Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection

doi: 10.3791/54515 Published: January 1, 2017

Summary

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor acute skeletspier regeneratie bij volwassen muizen en latere manipulaties van de spieren, zoals dissectie, bevriezen, snijden, routine kleuring en myofiber dwarsdoorsnede analyse induceren.

Abstract

Skeletspier aanpassing een fysiologisch proces dat plaatsvindt bij volwassen skeletspieren als reactie op letsel of ziekte. Acute verwonding geïnduceerde skeletspier aanpassing een veel gebruikt, krachtig modelsysteem om de gebeurtenissen betrokken bij spierregeneratie alsook de mechanismen en verschillende spelers bestuderen. Inderdaad, een gedetailleerde kennis van deze werkwijze is essentieel voor een beter begrip van de pathologische omstandigheden die leiden tot skeletspier degeneratie, en het helpt bij het identificeren van nieuwe gerichte therapeutische strategieën. De huidige werk beschrijft een gedetailleerd en reproduceerbare protocol voor acute skeletspier regeneratie in muizen te induceren via een enkele intramusculaire injectie van cardiotoxine (CTX). CTX behoort tot de familie van slangengif toxines en veroorzaakt myolyse van myovezels, die uiteindelijk leidt tot de regeneraties. De dynamiek van de skeletspieren regeneratie wordt geëvalueerd door histologische analyse van de spier secties. Het protocol ooktoont de experimentele procedures voor het ontleden, het invriezen en het snijden van de tibialis anterior spier, en de routine hematoxyline en eosine kleuring die op grote schaal wordt gebruikt voor latere morfologische en morfometrische analyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zoogdieren volwassen skeletspieren worden gevormd door groepen van fascicules van meerkernige spiercellen (spiervezels), die gespecialiseerd zijn voor samentrekking zijn. Elke spiervezeloriėntaties een langwerpig syncytia, omringd door de sarcolemma (plasmamembraan) en die myofibrils, die bestaan ​​uit regelmatig en herhaaldelijk georganiseerde contractiele eiwitten (actine en myosine filamenten). Bij volwassen leven en in rusttoestand, skeletspieren hebben een zeer lage omzet van hun myonuclei 1; inderdaad, de myonuclei, die zich aan de rand van de spiervezeloriėntaties onder sarcolemma worden aangehouden in de G0-fase van de celcyclus en niet in staat te prolifereren 1,2.

Skeletspieren hebben de bijzondere mogelijkheid om te regenereren na schade, het bereiken van homeostase na een aantal gebeurtenissen van weefselremodellering die nauw verwant zijn aan elkaar. Na een acuut letsel of trauma, degeneratie wordt veroorzaakt, gevolgd door regeneratie processendat verschillende celpopulaties, met inbegrip van een bevolking van spiercellen te betrekken, de satelliet cellen (SCS). Inderdaad, bij gebrek aan omgevingsstimuli, de satelliet cellen in een rusttoestand en bevinden zich in een niche tussen de sarcolemma en de basale lamina 3,4. Na een verwonding of ziekte, SC's geactiveerd worden, prolifereren, te migreren naar het beschadigde gebied, en uiteindelijk differentiëren, die aanleiding geven tot nieuw gevormde myovezels 5. Geactiveerde SC stellen cross-talk met verschillende celpopulaties, voornamelijk ontstekingscellen, die worden aangeworven in de plaats van trauma 6-8. Deze overspraak laat de cellen een gereglementeerd paradigma waarmee moleculaire signalen rijden structurele veranderingen volgen, uiteindelijk leidend tot 9 homeostase. Bovendien SC, inflammatoire en interstitiële cellen, angiogene processen en reïnnervatie gebeurtenissen betrokken stelt een gecoördineerde wijze repareren goed georganiseerde en specialized structuur.

Er is grote belangstelling voor het bestuderen van verschillende aspecten van skeletspieren regeneratie niet alleen de fysiologie van de spier te begrijpen, maar ook voor therapeutische strategieën die diepere kennis over het gehele proces te verbeteren. Verschillende experimentele benaderingen zijn beschikbaar om de identiteit en functie van de verschillende celpopulaties, de signaalwegen en de moleculaire mechanismen te bestuderen. Muismodellen van acuut letsel vormen een krachtig hulpmiddel om vele aspecten van dit proces te onderzoeken. Andere gewoonlijk gebruikte technieken voor het induceren van acute spierschade kunnen onderzoekers het regeneratieproces volgen in vivo, van het prille begin tot het einde van het proces. Dit protocol beschrijft de stappen van de intramusculaire injectie van slangengif-afgeleide cardiotoxine (CTX), die myolyse induceert en activeert het regeneratieproces tot de analyse van weefselmonsters. Na CTX injectie, mice kunnen op verschillende tijdstippen opgeofferd afhankelijk experimentele eisen en de skeletspieren kan worden uitgesneden en verwerkt voor verdere analyse. Tenslotte beschrijven we de kleuring protocol van het weefsel secties om morfologische observaties en fundamentele kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit protocol maakt het onderzoek naar acute skeletspier regeneratie in vivo op zeer reproduceerbare wijze 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierlijke onderzoek en door het ministerie van Volksgezondheid, diergezondheid, voeding en voedselveiligheid van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid in overeenstemming met de wet op de dierproeven goedgekeurd. Cervicale dislocatie procedures kan variëren van instelling tot instelling op basis van IACUC of het equivalent daarvan eisen.

1. cardiotoxine Injectie in de tibialis anterior

  1. Bereid een 10 pM werkoplossing van cardiotoxine (CTX) door verdunning van de voorraadoplossing cardiotoxine in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of in water voordat de procedure.
    Opmerking: CTX is oplosbaar in water bij 1 mg / ml. Bereid een 70 uM voorraad oplossing. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. CTX voor dit protocol is een mengsel van cardiotoxins met een molecuulgewicht van ongeveer 7000 Da.
    LET OP: Er wordt voorgesteld om te dragendubbele handschoenen, een hygiëne masker en een veiligheidsbril (als alternatief een veiligheidsbril, is het raadzaam om te werken onder een kap) en zeer voorzichtig zijn om elk contact met de oplossing te voorkomen, zelfs indien verdund.
  2. Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine (80 mg / kg en 10 mg / kg lichaamsgewicht) of andere erkende beschikbaar verdoving.
  3. Met de muis naar boven, spuit de achterste ledematen met 70% ethanol. De exacte locatie van de tibialis anterior (TA) spier met behulp van een scalpel visualiseren knip het haar weg van het voorste deel van het onderbeen onder de knie.
    Opmerking: De TA spier voort uit het proximale lichaam van de tibia, naar beneden lateraal van het bot en eindigt bij de enkel. Zijn lange pees zich uitstrekt tot in de voet over de enkel (zie figuur 1A).
  4. Teken ~ 100 pi van de oplossing in de spuit door zachtjes trekken van de zuiger.
  5. Verwijder luchtbellen, die de spuit rechtop (met de naald naar boven). Trek de zuiger en tik de zijkant van de spuit om luchtbellen aan de binnenkant van de buis omhoog komen. Langzaam druk op de zuiger om grote luchtbellen vrij te laten. Een paar druppels vloeistof komt uit de naald. Op dit punt, zorg ervoor dat de vloeistof weer op te halen in de buis en niet verspreiden het, gezien de toxiciteit van cardiotoxine.
  6. Zuig de oplossing in de spuit totdat de gewenste dosis is bereikt. Injecteer 20 pi van CTX oplossing bij TA spier.
  7. Steek de naald in het midden van de TA door de positie van de tibia als leidraad van de pees aan de knie. Omdat de TA is een dunne weefsel, de injectie toe zonder al te diep (steek de naald 2/3 mm diep, op ongeveer 10 ° tot 20 ° hoek), en te voorkomen dat verder gaat dan de spier zelf (Figuur 1A).
  8. Trek niet de naald direct na de injectie, maar wacht 2-3 s te lekken te voorkomenleeftijd CTX druppels uit de spier.
  9. Na de procedure, plaatst de kooi op een verwarmingsplaat (bij 37 ° C) totdat de muizen wakker zijn, omdat de verdoving en het ethanol verminderen lichaamstemperatuur.

2. tibialis anterior Isolation

Opmerking: Spieren kunnen op verschillende tijdstippen na injectie cardiotoxine worden geïsoleerd volgens experimentele eisen.

  1. Offer de muis door cervicale dislocatie.
  2. Spuit de achterpoten met 70% ethanol. Tijdens de procedure, kan het dier worden bevestigd aan een drager om het te houden.
  3. Snijd de huid op het niveau van de proximale pees (boven de voet), plaatst een van de bladen van de schaar onder de huid, en snijd de huid omhoog, in de richting van de knie. Met behulp van een tang, trek de huid en bloot de spieren geheel. Verwijder voorzichtig alle van de huid en het haar uit het gebied van belang.
  4. Elimineer de fascia door langzaam te knijpen of snijden (met thin-tip pincet of fijne micro ontleden schaar) de uiterste omtrek van de spier aan de andere zijde van de tibia (figuur 1B). Zodra gebroken, verwijder voorzichtig de fascia met behulp van dunne-tip pincet; beschadiging van de onderliggende spier.
    Opmerking: Zoals voor andere spieren en organen, wordt de TA onder fascia (diepe fascia of het been), een dunne laag bindweefsel dat ligt diep onder de huid en die moet worden verwijderd om de onderliggende spier gemakkelijk isoleren.
  5. Visualiseer de distale TA pees en extensor digitorum pees boven de voet, die naast elkaar zijn geplaatst. De pees van de extensor digitorum Longus (EDL) spier ligt iets onder de TA pees. Pezen van volwassen muizen met het blote oog.
  6. Verwijder de TA spier na één van de twee volgende technieken:
    1. Snijd beide pezen met een fijne micro ontleden schaar en trek ze naar de proximale zijde, holding de pezen met een tang. Scheid de twee pezen, ze zachtjes te trekken in tegengestelde richting naar de spieren te scheiden.
    2. Met behulp van dunne-tip pincet, scheiden het distale TA pees van de extensor digitorum pees door het passeren van de punt onder de pees zelf (Figuur 1C, bovenste afbeelding). Schuif de pincet onder de TA om het scheiden van de onderliggende spieren (figuur 1C, onderste foto).
    3. Houd de pincet onder de spier te houden iets verhoogd, snijd de TA pees, en trek het voorzichtig omhoog totdat alleen het gebied onder de knie is bevestigd (figuur 1D, foto links). Snijd de TA onder de knie na de rand van de spier met de schaar (figuur 1D, rechter afbeelding).
      Let op: Als de spier licht blijft bevestigd aan de zijkanten, maken gebruik van fijne micro ontleden schaar om te helpen verwijder.
      Let op: Als de tang niet gemakkelijk onder de TA passen,is het mogelijk dat de fascia niet volledig is verwijderd, en het kan nog steeds zichtbaar bovenop de spier. In dit geval is de fascia volledig te verwijderen voordat u verder gaat.

3. Fresh Frozen Muscle Techniek

  1. Plaats een kleine hoeveelheid tragacanth gom of een soortgelijk kleefmiddel bevriezing verbinding (bijv optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding) op een schijfje kurk. Label slice de kurk op de achterzijde voor het invriezen, indien nodig (Figuur 2A).
  2. Teneinde dwarsdoorsneden van de spier te verkrijgen, zinken de TA in de tragantgom aan door de distale pees en waardoor ongeveer 3/4 van de spieren buiten en zorg ervoor dat de spier in een loodrechte positie ten opzichte van de kurk (Fig 2A).
  3. Vul een aluminium blikje (als alternatief, een metalen beker of een glazen beker), met isopentaan. Hang de blik isopentaan in een Dewar met liquid stikstof te zorgen dat het stikstof in het blik te openen.
    Opmerking: Isopentaan moet de juiste temperatuur heeft bereikt (van -150 tot -160 ° C) voor een optimale invriezen van het weefsel. De juiste temperatuur is bereikt wanneer sommige witte vaste deeltjes op de bodem van de kan en de isopentaan wordt iets viskeus.
    Opmerking: de steekproef niet bevriezen vóór de vorming van de vaste deeltjes, omdat het kan leiden tot bevriezing artefacten. Anderzijds, als de isopentaan wordt volledig vast, laat het op kamertemperatuur totdat het ontdooid, ervoor zorgen dat sommige witte deeltjes nog aanwezig.
  4. Met behulp van een tang Mixter, snel dompel de kurk met de spier in de isopentaan, waardoor de spier geplaatst omlaag, en zorg ervoor dat de kurk los wanneer deze volledig is ondergedompeld in de vloeistof. Zo terwijl het monster drijft alleen de achterzijde van de kurk moet zichtbaar in de vloeistof.
  5. Laat de sample in isopentaan gedurende 1 min.
  6. Met behulp van een tang Mixter (of soortgelijke tang), neemt u de spieren en onder te dompelen in vloeibare stikstof gedurende minstens 2 min.
  7. Wikkel de monsters afzonderlijk in geëtiketteerde aluminiumfolie en ze onmiddellijk plaatsen in droogijs (-70 ° C), of direct op te slaan ze in een -80 ° C vriezer.
    Opmerking: Door de procedure van stap 3,4-3,7, is het uiterst belangrijk dat de juiste temperatuur te houden en te voorkomen dat de monsters van ontdooien (bijvoorbeeld tijdens de overdracht naar de -80 ° C vriezer.). De temperatuurstijging leidt tot ongecontroleerde ontdooien en opnieuw bevriezen van het water microkristallen die aanwezig in het weefsel en uiteindelijk leidt tot de vorming van artefacten of afbraak van spiervezels (gevisualiseerd op de weefselcoupes zo groot wit gat in het midden van de vezel).

4. cryostaat Opdeling van Frozen Spieren

  1. Stel de cryostaat kamer temperatuur to -20 tot -22 ° C.
  2. Zet het monster stub, het mes en het model in de cryostaatkamer, zodat ze equilibreren gedurende ten minste 30 min.
  3. Plaats een kleine hoeveelheid van het bevriezen van verbinding (bv oktober compound) op het monster stomp en dompel de kurk met het monster vóór het invriezen verbinding stolt. In de tussentijd zet het mes in de bladhouder.
  4. Lijn het model en het mes met behulp van de meegeleverde schroeven om het monster houder met het mes houder (Figuur 2B) oriënteren.
  5. Stel de snijdikte tot 10 pm. Ga verder met het weefsel te snijden. Voor elke omwenteling van het aandrijfwiel, de monsterhouder voorschotten een gecontroleerde afstand naar het mes.
  6. Leg de secties over een gepolariseerde dia (8-10 sectie per dia) (figuur 2C).
  7. Na het snijden, slaan de dia's bij -80 ° C.
    Opmerking: Het monster kan in een -80 ° C vriezer bewaard en hergebruikt voor further snijden, mits goed behandeld en opgeslagen.

5. Routine histologische kleuring (hematoxyline & eosine Stains)

Opmerking: Verscheidene histologische kleuringen kan volgens de analyse worden uitgevoerd op spier- secties. Een routine histologische vlek voor morfologische en morfometrische analyse is de hematoxyline & eosine (H & E) bichromic vlek. De hematoxyline vlekken de kernen een diep paars. Nucleaire kleuring is tegengekleurd met eosine (roze / rood), die eosinofiele structuren, zoals de spiervezels in het cytoplasma vlekken.

  1. Volledig lucht drogen bevroren dia met secties voor 10 - 15 minuten bij kamertemperatuur, het indienen van de dia's in een kleuring lade en zet de schaal in een kleuring trog.
  2. Kleur wordt 1 minuut met hematoxyline.
  3. Leg de vlekken trog in het kader van een vrij zwak kraan waterstraal gedurende 10 minuten te spoelen de hematoxyline.
  4. Dompel de dia's gedurende 5 minuten in 95% ethanol, als een alcoholische oplossing van eosine zal worden gebruikt (overslaan tstap zijn bij een waterige oplossing eosine).
  5. Tegenkleuring gedurende 1 min met eosine-oplossing.
  6. Spoelen met water aan overmatige eosine oplossing te elimineren.
    Let op: Optimale timing van de kleuring met ofwel hematoxyline en eosine moeten worden gedefinieerd voor elke nieuwe batch.
  7. Dehydrateer de monsters in een ethanolreeks: 50% en 70% (enkele seconden). Snel onderdompelen in 95% ethanol, gevolgd door 2 veranderingen in 100% ethanol, 5 minuten elk.
  8. Clear in 2 veranderingen van xyleen, elke 5 minuten of langer. Deze stap moet in het kader van een chemische kap worden uitgevoerd.
  9. Monteer de glaasjes met een xyleen basis van montage medium, het toepassen van een paar druppels fixeermiddel op de slede en die met een dekglaasje. Het fixeermiddel kan ook worden toegepast op het dekglaasje en het dekglaasje gezet op de slede.
    1. Vermijd de vorming van luchtbellen tussen de glijbaan en het dekglaasje. Om luchtbellen te verwijderen, houdt u de dia verticale (na montage) en knijp het overtollige mounting medium en luchtbellen door voorzichtig drukken op de dekglaasje met stompe pincet (of een soortgelijk stomp voorwerp).
  10. Houd de dia's onder de motorkap voor een paar uur of 's nachts te laten de xyleen verdampen volledig alvorens over te gaan tot de analyse.
  11. Voer de morfologische en morfometrische analyse van H & E gekleurde secties regenererende spieren door niet-overlappende seriële beelden van ten minste één volledig spiersectie per muis. Maak foto's met een heldere-veld microscoop met 20x vergroting.
    Opmerking: Een minimum van 5 muizen wordt aanbevolen om de statistische significantie van de metingen te verkrijgen.
    Opmerking: Afbeelding analyse software is beschikbaar voor dit doel, zoals de gratis te downloaden software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

H & E kleuring maakt de evaluatie van de morfologie van het regeneratieproces op specifieke tijdstippen tijdens skeletspier regeneratie. Figuur 3 toont het tijdsverloop analyse uitgevoerd op TA geblesseerde spieren van wildtype muizen. Spieren zijn geïsoleerd op 3, 7, 15 en 30 dagen na injectie CTX, zoals schematisch weergegeven in figuur 3A. Representatieve foto's van H & E-gekleurde dwarsdoorsneden tonen de dynamiek van de skeletspieren herstel na verloop van tijd (Figuur 3B-E). Op dag 3 na een blessure, is de structurele architectuur van de spier volledig verwoest, en beide ontaardde spiervezels (necrotische gebied) en mononucleaire cellen zijn duidelijk zichtbaar (Figuur 3B). Deze heterogene groep van cellen bestaat voornamelijk uit voorbijgaande versterkend satelliet-cellen (myoblasten), ontstekingscellen gerekruteerd uit het bloed 11 en interstitiële en endotheelcellen die participate in het regeneratieproces, die in werking treedt op de plaats van verwonding. Hierbij worden nieuwe regenererende spiervezels gegenereerd door fusie en differentiatie van myoblasten. Het belangrijkste kenmerk van de regenererende gebied is de aanwezigheid van kleine basofiele myofibers met centraal gelegen kernen en een donker gekleurd cytoplasma (Figuur 3C). In dit stadium ontsteking is nog zichtbaar, hoewel het geleidelijk afneemt. De grootte van regenererende spiervezels mettertijd toeneemt, hetgeen leidt tot eosinofiele geregenereerd myovezels kenmerk centraal gelegen kernen (figuur 3D, E). De geregenereerde spiervezels zichtbaar in latere stadia van regeneratie en tot het einde van het proces. De gezonde spiervezels lijken sterk georganiseerd en dicht bij elkaar, met een roze cytoplasma en de kernen geplaatst aan de omtrek van de vezels onder de sarcolemma. Deze spiervezels zijn meestal veel aanwezig zijn van de plaats van CTX injectie en verwondingen, en ze meer zeldzamely vertegenwoordigen gebieden waar de regeneratie definitief voltooid. Inderdaad, geregenereerd vezels gekenmerkt door de aanwezigheid van centraal kernen die naar de omtrek slechts enkele maanden na verwonding.

Digitale beelden van de gekleurde spier secties worden opgevangen door toevoeging van de schaalbalken ruimtelijke kalibratie, die nodig is om nauwkeurig de aandachtsgebieden met een overzicht van de contouren van de betrokken gebieden. De meting van de spiervezeloriėntaties dwarsdoorsnedeoppervlak (CSA) is een betrouwbare morfometrische analyse, die op grote schaal wordt gebruikt om de verschillen in de regeneratie trend tussen verschillende groepen muizen kwantificeren. Deze analyse vereist de meting van gebieden met centraal kernhoudende spiervezels, waarvan ten minste 500 en tot 1000 vezels per groep. Zowel het gemiddelde van de regenererende en geregenereerd spiervezeloriėntaties gebieden en de Gaussische verdeling van deze gebieden zijn indicatoren van de regeneratie Process. Verhoogde spiervezeloriėntaties CSA wordt algemeen geassocieerd met een verbeterde en / of versnelde regeneratieve respons. Integendeel, is het niet goed regeneratie geassocieerd met een daling in CSA. Hier rapporteerden we de spiervezeloriėntaties CSA analyse aangeduid als zowel de gemiddelde (Figuur 3F) en distributie (figuur 3G) van spiervezeloriėntaties CSA op verschillende tijdstippen. De analyse benadrukt hoe de verdeling van spiervezeloriėntaties gebieden loop der tijd verandert en hoe de CSA verschuift in de richting van grotere hoeveelheden vezels als het proces van herstel verloopt.

Figuur 1
Figuur 1. Intramusculaire injectie en isolatie van de tibialis. A. intramusculaire injectie van cardiotoxine in de tibialis anterior spier. B. Verwijdering van spierfascie. De witte pijl geeft de thin-tip pincet dat de spier knijpen om th verwijderene fascia. C. De bovenste afbeelding toont de anatomische positie van het distale TA pees. De onderste foto laat zien hoe de TA te tillen en te verwijderen terwijl het vermijden van spierschade. D. Foto links: de TA wordt opgeheven door omhoog te trekken de distale pees. De witte pijl geeft de distale EDL pees. Foto rechts: door de pees die met een tang, de bovenrand van de TA afgesneden onder de knie. De witte pijl geeft de snij-website. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Fresh Bevriezing Spier en cryostaat Opdeling van Frozen Spieren. A. Techniek van verse spier opname in tragantgom. De TA spier wordt ondergedompeld in het tandvlees van de pees, met ongeveer 3/4 buiten engehandhaafd in een loodrechte positie ten opzichte van de kurk. B. Vertegenwoordiger beelden van de procedure voor de cryostaat snijden. De kurk wordt in een kleine hoeveelheid ijskoud verbinding op het monster stub. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Tijd Cursus Analyse van de skeletspieren Regeneration. A. Experimenteel schema van acute skeletspier letsel. BE. Representatieve foto's van hematoxyline & eosine gekleurde coupes van cardiotoxine (CTX) -behandeld spieren op aangegeven dagen na het letsel. B. De zwarte ononderbroken lijn (aan de linkerkant van de foto), omsluit een paar necrotische vezels, waarschijnlijk binnengevallen door ontstekingscellen. De stippellijn (rechtsvan de foto) markeert een oppervlakte van infiltrerende mononucleaire cellen. C. Eén onrijpe spiervezeloriėntaties met centraal nucleus wordt aangegeven door de zwarte cirkel. DE. Grote geregenereerd eosinofiele spiervezels, met centraal gelegen kernen worden gekenmerkt door zwarte cirkels. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 mm. F. Gemiddelde van centraal kernhoudende spiervezeloriėntaties grootte waarden in TA spier secties. Waarden zijn gemiddelden ± SEM, 5 muizen / groep. G. spiervezeloriėntaties dwarsdoorsnede-oppervlak (CSA) distributie op 6, 15, en 30 dagen na de CTX injectie. Waarden zijn gemiddelden ± SEM, 5 muizen / groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier beschrijven we een protocol om acuut letsel in de skeletspier (dat wil zeggen, de intramusculaire injectie van CTX) induceren. Het wordt veel gebruikt als een krachtig instrument om de dynamiek van de skeletspier regeneratie in vivo te bestuderen. CTX injectie induceert de degeneratie van spiervezels, die wordt veroorzaakt door de depolarisatie van de sarcolemma en contractie van de vezels 12, en leidt tot de cascade van gebeurtenissen die leidt tot spierregeneratie. Skeletspieren ontleed op gewenste tijdstippen na de injectie en schade volgens experimentele eisen, en gebruikt voor latere histologische analyse. De ontleed spieren kan zowel worden bevroren, na opname in cryo-beschermende media, of zijn opgenomen in paraffine. Echter, deze procedures vereisen een stap van vooraf fixatie met paraformaldehyde, dat artefacten kan genereren en kan uiteindelijk invloed hebben op de latere analyse. direct bevriezen van het weefsel kan dit probleem te voorkomen. Van de nota, veelprimaire antilichamen werken uitsluitend of effectiever op vers ingevroren spier secties 13, die deze procedure betrouwbaarder maakt. De morfometrische analyse wordt meestal uitgevoerd op tijdsverloop experimenten, waarmee voor de evaluatie van verschillen in het regeneratieproces tussen groepen muizen met dezelfde leeftijd en specifieke genetische mutaties en / of farmacologische behandelingen. Hoewel het protocol van CTX-geïnduceerde schade zeer reproduceerbare zichzelf een mogelijke beperking komt door de operator variabiliteit van CTX injectie. Om deze beperking te overwinnen, heeft het de voorkeur dat het gehele tijdsverloop experiment werd uitgevoerd door dezelfde persoon.

De omvang van de spieren regeneratie kan worden gekwantificeerd als percentage van gezonde vezels, necrotische gebieden en ontsteking, en herstellende en geregenereerd gebieden over de totale oppervlakte. Echter, deze aanpak vooral gebruikt bij het bestuderen van gebeurtenissen van chronische schade, zoals in dystrofische mdx mice, in plaats van in modellen van acute schade. Sterker nog, terwijl dystrofische spieren worden gekenmerkt door asynchrone gebeurtenissen van degeneratie en regeneratie, acuut letsel wordt gevolgd door goed gedefinieerde en de daaruit voortvloeiende gebeurtenissen. Een beperking van deze analyses, waarbij een empirische identificatie van de morfologische kenmerken hierboven beschreven eisen, is dat ze niet volledig zuiver. Experimentele conclusies ondersteunen, moet de morfologische analyse altijd aangevuld met verdere analyse, zoals immunofluorescentie analyse van specifieke moleculaire merkers, experimentele conclusies ondersteunen. Daarom heeft het de voorkeur parallel analyse gebruiken om ondubbelzinnig de resultaten te interpreteren. Zo regenereren spiervezels kleurden positief voor embryonale myosine heavy chain (eMyHC) die specifiek tot expressie wordt gebracht in nieuw gevormde spiervezels. Aldus kan kwantificering van eMyHC gekleurde spiervezels worden uitgevoerd zij-aan-zij met de morfologische analyse.

De CSA-analyse is een meer betrouwbare kwantificatie en kunnen ofwel worden uitgevoerd op H & E-gekleurde coupes of spier secties gekleurd met laminine, die de rand van de spiervezels markeert; kwantificering wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ juiste macro's, zoals hierboven beschreven. In beide gevallen is het altijd noodzakelijk eerst de kwaliteit van de secties beoordelen en weefselgebieden die verschijnen vervormd of gekruld sluiten.

Naast de morfologische analyse van de weefsels, H & E-gekleurde coupes kunnen vaststellen van andere specifieke kenmerken, zoals de aanwezigheid van fibrose en / of vetweefsel. Inderdaad, fibrose is afgeleid van de buitensporige accumulatie van extracellulaire matrix dat hetzij als de regeneratie verminderd is of bij chronische ziekten 14. Sterker nog, de extracellulaire matrix accumulatie is zichtbaar als bleke materiaal tussen de geregenereerde spiervezels in H & E-histologische kleuring afgezet. Meerdere ronden van CTX injectie kan worden gebruikt to na te bootsen chronische ziekte waarbij de spiervezels ondergaan golven van degeneratie en regeneratie en littekenweefsel ophoopt afwijkend. Echter betrouwbaarder protocollen beschikbaar voor spierfibrose 15 induceren, en specifieke histologische kleuring kan worden uitgevoerd om deze structuren, zoals Masson Trichrome of Sirius Red kleuring identificeren en te kwantificeren. Vorming van vetweefsel is duidelijk zichtbaar in H & E gekleurde secties afgerond witte structuren tussen de spiervezels, waardoor een belangrijke aanwijzing voor de aanwezigheid van vetweefsel, die wordt gekwantificeerd door Oil Red kleuring. Tenslotte verkregen skeletspier secties volgens de methode beschreven kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie-analyse met specifieke antilichamen en protocollen voeren protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, (8), 1151-1156 (2003).
  2. Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4, (2), 243-259 (2015).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  4. Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142, (9), 1572-1581 (2015).
  5. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91, (1985), 534-551 (1985).
  6. Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31, (2), 384-396 (2013).
  7. Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304, (5), E453-E465 (2013).
  8. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  9. Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
  10. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, (1), 209-238 (2004).
  11. Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204, (5), 1057-1069 (2007).
  12. Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44, (4), 752-764 (1972).
  13. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  14. Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1, (1), (2011).
  15. Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4, (1), 7 (2014).
Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).More

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter