والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

Summary

وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لنمذجة الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران. هنا، نحن تصف غير الغازية، وغير مكلفة، طريقة سريعة لإحداث الالتهاب الرئوي عن طريق الطموح (أي استنشاق) من اللقاح البكتيري pipetted في البلعوم. طرق المصب لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية هي أيضا مفصلة.

Abstract

على الرغم من أن الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع لا يزال يمثل مشكلة صحية عامة رئيسية، ونماذج الفئران من الالتهاب الرئوي البكتيري قد سهلت مؤخرا التقدم قبل السريرية كبيرة في فهمنا للالمرضية الخلوية والجزيئية الكامنة. والنماذج الحية الماوس التقاط علم وظائف الأعضاء المتكاملة ومرونة الاستجابة دفاع المضيف في بطريقة لم تكشف من قبل، فيفو النهج السابق مبسطة بديلة. وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب للتلقيح داخل الرئة من البكتيريا في الفئران، بما في ذلك هباء، والتسليم داخل الأنف، بطريق الفم إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية في ظل ظروف "العمياء" وتصور، وعبر الجلد إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية. كل الطرق لها المزايا النسبية والقيود. هنا، نحن تصف بالتفصيل طريقة غير الغازية، من الناحية الفنية غير كثيفة، وغير مكلفة، وسريع للتسليم داخل القصبة الهوائية من البكتيريا التي ينطوي الطموح (أي استنشاق) عن طريق الماوسلقيحة المعدية pipetted في البلعوم وهو تحت التخدير العام. هذه الطريقة يمكن استخدامها لتسليم الرئوي من مجموعة واسعة من العوامل البيولوجية والكيميائية غير الكاوية، وسهلة نسبيا للتعلم، حتى بالنسبة للمختبرات لديهم خبرة سابقة الحد الأدنى للإجراءات الرئوية. بالإضافة إلى وصف طريقة الالتهاب الرئوي التنفسي، ونحن نقدم أيضا إجراءات خطوة بخطوة لمعايرة اللاحقة في الجسم الحي الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية من الفأرة، على وجه الخصوص، وأساليب لقياس إزالة البكتيريا والاستجابة المناعية الخلوية من مجرى الهواء المصاب. هذا نهج متكامل وبسيط لتقييم التهاب رئوي يسمح للتقييم السريع والقوي للتأثير التلاعب الوراثية والبيئية على الحصانة الفطرية الرئوية.

Introduction

لا يزال المجتمع المكتسبة الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي للوفاة من العدوى في الولايات المتحدة، مع تغير ضئيل عموما في معدلات الوفيات على مدى السنوات ال 40 الماضية على الرغم من التحسينات في التطعيم واستراتيجيات المضادات الحيوية ^1،2. وعلى الرغم من عدم إحراز تقدم ملموس على مستوى الصحة العامة، في السنوات الأخيرة تم إحراز تقدم كبيرة في فهمنا للالمرضية الجزيئية والخلوية من الالتهاب الرئوي، مع العديد من هذه الخطوات جعل الأمام ممكن عن طريق استخدام نماذج الماوس من التهاب في الرئتين. وقابلية الإستطراق الوراثي للفأرة، والتشابه من الفئران وجهاز المناعة البشرية، ومجموعة واسعة من الكواشف المناعية التي تستهدف الفئران التي أصبحت متاحة تجاريا سهلت معا التقدم السريع في هذا المجال.

وقد اعتمدت نماذج الماوس من الالتهاب الرئوي الجرثومي وصفها في الأدب عموما على واحد من أربعة مسارات التقنية للتلقيح الممرض: ط) هباء. ب) INTRتسليم anasal. ج) تسليم بطريق الفم. والرابع) الحقن داخل الرغامى الجراحية (أي القصبة الهوائية) ^3. جميع طرق العدوى لها مزايا وعيوب ^3. ولا سيما، والتعرض النسبي لمجرى الهواء العلوي، وقدرتها على خليط من النباتات فموي أنفي، ومتطلبات للتخدير العام، وتقلب من اللقاح تسليمها إلى الرئة البعيدة، توزيع فصي من مسببات الأمراض تسليمها، ومتطلبات الخبرة التقنية، والاعتلال الإجرائي تختلف على نطاق واسع عبر هذه اقتراب.

عادة تشمل استخدام تقنيات عدوى الفم؛ بالفم القصبة الهوائية (translaryngeal) إقناء؛ إدخال القنية إما عن طريق نهج "أعمى" (غير تصور)، أو تحت الحنجرة مباشرة تصور ^3-5. كلتا الطريقتين، بينما قوية، تتطلب قدرا كبيرا من التدريب وتحمل أيضا خطر الصدمة لمجرى الهواء العلوي. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا فنيا غير كثيفة، غير الغازية، وغير مكلفة، وسريع العدوى بطريق الفم، ثpipetted البكتيريا بموجب (الكلبسيلة الرئوية في المثال المقدمة) في البلعوم من الماوس تخدير يتم تسليمها إلى الرئتين عن طريق الطموح (أي استنشاق). نحن وآخرون استخدموا تقنية الالتهاب الرئوي التنفسي بنجاح ^6-9. ويمكن تمديد هذه الطريقة الرئة التسليم تنوعا وتعلمت بسهولة إلى تقديم العديد من وكلاء غير الكاوية إضافية إلى الرئتين، بما في ذلك السيتوكينات والبروتينات الأخرى، الجزيئات المرتبطة الممرض (على سبيل المثال، lipopolysaccharide في)، والخلايا (أي نقل بالتبني)، والسموم (مثل بليوميسين). بالإضافة إلى مناقشة الاعتبارات الفنية الهامة، ونحن أيضا وصف نهج متكامل، الكمي لتقييم استجابة المضيف لاحقة إلى الالتهاب الرئوي، بما في ذلك قياس المصب إزالة البكتيريا (أي مستعمرة تشكيل وحدة [كفو] الكميات في الرئة والطرفية الأجهزة) والكريات البيض تراكم في المجال الجوي.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لقانون رعاية الحيوان وسياسة دائرة الصحة العامة الأميركية على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية بعد مراجعة من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة لعلوم الصحة البيئية.

1. إعداد ك. الرئوية الثقافة

الحذر: تنفيذ جميع الخطوات في 2 (BSL2) هود مستوى السلامة الحيوية أو غيرها من مجال معين BSL2 وتجاهل النفايات في المبادئ التوجيهية BSL2 المعهد.

1. للنمو تعليق ك. الرئوية، أذاب المخزون الجلسرين من البكتيريا وتطعيم ثقافة العمل عن طريق نقل 1 مل من ك. الأسهم الرئوية إلى 50 مل من مرق الصويا زيتية (TSB) في 500 مل أو أكبر قارورة.
2. جعل الأسهم الجلسرين وذلك بإضافة 900 ميكرولتر من مثقف سجل مرحلة ك. الرئوية إلى 100 ميكرولتر من الجلسرين معقم وتجميد في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، فمن المستحسن -80 درجة مئوية.
3. البكتيريا الثقافة من الصورةتيب 1.1 عن طريق هز قارورة بين عشية وضحاها (14-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية في 200-225 rpm.In أجل تعزيز النمو مرحلة السجل، وتمييع 1-5 مل من هذه الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة تحتوي على 50 مل تسب في الصباح و المكان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع الهز ل~ 2.5 ساعة.
4. نقل 1 مل من ك. ثقافة الرئوية من الخطوة الأخيرة في أنبوب 1.5 مل وتدور في 7500 x ج لمدة 2 دقيقة. وينبغي أن يكون بيليه الأبيض مرئية. إزالة طاف دون الإخلال بيليه، و resuspend بلطف البكتيريا مع ماصة في 1 مل من محلول ملحي، وتدور مرة أخرى في 7500 x ج لمدة 2 دقيقة.
   1. تنفيذ هذه الخطوة غسل 2X، تنشئة النهائي، بيليه غسلها في 1 مل من محلول ملحي معقم.
5. أداء التخفيفات، سجل الحكمة المسلسل من هذا اللقاح أنيق. على سبيل المثال، إضافة 400 ميكرولتر من اللقاح إلى 3.6 مل من محلول ملحي معقم بشكل متسلسل إلى اتخاذ سلسلة 10 ^-1 -10 ^-9 التخفيف.
6. تحديد OD ₆₀₀ من ك غسلها الرئوية عن طريق وضع 1 مل من01:10 و 1: 100 التخفيفات في cuvettes القابل للتصرف وقياس OD _600، المسح أولا بمحلول ملحي معقم. قياس مكررة لضمان الدقة. وOD ₆₀₀ من 1.0 ما يعادل تقريبا 4-7 × 10 ⁸ كفو / مل. لاحظ أن العلاقة بين التطوير التنظيمي وكفو / مل قد لا تكون خطية.
   1. استخدام OD ₆₀₀ من التخفيفات لحساب تركيز ك. الرئوية، وتطبيق OD: تحويل كفو / مل أعلاه، والعوملة في التخفيف.
7. استخدام ك. تركيز الرئوية لإعداد جرعة اللقاح كفو المطلوب في <100 حجم ميكرولتر للتسليم في الفئران (أنظر أدناه).
8. أيضا لوحة 100 ميكرولتر من 10 ^-6 -10 ^-9 التخفيفات و 100 ميكرولتر من محلول ملحي على لوحات زيتية الفردية أجار الصويا (TSA) في RT. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل وتعداد المستعمرات البكتيرية وذلك لحساب تركيز المحدد الذي تم استخدامه في تجربة وللسيطرة على التلوث.
   ملاحظة: تركيز البكتيريا الفعلي من اللقاح النهائي قد يكون ± 500 خلية / مل التي تنبأ بها الامتصاصية. يجب المجربون تأكيد مثالي OD _600: كفو / مل العلاقة في الدراسات التجريبية السابقة لاستخدامها في الجسم الحي في الفئران، وإعادة تعديل تجريبيا OD _600: كفو / تحويل مل على أساس الخبرة الشخصية.

2. الفئران داخل الرغامى (عليه) طموح ك. الرئوية من البلعوم

1. تأكد من أن الفئران تم تحديدها بشكل فريد من علامة الذيل، والوشم، أو غيرها من المعرف المعتمدة.
2. وضع جرعات اللقاح من البكتيريا باستخدام ماصة P200 قبل إزالة الفئران من الأيزوفلورين من أجل تسريع الإجراءات. للحصول على أفضل النتائج مع ذلك الطموح، واستخدام حجم <100 ميكرولتر لمنع تجاوز. هنا، استخدم 2000 كفو / 50 ميكرولتر من ك. الرئوية.
3. تخدير الفئران في غرفة واضحة مع الغاز الأيزوفلورين (على سبيل المثال، 2٪ الأيزوفلورين في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة) أو حسب institالمبادئ التوجيهية utional. يتم تحديد عدد من الفئران لتخدير معا حسب مستوى الراحة من مجرب، وعادة 1-2 في وقت واحد. مراقبة التنفس وتأكيد مستوى التخدير مرة واحدة نفسا عميقا واضحة و2-3 ثانية يمكن عدها بين الأنفاس.
   ملاحظة: إذا كان هناك قلق حول آثار الخلط المحتملة لتقلب التخدير (استنشاق)، والتخدير يمكن أن يتحقق بدلا من ذلك مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين. مع الطريقة الموصوفة أعلاه، التخدير العميق تستغرق سوى دقائق قليلة. إذا هو فعل المزيد من التخدير لفترات طويلة، وينبغي استخدام مرهم العين لمنع جفاف العين.
4. مرة واحدة يتم تخدير الماوس، وضعه في موقف ضعيف مستلق جزئيا، مع وقف التنفيذ من قبل القواطع العلوية من الشريط المطاطي تمتد بين أوتاد على لوحة زجاجي مائلة (الشكل 1).
5. سحب بلطف اللسان الماوس إلى جنب مع زوج من الملقط حادة غير مخدد وجرعة الإيداع في تجويف الفم مع pipett P200ه. الحذر الشديد لتجنب إحداث صدمة إما اللسان أو البلعوم.
6. مع الحفاظ على اللسان تراجعت، تسد بلطف الأنف مع إصبع القفاز حتى يستنشق الماوس. مواصلة لتغطية الأنف حتى اتخذت الماوس اثنين أو أكثر من استنشاق، وليس السائل مرئيا في تجويف الفم. تغطية الأنف يساعد على ضمان أن الماوس سوف يستنشق الجراثيم في الرئتين، والفئران هي الاستراحات الأنف تلزم.
7. إزالة الماوس من لوحة التلقيح والعودة إلى قفصه، ووضع الماوس على ظهرها لمنع الفراش أو الحطام من عرقلة فتحتي الأنف بينما الماوس يتعافى من التخدير.
8. مرة واحدة وقد تم مداوي جميع الفئران ولقد استيقظ من التخدير، والفئران منزل في حجرة / غرفة تحتوي على الفئران الوحيد الذي تم مداوي مع ك. الرئوية. مراقبة الفئران يوميا، بما في ذلك وزن الجسم إذا تجاوز 48 ساعة بعد العدوى.
9. استخدام الهريس اليومي و / أو الحرارة تكميلية إذا السماح للفئران لتجاوز 48ساعة.

3. القصبات الغسل السائل (BALF) جمع وتحليل

1. الموت ببطء الفئران في المبادئ التوجيهية المؤسسية. هنا، واستخدام الحقن القاتلة من 150 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم أو الجرعة المكافئة من حل القتل الرحيم التجارية تليها استنزاف، وهذا يتجنب المضاعفات المحتملة إلى الرئتين المرتبطة CO ₂ الاستنشاق وخلع عنق الرحم.
2. موقف الماوس على ظهره وتعقيم الماوس عن طريق الرش الفراء مع الايثانول 70٪ وخاصة على منطقة الصدر والرقبة.
3. اجراء خفض طولية أسفل عظمة القص، ثم عقد القص مع ملقط، نيك الحجاب الحاجز، والسماح للرئة أن يسقط مرة أخرى إلى تجويف الصدر. تقطيع من خلال تجويف الصدر على جانبي الأوعية الدموية وحتى ذلك الحين من خلال الرقبة، وفضح القصبة الهوائية.
4. كما تحيط القصبة الهوائية من قبل العضلات الطولية على جانبي، وقطع بعناية عن طريق الوسط ودفع الأنسجة على الجانبين، كماهذا يتجنب قطع الأوعية الدموية المحيطة بها، والتي يمكن أن يعرض الدم إلى القصبة الهوائية. إذا رصدت الأوعية الدموية، وتنظيف المنطقة المحيطة بها مع الشاش قبل الوصول إلى تجويف القصبة الهوائية.
5. استخدام مقص جراحي أو إبرة لنيك القصبة الهوائية حوالي ربع الطريق نزولا من الرأس وإدراج قنية تعلق على حقنة 1 مل مسبقة مع 1 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) caudally إلى القصبة الهوائية. إذا باستخدام الفئران <8 أسابيع من العمر أو الإناث، والحد من حجم lavaging إلى 600-800 ميكرولتر.
6. دفع حجم في الرئة ببطء، مما يتيح لجميع فصوص لتضخيم ثم سحب حجم مرة أخرى للخروج مع حقنة، وتكرار 3X. إذا PBS هو الخروج من الخياشيم لم يتم دفع قنية بعيدا بما فيه الكفاية إلى القصبة الهوائية أو التضخم يحدث بسرعة كبيرة جدا. بدلا من ذلك، إذا الرئتين لا تضخم بشكل جيد، وقد دفعت قنية في غاية الآن، لذلك الانسحاب قليلا.
7. جمع يغسل المجمعة في أنبوب 15 مل على الجليد.
8. غزلالسائل المجال الجوي غسيل في 1200 x ج لمدة 5 دقائق، وجمع طاف في أنبوب 1.5 مل وتجميد في -80 درجة مئوية. وفي وقت لاحق، واستخدام طاف (أي BALF) لقياس البروتين، السيتوكينات، ولمختلف فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى. يمثل بيليه الخلايا من الفضاء الشعبى.
9. إذا خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) واضحة في بيليه الخلية على أساس اللون أو ليز مع 1 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 1 دقيقة تليها إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لوقف رد فعل تحلل وتمييع العازلة. التعامل مع جميع العينات مماثل، إما للعلاج أو لا مع العازلة تحلل ACK.
10. خلايا تدور في 1200 x ج لمدة 5 دقائق، صب وطاف، وجلب الخلايا يصل في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
11. دوامة وعدد الخلايا على عدادة الكريات لتعداد مجموع الخلايا المجال الجوي.
12. وبناء على كثافة خلايا إضافة حوالي 80-150 ميكرولتر (~ 80 ميكرولتر للفأر مصاب و~ 150 فأر ساذج) إلى غرفة الشريحة على جهاز للطرد المركزي cytospin. خلية تدورالصورة على المجهر الشرائح لتلطيخ لاحقة لتحديد السكان الخلية التفاضلية.
13. تسمح للخلايا لتجف على الشرائح بين عشية وضحاها. خلايا وصمة عار مع ثلاثي وصمة عار (على سبيل المثال، هيما (3) [انظر الجدول]) عن طريق غمس الشرائح 7 مرات في تثبيتي، 9 مرات في صمة عار 1، و 7 مرات في صمة عار 2 (لا يشطف بين البقع)، والسماح ليجف. بعد قد جفت وصمة عار، والشرائح ساترة ويدويا عد فروق بواسطة المجهر. عموما، والعدلات والوحيدات / الضامة تفريقها بسهولة حجمها والتشكل النووي.

4. تحديد الحمولة البكتيرية في الرئة والأنسجة الطرفية

1. قبل البداية: إعداد أنابيب التخفيف مع 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لالرئة والطحال و90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للدم. لوحات التسمية لزراعة البكتيريا وضعت في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، سيكون اقل وقت مرة واحدة وقد تم جمع الأنسجة بين التجانس والطلاء لنمو البكتيريا.
   ملاحظة: نظرا لdeposi غير متجانسة، فمن المستحسن نشوئها من البكتيريا في الرئتين التي يمكن أن تحدث مع طموح أن يتم استخدام الفئران الفردية لتحليل إما مجموع الخلوية الهوائية أو الكلي عبء البكتيري (الثنائية) الرئة.
2. الموت ببطء الماوس كما في الخطوة 3.1 وبعد ذلك جمع الدم من البطين الأيسر، ووضع في أنبوب heparinized لتجنب تجلط. إزالة جميع فصوص الرئة ومكان في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X، تليها إزالة الطحال والتنسيب إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X. وضع أنابيب على الجليد. احرص على تنظيف الأدوات مع الإيثانول بين كل الأنسجة / الماوس.
3. تجانس الأنسجة على الجليد، ويفضل أن يكون مع المجانسة القابل للتصرف التي يمكن تغييرها بين كل عينة. نصائح الخالط يمكن التخلص منها يمكن تعقيمها لإعادة استخدامها بين التجارب.
4. مرة واحدة وقد تم المتجانس الأنسجة، نفذ التخفيفات المتسلسلة ولوحة. عينات لوحة من معين الأنسجة / التخفيف من نسختين على لوحة TSA واحدة عن طريق رسم خط فاصل على البلاستيك. الطلاء وديوعرض الاقتراحات lution أدناه (في جميع الحالات، ينتشر 10 ميكرولتر من العينة على لوحة)، وتستند على مدار 24 ساعة بعد العدوى التشريح. إذا تحليل عينات 48-72 ساعة، قد تحتاج إلى مطلي بسبب زيادة عبء البكتيريا في نقاط زمنية لاحقة لعدد أكبر من التخفيفات.
   1. للالدم - تمييع 01:10 بإضافة 10 ميكرولتر من الدم إلى 90 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. لوحة أنيق و01:10 عينات مخففة في مكررة. مرة واحدة وقد تم مطلي الدم، وتدور في الدم المتبقي في 9300 x ج لمدة 10 دقيقة لاستخراج البلازما لقياس السيتوكينات و chemokines.
   2. لالرئة - تمييع 01:10 - 1: 100 بإضافة 100 ميكرولتر من الرئة المتجانس في 900 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X متسلسل. لوحة جناسة أنيق وجميع التخفيفات في نسختين.
   3. لالطحال - تمييع 1: 10-1: 100 بإضافة 100 ميكرولتر من الطحال المتجانس في 900 ميكرولتر من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X متسلسل. لوحة جناسة أنيق وكل من التخفيفات في نسختين.
5. السماح للعينات منتشرة لتجف لفترة وجيزة. عكس لوحات TSA ومكان في ثابتة 37 درجة مئوية الحاضنة بين عشية وضحاها.
6. تحديد عدد من البكتيريا استعمار عن طريق حساب متوسط ​​المستعمرات البكتيرية من جانبي لوحة ومن كل تخفيف. عامل في التخفيفات الأولية من 5 مل الرئة و 2 مل الطحال لتحديد إجمالي CFUs الأنسجة.

Representative Results

أصيب C57BL / 6 الفئران مع 2000 كفو من ك. الرئوية 43816 (النمط المصلي 2) عن طريق الفم والبلعوم التطلع إلى الرئتين. عند هذه الجرعة، والفئران عادة ما تبدأ في إظهار أعراض سريرية 12-24 ساعة بعد العدوى بما في ذلك الخمول، والفراء تكدرت، وفقدان الوزن من 5-10٪ (الشكل 2A). في غضون 48-72 ساعة بعد الإصابة، وكثير من الفئران تظهر أعراض المرض والاعتلال التي عادة ما تسبق بمعدل فقدان الوزن 20٪ والنتائج في المواقف منحنية مع انخفاض النشاط وانخفاض القدرة على الاستجابة للتحفيز. قد تتطلب دراسات لمدة أطول أقل جرعة من ك. الرئوية. عدوى مع 500 كفو من ك. النتائج الرئوية في مرض أكثر اعتدالا تبلغ ذروتها 3-5 د بعد الإصابة التي تتميز خسارة الوزن من 10-15٪ مع انتعاش وزيادة الوزن بدأت يوم 5-6 (الشكل 2B). وزن الجسم في كثير من الأحيان التنبؤية من البقاء على قيد الحياة، مع خسارة الوزن من 20٪ النادرةيرتبط لاي مع الانتعاش.

قد يكون من الأفضل أشار النجاح النهائي للاستجابة المضيف عن طريق دراسات البقاء على قيد الحياة، حيث يتم رصد الفئران لمدة 10-14 يوما، والموت الرحيم (لكل المبادئ التوجيهية وافق مؤسسيا) عن علامات الاحتضار، مثل الحد الأدنى من القدرة على الاستجابة للتحفيز عن طريق اللمس و / أو فقدان الوزن > 20٪. دراسات البقاء على قيد الحياة وغالبا ما تكون أكثر فعالية إذا واحد يستهدف على اللقاح اصابة يقارب 50٪ الفتك (أي LD50 الجرعة) في السيطرة على المجموعة (الشكل 2C). جرعة LD50 تسمح للكشف عن كل من زيادة نسبيا وانخفاض بقاء في المجموعة التجريبية. قد يكون بقاء الفرق التي تعتمد على اللقاح، قد يكون ذلك عدة جرعات العدوى في بعض الأحيان من الضروري الكشف عن النمط الظاهري دفاع المضيف تغير.

عدوى بالجهاز التنفسي السفلي مع ك. يتميز الرئوية بسبب التدفق القوي للليكocytes في مجرى الهواء. المناعي تعداد الخلايا والتمايز عن طريق تلوين الخلية بيليه BAL يدل على زيادة في الخلايا المناعية مجرى الهواء داخل 6H بعد الإصابة (الشكل 3A). قمم الخلوية من 24 ساعة، مع العدلات كونها الخلايا المناعية السائدة في مجرى الهواء (الشكل 3A-B). كلا الجنسين من C57BL / 6 الفئران تظهر أي ما يعادل زيادة عدد الكريات البيضاء مجرى الهواء ردا على ك. الرئوية في 24 ساعة و 48 ساعة بعد العدوى (أرقام 3C-D).

الالتهاب الرئوي الجرثومي يدفع المحلية (داخل الرئة) والوسطاء النظامية الموالية للالتهابات بما في ذلك السيتوكينات و chemokines. ويمكن الكشف عن مستويات خلوى / chemokine المحلية في BALF مع إليسا التقليدية أو باستخدام نظام خلوى متعددة. السيتوكينات بما في ذلك IL-6، RANTES، TNFα، G-CSF، والبعض الآخر اكتشافها في كل 24 ساعة و 48 ساعة بعد العدوى مع K. الرئوية وتوفير نظرة ثاقبة على منطقيةز المكروية والتوظيف من الخلايا المناعية (الشكل 4).

مجموعة من الرئة والدم والأنسجة الطرفية (ق) مثل الطحال يسمح الكميات من أنسجة الحمل البكتيري، وتوفير نظرة ثاقبة على حد سواء إزالة الرئوي المحلي من الميكروبات فضلا عن نشر خارج الرئة من البكتيريا. التخفيف المتسلسل وزراعة الرئة يوضح التوسع في عبء الميكروبي بين 24 ساعة و 48 ساعة بعد الإصابة (الشكل 5A). وأشار إلى نتائج مماثلة في الدم والطحال (الشكل 5B - C). وتجدر الإشارة، وهو عبء البكتيرية ذات النسقين يمكن ملاحظته في الدم والطحال في 24 ساعة بعد العدوى، مع بعض الفئران وجود عالية الجودة نشر البكتيرية، وغيرها، حتى في مواجهة عبء البكتيرية عالية الجودة في الرئة، وعرض لا البكتيريا التي يمكن اكتشافها في الدم أو الطحال. ك. الرئوية الحمل البكتيري في C57BL / 6 الفئران لا gendإيه محددة، كما الذكور والإناث تظهر عبء مماثل في مختلف الأنسجة بعد التلقيح (الشكل 5D-F).

يتم وضعه المجلس إجراء لمرض الالتهاب الرئوي التنفسي في الفئران دراسة الفئران، يصل رئيس والعودة إلى المجلس (أي مستلق جزئيا) والتعليق من القواطع من الشريط المطاطي تمتد بين اثنين من أوتاد التي شنت على زجاجي أو ألواح مماثلة: الشكل 1.

الشكل 2: تقييم لتخفيف الوزن والإصابة بالأمراض وفيما يلي الرئوي الطموح من ك. الرئوية. C57BL / 6 الفئران (N = 10-20 في حالة) كانت مصابة من قبل تطلع ك. الرئوية 43816 (النمط المصلي 2). (A) أوزان اليومية، مفهرسة الوزن إلى ما قبل الإصابة، من الفئران مصابة 2000 كفو. في هذه الدراسة، نجا لا الفئران الماضي يوم 6. (B) العدوى مع 500 النتائج كفو في فقدان الوزن اليومية من خلال يوم 4 بعد العدوى مع التحول نحو زيادة الوزن ابتداء من يوم 5. منحنيات (C) البقاء على قيد الحياة من 150 كفو، 500 كفو، ومستعمرة تشكيل وحدة التهابات 2000 (كفو)، تشير إلى أن 500 كفو يقارب LD50. بيانات في لوحات A و B هي يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): العدوى مع ك. الرئوية النتائج في الوقت التي تعتمد على مجرى الهواء زيادة عدد الكريات البيضاء. أعطيت C57BL / 6 الفئران العدوى داخل الرئة مع 2000 كفو من ك. الالتهاب الرئويه. (A) تعداد الكريات البيض الإجمالية (WBC)، العدلات (السوداء)، والضامة (Mφ) في السائل المجال الجوي في وقت مختلف نقاط بعد الإصابة. (ب) عند تلطيخ، PMNs والضامة ويمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق التشكل النووي والحجم في مجالات cytospin وعدها. (C - D) العدوى في الذكور والإناث يؤدي إلى أعداد مماثلة من الخلايا الالتهابية تجنيدهم في 24 ساعة و 48 ساعة بعد العدوى. تستمد البيانات 6-25 / الفئران في حالة وهي يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وبفعل السيتوكينات و chemokines في المجال الجوي في الاستجابة للعدوى البكتيرية أعطيت C57BL / 6 الفئران intrapulmon: الرقم 4.عدوى آرى مع 2000 كفو من ك. الرئوية. السيتوكينات BALF و chemokines وكميا عن طريق فحص تعدد الإرسال في 24 ساعة و 48 ساعة بعد العدوى. تستمد البيانات 5-15 الفئران / حالة ويعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/ أعطيت التوسع الوقت التي تعتمد من عبء الجرثومي في الرئة والأنسجة الطرفية أثناء الالتهاب الرئوي C57BL 6 الفئران العدوى داخل الرئة مع 2000 كفو من ك: الرقم 5. وقد تم قياس الرئوية. (A) الرئة متني عبء البكتيريا عن طريق طلاء التخفيفات المسلسل من جناسة الرئة على TSA 24 ساعة و 48 ساعة بعد العدوى. (ب) مجرى الدم و(C) عبء البكتيرية الطحال وتم قياس كمية مماثلة. ( F) عبء البكتيرية في الأنسجة المختلفة ما يعادل في الفئران الذكور والإناث بعد تحريض من الالتهاب الرئوي. تستمد البيانات من 10 الفئران / حالة ويعني ± SEM. تم تعيين الصفر القيم في لوحات B، C، E و F قيمة 0.1 للسماح الرسوم البيانية على نطاق والسجل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نماذج الفئران من الالتهاب الرئوي الجرثومي، في شراكة مع استهداف الجينات وفي التدخلات البيولوجية والدوائية الجسم الحي، وقدمت أفكارا هامة في الاستجابة دفاع المضيف الرئوية. وقد تقدما كبيرا ولا سيما في فهمنا للكيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تحكم توظيف العدلات إلى المجال الجوي المصاب ^10،11. وفي النماذج الحية من الالتهاب الرئوي، على عكس النهج القائم على خلية أو بديلة، وقد وفرت أيضا أفكارا رئيسية في الغدد الصماء الاتصالات التي تحدث بين الرئة المصابة وغيرها من الأجهزة، مثل الكبد (استجابة المرحلة الحادة) ¹² والغدد الكظرية (السكرية الإجهاد) ^13. وأخيرا، نقطة حرجة وسريريا ذات الصلة للغاية التي كشفت عنها في النماذج الحية الالتهاب الرئوي هو أن نجاح إزالة العوامل المسببة للأمراض ليست بمثابة نجاح للمضيف. في كثير من الحالات، استجابة مناعية overexuberant قد يؤدي إلى الموت للمضيفبسبب اصابة المارة الرئة المفرطة، حتى في مواجهة ناجحة إزالة العوامل المسببة للأمراض ^8،14. ونظرا لهذا، وقياسات موازية لإزالة مسببات المرض والاستجابة المناعية عادة ما تكون أكبر قدر من المعلومات، وربما تكون هناك حاجة دراسات البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف للكشف عن مرونة متكاملة للمضيف.

هنا، التي وصفناها طريقة بسيطة وغير الغازية للتسليم من البكتيريا إلى الرئة الفئران عن طريق الطموح. مقارنة هباء، وهذا الأسلوب يحمل انخفاض المخاطر المحتملة للتعرض الجهاز التنفسي للأفراد الدراسة، ينص على تسليم اللقاح أعلى تركيزا مع رئة عميقة، ويتجنب الخلط المحتملة من جانب العين ومجرى الهواء العلوي الاستجابات المناعية. كما يحمل الأنف التلقيح القلق يحتمل أن يتيه من عدوى مجرى الهواء العلوي، بما في ذلك إمكانية العدوى الغازية محليا من الجهاز العصبي المركزي ^4، وكما ذكرت أن يؤدي إلى قائح متغير بدرجة كبيرة في الرئة^5. وبالمقارنة مع التنبيب الرغامي عن طريق إما بطريق الفم؛ بالفم أو الطريق عبر الجلد، يتطلب هذا الأسلوب الحد الأدنى من التدريب، أكثر سرعة (~ 1 دقيقة لكل الماوس)، و، على الأقل بالمقارنة مع الأسلوب الأخير، لديها أدنى معدلات الإصابة بالأمراض. العيوب المحتملة لطريقة طموح البلعوم - وبعضها مشترك من قبل وسائل أخرى - وتشمل متطلبات التخدير العام، واحتمال غير مكتمل (أي غير المتماثلة وغير متجانسة) تسليم الممرض، والعدوى السائد من الفصوص السفلى ^15، وعدم القدرة على توجيه الممرض من جانب واحد إلى رئة واحدة. بسبب التوزيع غير مكتمل في الرئتين بعد الطموح (لا تظهر البيانات) - وهي النتيجة التي واجهتها مع جميع طرق العدوى الرئة الأخرى من هباء ¹⁵ - ونحن عموما لا يؤدون فحوصات الرئة من جانب واحد على الفئران المصابة. إما lavaged كلا الرئتين معا لتقييم الاستجابة المناعية، أو necropsied معا لضليع في الرياضيات البكتيرية المجمعةitation و / أو التحليل الجزيئي (على سبيل المثال، التعبير الجيني، الميلوبيروكسيديز الفحص، خلوى ELISA). الخطوات الحاسمة وخاصة البروتوكول هي خطوة 1.8 -confirming التطوير التنظيمي _600: كفو العلاقة / مل قبل في الجسم الحي العدوى وأيضا يؤكد تركيز اللقاح من خلال الطلاء في كل تجربة. وكذلك خطوة 3.6 - ضمان غسيل غير الصدمة من مجرى الهواء مع عوائد حجم جيدة في حقنة.

على الرغم من الاصابات المشتركة مع النباتات عن طريق الفم (أي والالتهاب الرئوي متعدد المكروبات) هو مصدر قلق النظري، ونحن لم اجه المستعمرات البكتيرية متعددة الأشكال في الخليط الرئة من الفئران المصابة مع ك. الرئوية أو S. الرئوية. للمحققين تشعر بالقلق إزاء هذا الاحتمال، ومع ذلك، السيطرة على الفئران يمكن أن يتعرض لمركبة يستنشق (أي عازلة)، إذا رغبت في ذلك. على الرغم من أن بعض تلوث التجويف المعدة (عن طريق ابتلاع البكتيريا unaspirated المتبقية) هو ممكن خفة دمح طريقة وصفنا، ونحن لم اجه علامات أو تغييرات في علم الأمراض السريرية الإجمالي الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، هذا الاحتمال هو شائع إلى أساليب هباء والأنف، وحتى يمكن أن تحدث بعد السعال في طريقة التلقيح داخل القصبة الهوائية.

بعض المخاوف المنهجية عالمية لجميع نماذج الالتهاب الرئوي. وينبغي أن تكون المجموعات الضابطة والتجريبية الماوس مثالي في غضون 2-3 أسابيع من بعضها البعض العمر المتطابقة. على الرغم من أننا لم نجد الفروق بين الجنسين العلنية في إزالة العوامل المسببة للأمراض أو التهاب الشعب الهوائية في ك. الرئوية نموذج، وينبغي أن تكون الفئران المتطابقة بين الجنسين، كما تم الإبلاغ عن فروق ذات دلالة إحصائية بين الجنسين في الاستجابة المناعية الفطرية ^16. ينبغي النظر بعناية في الأصل من السيطرة على الفئران. ضوابط Littermate هي الأفضل عموما أكثر من الضوابط التي تم شراؤها تجاريا باسم backcrossing غير مكتمل، والاختلافات المتعلقة microbiome في السكان الخلايا المناعية، وغيرها من epigenetالخلافات جيم كلها الإرباك المحتملة التي قد تؤثر على استجابة مناعية ^17،18. وينبغي إيلاء الاهتمام الدقيق لالمصلي محددة ويمكن أن ينظر إليها زراعة تاريخ بكتيريا تصيب عن التباينات الكبيرة في الفوعة. بناء على خبرتنا مع ك. الرئوية، نوصي إجراء دراسات التجريبية الأولية باستخدام مجموعة من اصابة قائح (على سبيل المثال، 500-2،000 كفو) كما الاعتلال / وفيات جرعات البكتيرية محددة ذكرت في الأدب - حتى مع نفس البكتيريا المصلي والماوس سلالة - قد لا تترجم جيدا إلى مختبر واحد نفسه، من المحتمل بسبب مجموعة متنوعة من التناقضات التقنية. الاختلافات بين الجماعات بين السيطرة وفئران التجارب في نتائج الدفاع التهابات والمضيف قد تكون تعتمد على اللقاح. ويرجع ذلك إلى الحقائق اللوجستية للتربية الحيوانات والموظفين، ونحن في كثير من الأحيان إجراء التجارب مع الفئران 5-6 في المجموعة التجريبية. على الرغم من أن هذا يوفر بعض الأحيان قوة إحصائية كافية لقوات التحالفU وعدد خلايا النتائج، نجد أننا غالبا ما تحتاج إلى تكرار دراسة بهذا الحجم واحد أو أكثر من مرة من أجل تحقيق قوة كافية.

بالنسبة لبعض الفئران في تجربة معينة، أي نمو جرثومي يمكن كشفها في الدم والطحال قد يكون واجه 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 5). نحن نفسر هذا يشير إلى أن 24 ساعة قد تكون بالقرب من عتبة الحركية للنشر خارج الرئة يمكن كشفها. إذا لوحظ انخفاض / النمو لا يمكن الكشف عنها في الدم / الطحال والرئة CFUs من نفس الماوس يجب دائما أن تدرس لمعالجة احتمال وجود خطأ فني (أي منخفضة جدا / غير قابل للكشف التهاب في الرئتين ربما يشير إلى خطأ في الجرعات من الماوس).

وفي الختام، وطريقة التسليم طموح الفم والبلعوم لعلاج الالتهاب الرئوي البكتيري في الفئران هي تقنية قوية التي هي سهلة نسبيا للحصول على من التكلفة، والتدريب، وجهة نظر المعدات، وغير واقعي حتى بالنسبة للمختبرات دون خبرة واسعةفي إجراءات الرئوية. ويقترن طريقة بسهولة إلى فحوصات ميكروبيولوجية والمناعية المصب من الاستجابة دفاع المضيف، ويمكن علاوة على ذلك أن تستخدم وسيلة لتوصيل الرئة لمجموعة واسعة من التعرض غير الكاوية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4