Introduction
대부분의 동물들은 주변 환경과 상호 작용하는 화학적 감각에 크게 의존하고있다. 냄새의 감각은 적합한 상대 파트너를 찾아 음식을 평가, 포식자를 피하고 위치에 필수적인 역할을한다. 주 후각 상피 1,2의 Grueneberg 신경절 3, 4, 5, 6 Masera의 중격 기관 및 골코 (vomeronasal) 기관 : 대부분의 포유 동물에서, 후각 시스템은 적어도 네 개의 해부학 적 및 기능적으로 서로 다른 주변 장치 서브 시스템으로 구성된다. VNO 신원, 성별, 사회적 순위 성적 7-10 상태에 대한 정보를 전달하는 화학적 신호를 검출하기에 중요한 역할을 액세서리 후각 시스템 (AOS)의 주연 감각 구조를 포함한다. VNO는 바로 구개 위의 비중격의 기지에 위치해 있습니다. 마우스에서, 그것은 연골 캡슐 11 ~ 13 안에 양자 블라인드 끝 튜브입니다. 기관은 초승달 모양의 중간 감각 epithe 모두 구성VSN을을 항구와 측면에 비 감각 부분의 lium. 모두 상피 사이 좁은 골코 (vomeronasal) 덕트 (14)를 통해 비강에 연결되어있는 점액 가득한 루멘있다. 비 감각 조직에 큰 횡 혈관 음압 15,16 통해 예 VNO 루멘으로 작은 펩티드 또는 단백질과 같은 비교적 대형, 주로 비 휘발성 분자의 진입을 용이하게하기 혈관 펌핑 메커니즘을 제공한다. VNO의 구성 요소는 출생시 존재하고 장기 곧 사춘기 17 전에 성인 크기에 도달합니다. 그러나, 설치류 AOS 이미 청소년의 작동 여부를 18 ~ 20 토론을 계속 될 수 있습니다.
VSN을들은 상피 위치와 그들이 표현 수용체의 종류 모두에 의해 구별된다. VSN을은 수초 축삭과 내강쪽으로 돌출하고 microvillous 돌기 손잡이로 끝나는 하나의 정점 덴 드라이트와 바이폴라 형태를 보여줍니다. VSN 도끼기능 총생의 배측 - 꼬리 끝 부분에있는 연골 캡슐 잎 격막을 따라 상승, 액세서리 후각 망울 (AOB) 21, 22에 소공 질의 판과 프로젝트를 통과 골코 (vomeronasal) 신경을 형성한다. 골코 (vomeronasal) 감각 상피는 두 개의 층으로 이루어져있다 : 꼭대기 층이 내강 측과 항구 V1R- 및 신경 세포를 FPR-RS는 발현의 한 종류지만 모두 모두 가까이에 있습니다. 이 신경 세포는 AOB 23-25의 앞쪽 부분에 G 단백질 α-서브 유닛 G의 αi2와 프로젝트를 같이 발현. G의 αo 함께 더 기저층 명시 V2Rs 또는 FPR-RS1에있는 감각 신경 세포와는 AOB 26 ~ 28의 후방 영역에 자신의 축삭을 보냅니다.
골코 (vomeronasal) 뉴런은 가능성이 소변, 타액 등 다양한 체액으로 분비 및 유체 눈물되어 오히려 작은 semiochemicals 29-33 (V1Rs) 또는 단백질 화합물 34-38 (V2Rs)에 의해 활성화된다 37,39-41 현장 실험에서이 VSN을도 포르 밀화 펩티드 및 각종 항균 / 염증 결합 된 화합물 25,42에 의해 활성화되는 것으로 나타났습니다. 또한, 이종 FPR-RS 단백질 (참조 43 참조) 동종 또는 버릇 음식 소스 (25)의 질병에 대한 검출기 등의 잠재적 인 역할을 나타내는 면역 체계로 표현 FPRs과 효능 스펙트럼을 공유 표명했다.
특정 VSN 집단에서 수용체 - 리간드 관계 및 다운 스트림 신호 계곡을 이해하는 기본은 네이티브 환경에서 기본적인 생물 물리학 적 특성에 대한 자세한 평가입니다. 과거에는, 셀룰러 신호의 분석은 크게 형광 마커 단백질을 30,44-49 coexpressing함으로써 뉴런 정의 집단 표시 유전자 변형 동물로부터 혜택있다. 이 프로토콜에서, 형광 마커와 함께 FPR-RS3를 발현하는 형질 전환 마우스 선 (FPR-RS3는-I-금성)가 사용된다.이 접근법은 급성 관상 VNO 조직 슬라이스 단일 뉴런 패치 클램프 기록을 이용하여 광학적으로 식별 가능한 세포 집단의 전기 생리 학적 분석을 수행하기 위해 이러한 유전자 변형 마우스 균주를 사용하는 방법을 예시한다. 공기 압력 중심의 멀티 배럴 관류 시스템 감각 자극 및 약리 에이전트는 녹음 중, 빠른 가역과 초점 신경 자극하거나 억제 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 전체 세포 레코딩은 셀의 기본 환경에서 고유 특성, 전압 - 활성화 컨덕턴스의 상세한 분석뿐만 아니라, 활동 전위 방전 패턴을 허용한다.
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Protocol
모든 동물의 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물의 보호 (지침 6백9분의 86 / EEC)와 함께 추천 유럽 실험 동물 과학 연맹 (FELASA)에 의해 제시에 지역 및 유럽 연합 (EU) 법률을 준수했다. C57BL / 6 마우스와 FPR-RS3 - 난 - 금성 마우스 모두 음식과 물을 가능한 광고 무제한와 12 시간 조명 / 어두운주기에 실온에서 남녀의 그룹에 보관 하였다. 실험을 위해 섹스 중 젊은 성인 (6~20주)를 사용 하였다. 명백한 성별에 따라 차이가 관찰되지 않았다.
1. 솔루션 준비
- 세포 외 용액 S 1 준비 : 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (145)의 NaCl, 5 KCl을 1 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES (mm 단위)를 함유하는 세포 외 완충 용액 (HEPES)을; pH가 7.3 (NaOH로 조정) (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm.
- extracellu 준비LAR 용액 S 2 : Carbogen - 산소 (95 % O 2, 5 % CO 2) CaCl2를 1 황산 125 염화나트륨 25 (단위 : mm)의 NaHCO3 5의 KCl, 1을 포함하는 세포 외 용액 5 BES; pH는 7.3; (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm.
- 조직 삽입을 위해 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스 용액 (S 3) 준비 : 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를. 2g는 자기 교반기와 함께 100 ㎖ 유리 실험실 병 S (1)의 50 ml의 아가 로스 겔 둘러 녹인다. 아가로 오스를 용융, 약 20 분 동안 또는 솔루션을 교반하면서 투명하게 될 때까지 70 ° C에서 (뚜껑을 밀폐하지으로) 수조에 병을 넣어. 냉각 추가로 사용할 때까지 42 ° C에서 두 번째 물을 욕조에 녹은 아가로 오스를 유지합니다.
- 세포 내 솔루션 S 사를 준비합니다 피펫 솔루션 2 (무료 칼슘 2 + = 110 ㎚) 1 EGTA (143)의 KCl, 2 KOH, 0.3 염화칼슘, 10 HEPES, 2 MgATP (mm 단위)을 포함, 1 NaGTP;pH가 7.1 (KOH로 조정) 삼투압 =이 290mOsm.
- 수정 / S (1)의 조성물을 조정 개별 실험 설계 (예를 들어, 약리학 적 차단제 전압 작동 전류의 특정 유형을 분리하기 위해)에 따라 S 2 및 S (4).
2. 작업 준비
- 온도와 pH를 조정하고 지속적 네이트 솔루션 얼음에 S 2 적어도 30 분 전에 해부에, 장소 슬라이스 저장 챔버를 산소로 입력합니다.
- S 2와 설정을 기록에 슬라이스 superfusion에 대한 저장소를 작성하고 지속적으로 산소를.
- 해부하기 전에, S 2 vibratome 챔버를 채우고 실 주위에 얼음 조각을 정렬합니다. 또한, vibratome 챔버에 챔버를 산소로부터 예비 얼음 차가운 산소 솔루션을 전송하고 지속적으로 산소로 유지합니다.
- 수술 도구와 소모품을 정렬합니다.
- 해부 아래에 얼음 젤 팩을 배치현미경, 접시의 바닥에 얼어에서 VNO 조직을 방지하기 위해 종이 타월로 다룹니다.
- 간략 70 % 에탄올과 증류수로 세척하고 vibratome 마운트하여 면도 면도날. 모든 슬라이스 세션에 장착합니다.
3. VNO 해부 및 포함
- 2 CO 날카로운 외과 가위를 사용하여 목을 벨에 짧은 노출에 의해 동물을 희생. 참고 : 중요 얼음에 VNO 캡슐 퍼팅에 동물을 희생에서 시간으로,보다 2 분으로 시간을 최소화 할 수 있습니다. 조직의 생존을 유지하기 위해 30 분 이내에서 아가 모두 완전히 해부 VNOs를 포함.
- 큰 수술 가위로 아래턱을 제거합니다. 입 캐비티를 통해 입력하고 개별적으로 각면의 하악 뼈와 근육을 잘라.
- 거꾸로 큰 페트리 접시에 머리의 나머지 부분을 놓습니다.
- 위턱과의 더 나은 액세스하는 매체 집게로 코의 선단 주변의 피부를 끌어낼앞니.
- 주동이의 방향 (그림 1A)에서 ~ 45 ° 각도로 앞니의 가장 큰 부분을 절단하는 뼈 가위를 사용합니다. 이 비강에서 VNO 캡슐의 제거를 용이하게한다.
주 : VNO 캡슐의 선단부의 손상을 방지하기 위해 치아의 뿌리를 절단하지 않는다. - 중간 집게와의 주동이의 부분에 강성 상부 미각을 잡고 조심스럽게 평평한 각도 (그림 1B)에서 다시 한 조각의 껍질.
참고 : 반복적으로 얼음처럼 차가운 S 2와 린스. - 보습 뼈의 뼈와 턱의 끝 사이의 뼈 융합을 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용합니다. VNO 캡슐에 왼쪽과 오른쪽 측면 모두에서 작은 단계에 뼈를 잘라 바깥쪽으로 멀리 VNO에서 조심스럽게 가리키는 끝의 곡선 부분에 가위 팁을 삽입합니다.
- VNO 캡슐을 제거하려면, 꼬리 부분에 보습 뼈 뼈를 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용하여 조심스럽게 N 밖으로 보습 뼈 뼈를 들어 올려매체 집게를 사용하여 ASAL 공동. 즉시 절개의 나머지 단계를 수행 할 것입니다 얼음 젤 팩에 스테레오 현미경으로 작은 페트리 접시에 VNO을 전송합니다.
- 마르지 조직 않도록 빙냉 S (2)의 소량의 VNO 린스.
- 매체 집게와 보습 뼈 뼈의 뒤쪽을 잡아하여 VNO 연부 조직을 포함하는 연골 캡슐을 분리합니다. 모두 VNOs 사이의 분할 (그림 1D ⅰ) 표시가되도록 지느러미보기를 캡슐을 배치합니다.
- 뒷부분에 아래로 고정 보습 뼈 뼈를 유지하면서 중앙 뼈에서 모두 연골을 VNO 캡슐을 분리하는 미세 집게의 끝 부분을 사용합니다.
참고 : 연골 캡슐의 가장자리에 집게를 사용하여 섬세한 감각 상피가 쉽게 손상 될 때 연골 관통하지 않도록 매우주의해야합니다. - 두 VNOs이 분리되면, 전나무을 캡슐화 연골을 제거 시작t VNO.
- 하나의 미세 집게로 캡슐의 상단 가장자리를 잡고 이전에 보습 뼈 뼈 (내측)에 부착 된 연골 벽을 멀리 분할합니다.
- 연골은 접시의 바닥에 그 곡선 측면과 함께 VNO를 설정하고 안전하게 집게를 사용하여 한 쪽의 연골을 아래로 고정 나머지 제거합니다. 조심스럽게 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 연골과 VNO 사이에 매우 평평한 각도로 뒤쪽에서 두 번째 미세 집게를 이동합니다.
- 천천히 감각 상피 손상을 방지하기 위해, 자사의 꼬리 끝에서 그것을 잡고 멀리 연골에서 VNO 껍질.
- VNO는 캡슐에서 움직여되면, 슬라이스 과정에서 아가로 오스 주변에서 조직을 분리합니다 연골의 나머지 조각으로 남아있는 모든 작은 연골 부분을 제거해야합니다.
- 조직 손상을 방지하기 위해 제 해부 VNO에 빙냉 S (2)의 작은 방울을 놓는다. 측면 줘야에 큰 혈관난 장기가 그대로이고 심하게 해부 (그림 2A ⅱ) 중에 손상되지 않았 음을 나타내는 표시됩니다. 혈관이 손상있어 경우, 여전히 한 전체 형태가 명확하게 손상되지되었을 때 VNO 슬라이스로에 수행 할 가치가있을 것입니다.
- 즉시 두 번째 VNO를 해부하다.
- VNOs을 포함하려면, 녹은 S 3 림에 모두 작은 배양 접시를 작성 (42 ° C에서 물을 욕조에 저장된 1.3 참조).
- 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 미세 집게로 넓은 꼬리 끝에있는 VNO를 잡습니다.
- 아가로 오스에 VNO을 담그고 세포 용액의 필름뿐만 아니라, 그 표면에서 기포를 제거하기 전후 수평으로 여러 번 이동.
- 접시의 바닥을 향하게 꼬리 끝이 수직으로 VNO를 놓습니다. 대신 직접 집게로 VNO 곤란의, 가까운 proximi의 집게 팁을 이동하여 방향을 조정VNO에 타이.
참고 :이 실험 기간 동안 감각 뉴런에 조각 평면과 접근성을 결정으로 삽입시 방향이 중요합니다. - 겔 얼음 팩에 요리를 놓고 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다.
참고 : 아가로 오스는이 주변 아가로 오스에서 조직을 분리하는 바와 같이 응고 시작되면 VNO 방향을 변경하지 마십시오.
4. 코로나 VNO 조직 슬라이스
- 큰 페트리 접시의 뚜껑에 작은 접시에서 아가로 오스 블록을 제거하는 작은 주걱을 사용하여, 거꾸로 위쪽으로 향하도록 VNO의 꼬리 끝을 떠나 아가로 오스를 뒤집습니다.
- 외과 용 메스 (선단 3-4 mm의 바닥 8-10 mm)를 사용하여 피라미드 형상으로 블록을 잘라. 포함 된 조직이 손상되지 않도록주의하십시오.
- vibratome 표본 판의 중앙에 피라미드 모양의 블록을 수정하고 접착제가 완전히 마를 때까지 ~ 1 분을 기다려야 슈퍼 접착제를 사용합니다.
- 슬라이싱 C에 시료 판을 이동hamber 따라, 두 번째 VNO을 준비합니다. 사용까지 4 ° C에서 두 번째 시료 접시를 유지합니다.
- 두께 : 다음 설정을 사용하여 진동 블레이드 마이크로톰 사용하여 150 ~ 200 μm의; 속도 : 3.5 AU = 0.15 mm / 초; 주파수 = 75 Hz에서 7.5 AU. 간단히 해부 현미경 슬라이스 형태를 검사 한 후 사용할 때까지 산소로 챔버에 조각을 전송합니다. 조각은 몇 시간 동안 유지 될 수있다.
5. 단일 세포 전기 생리 레코딩
- 녹화 내용 수침 목표 Dodt 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 및 에피 - 형광뿐만 아니라 냉각 CCD 카메라를 구비 한 직립 고정 스테이지 현미경을 사용한다. 데이터 수집, 패치 클램프 증폭기 헤드 단, AD / DA 인터페이스 보드 (기록 소프트웨어 등)를 PC를 사용한다.
- 10 ~ 20 패치 피펫 (4-7 MΩ)의 재고를 준비합니다. 붕규산 유리 모세관에서 풀 피펫 (1.50 mm 외경 / 0.86 mm의 ID) 날기microforge와 조지아 마이크로 피펫 풀러와 화재 - 폴란드어.
참고 : 오히려 작은 VSN을 패치 할 때 화재 피펫 팁을 연마하는 것이 중요하다. 이것은 고 저항의 밀봉을 얻기 위해 부압을인가하는 경우에 세포막을 파열을 방지하는 것을 도울 것이다. 피펫 구멍을 연마 한 후 약 1 ㎛해야합니다. - 사용할 때까지 손상 및 먼지 축적을 방지하기 위해 피펫 저장 항아리에 피펫을 유지합니다.
- 솔루션 저수지를 채우고 실험 설계에 따라 튜브에 의해 관류 시스템을 준비합니다.
참고 :이 강하게 전기 생리 녹음에 방해가되므로 완전히 튜브에서 공기 방울을 제거합니다. - ~ 3 ml / 분의 흐름을 달성하기 위해 압력을 조정합니다.
참고 : 높은 압력이 전기 생리 레코딩의 조직 절편의 이동뿐만 아니라 종료의 원인이됩니다. - 영상 실에 VNO 슬라이스를 전송하고 0.1 mm 두께 SYNT와 유선 스테인레스 스틸 앵커를 사용하여 조각의 위치를 고정hetic 섬유 (그림 2B - C).
참고 : 합성 섬유 스레드 중 하나가 아니라 슬라이스를 둘러싼 아가로 오스와 조직 절편을 포함하지 마십시오. - 목욕 응용 프로그램을 통해 실온에서 산소 S 2로 설정하고 지속적으로 superfuse 슬라이스를 기록에 전송 영상 실.
- 욕 용액을 일정한 교류 느린 시키되, 용액의 표면에 흡착 모세관을 조정한다. 8에서 1 멀티 배럴 "관류 연필"위 혈관 (그림 2C, 3A) (50)를 포함하는 VNO 슬라이스의 비 감각 부분에 가까운를 조정합니다. 반대 방향에서 슬라이스를 직면 할 재관류 연필 기록 피펫을 주선 도움이 될 것입니다.
- 기준 전극 (150 mM의 KCl을 가득) L 자형 한천 다리를 사용하여 목욕 솔루션을 연결합니다.
- 피펫 솔루션 S 4 패치 피펫을 입력합니다.
- 코팅을 긁어없이 머리 스테이지에 연결된 염화은 코팅 패치 전극 위에 피펫을 탑재 단단히 연결합니다.
- 약간의 긍정적 인 압력을 적용 (약 10 ml의 플라스틱 주사기 1 ml)을 욕조에 들어가기 전에 패치 피펫합니다.
- (그림 2D)을 타격하지 않고 목표를 잠수함 할 수 있도록 충분히 미세 조작기를 이용하여 욕조에 피펫을 낮 춥니 다.
- 머리 단계에 연결된 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여 (4-7 MΩ 사이의 R 핍) 피펫 저항을 모니터링합니다.
참고 : R 핍 인 경우 <4 MΩ 유리 팁이 끊어집니다. R의 PIP가> 10 MΩ 인 경우, 팁은 대부분 막혀 상기 피펫은 교체되어야한다. - 적외선에 최적화 된 미분 간섭 대비 (DIC)을 사용하여 CCD 카메라와 VNO 슬라이스를 시각화하고 형광 조명을 사용하여 FPR-RS3 - 난 - 금성 (유사 표시 뉴런 또는) 발현 세포를 식별적절한 필터 큐브.
- 초점과 목표 형광 또는 비 형광 세포는 실험 설계에 따라 달라집니다.
- 세포체 접근 최대 감도 핸드 휠을 사용한다. 피펫 팁이 가까이에 일단 긍정적 인 압력으로 인해, 셀 소마 막에 작은 함몰이 표시됩니다.
- 정압 놓고 고 저항 시일 (1-20 GΩ)를 얻기 위하여 세포막 빨아 약간 부압을 적용한다. 세포막을 파괴하고, 전체 셀 구성을 설정하는 짧은 부드러운 흡입을 적용한다.
- 실험 기간 동안 지속적으로 액세스 저항을 모니터링합니다.
참고 : 작고 안정적인 접속 저항을 나타내는 신경 세포 포함 (R 입력 ≤3 %를, 변화 <실험의 과정을 통해 20 %) 분석에 있습니다.
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Representative Results
정의 된 세포 집단의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성에 대한 통찰력을 얻으려면, 우리는 마우스 VNO (- 2 그림 1)의 급성 관상 조직 조각을 수행합니다. 절개 후, 슬라이스는 몇 시간 동안 빙냉 산소 세포 외 용액 (S 2)에 유지 될 수있다. 녹화 설정에서 신선한 산소 솔루션 일정한 교환 (그림 2D)은 실험을 통해 조직의 생존을 보장합니다. 우리는 여기에 형질 전환 마우스 모델 (FPR-RS3 - 난 - 금성)를 사용한다. 이 변형 같이 발현 FPR-RS3와 형광 마커 단백질, 감각 뉴런의 정의 된 인구의 광학 식별을 가능하게하는 FPR-RS 유전자 가족 (그림 3)의 원형 부재 VSN을. 전기 생리 학적 기록은 단일 세포 수준에서 심층 분석을위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 게이트 전압 전류 분석 전압 클램프 수행모드 (도 4a - B). 이온 전류의 특정 유형을 분리하기 위해 슬라이스 전압 게이트 된 L 형 칼슘 전류 (도 4b)를 차단하는 전압 - 게이트 나 + 전류 (도 4a) 또는 니페디핀을 억제하는 등 TTX 같은 약리학 적 제제와 superfused된다. 또한, 우리는 정기적으로 활동 전위 방전 패턴 (그림 4C)을 분석하기 위해 현재의 클램프 구성에서 전체 셀 녹음을 수행합니다. 전체 셀 녹화에 더하여, 세포 부착 '루스 시일'녹음 균체 내 성분 (도 5a)의 투석을 방지 덜 침습적 인 방법을 제공한다. 셀 (51) (그림 5B)의 인구를 정의 활성화하십시오, 녹화 활동 전위 중심의 짧은 자극 응용 프로그램에 용량 성 전류는 감각 리간드 (MUPs 예를 들어, 주요 소변 단백질)을 선별 할 수있는 민감하고 효율적인 방법을 제공합니다.
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그림 1 : VNO의 해부. 마우스 머리에 (A) 측면보기는 앞니가 절단되는 위치와 각도를 설명합니다. (B) 잡고 상부 미각 (UP)를 다시 벗겨 최고의 포인트를 묘사 복부 볼 수 있습니다. 아래턱, 앞니와 미각을 제거한 후 VNO과 보습 뼈 뼈 (VB)를 항구 (C) 연골 캡슐 (CC) 상 복부 볼 수 있습니다. 모두 VNOs (D의 I)의 양자 현지화를 묘사 해부 VNO 캡슐 (D) 느 러 미보기. 측면 뷰는 모두 VNOs이 (D II)로 분리해야하는 등의 측 연골의 테두리를 보여줍니다. 스케일 바 = 1mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 조직 준비, 챔버와 현미경 스테이지를 녹음 VNO에 회로도 측면 뷰는 코스와 상피 (A I)의 비 감각 부분에있는 큰 혈관 (BV)의 위치를 설명하기. 점선은 관상 슬라이스 층을 나타냅니다. 공통 평가 기준에서 벗겨 VNO에 측면 뷰는 혈관을 보여줍니다 (A II). (B)는 0.1 mm 두께의 합성 섬유 (SF) 스레드 유선 스테인리스 앵커를 사용하여 용액으로 채워진 기록 챔버의 바닥에 고정 된 관상 VNO의 조직 절편을 아가 로즈 매립. 박스형 영역은 조직 절편을 둘러싼 아가 로스를 나타낸다. (C) 아가로은 (Ag)의 위치 및 방향을 나타낸 개략도, 두 섬유 사이에 위치 코로나 VNO 슬라이스 - 임베디드. (D) 현미경의 스테이지에 배치 된 상기 기록 챔버 개요. 챔버는 감각 자극 또는 약리학 적 제제를 적용하는 산소 S 2 재관류 연필 (PP)과 일정한 superfusion 목욕 애플리케이션 (BA), 증폭기 헤드 단, 기준 전극에 접속 된 기록 피펫 (RP) (RE 장착되어 ) 및 흡입 모세관 (SC)는 챔버 내의 용액의 일정한 교환을 유지한다. 스케일 바 = 1mm (A II). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 코로나 VNO의 담배 마는UE 조각입니다. (A) 공 초점 이미지 (최대 투사) 150 μm의 급성 관상 VNO 조직 슬라이스의 골코 (vomeronasal) 감각 상피 세포에서 형광 FPR-RS3 타우 - 금성 + 뉴런 (녹색)의 분포를 나타내는. 혈관 (BV), 루멘 (L), 감각 상피 (SE). (B) FPR-RS3 타우 - 비너스 + 뉴런은 내강 테두리에 손잡이 같은 구조로 끝나는 하나의 혀끝의 수상 돌기을 나타낸다. 전체 셀 패치 클램프 녹음은 VSN의 소마, 패치 피펫 (PP)에서 수행 하였다. 길고 좁은 덴 드라이트 (D)의 선단부에 돌기 노브 (K)를 갖는 단일 VSN의 (C) 형태, 기부 측 소마 떠나는 셀 소마 (S) 및 엑손 (A). 스케일 바, 50㎛의 (A), 10 ㎛의 (B), 5 ㎛의 (C). 이 수치가 52에서 수정되었습니다에게. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4 : 절연 전압 - 문이 나 +와 칼슘 2 + 전류뿐만 아니라 스파이크 방전 (A) FPR-RS3 + VSN을에서 TTX에 민감한 빠른 활성화 나 + 전류의 전체 셀 패치 클램프 녹음에서 대표 흔적.. 제어 조건 (A I) 전압 스텝 레코딩 (세포 외 용액 S 1, 세포 내 솔루션 S 4) 현재의 내부 전압에 의존 빠르고 순간을 보여준다. (A II) 처리 TTX (1 μM)을 강하게 전류를 감소시킨다. 디지털 감산 추적 (제어 TTX (A ⅲ)) 브TTX에 민감한 전압 - 문이 나 + 전류를 ALS. 제어 및 FPR-RS3 + 뉴런으로부터 격리 TTX에 민감한 나 + 전류의 전류 - 전압 관계 (A IV). (B) 대표 칼슘 현재 트레이스 (10 μM의 니페디핀) 약리학 적입니다. (C) / 과분극 및 단계적 플러스 (C의 i) 및 음 (C ⅲ) 전류 주입시 발생 (리바운드) 활동 전위의 열차를 디 보여주는 대표적인 전류 클램프 흔적. 0는 pA 전류 주입 (C ⅱ)에서 측정 된 자발적인 활동을합니다. (C 정맥) 제어 및 FPR-RS3 + (내가 주입) 주입 전류의 함수로 뉴런의 발사 주파수. 속도를 발사의 점진적 증가는 컨트롤과 유사및 FPR-RS3 + VSN을. VSN을도 낮은 picoamperes에서 현재 주사에 정교하게 민감한 53-56 범위합니다. F -I 곡선 0는 pA 전류 주입에 자연 급상승 주파수를 사용하여 "배경 - 수정"되었다고합니다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 이 수치가 52에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 기초 VSN을에서 세포 외 '느슨한 패치'기록 감각 상피의 기저층에 기록 피펫을 묘사 급성 VNO 조직 슬라이스 (A) IR-DIC 이미지.. (B) 상기 셀에 연결된 구성에서의 대표적인 기초 VSN 원래 기록 (# 39; 느슨한 밀봉 풀링 재조합 발현의 주요 소변 단백질 (rMUPs와 자극 (3 초))과 높은 칼륨 농도 (50 mM의, 1 초를 브리핑하는 스파이크의 짧은 과도 버스트 응답 ')), 각각 (B의 난) . (B의 I)에 도시 된 레코딩 높은 배율은 자극 (B II)에 응답하여 버스트 스파이크를 나타낸다. 빨간색 막대 자극, 간 자극 간격 = 30 초, 연속 촬영, 중단 <1 초 (컷 마크 //)의 시간을 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm의 (A). 패널 (A)를 참조 (38)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
VNO는 semiochemicals을 감지하는 화학 감각 구조입니다. 현재까지, 서 골코 (vomeronasal) 수용체의 대부분은 단지 몇 수용체 - 리간드 쌍은 식별 된대로 deorphanized 일이다. 그 중 V1rb2가 남성 비뇨기 페로몬 2- 헵 타논 (30)에 의해 구체적으로 활성화되도록 설명했다 V2rp5이 남성 특정 페로몬 ESP1 57뿐만 아니라 SYFPEITHI V2r1b과 V2rf2가 MHC 펩타이드에 의해 활성화 될뿐만에 의해 활성화되는 48 SEIDLILGY (58) 각기. 수용체 - 리간드 관계와 신호 전달을 이해하는 전제 조건은 네이티브 환경에서 정의 된 VSN 인구의 생물 물리학 적 특성에 대한 지식이다. 수동 및 능동 막 특성, 전압 - 게이트 이온 전도도 및 활동 전위 방전 패턴 수용체 신경 세포가 자극을 화학 감각에 반응되는 수단과 범위를 정의합니다. 전기 생리 급성 조직 조각에서 녹음하고, 특히, 사람르 셀 패치 클램프 녹음은 훌륭한 세부 사항에 이러한 속성을 분석 할 수있는 훌륭한 방법을 제공한다.
조직 조각에 성공하고 신뢰할 수있는 생리 학적 레코딩을위한 중요한 단계는 준비 자체입니다. 실험을 수행하기위한 시간 범위를 최대화하기 위해, 조직 슬라이스 즉시 절개 후 빙냉 용액을 산소로 전송되어야한다. 그 후, 슬라이스는 실험 하루 세포의 상당한 수의 몇 시간 있도록 분석을 유지할 수있다. 그것은 해부 미만 30 분에 한 동물 모두 VNOs를 포함하는 시간을 줄이기 위해 약간의 연습이 필요합니다. 그 후, 생세포 여러 손상 조직 조각을 얻기 숙련 실험 성공률이 아니라 75 % 이상이다. 패치 클램프 녹음을 수행하면 칼슘 이미징에 비해 낮은 처리량 실험적인 접근 방법이다. 그러나, 그것보다 높은 시간적으로 단일 세포 수준에서 활동의보다 상세한하고 다양한 분석을 허용해결. 전체 셀 구성에서, 세포 배지를 피펫 용액으로 투석한다. 피펫 솔루션은 정확한 세포질 구성을 반영하지 않을 수도 있지만, 그것은 역외 및 세포 내 이온 조건 모두를 통해 정확한 제어와 실험자를 제공합니다. 결과의 신뢰성 해석, 접속 저항 및 누설 전류의 지속적인 모니터링이 중요하다. 배에서 크게 증가 또는 액세스 저항에 강한 변화 또는 해석 불가능한 결과 현재 리드를 누설 따라서 폐기해야하는이 기록은 요구한다. 또한, 일부 화합물은 약리학 돌이킬 필요가 각각의 기록 후에 조각을 대체 렌더링 귀속 것이 중요하다.
세포 부착 구성 녹화 균체 내 성분의 투석을 방지하고, 세포의 막 전위에 영향을 미치지 않는다. 따라서,이 기술은 스크리닝 덜 침습적 비교적 빠른 방법을 제공한다. 그러나,이 아프로ACH는 일반적으로 세포막의 외부에서 초 임계 활동 전위 구동 전류 용량의 기록 제한된다. 느슨한 패치 녹음은 VNO 슬라이스 38,54 감각 뉴런의 많은 수의 급상승 동작을 분석하는 데 적합한 것으로 입증되었다.
여기에 사용 된 형질 전환 모델 식별하고 VSN을 표현 FPR-RS3의 인구를 분석하는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다. 또한, 여기에 설명 된 기술에 관계없이 유전자형 다른 라인으로 확장 될 수있다. 트랜스 제닉 마우스를 사용하여, 정해진 세포 유형을 조사하는 엄청난 이점에도 불구하고 가능한 라인 실험을 제한한다. 그러나 최근 대상 게놈 편집이보다 빠르고 휴한 CRISPR / Cas9 기술 59이되고있다. 결론적으로, 급성 골코 (vomeronasal) 조직 조각에서 패치 클램프 녹음은 정의의 populat의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성을 특성화 할 수있는 다양한 방법을 제공 대상감각 뉴런의 이온.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
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