / mus.
3. Homogenisera vävnaden på is, företrädesvis med engångs homogenisatorer som kan ändras mellan varje prov. Engångshomogenisator tips kan autoklaveras för återanvändning mellan experiment.
4. När vävnad har homogeniserats, utföra seriespädningar och plåt. Plate prov av en viss vävnad / utspädning i två exemplar på en enda TSA plattan genom att dra en skiljelinje på plasten. Plätering och dilution förslag visas nedan (i samtliga fall, är 10 | il av provet spreds på platta) och är baserade på en 24 h efter infektion nekropsi. Om analys av 48-72 hr prover, kan ett större antal utspädningar måste pläteras på grund av ökad bakteriell belastning vid senare tidpunkter.
   1. För blod - späd 1:10 genom att tillsätta 10 pl blod i 90 l sterilt 1x PBS. Plattan snyggt och 1:10 utspädda prover i duplikat. När blod har pläterade, snurra resterande blod vid 9300 xg under 10 min för att extrahera plasma för mätning av cytokiner och kemokiner.
   2. För Lung - späd 1:10 - 1: 100 genom att tillsätta 100 pl homogeniserad lunga i 900 pl steril 1x PBS seriellt. Plattan snyggt homogenatet och alla utspädningar i duplikat.
   3. För Spleen - späd 1: 10-1: 100 genom att tillsätta 100 pl homogeniserad mjälte i 900 pl steril 1x PBS seriellt. Plattan snyggt homogenatet och båda späd i duplikat.
5. Tillåta spridnings prover torka kortvarigt. Invertera TSA plattor och plats i en statisk 37 ° C inkubator över natten.
6. Bestämma antalet koloniserande bakterier genom medelvärdesbildning av bakteriekolonier från båda sidor av plattan och från varje utspädning. Faktor i de inledande utspädningar av 5 ml för lung- och 2 ml för mjälte att bestämma den totala vävnads CFU.

Representative Results

C57BL / 6-möss infekterades med 2000 CFU K. pneumoniae 43.816 (serotyp 2) via orofaryngeal aspiration i lungorna. Vid denna dos, möss börjar vanligtvis att visa kliniska symptom 12-24 timmar efter infektion, inklusive letargi, ruggig päls, och viktminskning på 5-10% (Figur 2A). Inom 48-72 timmar efter infektion, många av mössen visar sjukdomssymptom och sjuklighet som normalt föregås med i genomsnitt 20% viktförlust och resulterar i hunched ställningar med minskad aktivitet och minskad känslighet för stimulering. Studier av en längre varaktighet kan kräva en lägre dos av K. pneumoniae. Infektion med 500 CFU av K. pneumoniae resulterar i mildare sjukdom topp 3-5 d efter infektion som kännetecknas av en viktminskning på 10-15% med återvinning och viktökning börjar dag 5-6 (Figur 2B). Kroppsvikt är ofta förutsägande att överleva, med en viktminskning på 20% sällsyntly i samband med återvinning.

Den slutliga framgången i värdsvaret kan bäst visas med överlevnadsstudier, där möss övervakas i 10-14 dagar, och avlivades (per institutionellt godkända riktlinjer) för tecken på moribundity, såsom minimal känslighet för taktil stimulering och / eller viktminskning > 20%. Överlevnadsstudier är ofta mest effektiva om man riktar en infekterande inokulat som approximerar 50% dödlighet (dvs LD50 dos) i kontrollgruppen (figur 2C). Ett LD50 dos möjliggör detektering av både relativt ökad och minskad överlevnad i den experimentella gruppen. Differential överlevnad kan vara ymp-beroende, så flera infektions doser kan ibland vara nödvändigt att detektera en förändrad värdförsvar fenotyp.

Nedre luftvägsinfektion med K. pneumoniae kännetecknas av en stark tillströmning av leukocytes in i luftvägen. Immuncell uppräkning och differentiering genom färgning av BAL cellpelleten visar en ökning av luftvägsimmunceller inom 6h efter infektion (figur 3A). Cellularitet toppar efter 24 h, med neutrofiler som är den dominerande immunceller i luftvägarna (figur 3A-B). Båda könen av C57BL / 6-möss demonstrerar ekvivalent luftvägs leukocytos som svar på K. pneumoniae vid 24 timmar och 48 timmar efter infektion (Fig 3C-D).

Bakteriell lunginflammation inducerar lokal (intrapulmonär) och systemiska pro-inflammatoriska mediatorer inklusive cytokiner och kemokiner. Lokala cytokin / kemokin nivåer kan upptäckas i BALF med en konventionell ELISA eller genom att använda en multiplex cytokin-system. Cytokiner inklusive IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, och andra är detekterbar vid både 24 timmar och 48 timmar efter infektion med K. pneumoniae och ge en inblick i lung mikro och rekrytering av immunceller (Figur 4).

Insamling av lunga, blod, och perifer vävnad (er), såsom mjälte tillåter kvantifiering av vävnad bakteriehalten, ger en inblick i både lokala lung clearance av mikrober samt extrapulmonär spridning av bakterier. Seriespädning och odling av lungan visar expansionen av mikrobiell belastning mellan 24 h och 48 h efter infektion (figur 5A). Liknande resultat noteras i blodet och mjälte (Figur 5B - C). Notera kan en bimodal bakteriell belastning noteras i blodet och mjälten vid 24 timmar efter infektion, med några möss med bakteriespridning hög kvalitet, och andra, även i ansiktet av hög kvalitet bakteriell belastning i lunga och visar ingen detekterbara bakterier i blodet eller mjälte. K. pneumoniae bakteriehalten i C57BL / 6 möss inte Gender-specifik, eftersom hanar och honor demonstrera ekvivalent börda i olika vävnader efter ympning (Figur 5D-F).

Figur 1:. Ordningen Board för aspirationspneumoni hos möss Studie möss är placerade, huvudet upp och tillbaka till ombord (dvs semirecumbent) upphävde av framtänderna från ett gummiband sträckt mellan två pinnar monterade på en plexiglas eller liknande skivor.

Figur 2: Bedömning av viktminskning och sjuklighet Efter Pulmonell aspiration av K. pneumoniae. C57BL / 6 möss (N = 10-20 per tillstånd) infekterades genom aspiration av K. pneumoniae 43.816 (serotyp 2). (A) Dagliga vikter, indexerad till pre-infektion vikt, från möss infekterade med 2000 CFU. I denna studie, inga möss överlevde förbi dag 6. (B) Infektion med 500 CFU resultat i det dagliga viktminskning genom dag 4 efter infektion med en övergång mot viktökning början dag 5. (C) överlevnadskurvorna från 150 CFU, 500 CFU, och 2000 kolonibildande enhet (CFU) infektioner, vilket indikerar att 500 CFU approximerar LD50. Data i panelerna A och B är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Infektion med K. pneumoniae Resultat i Tidsberoende Airway Leukocytos. C57BL / 6-möss gavs intrapulmonell infektion med 2000 CFU K. lunginflammatione. (A) Räkning av totala leukocyter (WBC), neutrofiler (PMN) och makrofager (M O) i luftrummet fluid vid olika tidpunkter efter infektion. (B) Vid färgning, PMN och makrofager kan lätt identifieras genom nukleär morfologi och storlek i cytospin fält och räknades. (C - D) Infektion hos män och kvinnor resulterar i liknande antal rekryterade inflammatoriska celler vid 24 h och 48 h efter infektion. Uppgifterna framgår 6-25 / möss per tillstånd och är medelvärden ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Cytokiner och kemokiner induceras i luftrummet som svar på bakterieinfektion C57BL / 6-möss gavs intrapulmon.Ary infektion med 2000 CFU K. pneumoniae. BALF cytokiner och kemokiner kvantifierades genom multiplex analys vid 24 h och 48 h efter infektion. Uppgifterna framgår 5-15 möss / skick och är medelvärden ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5:. Tidsberoende Utbyggnad av bakteriell belastning i lunga och perifera vävnader under Lunginflammation C57BL / 6-möss gavs intrapulmonell infektion med 2000 CFU K. pneumoniae. (A) Lung parenkymal bakteriell belastning mättes genom plätering av serieutspädningar av lunghomogenat på TSA 24 h och 48 h efter infektion. (B) blodomloppet och (C) splenic bakteriell belastning på liknande sätt kvantifieras. ( F) Bakteriell belastning i olika vävnader är likvärdigt med manliga och kvinnliga möss efter induktion av lunginflammation. Uppgifterna framgår av 10 möss / skick och är medelvärden ± SEM. Nollvärden i panelerna B, C, E och F tilldelades ett värde av 0,1 för att tillåta graf på en logaritmisk skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Musmodeller av bakteriell lunginflammation, samarbetar med riktad genmodifiering och in vivo biologiska och farmakologiska interventioner, har gett viktiga insikter i lungvärdförsvar svar. Stora framsteg har gjorts i synnerhet i vår förståelse av kemokiner och adhesionsmolekyler som styr rekryteringen av neutrofiler till den infekterade luftrummet ^10,11. In vivo-modeller av lunginflammation, till skillnad från cellbaserade eller alternativa metoder, också har gett viktiga insikter endokrina kommunikation som sker mellan den infekterade lungan och andra organ, såsom levern (akutfassvar) ¹² och binjurarna (stress glukokortikoider) ^13. Slutligen, är en kritisk och kliniskt mycket relevanta punkt som avslöjas av in vivo lunginflammation modeller som framgångsrik patogen clearance är inte liktydigt med framgång värd. I många fall kan en overexuberant immunsvar leda till döden i den mottagandepå grund av alltför åskådare lungskada, även i ansiktet av framgångsrik patogen clearance ^8,14. Med tanke på detta, parallella mätningar av patogen clearance och immunsvaret är i allmänhet mest informativa och studier överlevnad kan i slutändan krävas för att avslöja den integrerade motståndskraft värden.

Häri, har vi beskrivit en enkel och icke-invasiv metod för leverans av bakterier till den murina lungan via aspiration. Jämfört med aerosolbildning, bär denna metod lägre potentiell risk för andnings exponering av studiepersonal, ger högre koncentrerat inokulat leverans till djupa lungan och undviker potentiella felkällor genom okulära och övre luftvägsimmunsvar. Intranasal ympning bär också potentiellt confounding oro för övre luftvägsinfektion, inklusive möjligheten av lokalt invasiv infektion i det centrala nervsystemet ^4, och har även rapporterats att resultera i mycket varierande inokula i lungan^5. Jämfört med endotrakeal intubation via antingen den perorala eller transkutan rutt kräver denna metod minimal utbildning, är mer snabb (~ 1 min per mus), och, åtminstone jämfört med den senare metoden, har lägre morbiditet. Potentiella nackdelar med orofaryngeal aspirationsmetoden - varav delas av andra metoder - bland annat krav på narkos, sannolikheten för ojämn (dvs. asymmetrisk och heterogen) patogen leverans, dominerande infektion i de nedre lober ^15, och oförmåga att rikta patogenen ensidigt till en enda lunga. På grund av ojämn fördelning i lungorna efter aspiration (data visas inte) - ett resultat som påträffas med alla andra än aerosolbildning ¹⁵ lunginfektion metoder - vi i allmänhet inte utföra ensidiga lung analyser på infekterade möss. Båda lungorna antingen sköljs tillsammans för att bedöma immunsvaret, eller obducerades tillsammans utjämningsbakterie quantitation och / eller molekylär analys (t.ex. genuttryck, myeloperoxidas analys cytokin ELISA). Särskilt kritiska stegen i protokollet är steg 1,8 -confirming OD _600: CFU / ml relation före in vivo-infektion och även bekräftar inokulatkoncentration genom plätering i varje experiment; samt steg 3,6 - säkerställa en icke-traumatisk sköljning av luftvägarna med god återgår volymen i sprutan.

Även om samtidig infektion med oral flora (dvs polymikrobiella lunginflammation) är en teoretisk risk, har vi inte stött på polymorfa bakteriekolonier i lunghomogenat av möss infekterade med K. pneumoniae eller S. pneumoniae. För bekymrade över denna möjlighet utredare dock kontrollmöss kan utsättas för aspire fordon (dvs buffert), om så önskas. Även om vissa kontaminering av magen lumen (genom sväljer resterande oaspirerade bakterier) är möjlig with den metod vi beskriver, har vi aldrig stött gastrointestinala kliniska tecken eller förändringar på grov patologi. Dessutom är denna möjlighet gemensam för aerosolise och intranasala metoder, och kan även förekomma efter hosta i intratrakeal inokuleringsmetod.

Vissa metodologiska problem är universella för alla lunginflammation modeller. Kontroll och experimentell mus grupper bör vara åldersmatchade helst inom 2-3 veckor från varandra. Även om vi inte har hittat uppenbara könsskillnader i patogen clearance eller luftvägsinflammation i K. pneumoniae modell, bör möss vara könsmatchade, som betydande skillnader mellan könen i det medfödda immunsvaret har rapporterats ^16. Noggrann hänsyn till ursprung kontrollmöss bör ges. Kull kontroller är i allmänhet att föredra framför kommersiellt inköpta kontroller som ofullständig återkorsning, microbiome relaterade skillnader i immuncellpopulationer, och andra epigenetic skillnader är alla möjliga störande variabler som kan påverka immunsvaret ^17,18. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt den specifika serotyp och odling historia infekterande bakterien som betydande skillnader i virulens kan ses. Baserat på vår erfarenhet med K. pneumoniae, rekommenderar vi att utföra inledande pilotstudier med hjälp av en rad infektera inokula (t.ex. 500-2,000 CFU) som sjuklighet / dödlighet av specifika bakteriella doser som rapporterats i litteraturen - även med samma bakterie serotyp och musstam - kan inte översätta väl till ett eget laboratorium, troligen beroende på en mängd olika tekniska avvikelser. Inter-gruppskillnader mellan kontroll och experimentella möss i inflammatoriska och värdförsvars utfallet kan vara ymp beroende. På grund av de logistiska realiteter djuruppfödning och bemanning, gör vi ofta experiment med 5-6 möss per experimentgrupp. Även om detta ibland ger tillräcklig statistisk styrka för CFU och celltalsresultat, finner vi att vi ofta behöver upprepa en studie av denna storlek en eller flera gånger för att uppnå tillräcklig effekt.

För vissa möss i ett givet experiment, kan ingen detekterbar bakterietillväxt i blod och mjälte påträffas 24 h efter infektion (figur 5). Vi tolkar detta som tyder på att 24 timmar kan vara nära den kinetiska tröskeln för detekterbar extrapulmonär spridning. Om låg / odetekterbara tillväxt i blod / mjälte observeras ska lunga CFU från samma mus alltid undersökas för att ta itu med möjligheten av ett tekniskt fel (dvs mycket låg / omöjlig att upptäcka lunginfektion möjligen indikerar ett fel i dosering av musen).

Avslutningsvis är det orofaryngeal aspirationsleveransmetod för bakteriell lunginflammation hos möss en robust teknik som är relativt lätt att få från en kostnad, utbildning och utrustning synvinkel, och är realistiskt även för laboratorier utan omfattande expertisi lung förfaranden. Metoden är lätt kopplad till nedströms mikrobiologiska och immunologiska analyser i värdförsvars respons, och kan dessutom användas som en lungleveransmetod för ett brett spektrum av icke-kaustika exponeringar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4