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Neuroscience

में गहराई शारीरिक माउस vomeronasal अंग की तीव्र ऊतक स्लाइस में परिभाषित सेल आबादी के विश्लेषण

Published: September 10, 2016 doi: 10.3791/54517
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

Introduction

अधिकांश जानवरों को उनके रासायनिक इंद्रियों पर काफी भरोसा है अपने आसपास के साथ बातचीत करने के लिए। गंध की भावना को खोजने और भोजन का मूल्यांकन, शिकारियों से बचने और पता लगाने उपयुक्त संभोग भागीदारों के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाता है। मुख्य घ्राण उपकला 1,2, 3,4 Grueneberg नाड़ीग्रन्थि, Masera 5,6 के सेप्टल अंग और Vomeronasal अंग: सबसे स्तनधारियों में, घ्राण प्रणाली में कम से कम चार संरचनात्मक और कार्यात्मक अलग परिधीय उप के होते हैं। VNO गौण घ्राण प्रणाली (AOS) है, जो रासायनिक संकेत है कि पहचान, लिंग, सामाजिक रैंक और यौन राज्य 7-10 बारे में जानकारी देने का पता लगाने में एक प्रमुख भूमिका निभाता के परिधीय संवेदी संरचना शामिल हैं। VNO सही तालू ऊपर नाक पट के आधार पर स्थित है। चूहों में, यह एक द्विपक्षीय अंधा न खत्म होने वाली एक उपास्थि कैप्सूल 11-13 में संलग्न ट्यूब है। अंग दोनों एक चंद्राकार औसत दर्जे का संवेदी epithe के होते हैंlium कि VSNs बंदरगाहों और पार्श्व पक्ष पर एक गैर-संवेदी भाग की। दोनों के बीच एक epithelia बलगम से भरे लुमेन जो संकीर्ण vomeronasal वाहिनी 14 के माध्यम से नाक गुहा से जुड़ा है निहित है। गैर-संवेदी ऊतकों में एक बड़े पार्श्व रक्त वाहिनियों की नकारात्मक दबाव 15,16 के माध्यम से ऐसे पेप्टाइड्स या VNO लुमेन में छोटे प्रोटीन के रूप में अपेक्षाकृत बड़े, ज्यादातर गैर अस्थिर अणुओं के प्रवेश की सुविधा के लिए एक संवहनी पंप तंत्र प्रदान करता है। VNO की संरचनात्मक घटकों जन्म के समय मौजूद हैं और अंग शीघ्र ही यौवन 17 से पहले वयस्क आकार तक पहुँचता है। हालांकि, कृंतक AOS पहले से किशोरों में कार्यात्मक है कि क्या अभी भी 18-20 बहस का विषय है।

VSNs दोनों अपने उपकला स्थान और रिसेप्टर के प्रकार वे एक्सप्रेस द्वारा प्रतिष्ठित हैं। VSNs एक बिना मेलिनकृत अक्षतंतु और एक भी शिखर डेन्ड्राइट कि लुमेन की ओर protrudes और एक microvillous वृक्ष के समान घुंडी में समाप्त होता है के साथ एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान दिखा। VSN कुल्हाड़ीons fasciculate vomeronasal तंत्रिका कि dorso दुम अंत में उपास्थि कैप्सूल छोड़ देता है, पट साथ ascends, cribriform प्लेट और गौण घ्राण बल्ब (एओबी) 21,22 करने के लिए परियोजनाओं गुजरता के रूप में। vomeronasal संवेदी उपकला दो परतों के होते हैं: शिखर परत ल्यूमिनल पक्ष और बंदरगाहों दोनों V1R- और सभी लेकिन न्यूरॉन्स FPR रु व्यक्त की एक प्रकार के करीब स्थित है। इन न्यूरॉन्स जी प्रोटीन α सबयूनिट जी αi2 और एओबी 23-25 ​​के पूर्वकाल हिस्सा करने के लिए परियोजना coexpress। संवेदी अधिक बेसल परत एक्सप्रेस V2Rs या FPR-RS1 जी αo के साथ-साथ में स्थित न्यूरॉन्स और एओबी 26-28 के पीछे क्षेत्र के लिए उनकी एक्सोन भेजते हैं।

Vomeronasal न्यूरॉन्स की संभावना नहीं बल्कि छोटे semiochemicals 29-33 (V1Rs) या प्रोटीन यौगिकों 34-38 (V2Rs) कि इस तरह के मूत्र, लार के रूप में विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में स्रावित तरल पदार्थ और आंसू रहे हैं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 37,39-41 सीटू प्रयोगों में पता चला है कि VSNs भी formylated पेप्टाइड्स और विभिन्न रोगाणुरोधी / सूजन से जुड़े यौगिकों 25,42 से सक्रिय कर रहे हैं। इसके अलावा, heterologously व्यक्त FPR रु प्रोटीन प्रतिरक्षा प्रणाली में व्यक्त FPRs साथ एगोनिस्ट स्पेक्ट्रा का हिस्सा है, conspecifics या खराब खाना सूत्रों 25 में बीमारी के लिए डिटेक्टरों के रूप में एक संभावित भूमिका का संकेत (संदर्भित 43 देखें)।

विशिष्ट VSN आबादी में रिसेप्टर ligand रिश्तों को और नीचे की ओर cascades संकेत समझने के लिए मौलिक एक देशी वातावरण में अपने बुनियादी biophysical विशेषताओं का एक विस्तृत मूल्यांकन है। अतीत में, सेलुलर संकेत के विश्लेषण बहुत आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर 30,44-49 coexpressing द्वारा न्यूरॉन्स की एक परिभाषित आबादी के निशान से लाभान्वित किया है। इस प्रोटोकॉल में, एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन है कि एक साथ FPR-RS3 व्यक्त एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ (FPR-RS3-ए-शुक्र) का इस्तेमाल किया जाता है।यह दृष्टिकोण कैसे इस तरह के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस तनाव को रोजगार के लिए एक ऑप्टिकली पहचाने जाने सेल तीव्र राज्याभिषेक VNO ऊतक स्लाइस में एक न्यूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग आबादी के electrophysiological विश्लेषण करने के लिए एक मिसाल है। एक हवा के दबाव पर ही आधारित संवेदी उत्तेजनाओं और औषधीय एजेंटों के लिए मल्टी बैरल छिड़काव प्रणाली रिकॉर्डिंग के दौरान, जल्दी प्रतिवर्ती और फोकल न्यूरोनल उत्तेजना या निषेध की अनुमति देता है। टुकड़ा तैयारी में पूरे सेल रिकॉर्डिंग सेल के देशी वातावरण में आंतरिक गुणों, वोल्टेज सक्रिय conductances का एक विस्तृत विश्लेषण, साथ ही संभावित कार्रवाई मुक्ति पैटर्न के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण (निर्देशक 86/609 / ईईसी) और साथ सिफारिशें यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के महासंघ (FELASA) से आगे रख पर स्थानीय और यूरोपीय संघ के कानून के अनुपालन में थे। दोनों C57BL / 6 चूहों और FPR-RS3-ए-शुक्र चूहों भोजन और पानी उपलब्ध यथेच्छ के साथ एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर कमरे के तापमान पर दोनों लिंगों के समूहों में रखे थे। प्रयोगों के लिए या तो सेक्स के युवा वयस्कों (6-20 सप्ताह) का इस्तेमाल किया गया। कोई स्पष्ट लिंग पर निर्भर मतभेद मनाया गया।

1. समाधान तैयार

  1. कोशिकी समाधान एस 1 को तैयार: 4- (2 हाइड्रोक्सी एथिल) piperazine-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES) कोशिकी समाधान (मिमी) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES युक्त बफर; पीएच = 7.3 (NaOH के साथ समायोजित); परासारिता = 300 mOsm (ग्लूकोज के साथ समायोजित)।
  2. extracellu तैयारLAR समाधान एस 2: कार्बोगन ऑक्सीजन (95% हे 2, 5% सीओ 2) कोशिकी समाधान (मिमी) युक्त 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; पीएच = 7.3; परासारिता = 300 mOsm (ग्लूकोज के साथ समायोजित)।
  3. ऊतक embedding के लिए 4% कम तापमान बीच बढ़िया तालमेल agarose समाधान (एस 3) तैयार: 4% कम तापमान बीच बढ़िया तालमेल agarose। 2 जी agarose एस 1 के 50 मिलीलीटर में एक 100 मिलीलीटर कांच की बोतल प्रयोगशाला में एक साथ एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ कम-बीच बढ़िया तालमेल भंग। agarose पिघल, बोतल एक नहाने के पानी में (ढक्कन कसकर बंद नहीं) के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 20 मिनट के लिए या समाधान सरगर्मी जबकि पारदर्शी हो जाता है जब तक डाल दिया। शांत हो जाओ और आगे उपयोग करें जब तक 42 डिग्री सेल्सियस पर एक दूसरे नहाने के पानी में पिघल agarose रहते हैं।
  4. Intracellular समाधान एस 4 तैयार: पिपेट समाधान (मिमी) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 2 CaCl (मुक्त सीए 2 = 110 एनएम), 10 HEPES, 2 MgATP युक्त, 1 NaGTP;पीएच = 7.1 (KOH के साथ समायोजित); परासारिता = 290 mOsm।
  5. संशोधित / एस 1 की संरचना को समायोजित, एस 2 और एस 4 अलग-अलग प्रयोगात्मक डिजाइन (जैसे, औषधीय ब्लॉकर्स वोल्टेज सक्रिय धाराओं के कुछ प्रकार को अलग करने के लिए) के अनुसार।

2. कार्यक्षेत्र तैयारी

  1. तापमान और पीएच समायोजन और आक्सीजन के समाधान के लिए लगातार बर्फ पर एस 2 में कम से कम 30 मिनट के विच्छेदन के लिए पहले, जगह के साथ टुकड़ा भंडारण के चैम्बर oxygenating भरें।
  2. एस 2 के साथ सेटअप रिकॉर्डिंग पर टुकड़ा superfusion के लिए जलाशय भरें और लगातार आक्सीजन।
  3. विच्छेदन के लिए पहले, एस 2 के साथ vibratome कक्ष को भरने और कक्ष के आसपास कुचल बर्फ की व्यवस्था। वैकल्पिक रूप से, vibratome कक्ष में चैम्बर oxygenating से स्पेयर बर्फ के ठंडे ऑक्सीजन समाधान स्थानांतरण और लगातार oxygenating रहते हैं।
  4. सर्जिकल उपकरण और उपभोज्य की व्यवस्था।
  5. विदारक के नीचे बर्फ जेल पैक रखेंमाइक्रोस्कोप, पकवान की तह तक ठंड से VNO ऊतक को रोकने के लिए एक कागज तौलिया के साथ कवर।
  6. संक्षेप में 70% इथेनॉल और आसुत जल में rinsing और vibratome के लिए माउंट द्वारा साफ रेजर ब्लेड। हर टुकड़ा करने की क्रिया सत्र के लिए बदलें।

3. VNO विच्छेदन और एम्बेडिंग

  1. संक्षिप्त जोखिम से पशु बलि 2 सीओ और तेज शल्य कैंची का उपयोग करने के लिए सिर काटना। नोट: बर्फ पर VNO कैप्सूल डालने के लिए पशु त्याग से समय के रूप में महत्वपूर्ण है, कम से कम 2 मिनट के समय को कम। ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, कम से कम 30 मिनट में agarose में दोनों पूरी तरह से विच्छेदित VNOs एम्बेड।
  2. बड़ी शल्य कैंची के साथ निचले जबड़े निकालें। मुंह गुहा के माध्यम से दर्ज करें और जबड़ा हड्डियों और प्रत्येक पक्ष की मांसपेशियों को अलग से काटा।
  3. सिर के शेष भाग उल्टा बड़े पेट्री डिश में नीचे रखें।
  4. दूर ऊपरी जबड़े की और मध्यम संदंश के साथ नाक के लिए बेहतर पहुँच प्राप्त करने की नोक के आसपास की त्वचा खींचोकृन्तक।
  5. दूर व्याख्यान चबूतरे दिशा (चित्रा 1 ए) में एक ~ 45 डिग्री के कोण पर कृन्तक का सबसे बड़ा हिस्सा कटौती करने के लिए हड्डी कैंची का प्रयोग करें। यह नाक गुहा से VNO कैप्सूल के हटाने को कम करेगा।
    नोट: दांत की जड़ तक कटौती न करें VNO कैप्सूल की नोक को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए।
  6. मध्यम संदंश के साथ अपने व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा पर कठोर ऊपरी तालू ले लो और ध्यान से एक फ्लैट कोण (चित्रा 1 बी) पर एक टुकड़ा में वापस छील।
    नोट: बार-बार ठंडा एस 2 से कुल्ला।
  7. VOMER हड्डी और जबड़े की नोक के बीच बोनी संलयन कटौती करने के लिए माइक्रो वसंत कैंची का प्रयोग करें। टिप जावक VNO से दूर है और ध्यान से इशारा करते हुए दोनों को छोड़ दिया और VNO कैप्सूल के लिए दाईं ओर पार्श्व पर छोटे चरणों में हड्डी में कटौती की घुमावदार भाग के साथ कैंची सुझावों डालें।
  8. VNO कैप्सूल को दूर करने के लिए, सूक्ष्म वसंत कैंची का उपयोग दुम भाग में VOMER हड्डी के माध्यम से कटौती करने के लिए और ध्यान से n के बाहर VOMER हड्डी उठाasal गुहा मध्यम संदंश का उपयोग। इसके तत्काल बाद एक बर्फ जेल पैक जहां विच्छेदन के बचे हुए चरणों प्रदर्शन किया जाएगा पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे एक छोटा सा पेट्री डिश के लिए VNO हस्तांतरण।
  9. बाहर सुखाने से ऊतक को रोकने के लिए ठंडा एस 2 की एक छोटी राशि में VNO कुल्ला।
  10. अलग उपास्थि कैप्सूल है कि मध्यम संदंश के साथ VOMER हड्डी के पीछे हथियाने के द्वारा VNO कोमल ऊतकों में होते हैं। एक पृष्ठीय दृश्य के लिए कैप्सूल स्थिति इतनी है कि दोनों के बीच एक विभाजन VNOs दिखाई हो जाता है (चित्रा -1 i)।
  11. केंद्रीय हड्डी से दोनों उपास्थि VNO कैप्सूल को अलग करते हुए VOMER हड्डी पीछे भाग पर नीचे टिकी रखने के लिए ठीक संदंश की नोक का प्रयोग करें।
    नोट: केवल उपास्थि कैप्सूल के रिम पर संदंश का प्रयोग करें और के रूप में नाजुक संवेदी उपकला आसानी से क्षतिग्रस्त है उपास्थि के माध्यम से बेध नहीं बहुत सावधान रहना होगा।
  12. एक बार दो VNOs अलग हो रहे हैं, उपास्थि एफआइआर encapsulating हटाने शुरूटी VNO।
  13. एक ठीक संदंश के साथ कैप्सूल के शीर्ष रिम ले लो और उपास्थि दीवार है कि पहले VOMER हड्डी (औसत दर्जे का पक्ष) से ​​जुड़ा था दूर विभाजित।
  14. शेष उपास्थि पकवान की तह तक अपने घुमावदार पार्श्व पक्ष के साथ VNO की बारी है और सुरक्षित रूप से संदंश का उपयोग कर एक तरफ उपास्थि नीचे पिन निकालने के लिए। ध्यान से ऊतक और उपास्थि के बीच के संबंध को ढीला करने के उपास्थि और VNO के बीच एक बहुत ही फ्लैट कोण पर पीछे की ओर से दूसरी ठीक संदंश चलते हैं।
  15. धीरे धीरे अपनी दुम नोक पर इसे धारण, संवेदी उपकला हानिकारक से बचने के द्वारा उपास्थि से दूर VNO छील।
  16. एक बार जब VNO कैप्सूल से levered है, उपास्थि के किसी भी शेष टुकड़े के रूप में सभी शेष छोटे उपास्थि भागों को दूर करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान agarose आसपास के ऊतक से अलग होगा सुनिश्चित करें।
  17. पहले विच्छेदित VNO पर ठंडा एस 2 की एक छोटी सी बूंद ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए रखें। पार्श्व पक्ष Wil पर एक बड़ी रक्त वाहिकाएल यह दर्शाता है कि अंग अभी भी बरकरार है और निहायत विच्छेदन (2A चित्रा द्वितीय) के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं किया गया था दिखाई देने लगते हैं। मामले में रक्त वाहिका क्षतिग्रस्त हो गया, यह अभी भी रूप में लंबे समय के रूप में कुल आकृति विज्ञान स्पष्ट रूप से नहीं बिगड़ा हुआ था VNO टुकड़ा करने की क्रिया के साथ पर ले जाने के लिए सार्थक हो जाएगा।
  18. इसके तत्काल बाद दूसरी VNO काटना।
  19. VNOs एम्बेड करने के लिए, पिघला एस 3 के साथ रिम को दोनों छोटे पेट्री डिश को भरने (42 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में संग्रहीत; 1.3 देखें)।
  20. ठीक संदंश के साथ व्यापक दुम अंत पर VNO पकड़ो संवेदी उपकला को होने वाले नुकसान से बचने के लिए।
  21. agarose में VNO विसर्जित कर दिया और यह क्षैतिज आगे और पीछे ले कई बार कोशिकी समाधान की फिल्म के साथ ही इसकी सतह से किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
  22. दुम टिप डिश के नीचे का सामना करना पड़ के साथ खड़ी VNO स्थिति। इसके बजाय संदंश के साथ सीधे VNO बन्द रखो की, करीब proximi में संदंश टिप ले जाकर उन्मुखीकरण समायोजितVNO करने के लिए शब्द।
    नोट: एम्बेडिंग दौरान अभिविन्यास महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्रयोग के दौरान संवेदी न्यूरॉन्स के लिए टुकड़ा विमान और पहुंच निर्धारित करता है।
  23. जेल आइस पैक पर बर्तन रखें और इंतजार जब तक agarose जम गया है।
    नोट: VNO रुख बदल नहीं है एक बार agarose solidifying के रूप में इस आसपास agarose से ऊतक अलग होगा शुरू कर दिया है।

4. कोरोनल VNO ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया

  1. एक बड़े पेट्री डिश के ढक्कन में छोटे पकवान से agarose ब्लॉक दूर करने के लिए छोटा सा रंग का प्रयोग करें, agarose फ्लिप उल्टा VNO की दुम टिप ऊपर की ओर का सामना करना पड़ जा रही है।
  2. एक पिरामिड आकार एक शल्य छुरी (नोक पर 3-4 मिमी, तल पर 8-10 मिमी) का उपयोग करने में ब्लॉक में कटौती। देखभाल एम्बेडेड ऊतक को नुकसान नहीं ले लो।
  3. सुपर गोंद का प्रयोग करें vibratome नमूना प्लेट के केंद्र के लिए पिरामिड के आकार का ब्लॉक को ठीक करने और गोंद पूरी तरह से सूखे के लिए इंतजार ~ 1 मिनट के लिए।
  4. टुकड़ा करने की क्रिया ग के लिए नमूना थाली हस्तांतरणhamber और दूसरे VNO तैयार करते हैं, तदनुसार। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दूसरा नमूना के साथ थाली रखें।
  5. मोटाई: निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक हिल ब्लेड microtome प्रयोग 150-200 माइक्रोन; गति: 3.5 Au = 0.15 मिमी / सेकंड; आवृत्ति 7.5 Au = 75 हर्ट्ज। संक्षेप में विदारक माइक्रोस्कोप के तहत टुकड़ा आकृति विज्ञान निरीक्षण के बाद उपयोग करें जब तक oxygenating चैम्बर के लिए स्लाइस स्थानांतरण। स्लाइस कई घंटे के लिए रखा जा सकता है।

5. एकल कोशिका electrophysiological रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग के लिए, एक ईमानदार तय चरण पानी विसर्जन उद्देश्यों, Dodt या अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर डीआईसी), और महामारी प्रतिदीप्ति के साथ ही एक ठंडा सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। डाटा अधिग्रहण के लिए, एक पैच दबाना एम्पलीफायर, सिर चरण, ई / डीए अंतरफलक बोर्ड और (रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर सहित) एक पीसी का उपयोग करें।
  2. 10-20 पैच pipettes (4-7 MΩ) के एक शेयर की तैयारी। borosilicate ग्लास केशिकाओं से खींच pipettes (1.50 मिमी आयुध डिपो / 0.86 मिमी आईडी) usinगा micropipette खींचने और एक microforge के साथ आग पॉलिश।
    नोट: आग विंदुक युक्तियाँ चमकाने के लिए महत्वपूर्ण है जब बल्कि छोटे VSNs पट्टी। यह कोशिका झिल्ली फटने जब आदेश में एक उच्च प्रतिरोध मुहर प्राप्त करने के लिए नकारात्मक दबाव लागू करने को रोकने में मदद मिलेगी। पिपेट उद्घाटन चमकाने के बाद लगभग 1 माइक्रोन होना चाहिए।
  3. नुकसान और धूल संचय उपयोग करें जब तक रोकने के लिए एक पिपेट भंडारण जार में pipettes रखें।
  4. समाधान जलाशयों को भरने और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार टयूबिंग द्वारा छिड़काव प्रणाली तैयार करें।
    नोट: पूरी तरह से ट्यूबिंग वे दृढ़ता से electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा रूप से हवा के बुलबुले निकालें।
  5. ~ 3 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह प्राप्त करने के लिए दबाव को समायोजित करें।
    नोट: उच्च दबाव electrophysiological रिकॉर्डिंग के ऊतक टुकड़ा के आंदोलन के रूप में अच्छी तरह से समाप्ति का कारण होगा।
  6. इमेजिंग चैम्बर के लिए VNO टुकड़ा हस्तांतरण और स्टेनलेस स्टील लंगर 0.1 मिमी मोटी SYNT के साथ तार का उपयोग कर स्थिति को ठीक टुकड़ाhetic फाइबर (चित्रा 2 बी - सी)।
    नोट: सिंथेटिक फाइबर धागे से एक टुकड़ा बल्कि आसपास के agarose के साथ ऊतक टुकड़ा कवर मत करो।
  7. एक स्नान के आवेदन के माध्यम से कमरे के तापमान पर ऑक्सीजन एस 2 के साथ सेटअप और लगातार Superfuse टुकड़ा रिकॉर्डिंग करने के लिए स्थानांतरण इमेजिंग कक्ष।
  8. स्नान समाधान के निरंतर आदान प्रदान के लिए एक धीमी गति से सक्शन बनाने के लिए समाधान की सतह के लिए सक्शन केशिका समायोजित करें। 8 में 1 मल्टी बैरल "छिड़काव पेंसिल" ऊपर और VNO टुकड़ा है कि रक्त वाहिका (चित्रा -2, 3 ए) 50 होता है की गैर-संवेदी हिस्से के करीब समायोजित करें। यह छिड़काव पेंसिल और रिकॉर्डिंग पिपेट की व्यवस्था करने के लिए विपरीत दिशाओं से टुकड़ा सामना करना पड़ रहा हो के लिए फायदेमंद होगा।
  9. संदर्भ इलेक्ट्रोड और स्नान समाधान एक एल के आकार अगर पुल (150 मिमी KCl से भरा) का उपयोग कर कनेक्ट करें।
  10. पिपेट समाधान एस 4 के साथ पैच पिपेट भरें।
  11. कोटिंग बंद scraping बिना सिर मंच से जुड़े चांदी क्लोराइड लेपित पैच इलेक्ट्रोड पर पिपेट माउंट और मजबूती देते हैं।
  12. लागू मामूली सकारात्मक दबाव (लगभग एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज पर 1 मिलीलीटर) स्नान प्रवेश करने से पहले पैच पिपेट करने के लिए।
  13. स्नान काफी दूर तक माइक्रो manipulators का उपयोग करने में पिपेट लोअर इसे मार (चित्रा 2 डी) के बिना उद्देश्य डूब करने में सक्षम हो।
  14. पिपेट प्रतिरोध (आर रंज, 4-7 MΩ के बीच) सिर मंच से जुड़े इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मॉनिटर।
    नोट: आर रंज है तो <4 MΩ कांच टिप टूट गया है। आर रंज> 10 MΩ है, तो टिप की संभावना सबसे अधिक भरा हुआ है और पिपेट जगह होना चाहिए।
  15. एक सीसीडी कैमरा अवरक्त-अनुकूलित अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) का उपयोग कर के साथ VNO टुकड़ा कल्पना और FPR-RS3-ए-शुक्र कोशिकाओं को व्यक्त करने (या इसी तरह लेबल न्यूरॉन्स) की पहचान प्रतिदीप्ति रोशनी का उपयोगऔर एक उपयुक्त फिल्टर घन।
  16. ध्यान दें और लक्ष्य फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है।
  17. सेल शरीर के दृष्टिकोण से, अधिकतम संवेदनशीलता के लिए हाथ पहियों का उपयोग करें। सकारात्मक दबाव के कारण, सेल सोम झिल्ली में एक छोटा सा गड्ढा दिखाई हो जाता है एक बार विंदुक टिप करीब निकटता में है।
  18. सकारात्मक दबाव जारी है और आदेश में एक उच्च प्रतिरोध मुहर (1-20 GΩ) हासिल करने के लिए कोशिका झिल्ली में चूसना करने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू होते हैं। कोशिका झिल्ली को बाधित और पूरे सेल विन्यास की स्थापना के लिए छोटे और कोमल चूषण लागू करें।
  19. प्रयोग के दौरान लगातार उपयोग प्रतिरोध की निगरानी।
    नोट: केवल छोटे और स्थिर उपयोग प्रतिरोध का प्रदर्शन करते न्यूरॉन्स में शामिल हैं (आर इनपुट के ≤3%; परिवर्तन <प्रयोग के पाठ्यक्रम पर 20%) विश्लेषण में।

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Representative Results

परिभाषित सेल आबादी के biophysical और शारीरिक गुणों में जानकारी हासिल करने के लिए, हम माउस VNO (- 2 चित्रा 1) के तीव्र राज्याभिषेक ऊतक स्लाइस प्रदर्शन करते हैं। विच्छेदन के बाद, स्लाइस कई घंटे के लिए ठंडा ऑक्सीजन कोशिकी समाधान (एस 2) में रखा जा सकता है। रिकॉर्डिंग सेटअप में ताजा ऑक्सीजन समाधान के साथ एक निरंतर आदान-प्रदान (चित्रा 2 डी) ऊतक व्यवहार्यता प्रयोग के दौरान यह सुनिश्चित करता है। हम यहाँ एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (FPR-RS3-ए-शुक्र) को रोजगार। इस तनाव coexpress FPR-RS3 के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर, FPR रु जीन परिवार (चित्रा 3) संवेदी न्यूरॉन्स की एक परिभाषित आबादी के ऑप्टिकल पहचान को सक्षम करने के लिए एक प्रोटोटाइप सदस्य में VSNs। Electrophysiological रिकॉर्डिंग एकल कोशिका के स्तर पर गहराई से विश्लेषण के लिए साधन उपलब्ध कराते हैं। उदाहरण के लिए, वोल्टेज gated धाराओं के विश्लेषण वोल्टेज दबाना में किया जाता हैमोड (चित्रा -4 ए - बी)। आयनिक धाराओं के विशिष्ट प्रकार के अलग-थलग करने के लिए, स्लाइस ऐसे TTX के रूप में औषधीय एजेंटों वोल्टेज gated एल प्रकार सीए 2 धाराओं (चित्रा 4 बी) ब्लॉक करने के लिए वोल्टेज gated ना + धाराओं (चित्रा -4 ए) या ​​nifedipine को बाधित करने के साथ superfused रहे हैं। इसके अलावा, हम नियमित रूप से पूरे सेल रिकॉर्डिंग वर्तमान दबाना विन्यास में संभावित कार्रवाई मुक्ति पैटर्न (चित्रा 4C) का विश्लेषण करने के लिए करते हैं। पूरे सेल रिकॉर्डिंग के अलावा, सेल संलग्न 'ढीला-सील' रिकॉर्डिंग एक कम आक्रामक तरीका है कि intracellular घटकों (चित्रा 5 ए) के डायलिसिस रोकता है प्रदान करते हैं। कि परिभाषित कोशिकाओं 51 (चित्रा 5 ब) की आबादी सक्रिय; रिकॉर्डिंग संभावित कार्रवाई संचालित लघु प्रोत्साहन आवेदन पर कैपेसिटिव धाराओं एक संवेदनशील और कारगर तरीका संवेदी ligands (MUPS जैसे, प्रमुख मूत्र प्रोटीन) के लिए स्क्रीन के लिए प्रदान करता है।

= Fo "jove_content": रख-together.within-पेज = "1"> आकृति 1
चित्रा 1: VNO के विच्छेदन। (ए) माउस सिर पर साइड दृश्य की स्थिति और कोण जिस पर कृन्तक काट रहे हैं वर्णन करने के लिए। (बी) हड़पने के लिए और ऊपरी तालू (उत्तर प्रदेश) वापस छील करने के लिए सबसे अच्छी बात चित्रण उदर देखें। (सी) उपास्थि कैप्सूल (सीसी) पर उदर का मानना ​​है कि निचले जबड़े, कृन्तक और तालू को हटाने के बाद VNO और VOMER हड्डी (वीबी) बंदरगाहों। विच्छेदित VNO कैप्सूल (डी) पृष्ठीय दृश्य दोनों VNOs (डी आई) के द्विपक्षीय स्थानीयकरण चित्रण। पार्श्व दृश्य पृष्ठीय पक्ष जहां दोनों VNOs जरूरत अलग होना (डी ii) पर उपास्थि के रिम को दिखाता है। स्केल बार = 1 मिमी (ए - डी)।517 / 54517fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। ऊतक तैयारी, रिकॉर्डिंग कक्ष और माइक्रोस्कोप चरण में एक VNO पर योजनाबद्ध पार्श्व दृश्य कोर्स और उपकला (ए आई) के गैर-संवेदी हिस्से में बड़ी रक्त वाहिका (बीवी) की स्थिति को वर्णन करने के लिए। धराशायी लाइन राज्याभिषेक टुकड़ा करने की क्रिया परत का प्रतिनिधित्व करता है। एक VNO सीसी से बाहर खुली पर पार्श्व दृश्य रक्त वाहिका पता चलता है (एक द्वितीय)। (बी) agarose एम्बेडेड राज्याभिषेक VNO ऊतक टुकड़ा एक स्टेनलेस स्टील लंगर के साथ 0.1 मिमी मोटी सिंथेटिक फाइबर (एस एफ) धागे वायर्ड का उपयोग कर समाधान से भरे रिकार्डिंग कक्ष के नीचे करने के लिए तय की। बॉक्सिंग क्षेत्र ऊतक टुकड़ा आसपास agarose दर्शाया गया है। (सी) की स्थिति और एक agarose (एजी) की ओर रुख को दर्शाता हुआ योजनाबद्ध दृश्य राज्याभिषेक VNO टुकड़ा दो फाइबर के बीच तैनात -embedded। (डी) रिकॉर्डिंग कक्ष खुर्दबीन मंच पर रखा का अवलोकन। चैम्बर ऑक्सीजन एस 2, छिड़काव पेंसिल (पीपी) के साथ लगातार superfusion के लिए स्नान आवेदन (बीए) संवेदी उत्तेजनाओं या औषधीय एजेंटों लागू करने के लिए, रिकॉर्डिंग पिपेट (आरपी) एम्पलीफायर सिर मंच, संदर्भ इलेक्ट्रोड से जुड़ा (आरई के साथ सुसज्जित है ) और सक्शन केशिका (एससी) चैम्बर में समाधान की एक निरंतर विनिमय बनाए रखने के लिए। स्केल बार = 1 मिमी (एक द्वितीय)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: कोरोनल VNO TissUE टुकड़ा। (ए) confocal छवि (अधिकतम प्रक्षेपण) एक 150 माइक्रोन तीव्र राज्याभिषेक VNO ऊतक टुकड़ा के फ्लोरोसेंट FPR-RS3 ताऊ-वीनस + vomeronasal संवेदी उपकला में न्यूरॉन्स (हरा) का वितरण दिखा। रक्त वाहिका (बीवी), लुमेन (एल), संवेदी उपकला (एसई)। (बी) FPR-RS3 ताऊ-वीनस + न्यूरॉन्स एक भी शिखर डेन्ड्राइट ल्यूमिनल सीमा पर एक दस्ता की तरह संरचना में समाप्त दिखा रहे हैं। पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग VSN सोमा, पैच पिपेट (पीपी) से प्रदर्शन किया गया। (सी) लंबे और संकीर्ण डेन्ड्राइट (डी) की नोक पर वृक्ष के समान घुंडी (कश्मीर) के साथ एक एकल VSN की आकृति विज्ञान, सेल सोम (एस) और अक्षतंतु (ए) बेसल पक्ष में सोमा जा रही है। स्केल सलाखों, 50 माइक्रोन (ए), 10 माइक्रोन (बी), 5 माइक्रोन (सी)। यह आंकड़ा 52 से संशोधित किया गया है। कृपया यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4: पृथक वोल्टेज gated ना + और ​​सीए 2 धाराओं के साथ ही कील निर्वहन (ए) FPR-RS3 + VSNs में एक TTX के प्रति संवेदनशील तेजी से सक्रिय ना वर्तमान के पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि निशान।। नियंत्रण की शर्तों के तहत (ए आई) वोल्टेज कदम रिकॉर्डिंग (बाह्य समाधान एस 1; intracellular समाधान एस 4) वर्तमान आवक एक वोल्टेज पर निर्भर तेजी से और क्षणिक पता चलता है। (एक द्वितीय) TTX उपचार (1 माइक्रोन) दृढ़ता से वर्तमान घटता है। डिजिटल घटाया ट्रेस (नियंत्रण-TTX (ए iii)) ReveTTX के प्रति संवेदनशील वोल्टेज gated ना + वर्तमान als। नियंत्रण और FPR-RS3 + न्यूरॉन्स से अलग TTX के प्रति संवेदनशील ना + धाराओं के वर्तमान वोल्टेज रिश्तों (ए iv)। (बी) के प्रतिनिधि सीए 2 वर्तमान निशान औषधीय पृथक (10 माइक्रोन के nifedipine)। (सी) प्रतिनिधि वर्तमान दबाना डे / दिखा hyperpolarization और (पलटाव) कार्रवाई चरणबद्ध सकारात्मक (सी आई) और नकारात्मक (सी iii) वर्तमान इंजेक्शन पर उत्पन्न क्षमता की गाड़ियों निशान। 0 पीए वर्तमान इंजेक्शन (सी ii) में मापा सहज गतिविधि पर ध्यान दें। (सी iv) नियंत्रण और FPR-RS3 + वर्तमान इंजेक्शन (मैं इंजेक्षन) के एक समारोह के रूप में न्यूरॉन्स की फायरिंग आवृत्ति। दर फायरिंग में क्रमिक वृद्धि पर नियंत्रण के लिए समान हैऔर FPR-RS3 + VSNs। ध्यान दें कि VSNs कम picoamperes में भी नजाकत वर्तमान इंजेक्शन के प्रति संवेदनशील हैं सीमा होती है 53-56। ध्यान दें कि च -मैं घटता गया है "पृष्ठभूमि सही" है 0 पीए वर्तमान इंजेक्शन पर सहज spiking आवृत्ति का उपयोग कर। डेटा ± SEM के साधन हैं। यह आंकड़ा 52 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: कोशिकी 'ढीला पैच' बेसल VSNs से रिकॉर्डिंग (ए) आईआर डीआईसी एक तीव्र VNO ऊतक संवेदी उपकला के बेसल परत में रिकॉर्डिंग पिपेट का चित्रण टुकड़ा की छवि।। (बी) सेल संलग्न विन्यास में एक बेसल VSN के प्रतिनिधि मूल रिकॉर्डिंग (&# 39; ढीला-सील ') spikes जमा recombinantly व्यक्त प्रमुख मूत्र प्रोटीन (rMUPs साथ stimulations (3 सेकंड)) और एक ऊंचा पोटेशियम एकाग्रता (50 मिमी, 1 सेकंड जानकारी देने के लिए की छोटी क्षणिक फटने के साथ जवाब) क्रमश: (बी आई) । में (बी आई) से पता चला रिकॉर्डिंग के उच्च बढ़ाई stimulations (बी द्वितीय) के जवाब में spikes के फटने को दिखाता है। लाल सलाखों उत्तेजना, अंतर प्रोत्साहन अंतराल = 30 सेकंड, सतत रिकॉर्डिंग, रुकावट <1 सेकंड (कट के निशान //) के समय का संकेत मिलता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन (ए)। पैनल (ए) के संदर्भ 38 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

VNO एक chemosensory संरचना है कि semiochemicals का पता लगाता है। तिथि करने के लिए, vomeronasal रिसेप्टर्स के बहुमत के रूप में केवल कुछ रिसेप्टर ligand जोड़े पहचान की गई है deorphanized जाना बना रहता है। उन लोगों के बीच, V1rb2 वर्णित किया गया था पुरुष मूत्र फेरोमोन 2-heptanone 30 द्वारा विशेष रूप से सक्रिय होने की, V2rp5 पुरुष विशिष्ट फेरोमोन ESP1 57 के साथ ही V2r1b और V2rf2 एमएचसी पेप्टाइड्स से सक्रिय होने की SYFPEITHI से सक्रिय किया जा करने के लिए 48 और 58 SEIDLILGY, क्रमशः। रिसेप्टर ligand रिश्ते और संकेत पारगमन को समझने के लिए एक शर्त एक देशी वातावरण में परिभाषित VSN आबादी के biophysical विशेषताओं का ज्ञान है। निष्क्रिय और सक्रिय झिल्ली गुण, वोल्टेज gated आयनिक conductances और संभावित कार्रवाई मुक्ति पैटर्न साधन और हद रिसेप्टर न्यूरॉन्स उत्तेजनाओं chemosensory का जवाब जो करने के लिए परिभाषित करते हैं। तीव्र ऊतक स्लाइस में electrophysiological रिकॉर्डिंग और विशेष रूप से, जोLe सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक शानदार तरीका महान विस्तार में इन गुणों का विश्लेषण करने के लिए प्रदान करते हैं।

ऊतक स्लाइस में सफल और विश्वसनीय शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम तैयारी ही है। प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए समय अवधि को अधिकतम करने के लिए, ऊतक कटा हुआ और तुरंत विच्छेदन के बाद ठंडा ऑक्सीजन समाधान के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए। इसके बाद स्लाइस प्रति प्रयोगात्मक दिन कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या के कई मानव संसाधन की अनुमति के विश्लेषण के लिए रखा जा सकता है। यह कुछ अभ्यास लेता काटना और कम से कम 30 मिनट में एक जानवर के दोनों VNOs एम्बेड करने के समय को कम करने के लिए। उसके बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ कई बरकरार ऊतक स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक अनुभवी प्रयोगकर्ता के लिए सफलता की दर अच्छी तरह से 75% अधिक है। प्रदर्शन पैच दबाना रिकॉर्डिंग सीए 2 इमेजिंग की तुलना में एक कम throughput प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है। फिर भी, यह एक बहुत अधिक लौकिक के साथ एकल कोशिका स्तर पर गतिविधि का एक अधिक विस्तृत और बहुमुखी विश्लेषण की अनुमति देता हैसंकल्प। पूरे सेल विन्यास में, intracellular मध्यम पिपेट समाधान द्वारा dialyzed है। पिपेट समाधान सटीक साइटोसोलिक रचना को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, यह दोनों अतिरिक्त और intracellular आयनिक की स्थिति पर सटीक नियंत्रण के साथ प्रयोगकर्ता प्रदान करता है। परिणाम के विश्वसनीय व्याख्या के लिए, उपयोग प्रतिरोध और रिसाव वर्तमान की सतत निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है। कई बार, एक उल्लेखनीय वृद्धि या उपयोग प्रतिरोध में मजबूत बदलें या uninterpretable परिणाम के लिए वर्तमान सुराग रिसाव और इस तरह ये रिकॉर्डिंग खारिज किए जाने की मांग करती है। इसके अलावा, यह ध्यान दें कि कुछ औषधीय यौगिकों अचल यह आवश्यक प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बाद स्लाइस को बदलने के लिए प्रतिपादन बाँध महत्वपूर्ण है।

सेल संलग्न विन्यास में रिकॉर्डिंग intracellular घटकों की डायलिसिस रोकता है और कोशिका की झिल्ली क्षमता को प्रभावित नहीं करता। इस प्रकार, इस तकनीक स्क्रीनिंग के एक कम आक्रामक और अपेक्षाकृत तेजी से हो गए हैं। हालांकि, इस approACH आम तौर पर कोशिका झिल्ली के बाहर से सुपर-सीमा संभावित कार्रवाई संचालित कैपेसिटिव धाराओं के रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित है। ढीले पैच रिकॉर्डिंग VNO स्लाइस 38,54 में संवेदी न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या के spiking व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त साबित किया है।

ट्रांसजेनिक मॉडल यहां कार्यरत पहचान करने और FPR-RS3 VSNs व्यक्त की जनसंख्या का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, तकनीक यहाँ वर्णित अन्य लाइनों उनकी जीनोटाइप की परवाह किए बिना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एक परिभाषित सेल प्रकार की जांच कर ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने का बहुत बड़ा फायदा होने के बावजूद उपलब्ध लाइनों के लिए प्रयोगों की सीमा। हाल ही में, तथापि, लक्षित जीनोम संपादन तेजी से और अधिक CRISPR / Cas9 तकनीक 59 से सस्ती हो गई है। अंत में, लक्षित तीव्र vomeronasal ऊतक स्लाइस में पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक बहुमुखी दृष्टिकोण एक परिभाषित populat की biophysical और शारीरिक गुणों को चिह्नित करने के लिए प्रदान करते हैंसंवेदी न्यूरॉन्स के आयन।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature) PeqLab 35-2030
ATP (Mg-ATP) Sigma-Aldrich A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) Sigma-Aldrich B9879
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Glucose Sigma-Aldrich G8270
GTP (Na-GTP) Sigma-Aldrich 51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 03564
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mm VWR decapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mm VWR lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissor Fine Science Tools decapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissors Fine Science Tools cutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2 Fine Science Tools removing skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades  Fine Science Tools cutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 Fine Science Tools dissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatula Fine Science Tools handling agarose block and tissue slices
Surgical scalpel cutting agarose block into pyramidal shape
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amplifier HEKA Elektronik EPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) Science Products
CCD-camera Leica Microsystems DFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 Leica Microsystems I3
Fluorescence lamp Leica Microsystems EL6000
Hot plate magnetic stirrer Snijders 34532
Microforge  Narishige MF-830
Micromanipulator Device  Luigs & Neumann SM-5
Micropipette puller, vertical two-step Narishige PC-10 
Microscope Leica Microsystems CSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) Quest Scientific
Objective  Leica Microsystems HCX APO L20x/1.00 W
Oscilloscope Tektronik TDS 1001B
Osmometer  Gonotec Osmomat 030
Perfusion system 8-in-1 AutoMate Scientific
pH Meter five easy Mettler Toledo
Pipette storage jar World Precision Instruments e212
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Razor blades Wilkinson Sword GmbH Wilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) custom-made
Stereo microscope Leica Microsystems S4E
Trigger interface  HEKA Elektronik TIB-14 S
Vibratome  Leica Microsystems VT 1000 S
Water bath  Memmert WNB 45

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 115 Vomeronasal अंग महक तीव्र टुकड़ा तैयारी पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी संवेदी न्यूरॉन्स formyl पेप्टाइड रिसेप्टर
में गहराई शारीरिक माउस vomeronasal अंग की तीव्र ऊतक स्लाइस में परिभाषित सेल आबादी के विश्लेषण
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Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ. J. Vis. Exp. (115), e54517, doi:10.3791/54517 (2016).

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