Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.
Abstract
התחדשות שריר שלד היא תהליך פיסיולוגי המתרחש שרירי שלד מבוגרים בתגובת פציעה או מחלה. פגיעה הנגרמת חריפת התחדשות שריר שלד היא בשימוש נרחב, מערכת מודל רבה עצמה כדי לחקור את האירועים מעורבים התחדשות שרירים, כמו גם את מנגנוני שחקנים שונים. אכן, ידע מפורט של תהליך זה הוא חיוני להבנה טובה יותר של מצבים פתולוגיים שמובילים ניוון שרירי שלד, וזה מסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות חדשות. העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול מפורט לשחזור להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים באמצעות זריקה תוך שרירית אחת של cardiotoxin (CTX). CTX שייך למשפחת מרעלים ארס נחשים וגורם myolysis של myofibers, אשר בסופו של דבר מעורר את אירועי התחדשות. הדינמיקה של התחדשות שריר שלד מוערכת על ידי ניתוח היסטולוגית סעיפי שריר. הפרוטוקול גםממחיש את הפרוצדורות עבור לנתח, מקפיא, חיתוך השריר הקדמי tibialis, כמו גם מכתים Hematoxylin & Eosin שגר כי נעשה שימוש נרחב לניתוח מורפולוגיים morphometric הבא.
Introduction
שרירי שלד מבוגרים יונק נוצרים על ידי קבוצות של fascicules של תאי שריר multinucleated (myofibers) כי הם מיוחדים עבור התכווצות. כל myofiber הוא syncytium מוארך, מוקף sarcolemma (קרום plasmatic) ו במיופיברילים המכיל, אשר עשויים מחלבונים התכווצות מאורגן קבוע וחוזר (סיבי אקטין ו שרירן). בהבגרות ובתנאים המנוחים, שרירי שלד יש תחלופה נמוכה מאוד של myonuclei שלהם 1; ואכן, myonuclei, אשר ממוקמים בפריפריה של myofiber, תחת sarcolemma, נעצרים בשלב G0 של מחזור התא אינם מסוגלים להתרבות 1,2.
יש שרירי השלד יכולת מופלאה להתחדש בעקבות נזקים והגיע הומאוסטזיס לאחר מספר אירועים של שיפוץ רקמות שאינן קשורות באופן הדוק זה לזה. לאחר פציעה או טראומה חריפה, ניוון מושרה, ואחריו תהליכי התחדשותשכוללים אוכלוסיות תאים שונות, כולל אוכלוסיית תושב תאי שריר, תאי הלווין (SCS). ואכן, בהעדר כל לגירויים סביבתיים, תאי הלווין נמצאים במצב שקט וממוקמים בתוך גומחה בין sarcolemma ואת 3,4 lamina הבסיס. בעקבות פציעה או מחלה, גיל להיות מופעל, להתרבות, נודד אל האזורים שנפגעו, ובסופו של דבר להבדיל, והוליד להרכיב חדש myofibers 5. גיל הופעל להקים הצטלבות עם אוכלוסיות תאים שונות, תאים דלקתיים בעיקר, אשר מגויסות באתר של טראומת 6-8. הצטלבות זו מאפשרת לתאים אחרי פרדיגמה מוסדר שבו אותות מולקולריים לנהוג שינויים מבניים, המוביל בסופו של דבר הומאוסטזיס 9. מלבד גיל, תאים דלקתיים ביניים, תהליכי אנגיוגנזה, ואירועים מחדש עצבוב מעורב גם, מתנהג באופן מתואם כדי לתקן המאורגן הזה מאוד שלמבנה pecialized.
יש עניין רב בלימוד היבטים שונים של התחדשות שריר שלד, לא רק להבין את הפיסיולוגיה של השריר, אלא גם כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות הדורשות ידע עמוק של התהליך כולו. גישות ניסוייות קיימות מספר כרגע ללמוד את זהותו ותפקידו של אוכלוסיות תאים שונות, מסלולי איתות, ואת המנגנונים המולקולריים המעורבים. מודלים עכבר של פגיעה חריפה מייצגים כלי רב עוצמה כדי לחקור היבטים רבים של תהליך זה. שונים השתמש בטכניקות נפוצות כדי לגרום ניזק לשרירים חריף מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תהליך ההתחדשות in vivo, מן בשלבים מוקדמים מאוד עד סוף התהליך. פרוטוקול זה מתאר את השלבים מן זריקה תוך שרירית של cardiotoxin הנגזרות ארס נחשים (CTX), אשר גורם myolysis ומפעיל את תהליך השיקום, עד מועד ניתוח של דגימות רקמה. בעקבות הזרקת CTX, מילce אפשר להקריב בנקודות זמן שונות בהתאם לדרישות ניסוי, ואת שרירי השלד יכולים להיות גזור ומעובד לניתוח נוסף. לבסוף, אנו מתארים את פרוטוקול מכתים סעיפי רקמות לבצע תצפיות מורפולוגיים ניתוחים כמותיים בסיסיים. פרוטוקול זה מאפשר לחקר התחדשות שרירי השלד חריפה in vivo באופן מאוד לשחזור 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם קפדן עם ההנחיות המוסדיות עבור מחקר בבעלי חיים ואושר על ידי המחלקה לבריאות הציבור, בריאות בעלי החיים, תזונה ובטיחות המזון של המשרד האיטלקי בריאות בהתאם לחוק על ניסויים בבעלי חיים. נהלים נקע בצוואר רחם עשויים להשתנות ממוסד למוסד מבוסס על IACUC או הדרישות המקבילות שלה.
1. הזרקת Cardiotoxin בשריר השוקה הקדמית
- כן 10 מיקרומטר פתרון עובדים של cardiotoxin (CTX) על ידי דילול פתרון מניות cardiotoxin ב פוספט שנאגר סטרילי מלוח (PBS) או במים לפני תחילת ההליך.
הערה: CTX הוא מסיס במים הוא 1 מ"ג / מ"ל. כן פתרון מניות 70 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. CTX משמש פרוטוקול זה הוא תערובת של cardiotoxins בעל משקל מולקולרי של כ -7,000 Da.
זהירות: מומלץ ללבושכפפות כפולות, מסכה היגיינה, משקפי מגן (לחלופין משקפי מגן, מומלץ לעבוד מתחת למכסת מנוע) וכדי להיות מאוד זהיר כדי להימנע מכל מגע עם הפתרון, גם אם מדוללות. - להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של קטמין ו xylazine (80 מ"ג / ק"ג ו -10 מ"ג / ק"ג של מסת גוף) או הרדמה זמין מאושרת אחרת.
- עם הפנים כלפי מעלה עכבר, לרסס את הגפיים האחוריים עם אתנול 70%. כדי להמחיש את המיקום המדויק של שריר השוקה הקדמי (ת"א), בעזרת אזמל, לחתוך את השיער משם בחלק הקדמי של הרגל התחתונה, מתחת לברך.
הערה: שריר ת"א עולה מהגוף הפרוקסימלי של עצם השוק, יורד לרוחב עד העצם וכלה באזור הקרסול. הגיד הארוך שלה משתרע לתוך כף הרגל ברחבי הקרסול (ראה איור 1 א). - צייר ~ 100 μL של פתרון לתוך מזרק על ידי משיכת הבוכנה חזרה לאט.
- הסר בועות אוויר, מחזיק את המזרק כלפי מעלה (עם המחט כלפי מעלה). משוך בעדינות את הבוכנה כלפי מטה והקש על הצד של המזרק כדי לעזור בועות אוויר שהיו מחוברים אל החלק הפנימי של הצינור לבוא כלפי מעלה. לאט ללחוץ על המתג כדי לשחרר בועות אוויר גדולות. כמה טיפות של נוזל ייצא המחט. בשלב זה, הקפד לבחור את הנוזל שוב לתוך הצינור ולא לפזר אותה, בהתחשב הרעיל של cardiotoxin.
- לשאוב את התמיסה לתוך המזרק עד המינון הרצוי הוא הגיע. להזריק 20 μL של פתרון CTX עבור כל שריר ת"א.
- הכנס את המחט במרכז ת"א על ידי ביצוע עמדת עצם השוקה כקו מנחה, מן הגיד לכיוון הברך. מאז ת"א היא רקמה דקה, לבצע הזרקת מבלי לעבור עמוק מדי (להכניס את המחט 2/3 מ"מ עמוק, בערך בשעה 10 ° עד 20 ° זווית), ולהימנע הולך מעבר השריר עצמו (איור 1 א).
- אין למשוך את המחט מיד לאחר ההזרקה, אך לחכות 2 - 3 שניות כדי למנוע דליפהגיל CTX טיפות מן השריר.
- לאחר ההליך, למקם את הכלוב על צלחת מחוממת (37 מעלות צלזיוס) עד העכברים ערים, מאז ההרדמה ואת אתנול המשמש להפחית את טמפרטורת גוף.
בידוד 2. שוקה קדמית
הערה: שרירים יכולים להיות מבודדים בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת cardiotoxin פי דרישות ניסוי.
- להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
- רסס את hindlimbs עם אתנול 70%. במהלך ההליך, בעל החיים יכול להיות קבוע על תמיכה להחזיק אותו.
- חותכים את העור ברמה של גיד הפרוקסימלית (מעל כף הרגל), הכנס אחד הלהבים של המספריים מתחת לעור, לחתוך את העור כלפי מעלה, לכיוון הברך. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור ולחשוף את השריר לגמרי. מוציאים בזהירות את כל העור והשיער מאזור עניין.
- לחסל את fascia ידי צובט לאט או חיתוך (עם הב-קצה פינצטה או עם מייקרו בסדר לנתח מספריים) בפריפריה הקיצונית של השריר בצד הנגדי של הטיביה (האיור 1B). לאחר שבור, להסיר את fascia בעדינות בעזרת פינצטה דקה-קצה; למנוע נזק לשריר הבסיסית.
הערה: כמו עם שרירים אחרים ואיברים, ת"א מכוסית על ידי fascia (fascia העמוק של הרגל), שכבה דקה של רקמת חיבור שנמצאת עמוק מתחת לעור וזה צריך להיות מוסר לבודד לשריר הבסיסי בקלות. - דמיינו את גיד ת"א דיסטלי ואת גיד פושטי digitorum מעל כף הרגל, אשר מונחים זה לצד זה. הגיד של שריר פושטי digitorum Longus (EDL) ממוקם מעט מתחת גיד ת"א. הגידים של עכברים בוגרים גלויים לעין בלתי מזוינת.
- הסר את שריר ת"א הבא באחת משתי השיטות הבאות:
- חותכים שני גידים עם מיקרו בסדר לנתח מספריים ולמשוך אותם לכיוון הצד הפרוקסימלי, מחזיקהg הגידים עם מלקחיים. הפרד את שני הגידים, מושך אותם בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי להפריד את השרירים.
- בעזרת פינצטה דקה-קצה, להפריד את גיד ת"א דיסטלי מן גיד פושטי digitorum ידי העברת הקצה מתחת הגיד עצמו (איור 1 ג, תמונה עליונה). חלק בעדינות את פינצטה מתחת ת"א להפריד אותו מן השרירים הבסיסיים (התרשים 1C, תמונה למטה).
- החזק את פינצטה מתחת לשריר כדי לשמור אותו מורם מעט, לחתוך את הגיד TA, בעדינות למשוך אותו כלפי מעלה עד שרק באזור מתחת לברך מצורף (1D איור, תמונה משמאל). חותך את ת"א מתחת לברך, הוא הולך על הגבולות השרירים עם המספריים (1D איור, נכון תמונה).
הערה: אם השריר נשאר מחובר מעט לצדדים, השתמש מיקרו בסדר לנתח מספריים כדי לעזור לנתק אותו.
הערה: אם המלקחיים לא מתאימים בקלות מתחת ת"א,זה אפשרי כי fascia לא הוסר לחלוטין, וזה עדיין יכול להיות גלוי על גבי השריר. במקרה זה, הסר את fascia לחלוטין לפני שתמשיך.
3. טכניקת שרירים קפואה
- מניחים כמות קטנה של מסטיק tragacanth או תרכובת הקפאת דבק דומה (למשל, טמפרטורה אופטימלית חיתוך (תרכובת OCT)) על פרוסת הפקק. לייבל פרוסה של הפקק בצד ההפוך לפני ההקפאה, במידת הצורך (איור 2 א).
- על מנת לקבל חלקים רוחביים של השריר, להטביע את ת"א לתוך מסטיק tragacanth ידי החדרת הגיד הדיסטלי ולהשאיר על 3/4 של השריר בחוץ, והקפד יש שריר במצב מאונך ביחס הפקק (איור 2A).
- מלאו פחית אלומיניום (לחלופין, כוס מתכת או כוס זכוכית), עם איזופנטאן. להשעות את פחית איזופנטאן בתוך LIQUI המכיל דיוארחנקן ד, שאינו מאפשר את החנקן הנוזלי להיכנס לפח.
הערה: איזופנטאן צריך להגיע לטמפרטורה הנכונה (מ -150 ל -160 מעלות צלזיוס) במשך הקפאה אופטימלית של הרקמה. הטמפרטורה הנכונה הוא הגיע כאשר כמה חלקיקים מוצקים לבן הטופס בתחתית של פחית ואת איזופנטאן הופך צמיג מעט.
הערה: אין להקפיא המדגם לפני ההיווצרות של החלקיקים המוצקים, כפי שהוא יכול להוביל חפצים מקפיאים. מצד שני, אם איזופנטאן הופך לגמרי מוצק, להשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מופשר, ולוודא כי חלקיקים לבנים וחלקם עדיין קיים. - בעזרת מלקחי Mixter, טובל את הפקק במהירות עם השריר לתוך איזופנטאן, שמירה על מטה ממוצבת השריר, ולוודא כדי לשחרר את הפקק כאשר הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל. בדרך זו, בעוד הדגימה צפה, רק הצד ההפוך של הפקק צריך להיות גלוי בתוך הנוזל.
- השאירו את sample ב איזופנטאן דקות 1.
- בעזרת מלקחי Mixter (או מלקחיים דומים), לקחת את השריר לטבול אותו בחנקן נוזל 2 דקות לפחות.
- עוטפים את דגימות בנפרד בנייר אלומיניום שכותרתו ומיד למקם אותם בקרח יבש (-70 ° C), או ישירות לאחסן אותם מקפיא -80 מעלות צלזיוס.
הערה: לאורך כל ההליך, מצעדי 3.4 ל 3.7, זה מאוד חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה הנכונה ולמנוע דגימות מן המפשיר (למשל, במהלך ההעברה מקפיאה -80 מעלות צלזיוס.). תוצאות הטמפרטורה עולות פשרה מבוקרת refreezing של microcrystals המים שנמצאים בתוך הרקמה, ובסופו של דבר גורם להיווצרות של חפצים או ההתמוטטות של סיבי שריר (דמיינו על סעיפי רקמות כמו חורי לבן גדולים במרכז של הסיבים).
4. cryostat חתך של שרירים קפואים
- הגדר את t הטמפרטורה בתא cryostato -20 עד -22 ° C.
- שים את בדל הדגימה, להב, ואת הדגימה בתא cryostat, המאפשר להם לאזן במשך 30 דקות לפחות.
- מניחים כמות קטנה של תרכובת הקפאה (למשל, במתחם אוקטובר) על בדל הדגימה לטבול את הפקק עם הדגימה לפני מתמצק מתחם מקפיא. בינתיים, למקם את הלהב בעל להב.
- יישר את הדגימה ואת הלהב באמצעות הברגים המצורפים כדי לכוון את בעל הדגימה עם מחזיק הלהב (תרשים 2B).
- הגדר את עובי סעיף 10 מיקרומטר. המשך כדי לחתוך את הרקמה. עבור כל סיבוב של גלגל הכונן, בעל הדגימה מקדם מרחק מבוקר כלפי הלהב.
- מניחים את הסעיפים בשקופית מקוטב (8 עד 10 סעיף לכל שקופית) (איור 2 ג).
- לאחר חתך, אחסן את השקופיות ב -80 ° C.
הערה: הדגימה ניתן לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס ולעשות בהם שימוש חוזר עבור further חתך, אם ינוהלו כהלכה ומאוחסנים.
5. מכתים היסטולוגית שיגרתי (Hematoxylin & Eosin כתם)
הערה: כתמי היסטולוגית מספר יכולים להתבצע על סעיפים שריר על פי הניתוח. כתם היסטולוגית שגרתי לניתוח מורפולוגיים morphometric הוא Hematoxylin & Eosin (H & E) כתם bichromic. Hematoxylin מכתימה את הגרעינים סגול עמוק. מכתים גרעיני הוא counterstained עם eosin (ורוד / אדום), אשר מכתים מבנים אאוזינופילית, כגון myofibers בציטופלסמה.
- לגמרי אוויר יבש שקופיות קפוא עם חלקים במשך 10 - 15 דקות בטמפרטורת חדר, להגיש את שקופיות מגש מכתים, ולשים את מגש שוקת מכתימה.
- כתם דקות 1 עם hematoxylin.
- הנח את שוקת מכתים תחת סילון מים ברז חלש למדי במשך 10 דקות כדי לשטוף את hematoxylin.
- לטבול את השקופיות עבור 5 דקות באתנול 95%, אם פתרון אלכוהוליים של eosin ישמש (לדלג tהצעד שלו במקרה של פתרון eosin מימי).
- Counterstain דקות 1 עם פתרון eosin.
- לשטוף עם מים לחסל פתרון eosin מוגזם.
הערה: תזמון אופטימלי של מכתים עם או hematoxylin או eosin צריך להיות מוגדר עבור כל אצווה חדשה. - מייבש את הדגימות בסדרת אתנול מדורגת: 50% ו -70% (כמה שניות כל אחד). במהירות לטבול אתנול 95%, ואחריו 2 שינויים אתנול 100%, 5 דקות כל אחד.
- נקה 2 שינויים של קסילן, כל 5 דקות או יותר. צעד זה חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע כימי.
- הר השקופיות עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן, החל כמה טיפות של הרכבה בינונית בשקופית ומכסה עם coverslip. המדיום גובר יכול לחול גם על coverslip ואת coverslip לשים בשקופית.
- הימנע ויוצרים בועות אוויר בין שקופיות coverslip. כדי לחסל בועות אוויר, לשמור את השקופית אנכית (לאחר ההרכבה) ו לסחוט את מו העודףבינוני unting ובועות אוויר על ידי הלחיצה בעדינות על coverslip עם מלקחיים בוטים (או כלי קהה דומה).
- שמור את השקופיות מתחת למכסה המנוע במשך כמה שעות או למשך הלילה כדי לאפשר קסילן להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך ניתוח.
- לבצע את הניתוח המורפולוגי morphometric של H & E מוכתמים סעיפי התחדשות שריר באמצעות תמונות הסדרה שאינן חופפות של לפחות קטע שריר אחד שלם לכל עכבר. צלמו תמונות עם מיקרוסקופ שדה בהיר, עם הגדלה 20X.
הערה: ישנו מספר קטן של 5 עכברים מומלץ להשיג מובהקות סטטיסטית של המדידות.
הערה: תוכנה לניתוח תמונה זמינה למטרה זו, כגון ImageJ תוכנה להורדה בחינם (http://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צביעת H & E מאפשרת ההערכה של המורפולוגיה של תהליך ההתחדשות בנקודות זמן ספציפי במהלך רגנרציה שרירי שלד. איור 3 מציג את הניתוח כמובן הזמן שבוצע על שרירי ת"א נפצעו של עכברי סוג ברים. שרירים בודדו בבית 3, 7, 15, ו -30 ימים לאחר הזרקת CTX, כמו schematized באיור 3 א. תמונות נציג של H & חלקים רוחביים מוכתם E להראות הדינמיקה של תיקון שרירי שלד לאורך זמן (איור 3 ב-ה). ביום 3 לאחר פציעה, הארכיטקטורה המבנית של השריר נהרסה לחלוטין, ושניהם מידרדים myofibers (אזור נימקים) ו mononucleated תאים גלויים לעין (איור 3 ב). קבוצת הטרוגנית זו של תאים מורכבת בעיקר תאי לווין הגברה חולפים (myoblasts), תאים דלקתיים גויסו מדם 11, ו ביניים ותאי האנדותל כי Participate בתהליך ההתחדשות, אשר מופעל באתר של פציעה. בהקשר זה, myofibers ההתחדשות החדש מופק על ידי היתוך והבחנה של myoblasts. התכונה העיקרית של אזור ההתחדשות היא הנוכחות של myofibers basophilic הקטן עם גרעינים במיקום מרכזי וחדר הציטופלסמה כהה מוכתם (איור 3 ג). בשלב זה, דלקת עדיין גלויה, אם כי זה מקטין בהדרגה. גודלו של התחדשות myofibers מגדילה לאורך זמן, והוליד myofibers מחדש אאוזינופילית מאופיין גרעינים במיקום מרכזי (איור 3D, E). Myofibers מחדש גלויים בשלבים מאוחרים יותר של התחדשות ועד סוף התהליך. Myofibers הבריא להופיע מאוד מאורגן קרוב זה לזה, עם הציטופלסמה ורוד עם הגרעיני להציב בשולי הסיבים, תחת sarcolemma. myofibers אלה הם בדרך כלל כאלה שכיום עדיין מאתר ההזרקה ופציעה CTX, והם יותר נדיריםly לייצג באזורים שבהם ההתחדשות הושלמה באופן סופי. ואכן, סיבים מחדש מאופיין על ידי הנוכחות של גרעינים במיקום מרכזי כי לעבור לפריפריה רק מספר חודשים לאחר פציעה.
תמונות דיגיטליות של חלקי שריר המוכתמים נלכדות על ידי הוספת הברים בקנה המידה לכיול מרחבית, אשר יש צורך למדוד את תחומי העניין בצורה מדויקת על ידי מתאר את קווי המתאר של האזורים המעוניינים. מדידת שטח החתך myofiber (CSA) היא ניתוח morphometric אמין, שנמצא בשימוש נרחב כדי לכמת את הבדלי מגמת ההתחדשות בין קבוצות השונות של עכברים. ניתוח זה דורש למדוד תחומי myofibers הגרעיני מרכזי, כולל לפחות 500 עד 1,000 סיבים לכל סעיף. הן הממוצע של ההתחדשות ואזורי myofiber מחדש וחלוקת גאוס התחומים הללו הם אינדיקטורים של proc ההתחדשותESS. CSA myofiber המוגבר קשור בדרך כלל עם תגובה רגנרטיבית שיפור ו / או מואצת. להיפך, כישלון של התחדשות נכונה קשור לירידת CSA. הנה, דיווחנו על ניתוח CSA myofiber, הצביעו שכן הן הממוצע (איור 3F) והפצה (איור 3G) של CSA myofiber בנקודות זמן שונות. מדגיש הניתוח איך חלוקת אזורי myofiber משתנה במשך זמן ואיך משמרות CSA כלפי סיבים בגודל גדולים כתהליך של תמורת התחדשות.
איור 1. תוך שרירית הזרקה ובידוד של שריר tibialis. א תוך שרירית זריקה של cardiotoxin בשריר הקדמי tibialis. B. הסרת fascia שריר. החץ הלבן מצביע פינצטה דק שקצהו כי לצבוט את השריר כדי להסיר הfascia דואר. ג. התמונה העליונה מראה את המיקום האנטומי של גיד ת"א דיסטלי. התמונה התחתונה מראה כיצד להרים את ת"א ולהסיר אותו תוך הימנעות נזק לשרירים. D. תמונה משמאל: ת"א שיוסר על ידי משיכת הגיד הדיסטלי כלפי מעלה. החץ הלבן מצביע גיד אדי דיסטלי. תמונה מימין: על ידי לחיצה על הגיד עם מלקחיים, הקצה העליון של ת"א נחתך מתחת לברך. החץ הלבן מצביע באתר החיתוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. טריים שרירי הקפאת cryostat חתך של שרירי קפוא. טכניקה א של הכללת שריר טרי מסטיק נכאת. שריר ת"א הוא שקוע בתוך המסטיק מן הגיד, עם כ 3/4 בחוץשמור במצב מאונך ביחס הפקק. נציג תמונות ב נוהל חתך cryostat. הפקק מושם כמות קטנה של הקפאת מתחם על בדל הדגימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח מהלך זמן של התחדשות שריר שלד. מערך ניסוי א של פציעה בשריר שלד חריפה. BE. תמונות נציג של Hematoxylin & Eosin מוכתמים קטעי cardiotoxin (CTX) -treated שרירי ימים מצוינים לאחר פציעה. B. השורה רציפה שחור (בצד שמאל של התמונה), סוגר כמה סיבים נמקי, פלשו ככל הנראה על ידי תאים דלקתיים. השורה המקווקות (צד ימיןשל התמונה) מסמן שטח של הסתננות תאי mononucleated. ג myofiber אחת בשלה עם גרעין במיקום מרכזי מצוין על ידי העיגול השחור. DE. myofibers אאוזינופילית גדולה מחדש, עם גרעינים במיקום מרכזי מסומנים עיגולים שחורים. ברים סולם מייצגים 100 מ"מ. פ הממוצע של ערכי גודל myofiber גרעיניים מרכזי בסעיפים שרירים ת"א. ערכים הם ממוצעים ± SEM, 5 עכברים / קבוצה. ג Myofiber חתך באזור (CSA) הפצה 6, 15, ו -30 ימים לאחר הזרקת CTX. ערכים הם ממוצעים ± SEM, 5 עכברים / קבוצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול לגרום לפגיעה חריפה בשרירי השלד (כלומר, זריקה תוך שרירית של CTX). זה נעשה שימוש נרחב ככלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של התחדשות שריר השלד in vivo. הזרקת CTX גורמת לניוון של סיבי שריר, אשר נגרם על ידי שלילת הקוטביות של sarcolemma ואת ההתכווצות של הסיבים 12, ומפעילה המפל של אירועים שמובילים התחדשות שריר. שרירי שלד גזורים בנקודות זמן רצויות לאחר ההזרקה ופציעה, על פי דרישות ניסוי, ומשתמשים עבור ניתוחים היסטולוגית שלאחר מכן. השרירים הגזורים יכולים להיות קפוא, לאחר ההכללה במדיה קריו-מגן, או נכללים פרפין. עם זאת, נהלים אלה מחייבים צעד של קיבוע מראש עם paraformaldehyde, אשר יכול ליצור חפצים ובסופו של דבר יכול להשפיע על ניתוחים שלאחר מכן. הקפאת הרקמה ישירות יכולה למנוע בעיה זו. מן הראוי לציין כי רביםנוגדנים ראשוניים לעבוד באופן בלעדי או באופן יעיל יותר על חלקי שרירים קפואים 13, מה שהופך הליך זה אמין יותר. ניתוח morphometric מתבצע לרוב על ניסויים כמובן זמן, המאפשרים הערכה של הבדלים בתהליכי ההתחדשות בין קבוצות של עכברים עם אותו הגיל ועם מוטציות גנטיות ספציפיות ו / או טיפול תרופתי. אף על פי הפרוטוקול של נזק הנגרם CTX הוא מאוד לשחזור כשלעצמה, מגבלה אפשרית בשל השתנות תלויי מפעילת הזרקת CTX. כדי להתגבר על מגבלה זו, עדיף כי הניסוי כמובן כל הזמן מתבצע על ידי אותו המפעיל.
היקף התחדשות שריר ניתן לכמת כאחוז סיבים בריאים, אזורים נמקי דלקת, התחדשות ואזורים מחדש על השטח הכולל. עם זאת, גישה זו משמשת בעיקר כאשר לומדים אירועי נזק כרוני, כגון מיל MDX דיסטרופיce, ולא במודלים של פציעה אקוטית. ואכן, תוך שרירי דיסטרופי מאופיין אירועים אסינכרוני של ניוון והתחדשות, פציעה אקוטית מלווה אירועים מוגדרים היטב ובסיסיים הרבה יותר. מגבלה אחת של ניתוחים אלו, הדורשים הזדהות אמפירית של תכונות מורפולוגיות שתוארו לעיל, היא כי הם לא משוחדים לחלוטין. כדי לתמוך במסקנות הניסוי, הניתוח הצורני תמיד צריך להיות כהשלמה עם ניתוח נוסף, כגון ניתוח immunofluorescence של סמנים מולקולריים ייחודיים, לתמוך מסקנות הניסוי. מסיבה זו, הוא העדיף להשתמש ניתוח מקביל לפרש את התוצאות באופן חד-משמעי. למשל, myofibers התחדשות מגואלות חיובים שרשרת כבדת שרירן עוברי (eMyHC) אשר באה לידי ביטוי במיוחד ב myofibers שהוקמה זה עתה. לכן, כימות של myofibers מוכתם eMyHC יכול להתבצע Side-by-side עם הניתוח הצורני.
ניתוח CSA הוא כימות אמין יותר והוא יכול להתבצע גם על סעיפים מוכתמים E H & או על חלקי שריר מוכתם laminin, המסמן את הקצה של סיבי השריר; כימות מתבצע באמצעות פקודות מאקרו מתאימות של ImageJ, כפי שתואר לעיל. בשני המקרים, זה תמיד יש צורך תחילה להעריך את איכות החלקים לא לכלול אזורים של רקמה אינם נראים מעווה או מסולסל.
לצד ניתוחים מורפולוגיים של הרקמות, H & E מוכתם סעיפים המאפשרים זיהוי של תכונות ספציפיות אחרות, כגון נוכחות של סיסטיק ו / או רקמת שומן. ואכן, סיסטיק נובעת הצטברות יתר של תאי מטריקס המתרחשת גם אם התחדשות נפגעת או במחלות כרוניות 14. ואכן, ההצטברות תא מטריקס גלויה כחומר חיוור שהופקד בין myofibers המתחדש H & E-היסטולוגית מכתים. סבבים רבים של הזרקת CTX ניתן להשתמש to מחלה כרונית לחקות שבו myofibers עובר גלי ניוון והתחדשות רקמות צלקת מצטברת aberrantly. עם זאת, פרוטוקולים אמינים יותר זמינים כדי לגרום סיסטיק שרירים 15, והכתימו היסטולוגית ספציפי ניתן לבצע כדי לזהות ולכמת את המבנים האלה, כגון מכתים סיריוס האדום Trichrome או של מייסון. היווצרות של רקמת שומן היא נראית בבירור H & חלקים מוכתמים E כמבנים לבנים מעוגלים בין myofibers, נותנים אינדיקציה חשובה הנוכחות של רקמת שומן, אשר לכמת ידי מכתים אדום השמן. לבסוף, סעיפים שרירי השלד המתקבל בעקבות הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע ניתוח immunofluorescence באמצעות נוגדנים ופרוטוקולים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
