Summary
Dette håndskrift beskriver en detaljeret protokol til at fremkalde akut skeletmuskulatur regenerering i voksne mus og efterfølgende manipulationer af de muskler, såsom dissektion, frysning, opskæring, rutinemæssige farvning og myofiber tværsnitsareal analyse.
Abstract
Skeletal muscle regeneration er en fysiologisk proces, der forekommer hos voksne skeletmuskler som respons på skade eller sygdom. Akut skade-inducerede skeletmuskel regenerering er et meget anvendt, kraftfuld modelsystem til at studere de begivenheder, der er involveret i muskel regenerering samt de mekanismer og forskellige aktører. Faktisk et detaljeret kendskab til denne proces er afgørende for en bedre forståelse af de patologiske tilstande, der fører til skeletmuskulaturen degeneration, og det hjælper med at identificere nye målrettede terapeutiske strategier. Den nuværende arbejde beskriver et detaljeret og reproducerbar protokol for at fremkalde akut skeletmuskulatur regenerering i mus gennem en enkelt intramuskulær injektion af cardiotoxin (CTX). CTX hører til familien af slangegift toksiner og forårsager myolyse af myofibre, som i sidste ende udløser regenerering begivenheder. Dynamikken i skeletmuskulatur regenerering vurderes ved histologisk analyse af muskel sektioner. Protokollen ogsåillustrerer de eksperimentelle procedurer for dissekering, frysning, og skære tibialis anterior muskel, samt den rutinemæssige Hematoxylin & Eosin-farvning, der er almindeligt anvendt til efterfølgende morfologisk og morfometrisk analyse.
Introduction
Pattedyr voksne skeletmuskulatur dannes af grupper af fascicules af flerkernede muskelceller (myofibre), som er specialiseret til sammentrækning. Hver myofiber er en aflang syncytium, omgivet af sarcolemma (plasma membran) og indeholder myofibriller, som består af regelmæssigt og gentagne gange organiserede kontraktile proteiner (actin og myosin filamenter). I voksenlivet og i hviletilstande, skeletmuskler har en meget lav omsætning på deres myonuclei 1; Faktisk er de myonuclei, som er placeret ved periferien af den myofiber, under sarcolemma, arresteres i G0-fasen af cellens cyklus, og er ude af stand til at proliferere 1,2.
Skeletmuskler har den ejendommelige evne til at regenerere efter skade, og nåede homøostase efter flere begivenheder af vævsombygning, der er tæt knyttet til hinanden. Efter en akut skade eller traume, er degeneration induceret, efterfulgt af regenereringsprocesserneder involverer forskellige cellepopulationer, herunder en fastboende befolkning i muskelceller, satellit celler (SCS). Faktisk, i mangel af miljømæssige stimuli, satellit celler er i en hviletilstand og er placeret i en specialiseret niche mellem sarcolemma og den basale lamina 3,4. Efter en skade eller sygdom, SCs bliver aktiveret, formere sig, migrere til de ødelagte områder, og i sidste ende differentiere, hvilket giver anledning til nyligt danner myofibre 5. Aktiverede SC'er etablere krydstale med forskellige cellepopulationer, primært inflammatoriske celler, der er rekrutteret i stedet med traume 6-8. Denne krydstale tillader cellerne at følge et reguleret paradigme, hvorved molekylære signaler drev strukturelle modifikationer, sidste ende fører til homeostase 9. Udover SCs, inflammatoriske og interstitielle celler, angiogene processer, og re-innervation begivenheder er også involveret, handler på en koordineret måde for at reparere denne meget organiseret og specialized struktur.
Der er stor interesse i at studere forskellige aspekter af skeletmuskulatur regenerering, ikke kun for at forstå fysiologi af musklen, men også at forbedre terapeutiske strategier, der kræver større kendskab til hele processen. Adskillige eksperimentelle tilgange er i øjeblikket tilgængelige til at studere identiteten og funktionen af de forskellige cellepopulationer, signalvejene og de molekylære mekanismer, der er involveret. Musemodeller for akut skade et virksomt middel til at undersøge mange aspekter af denne proces. Forskellige almindeligt anvendte teknikker til at inducere akut muskelskade forskerne mulighed for at følge regenereringsprocessen in vivo, fra de tidlige stadier til slutningen af processen. Denne protokol beskriver de trin fra intramuskulær injektion af slangegift-afledt cardiotoksin (CTX), der inducerer myolyse og udløser regenerering processen op til en analyse af vævsprøver. Efter CTX injektion, mice kan aflivet på forskellige tidspunkter afhængig af eksperimentelle krav og skeletmuskulatur kan dissekeret og forarbejdet til yderligere analyse. Endelig beskriver vi farvningen protokollen af vævssnit til at udføre morfologiske observationer og grundlæggende kvantitative analyser. Denne protokol muliggør studiet af akut skeletmuskel regenerering in vivo i en meget reproducerbar måde 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for dyr forskning og godkendt af Institut for Folkesundhedsvidenskab, Animal Health, Nutrition og Fødevaresikkerhed af det italienske sundhedsministerium i overensstemmelse med loven om dyreforsøg. Cervikal dislokation procedurer kan variere fra institution til institution baseret på IACUC eller dets tilsvarende krav.
1. cardiotoxin Injektion i tibialis anterior
- Forbered en 10 uM arbejder løsning af cardiotoxin (CTX) ved at fortynde cardiotoxin stamopløsningen i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) eller i vand, før du starter proceduren.
Bemærk: CTX er opløseligt i vand ved 1 mg / ml. Forbered en 70 uM stamopløsning. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. CTX anvendes til denne protokol er en blanding af Cardiotoxiner med en molekylvægt på ca. 7.000 Da.
ADVARSEL: Det foreslås at bæredobbelt handsker, en hygiejne maske, og sikkerhedsbriller (alternativt til sikkerhedsbriller, anbefales det at arbejde under en hætte), og til at være meget omhyggelig med at undgå enhver kontakt med opløsningen, selv hvis fortyndet. - Bedøver de mus ved intraperitoneal injektion af ketamin og xylazin (80 mg / kg og 10 mg / kg legemsmasse) eller andet godkendt tilgængelige bedøvelsesmiddel.
- Med musen opad, spray bagbenene med 70% ethanol. At visualisere den nøjagtige placering af tibialis anterior (TA) muscle, ved hjælp af en skalpel, klippe håret væk på den forreste del af underbenet, under knæet.
Bemærk: TA musklen opstår fra den proximale legeme af skinnebenet går ned lateralt til knoglen og slutter ved anklen. Sin lange sene strækker sig ind i foden på tværs af anklen (se figur 1A). - Tegn ~ 100 pi af opløsningen op i sprøjten ved at trække stemplet langsomt tilbage.
- Fjern luftbobler, holde sprøjten lodret (med nålen opad). Træk forsigtigt stemplet ned og trykke på siden af sprøjten for at hjælpe eventuelle luftbobler knyttet til den indvendige side af røret kommer opad. Langsomt tryk på stemplet for at frigive store luftbobler. Et par dråber af væske vil komme ud nålen. På dette tidspunkt, skal du sørge for at vælge den væske op igen ind i røret og ikke sprede det på grund af den toksicitet cardiotoxin.
- Trække opløsningen ind i sprøjten, indtil den ønskede dosis er nået. Der indsprøjtes 20 pi af CTX løsning for hvert TA muskel.
- Stik nålen i midten af TA ved at følge positionen af Tibia knogle som vejledning, fra senen mod knæet. Da TA er en tynd væv, udføre injektionen uden at gå for dybt (indsætte nålen 2/3 mm dyb, ved omtrent 10 ° til 20 ° vinkel), og undgå at gå ud over musklen selv (figur 1A).
- Træk ikke nålen umiddelbart efter injektionen, men vent 2 - 3 s for at forhindre lækalder af CTX dråber fra musklen.
- Efter proceduren, placere buret på en opvarmet plade (ved 37 ° C), indtil musene er vågen, da bedøvelsesmiddel og ethanolen anvendes reducere kropstemperaturen.
2. tibialis anterior Isolering
Bemærk: Muskler kan isoleres på forskellige tidspunkter efter cardiotoxin injektion ifølge eksperimentelle krav.
- Sacrifice musen ved cervikal dislokation.
- Spray baglemmer med 70% ethanol. Under proceduren, kan dyret være fastgjort til en støtte til at holde det nede.
- Skære huden på niveauet for den proximale senen (over foden), indsætte et af bladene af saksen under huden, og skære huden opad i retning af knæet. Ved hjælp af pincet, træk op huden og eksponere musklen helt. Fjern omhyggeligt alt huden og håret fra området af interesse.
- Eliminer fascia ved langsomt at klemme eller skære (med thi-tip pincet eller med fine micro dissekere saks) den ekstreme periferi af musklen på den modsatte side af skinnebenet (figur 1B). Når brudt, forsigtigt fjerne fascia ved hjælp af tynde-tip pincet; undgå at beskadige den underliggende muskel.
Bemærk: Som med andre muskler og organer, er TA dækket af fascia (dyb fascia af benet), en tynd plade af bindevæv, der ligger dybt under huden og det skal fjernes for nemt at isolere den underliggende muskel. - Visualiser den distale TA senen og extensor digitorum senen over foden, som ligger side om side. Senen af extensor digitorum Longus (EDL) muskel er placeret lidt under TA senen. Sener af voksne mus er synlige for det blotte øje.
- Fjern TA-musklen efter en af de to følgende teknikker:
- Skær begge sener med fine mikro dissekere saks og trække dem mod den proksimale side, holding senerne med pincet. Adskille de to sener, trække dem forsigtigt i modsatte retninger for at adskille musklerne.
- Ved hjælp af tyndt-tip pincet, adskille den distale TA senen fra extensor digitorum senen ved at føre spidsen under senen selv (figur 1C, øverste billede). Skub forsigtigt pincet under TA at adskille den fra de underliggende muskler (figur 1C, nederste billede).
- Hold pincet under musklen for at holde det lidt hævet, skæres TA senen, og træk det forsigtigt opad, indtil kun det område under knæet er vedlagt (Figur 1D, venstre billede). Skær TA under knæet, følger kanten af musklen med saksen (figur 1D, højre billede).
Bemærk: Hvis musklen forbliver lidt fastgjort til siderne, skal du bruge fine mikro dissekere saks til at hjælpe løsne den.
Bemærk: Hvis tangen ikke let passer under TA,Det er muligt, at fascia ikke er blevet fuldstændigt fjernet, og det kunne stadig ses på toppen af musklen. I dette tilfælde helt fjerne fascia, før du fortsætter.
3. Frisk Frosset Muscle Technique
- Placer en lille mængde af tragantgummi eller et lignende klæbestof frysning forbindelse (f.eks Optimal Cutting Temperatur (OLT) forbindelse) på et stykke kork. Mærk Cork skive på bagsiden før frysning, om nødvendigt (figur 2A).
- For at opnå tværsnit af musklen, vask TA i traganthgummi ved at indsætte den distale sene og efterlader omkring 3/4 af musklen udenfor og sørge for at have musklen i en vinkelret position i forhold til proppen (figur 2A).
- Fyld en aluminiumsdåse (alternativt et metal kop eller et bægerglas), med isopentan. Hæng dåse isopentan i en Dewar indeholder LIQUId nitrogen, ikke lader den flydende nitrogen at komme ind i dåsen.
Bemærk: Isopentan skal nå den rette temperatur (fra -150 til -160 ° C) for optimal frysning af vævet. Den korrekte temperatur er nået, når nogle hvide faste partikler dannes i bunden af dåsen og isopentan bliver lettere viskøs.
Bemærk: Du må ikke fryses prøven før dannelsen af de faste partikler, da det kan føre til indefrysning artefakter. På den anden side, hvis den isopentan bliver helt fast, lade det blive ved stuetemperatur, indtil den er optøet, og sørg for, at nogle hvide partikler er stadig til stede. - Brug Mixter pincet, hurtigt dyppe proppen med musklen i isopentan, holde muskel placeret nedad, og sørg for at frigøre proppen, når den er helt nedsænket i væsken. På denne måde, medens prøven flyder, bør kun bagsiden af proppen være synlig i væsken.
- Lad sample i isopentan i 1 min.
- Brug Mixter pincet (eller lignende tang), tage musklen og fordybe det i flydende nitrogen i mindst 2 minutter.
- Wrap prøverne individuelt i mærket alufolie og straks placere dem i tøris (-70 ° C), eller direkte gemme dem i en -80 ° C fryser.
Bemærk: Under hele proceduren, fra trin 3,4-3,7, er det ekstremt vigtigt at opretholde den korrekte temperatur og for at forhindre, at prøver fra optøning (fx under overførslen til -80 ° C fryser.). De stigende temperatur resulterer i ukontrolleret optøning og genfrysning af vand mikrokrystaller, der er til stede i vævet og til sidst forårsager dannelsen af artefakter eller nedbrydning af muskelfibrene (visualiseret på vævssnit som store hvide huller i midten af fiberen).
4. Kryostat Sektionsinddeling af frosne Muskler
- Indstil kryostatkammeret temperaturen to -20 til -22 ° C.
- Sæt prøven stub, bladet, og modellen i kryostatkammeret, der giver dem mulighed for at ligevægt i mindst 30 min.
- Placer en lille mængde frysning forbindelse (f.eks OCT-forbindelse) på prøven stub og fordybe proppen modellen før indefrysning sammensatte størkner. I mellemtiden placere bladet i holderen bladet.
- Juster prøven og bladet ved hjælp af de medfølgende skruer til at orientere prøven holderen med knivholder (figur 2B).
- Indstil snittykkelsen til 10 um. Fortsæt til skære vævet. For hver omdrejning af drivhjulet, holder prøven rykker en kontrolleret afstand mod klingen.
- Placer sektionerne på en polariseret dias (8 til 10 afsnit per dias) (Figur 2C).
- Efter sektionering, opbevare dias ved -80 ° C.
Bemærk: Prøven kan opbevares i en -80 ° C fryser og genanvendes til further sektionering, hvis korrekt håndteres og opbevares.
5. Rutinemæssig histologisk farvning (hematoxylin & eosinfarver)
Bemærk: Flere histologiske pletter kan udføres på muskel sektioner ifølge analysen. En rutinemæssig histologisk pletten for morfologisk og morfometrisk analyse er Hematoxylin & Eosin (H & E) bichromic pletten. Den hæmatoxylin pletter kernerne en dyb lilla. Nuklear farvning modfarvet med eosin (pink / rød), som farver eosinofile strukturer, såsom de myofibre i cytoplasmaet.
- Helt lufttørre frosne lysbilleder med sektioner for 10 - 15 minutter ved stuetemperatur, indgive dias i en farvning bakke, og sætte bakken i en farvning trug.
- Farv i 1 minut med hematoxylin.
- Læg farvning trug under en temmelig svag vandhane jet i 10 minutter for at vaske ud hæmatoxylin.
- Fordybe objektglassene i 5 minutter i 95% ethanol, om der vil blive anvendt en alkoholisk opløsning af eosin (spring thans skridt i tilfælde af en vandig eosin opløsning).
- Kontrastfarve i 1 min med eosin-opløsning.
- Skyl med vand for at eliminere overdreven eosin-opløsning.
Bemærk: bør defineres Optimal timing af farvning med enten hematoxylin eller eosin for hver ny batch. - Dehydrer prøverne i en gradueret ethanolserie: 50% og 70% (i nogle få sekunder hver). Hurtigt nedsænkes i 95% ethanol efterfulgt af 2 ændringer i 100% ethanol, 5 min hver.
- Klar i 2 hold xylen, hver 5 min eller længere. Dette trin skal udføres under en kemisk hætte.
- Monter dias med en xylen-baserede montering medium, anvende et par dråber montering medium på dias og dækker med et dækglas. Monteringselementet medium kan også anvendes på dækglasset og dækglasset sat på objektglasset.
- Undgå danner luftbobler mellem dias og dækglasset. For at eliminere luftbobler, holde slide lodret (efter montering) og pres overskydende mounting medium og luftbobler ved forsigtigt at trykke på dækglasset med stumpe pincet (eller en lignende stumpt redskab).
- Hold dias under kølerhjelmen i et par timer eller natten over for at lade xylen fordampe helt, før man går videre til analysen.
- Udfør den morfologiske og morfometrisk analyse af H & E-farvede regenererende muskel sektioner ved anvendelse af ikke-overlappende serielle billeder af mindst én muskel sektion hel per mus. Tag billeder med en lys-felt mikroskop, med 20X forstørrelse.
Bemærk: Der anbefales en minimum antal 5 mus for at opnå statistisk signifikans af målingerne.
Bemærk: Billedanalyse software er tilgængelig til dette formål, såsom gratis downloade software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
H & E farvning muliggør evalueringen af morfologien af regenereringsprocessen ved specifikke tidspunkter i løbet af skeletmuskel regenerering. Figur 3 viser tidsforløbet analysen foretages på såret TA muskler vildtypemus. Muskler er blevet isoleret ved 3, 7, 15, og 30 dage efter CTX injektion, som skematiseret i figur 3A. Repræsentative billeder af H & E-farvede tværsnit viser dynamikken i skeletmuskulatur reparation over tid (figur 3B-E). På dag 3 efter skade, er den strukturelle arkitektur af musklen fuldstændig ødelagt, og begge degenererede myofibre (nekrotisk område) og mononukleære celler er klart synlige (figur 3B). Denne heterogen gruppe af celler består hovedsageligt af forbigående forstærkende satellit celler (myoblaster), inflammatoriske celler rekrutteret fra blod 11 og interstitielle og endothelceller, at participate i regenereringsprocessen, som udløses ved skadestedet. I denne sammenhæng er nye regenererende myofibre genereret ved fusion og differentiering af myoblaster. Det vigtigste træk ved regenererende område er tilstedeværelsen af små basofile myofibre med centralt placerede kerner og en mørk-farvet cytoplasma (figur 3C). På dette stadium, inflammation er stadig synligt, selv om den gradvist aftager. Størrelsen af regenererende myofibre stiger over tid, hvilket giver anledning til eosinofile regenereret myofibre karakteriseret af centralt placerede kerner (figur 3D, E). De regenererede myofibre er synlige på senere stadier af regenerering og indtil slutningen af processen. De sunde myofibre vises velorganiseret og tæt på hinanden, med en lyserød cytoplasmaet og med kernerne placeret ved periferien af fibrene, under sarcolemma. Disse myofibre er normalt til stede langt fra det sted, CTX injektion og skade, og de mere sjældnely repræsenterer områder, hvor regenereringen er endeligt fuldført. Faktisk er regenererede fibre kendetegnet ved tilstedeværelsen af centralt beliggende kerner, der bevæger sig til periferien kun flere måneder efter skaden.
Digitale billeder af de farvede muskel sektioner er fanget ved at tilføje skala barer for geografisk kalibrering, som er nødvendig for præcist at måle de områder af interesse ved at skitsere konturerne af de berørte områder. Målingen af myofiber tværsnitsareal (CSA) er en pålidelig morfometrisk analyse, som er meget udbredt at kvantificere forskellene i regenerering tendens mellem forskellige grupper af mus. Denne analyse kræver opmåling af arealer af centralt kerneholdige myofibre, herunder mindst 500 og op til 1.000 fibre pr sektion. Både gennemsnittet af regenererende og regenererede myofiber områder og den gaussiske fordeling af disse områder er indikatorer for regenerering process. Øget myofiber CSA er generelt forbundet med en forbedret og / eller accelereret regenerative respons. Tværtimod er svigt i den korrekte regenerering forbundet med et fald i CSA. Her, rapporteret vi myofiber CSA analyse, angivet som både den gennemsnitlige (figur 3F) og distribution (figur 3G) af myofiber CSA på forskellige tidspunkter. Analysen fokuserer hvordan fordelingen af myofiber områder ændrer sig over tid, og hvordan CSA skift i retning af større størrelse fibre som processen med regenerering provenu.
Figur 1. Intramuskulær injektion og Isolering af tibialismuskel. A. Intramuskulær injektion af cardiotoxin i tibialis anterior muskel. B. Fjernelse af muskelfascie. Den hvide pil angiver de tynde spids tang, der klemmer musklen for at fjerne the fascia. C. Det øverste billede viser anatomiske position af den distale TA senen. Det nederste billede viser, hvordan at løfte TA og fjerne det samtidig undgå muskelskader. D. Venstre billede: TA løftes ved at trække den distale senen opad. Den hvide pil angiver den distale EDL senen. Højre billede: ved at holde senen med pincet, den øverste kant af TA afskæres under knæet. Den hvide pil angiver skæringen site. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Frisk Frysning Muskel og Kryostat Sektionsinddeling af frosne muskler. A. Teknik frisk muskel optagelse i tragacanthgummi. TA musklen er nedsænket i gummiet fra senen, med omkring 3/4 udenfor ogopretholdes i en vinkelret position i forhold til proppen. B. Repræsentative billeder af proceduren for kryostat sektionering. Proppen er placeret i en lille mængde frysning forbindelse på prøven stub. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Time Course Analyse af Skeletal Muscle Regeneration. A. Eksperimentel arrangement med akut skeletmuskulatur skade. BE. Repræsentative billeder af hematoxylin & eosin farvede sektioner af cardiotoxin (CTX) -behandlet muskler på angivne dage efter skaden. B. Den sorte fuldt optrukne linje (på venstre side af billedet), omslutter et par nekrotiske fibre, sandsynligvis invaderet af inflammatoriske celler. Den stiplede linie (højre sideaf billedet) er et område af infiltrerende mononukleære celler. C. En enkelt umodne myofiber med centralt placeret kerne er angivet ved den sorte cirkel. DE. Store regenererede eosinofile myofibre, med centralt placerede kerner er markeret med sorte cirkler. Scale søjler repræsenterer 100 mm. F. Gennemsnit af centralt kerne myofiber størrelse værdier i TA muskel sektioner. Værdier er middelværdi ± SEM, 5 mus / gruppe. G. Myofiber tværsnitsareal (CSA) fordeling på 6, 15 og 30 dage efter CTX injektion. Værdier er middelværdi ± SEM, 5 mus / gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol til at fremkalde akut skade i skeletmuskulatur (dvs. intramuskulær injektion af CTX). Det er almindeligt anvendt som et effektivt værktøj til at studere dynamikken i skeletmuskulatur regeneration in vivo. CTX injektion inducerer degeneration af muskelfibre, som er forårsaget af depolarisering af sarcolemma og sammentrækning af fibrene 12, og udløser den kaskade af begivenheder, der fører til muskel regenerering. Skeletmuskler dissekeres på ønskede tidspunkter efter injektionen og skade, ifølge forsøgskravene, og anvendes til efterfølgende histologiske analyser. De dissekerede muskler kan enten fryses, efter optagelsen i kryo-beskyttelsesmiddel medier, eller indgår i paraffin. Men disse procedurer kræver et trin før fiksering med paraformaldehyd, som kan generere artefakter og kan i sidste ende påvirke de efterfølgende analyser. Frysning vævet direkte kan undgå dette problem. Notatet mangeprimære antistoffer arbejder udelukkende eller mere effektivt på friske frosne muskel §§ 13, hvilket gør denne procedure mere pålidelige. Den morfometriske analyse udføres normalt på tidsforløbet eksperimenter, der muliggør evalueringen af forskelle i regenereringsprocesserne mellem grupper af mus med samme alder og med specifikke genetiske mutationer og / eller farmakologiske behandlinger. Selv protokollen for CTX-induceret skade er meget reproducerbar per se, en eventuel begrænsning skyldes operatørafhængigt variabilitet CTX injektion. For at overvinde denne begrænsning, er det foretrukket, at hele tidsforløbet Forsøget udføres af den samme operatør.
Omfanget af muskel regenerering kan kvantificeres som procent af sunde fibre, nekrotiske områder og inflammation og regenererende og regenereres områder i det samlede areal. Men denne metode mest brugt når man studerer begivenheder kroniske skader, såsom i dystrofiske mdx mice, snarere end i modeller for akut skade. Faktisk mens dystrofe muskler er kendetegnet ved asynkrone begivenheder degeneration og regeneration, er akut skade efterfulgt af veldefinerede og følgeskader begivenheder. En begrænsning ved disse analyser, som kræver en empirisk identifikation af de morfologiske træk er beskrevet ovenfor, er, at de ikke er helt neutral. For at understøtte eksperimentelle konklusioner, bør den morfologiske analyse altid suppleres med yderligere analyse, såsom immunfluorescens analyse af specifikke molekylære markører, for at støtte eksperimenterende konklusioner. Af denne grund foretrækkes det at anvende parallel analyse til utvetydigt fortolke resultaterne. For eksempel er regenererende myofibre positivt farvet for embryonale Myosin tung kæde (eMyHC), som udtrykkes specifikt i nydannede myofibre. Således kan kvantificering af eMyHC-farvede myofibre udføres side om side med den morfologiske analyse.
CSA analysen er en mere pålidelig kvantificering og kan udføres enten på H & E-farvede sektioner eller på muskel sektioner farvet med laminin, der markerer kanten af muskelfibre; kvantificering udføres ved anvendelse af passende makroer af ImageJ, som beskrevet ovenfor. I begge tilfælde er det altid nødvendigt først at vurdere kvaliteten af afsnittene og udelukke områder af væv, der vises deforme eller krøllede.
Udover de morfologiske analyser af væv, H & E-farvede snit muliggør identifikation af andre specifikke funktioner, såsom tilstedeværelsen af fibrose og / eller fedtvæv. Faktisk fibrose stammer fra overdreven ophobning af ekstracellulær matrix, der opstår, enten når regenereringen er forringet eller i kroniske sygdomme 14. Faktisk ekstracellulær matrix akkumulering er synlig som et svagt materiale deponeret mellem de regenererede myofibre i H & E-histologisk farvning. Multiple runder af CTX injektion kan anvendes to efterligne kronisk sygdom, hvor myofibre undergår bølger af degeneration og regeneration og arvæv akkumuleres afvigende. Men mere pålidelige protokoller er tilgængelige til at inducere muskel fibrose 15, og specifik histologisk farvning kan udføres for at identificere og kvantificere disse strukturer, såsom Massons Trichrome eller Sirius Red-farvning. Dannelse af fedtvæv er klart synlig i H & E-farvede sektioner som afrundede hvide strukturer mellem myofibre, hvilket giver en vigtig indikation af tilstedeværelsen af fedtvæv, som kvantificeres ved Oil Red farvning. Endelig opnås skeletmuskulaturen sektioner ifølge protokollen beskrevet kan anvendes til at udføre immunofluorescensanalyse under anvendelse af specifikke antistoffer og protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
