Summary
この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。
Abstract
骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。
Introduction
哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核1の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し、1,2を増殖することはできませんされています。
骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス9につながる、構造的修飾を駆動することによって調整されたパラダイムに従うことができます。 SC、炎症および間質細胞、血管形成過程、および再神経支配のイベントの他にも、この高度に組織とsを修復するために協調的に作用し、関与していますpecialized構造。
筋肉の生理学を理解するだけでなく、プロセス全体のより深い知識を必要とする治療戦略を改善するだけでなく、骨格筋再生のさまざまな側面を研究することに大きな関心があります。いくつかの実験的アプローチは、現在、異なる細胞集団、シグナル伝達経路、および関与する分子メカニズムのアイデンティティと機能を研究するために利用可能です。急性の傷害のマウスモデルは、このプロセスの多くの側面を研究するための強力なツールを表します。研究者は非常に早い段階からプロセスの最後に、 インビボでの再生プロセスに従うことができるように、急性筋損傷を誘発する別の一般的に使用される技術。このプロトコルは、筋変性を誘導し、組織サンプルの分析まで、再生処理をトリガするヘビ毒由来の心臓毒（CTX）の筋肉内注射からの手順を説明します。 CTXの注射後、MICEは、実験の要件に応じて異なる時点で犠牲にすることができ、骨格筋を解剖し、さらなる分析のために処理することができます。最後に、我々は、形態学的観察結果と基本的な定量分析を行うための組織切片の染色プロトコルを記述する。このプロトコルは、非常に再現性のある方法10のin vivoでの急性骨格筋再生の研究を可能にします。
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Protocol
すべての実験は動物研究のための施設のガイドラインに厳密に従って行われ、動物実験に関する法律に従って公衆衛生、動物衛生、栄養と健康のイタリア省の食品安全省によって承認されました。頸椎脱臼手順はIACUCまたはそれと同等の要件に基づいて機関から機関に異なる場合があります。
前脛骨筋1.心臓毒注射
- 手順を開始する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または水中で心臓毒原液を希釈することにより、心臓毒（CTX）の溶液を作業10μMのを準備します。
注：CTXを1mg / mLで水に可溶です。 70μMストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 CTXは、このプロトコルのために使用される約7,000ダの分子量を有する心臓毒の混合物です。
注意：着用することが示唆されています二重手袋、衛生マスク、安全メガネは、希釈した場合でも、その溶液との接触を避けるために非常に注意する（あるいは安全メガネには、フードの下で作業することが推奨されます）。 - ケタミンおよびキシラジン（80 mgの/ kg及び10mgの体重の/ kg）または他の承認された利用可能な麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔。
- マウス面を上にして、70％エタノールで後肢をスプレー。前脛骨（TA）筋の正確な場所を視覚化するために、メスの助けを借りて、膝の下で、下肢の前方部分に離れて髪を切ります。
注：TA筋が骨に横を下って行くと足首で終わる、脛骨の近位本体から生じます。その長い腱は、（ 図1A参照）足首全体の足の中に延びます。 - バックゆっくりプランジャーを引くことにより、シリンジへの溶液の〜100μLを描画します。
- 直立シリンジを保持する、気泡を除去（針で上向き）。そっとプランジャーを引くと、チューブの内側部分に接続されているすべての気泡が上向きに来助けるために、注射器の側面をタップします。ゆっくりと、大きな気泡を解放するためにプランジャーを押してください。液体を数滴は、針を出てきます。この時点で、心臓毒の毒性を考慮すると、チューブに再び液体をピックアップし、それを分散しないようにしてください。
- 所望の投与量に達するまで、注射器への溶液を撤回。各TA筋のためのCTX溶液20μLを注入します。
- 膝に向かって腱から、ガイダンスとして脛骨骨の位置を追跡することによって、TAの中心に針を挿入します。 TAは薄い組織であるので、（2/3ミリメートルの深針、約10°〜20°の角度を挿入）深すぎる行かずに注射を行い、筋肉自体（ 図1A）を越えて行くことは避けてください。
- 注射直後に針を引き出したが、2待ってはいけない - 漏れを防ぐために3秒CTXの年齢は筋肉から落下します。
- マウスは麻酔ので、覚醒され、使用されるエタノールは、体温を低下させるまでの手順の後、（37℃で）加熱されたプレート上にケージを配置します。
2.前脛骨の分離
注：筋肉は、実験の要件に応じて心臓毒注射後の異なる時点で単離することができます。
- 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
- 70％エタノールで後肢をスプレーします。手順の間、動物はそれを保持するために支持体に固定することができます。
- （足の上）近位腱のレベルで皮膚を切り取り、皮膚の下にはさみの刃の1を挿入して、膝の方向に、上向きに皮膚を切りました。鉗子の助けを借りて、皮膚を引き上げ、完全に筋肉を露出させます。慎重に関心領域から肌や髪のすべてを削除します。
- ゆっくりと（thとつまんまたは切断することにより、 筋膜を排除チップインピンセットやハサミを解剖細かいマイクロ付き）脛骨（ 図1B）の反対側の筋肉の極端な周囲。一度壊れて、そっと細い先端ピンセットの助けを借りて筋膜を除去します。根本的な筋肉の損傷を防ぎます。
注：他の筋肉および器官と同様に、TAは、 筋膜 （脚の深部筋膜）、深い皮膚の下にあり、それは容易に下にある筋肉を単離するために除去する必要がある結合組織の薄いシートで覆われています。 - 遠位TAの腱と並置されている足、上記の伸筋Digitorum腱を視覚化します。伸筋Digitorum長い（EDL）筋肉の腱はわずかTA腱の下に位置しています。成体マウスの腱は、肉眼で見ることができます。
- 2次のいずれかの次のTA筋を削除します。
- 細かいマイクロはさみを解剖して、両方の腱をカットし、近位側に向かって、それらを引く、holdinグラム鉗子で腱。筋肉を分離するために反対方向に優しく、それらを引っ張って、2腱を分離します。
- 薄チップピンセットの助けを借りて、腱自体（ 図1C、上の写真）の下にチップを渡すことによって、伸筋腱Digitorumから遠位TA腱を分離します。ゆっくり基礎となる筋肉（ 図1C、下の写真）からそれを分離するために、TA以下ピンセットをスライドさせます。
- 、わずかに隆起それを維持TAの腱を切断し、軽くひざ下の領域のみが装着されるまで、上向きにそれを引っ張って筋肉の下でピンセットを持ち（ 図1D、左画像）。はさみ（ 図1D、右の写真）と筋肉のエッジ以下、膝下TAをカットします。
注：筋肉を少し脇に取り付けられたままの場合、それを切り離す助けるためにはさみを解剖細かいマイクロを使用しています。
注：鉗子を簡単にTAの下に収まらない場合は、筋膜が完全に除去されていないことが可能であり、それはまだ、筋肉の上に見えるかもしれません。この場合、完全に進む前筋膜を除去します。
3.新鮮凍結筋肉テクニック
- トラガカントゴムまたはコルクのスライス上に同様の接着剤、凍結化合物（ 例えば、最適な切削温度（OCT）化合物）の少量を置きます。必要に応じて（ 図2A）、凍結前の逆側のコルクのスライスにラベルを付けます。
- 筋肉の横断面を得るためには、コルクに対して垂直な位置にある筋肉を持って確認しながら、遠位腱を挿入し、外部の約3/4の筋肉のを残すことによって、トラガントガムにTAをシンク（ 図図2（a））。
- イソペンタンで、アルミ缶（あるいは、金属カップやガラスビーカー）を入力します。 LIQUIを含むデュワー内のイソペンタンの缶を一時停止D窒素は、液体窒素が缶に入力することができません。
注：イソペンタンは、組織の最適な凍結のために（-150から-160℃）適切な温度に到達する必要があります。いくつかの白色の固体粒子は、缶の底部に形成し、イソペンタンがわずかに粘性になったときに、正しい温度に到達します。
注：それは凍結アーチファクトにつながることができますように、固体粒子を形成する前にサンプルを凍結しないでください。それが解凍されるまで一方、イソペンタンが完全に固体になった場合、いくつかの白色粒子が依然として存在していることを確認して、室温でそれを残します。 - Mixterの鉗子を使用して、急速にイソペンタンに筋肉でコルクを浸し、下方に位置する筋肉を維持し、それが完全に液体に浸漬されたときにコルクを解放するようにしてください。試料が浮いている間このように、コルクの唯一の裏面には、液体中に表示されるはずです。
- SAを残します1分間のイソペンタンでmple。
- Mixter鉗子（または類似の鉗子）を使用して、筋肉を取ると、少なくとも2分間、液体窒素の中に浸します。
- 格納-80℃のフリーザー直接標識アルミ箔で個別に試験片をラップし、直ちにドライアイス（-70℃）に配置し、または。
ステップ3.4から3.7に、手順では、正確な温度を維持し、解凍から標本を防ぐために非常に重要です：注意してください （ 例えば 、℃の冷凍庫に-80転送中。）。組織内に存在しており、最終的には人工物の形成または筋線維（繊維の中心にある大きな白い穴として組織切片上で視覚化）の故障の原因となり、水の微結晶の制御されない融解および再凍結中の温度上昇をもたらします。
冷凍筋肉の4クライオスタットセクショニング
- クライオスタットチャンバ温度tを設定しますO -20〜-22℃です。
- 彼らは、少なくとも30分間平衡化することができ、試料のスタブ、ブレード、クライオスタットチャンバ内の試料を入れてください。
- 試料スタブで凍結化合物（ 例えば、10月化合物）の少量を置き、凍結化合物が固化する前に、検体とコルクを浸します。一方、ブレードホルダーに刃を配置します。
- ブレードホルダー（ 図2B）で試料ホルダーを方向付けるために付属のネジを使用して試料とブレードの位置を合わせます。
- 10μmの切片厚を設定します。組織を切断するために進んでください。駆動輪の各ターンのために、試料ホルダーは、ブレードに向かって制御された距離を進みます。
- 偏スライド（スライドあたり8〜10節）（ 図2C）のセクションを配置します。
- 切片後、-80℃でスライドを保存します。
注：試料は、-80℃の冷凍庫に保存し、furtheに再利用することができます適切に処理し、保存されている場合はrを、切片。
5.ルーチンの組織学的染色（ヘマトキシリン＆エオシン染色）
注：いくつかの組織学的染色は、分析によれば、筋肉切片上で実施することができます。形態学的および形態計測分析のためのルーチンの組織学的染色はヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）重クロム染色です。ヘマトキシリンは、深い紫色の核を染色します。核染色は、細胞質内の筋繊維のような好酸球の構造を、染色エオシン（ピンク/赤）、で対比されます。
- 10のためのセクションで完全に空気乾燥冷凍スライド - 室温で15分間、染色トレイにスライドを申し立てる、および染色トラフにトレイを置きます。
- ヘマトキシリンで1分間染色します。
- ヘマトキシリンを洗い流すために10分間、かなり弱い水道水ジェットの下で染色トラフを置きます。
- エオシンのアルコール溶液が使用される場合（Tをスキップし、95％エタノール中で5分間、スライドを浸漬水性エオシン溶液の場合では、彼のステップ）。
- エオシン溶液で1分間対比染色。
- 過度のエオシン液を除去するために水ですすいでください。
注：ヘマトキシリンまたはエオシンのいずれかで染色の最適なタイミングは、各新しいバッチのために定義されるべきです。 - 50％および70％（数秒ごと）：段階的エタノールシリーズでサンプルを脱水します。急速に100％エタノールで2変化、それぞれ5分、続いて95％エタノールに浸します。
- キシレンの2の変更、各5分以上でクリア。このステップは、化学フードの下で行わなければなりません。
- スライド上のメディアをマウントし、カバーガラスで覆い、数滴を適用し、キシレン系封入剤でスライドをマウントします。マウンティング培地はまた、カバーガラススライド上に置き、カバースリップを適用することができます。
- スライドとカバーガラスの間に空気の泡を形成することは避けてください。 、気泡を除去する（実装後）縦スライドを維持し、過剰カ月を絞り出すために、優しく鈍鉗子（または類似の鈍ツール）でカバースリップ上で押してuntingメディアや気泡。
- キシレンは、分析に進む前に、完全に蒸発させるために数時間または一晩フードの下のスライドを保管してください。
- マウスごとに少なくとも1つの全体の筋肉部分の非重複シリアル画像を用いて、H＆E染色された再生筋肉切片の形態学的および形態計測解析を実行します。 20X倍率で、明視野顕微鏡で画像をキャプチャします。
注：5匹のマウスの最小数は、測定値の統計的有意性を得ることが推奨されます。
注：画像解析ソフトウェアは、無料ダウンロードソフトウェアImageJのように、この目的のために利用可能である（http://imagej.nih.gov/ij/）。
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Representative Results
H＆E染色は、骨格筋の再生中に特定の時点で再生プロセスの形態の評価が可能になります。 図3は 、野生型マウスの負傷したTA筋肉に行っ時間経過解析を示します。 図3Aに図式として筋肉は、CTXの注射後3、7、15、30日目に単離されています。 H＆E染色した横断面の代表的な写真が（ 図3B-E）は、時間の経過骨格筋修復のダイナミクスを示しています。損傷後3日目に、筋肉の構造的なアーキテクチャは完全に破壊され、両方が筋線維（壊死領域）と単核細胞を縮退される（ 図3B）はっきりと見えます。この細胞の不均一な群は、主に一過性増幅衛星細胞（筋芽細胞）、血液11から募集炎症細胞、およびパルティ間質および内皮細胞で構成されてい損傷部位でトリガされる再生工程、にcipate。この文脈において、新しい再生筋線維の融合および筋芽細胞の分化によって生成されます。再生エリアの主な特徴は、中央に位置する核と暗い染色細胞質（ 図3C）と小好塩基性筋線維の存在です。それは次第に減少するが、この段階では、炎症は、表示されたままです。再生筋線維の大きさは、中央に位置する核（ 図3D、E）によって特徴づけられる好酸球、再生筋線維を生じさせる、時間の経過とともに増加します。再生された筋線維は再生の後の段階で、プロセスが終了するまで表示されます。健康的な筋線維は、ピンクの細胞質とし、筋細胞膜の下で、繊維の周囲に配置された核で、高度に組織化され、お互いに近接しています表示されます。これらの筋線維は、通常、CTX注入及び損傷部位から遠い存在であり、それら複数種の希LY再生が決定的に完了した領域を表します。確かに、再生繊維は、わずか数ヶ月損傷後の周囲に移動し、中央に位置する核の存在によって特徴付けられます。
染色された筋肉切片のデジタル画像を正確に関心のある領域の輪郭を概説することによって関心領域を測定する必要がある空間較正のためのスケールバーを追加することによって捕捉されます。筋線維断面積（CSA）の測定は、広く、マウスの異なるグループ間の再生傾向の差を定量化するために使用される信頼性の形態計測分析です。この分析は、少なくとも500、最大セクション1,000繊維にを含む、一元有核筋線維の面積の測定を必要とします。両方の再生の平均及び再生筋線維の領域とこれらの領域のガウス分布は、再生のprocの指標でありますESS。増加した筋線維CSAは、一般的に改善されたおよび/または加速再生応答に関連付けられています。逆に、適切な再生の失敗は、CSAの減少と関連しています。ここでは、筋線維CSA分析を報告し、異なる時点での平均（ 図3F）と筋線維CSAの分布（ 図3G）の両方として示されています。筋線維領域の分布が再生進行の過程として、より大きなサイズの繊維に向けてCSAシフト時間をかけて、どのようにどのように変化するかを分析のハイライト。
図1.筋肉内注射および脛骨筋の単離。前脛骨筋における心臓毒のA.筋肉内注射。 B。筋筋膜の除去。白い矢印は目を削除するには、筋肉をピンチ薄ひっくり返したピンセットを示し、電子筋膜 。 C。上の写真は、遠位TA腱の解剖学的位置を示しています。下の写真は、TAを持ち上げ、筋肉の損傷を回避しながら、それを削除する方法を示します。 D。左の写真：TAは上向きの遠位腱を引っ張ることによって持ち上げられます。白い矢印は、遠位EDL腱を示しています。右の写真は：鉗子で腱を保持することによって、TAの上端は、膝から下を切断されます。白い矢印は、切断部位を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.新鮮凍結筋肉や冷凍筋肉のクライオスタットセクショニング。トラガカントゴム新鮮な筋肉インクルージョンのA.技術 。 TA筋を約3/4外部と、腱からガムに浸漬され、コルクに対して垂直位置に維持。クライオスタット切片のための手順のB.代表的画像。コルクは、試料スタブに化合物を凍結少量の置かれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
骨格筋再生の図3.タイムコース分析。急性骨格筋損傷のA.実験スキーム。 BE。心臓毒のヘマトキシリン＆エオシン染色切片（CTX）の代表的な写真は、損傷後指示された日で筋肉を処置されました。 B。 （写真の左側）黒の実線は、おそらく炎症細胞によって侵入壊死性繊維のカップルを、囲みます。破線（右側絵の）単核細胞浸潤の領域をマークします。中央に位置する核を有するC.単一の未成熟筋線維は、黒丸で示されています。 DE。中央に位置する核を有する大規模な再生成好酸球性筋線維は、黒丸でマークされています。スケールバーは100ミリメートルを表しています。 TA筋切片で一元有核筋線維サイズ値のF.平均。値は平均±SEM、5マウス/群平均値です。 G.筋線維断面積6における（CSA）分布、15、及び30日CTXの注射後。値は平均±SEM、5マウス/群平均値です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維12の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。骨格筋は、実験の要件に応じて、注射および損傷後の所望の時点で解剖し、およびその後の組織学的分析のために使用されます。切開し、筋肉のいずれか凍結保護培地中に封入した後、凍結またはパラフィン中に含めることができます。しかしながら、これらの手順は、成果物を生成することができ、最終的にその後の分析に影響を与える可能性がパラホルムアルデヒドで予め固定のステップを必要とします。直接組織を凍結することで、この問題を防ぐことができます。注目すべきは、多くの一次抗体は、この手順は、より信頼性を向上させ、新鮮凍結筋肉切片13、排他的にまたは効率的に作業を行います。形態計測分析は、通常、同じ年齢のマウスのグループ間の再生過程における差異の評価のために、特定の遺伝子変異および/または薬理学的治療で可能時間経過実験で実行されます。 CTX誘発損傷のプロトコルは、それ自体が高度に再現可能であるが、可能な制限は、CTX注射のオペレータ依存の変動によるものです。この制限を克服するために、全体の時間経過実験を同一のオペレータによって実行されることが好ましいです。
筋肉再生の程度は、総面積にわたって健康繊維、壊死領域と炎症、および再生、再生エリアの割合として定量化することができます。このようなジストロフィーMDXマイルのような慢性損傷のイベントを、勉強するときしかし、このアプローチは、主に使用されていますむしろ急性損傷のモデルに比べて、CE、。ジストロフィー筋肉が変性と再生の非同期イベントによって特徴づけられる実際、急性損傷は、明確に定義されたと必然的なイベントが続いています。上記の形態学的特徴の経験的な識別を必要とするこれらの分析の1つの制限は、彼らが完全に公平ではないということです。実験的な結論をサポートするために、形態素解析は、常に実験的な結論をサポートするために、特定の分子マーカーの免疫蛍光分析として、さらなる分析で補完する必要があります。このため、明確な結果を解釈するために平行分析を使用することが好ましいです。例えば、再生筋線維を積極的に新たに形成された筋線維に特異的に発現している胚性ミオシン重鎖（eMyHC）について染色されています。したがって、eMyHC染色された筋線維の定量は、形態素解析と並んで行うことができます。
CSA分析は、より信頼性の高い定量化し、H＆E染色切片上又は筋線維のエッジをマークラミニン、で染色した筋肉切片のいずれかを行うことができます。上記のように定量化は、ImageJの適切なマクロを使用して実行されます。両方の場合において、第一セクションの品質を評価し、変形したりカール見える組織の領域を除外することは常に必要です。
組織の形態学的分析のほかに、H＆E染色切片は、線維症および/または脂肪組織の存在などの他の特定の機能の同定を可能にします。実際、線維症は、いずれかの再生が損なわれた場合、または慢性疾患14で発生する細胞外マトリックスの過剰蓄積に由来します。実際、細胞外マトリックスの蓄積は、H＆E-組織染色で再生筋線維の間に堆積淡い材料として表示されます。 CTXの注射の複数ラウンドをtを使用することができます筋線維は変性と再生および瘢痕組織の波を受けているO模倣慢性疾患が異常に蓄積します。しかし、より信頼性の高いプロトコルは、筋線維15を誘導するために利用可能であり、特定の組織染色は、マッソントリクロームまたはシリウスレッド染色のように、これらの構造を同定し、定量化するために行うことができます。脂肪組織の形成は、オイルレッド染色によって定量化された脂肪組織の存在の重要な指標を与える筋線維間の丸みを帯びた白色の構造、などのH＆E染色切片にはっきりと見えます。最後に、説明したプロトコールに従って得られた骨格筋切片は、特異的抗体およびプロトコルを使用して免疫蛍光分析を実行するために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
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