Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

Published: September 10, 2016 doi: 10.3791/54517
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

Introduction

De fleste dyr er stærkt afhængige deres kemiske sanser til at interagere med deres omgivelser. Lugtesansen spiller en afgørende rolle for at finde og vurdere mad, undgå rovdyr og finde egnede parring partnere. I de fleste pattedyr, den olfaktoriske system består af mindst fire anatomisk og funktionelt forskellige perifere delsystemer: den vigtigste lugteepitel 1,2, den Grueneberg ganglion 3,4, den septale organ Masera 5,6 og vomeronasale organ. Den VNO omfatter perifer sensorisk struktur af tilbehøret olfaktoriske system, (AOS), som spiller en stor rolle i at afsløre kemiske signaler, der formidler oplysninger om identitet, køn, social rang og seksuel tilstand 7-10. VNO er ​​placeret i bunden af ​​næseskillevæggen ret ovenfor ganen. Hos mus er det en bilateral blind-ending rør indesluttet i en bruskagtig kapsel 11-13. Orglet består af både en halvmåneformet medial sensorisk epitheTrifolium, som huser de VSNs og er af ikke-sensorisk del på den laterale side. Mellem begge epiteler ligger en mucus-fyldte hulrum, som er forbundet til næsehulen via den smalle vomeronasal kanalen 14. En stor lateral blodkar i den ikke-sensoriske væv tilvejebringer en vaskulær pumpemekanisme for at lette optagelse af relativt store, for det meste ikke-flygtige molekyler, såsom peptider eller små proteiner i VNO lumen gennem undertryk 15,16. De strukturelle komponenter i VNO er til stede ved fødslen, og orglet når voksenstørrelse kort før puberteten 17. Men om gnaver AOS er allerede funktionel i unge er stadig genstand for debat 18-20.

VSNs udmærker sig ved både deres epitel placering og typen af ​​receptor de udtrykker. VSNs viser en bipolær morfologi med en ikke-myelinerede axon og en enkelt apikal dendritceller, der rager mod lumen og ender i en microvillous dendritisk knop. VSN økseons fasciculate at danne vomeronasal nerve, der forlader bruskspidserne kapsel på dorso-caudale ende, stiger langs septum, passerer cribriform plade og projekter til tilbehøret lugtekolben (AOB) 21,22. Den vomeronasale sensoriske epithel består af to lag: den apikale lag er placeret tættere på den luminale side og havne både V1R- og alle undtagen én type FPR-RS-udtrykkende neuroner. Disse neuroner co-udtrykke G-protein α-subunit G αi2 og projekt til den forreste del af AOB 23-25. Sensoriske neuroner beliggende i de mere basale lag udtrykkelige V2Rs eller FPR-RS1 sammen G αo og sende deres axoner til den bageste region af AOB 26-28.

Vomeronasal neuroner sandsynligvis aktiveres af temmelig små semiochemicals 29-33 (V1Rs) eller proteinholdige forbindelser 34-38 (V2Rs), der udskilles i forskellige kropsvæsker såsom urin, spyt og tårevæske 37,39-41 In situ eksperimenter har vist, at VSNs også aktiveres af formyleret peptider og forskellige antimikrobielle / inflammation forbundne forbindelser 25,42. Desuden udtrykte heterologt FPR-rs proteiner deler agonist spektre med FPRs udtrykt i immunsystemet, hvilket indikerer en potentiel rolle som detektorer for sygdom i artsfæller eller forkælede fødekilder 25 (se referere 43).

Grundlæggende for forståelsen receptor-ligand relationer og downstream signalering kaskader i bestemte VSN befolkningsgrupper er en detaljeret evaluering af deres grundlæggende biofysiske karakteristika i en indfødt miljø. I fortiden, har analysen af cellulære signalering stærkt nydt godt af genmodificerede dyr, der markerer en defineret population af neuroner ved at co-udtrykke en fluorescerende markør protein 30,44-49. I denne protokol, en transgen mus linje, der udtrykker FPR-RS3 sammen med en fluorescerende markør (FPR-RS3-i-Venus) anvendes.Denne tilgang eksemplificerer, hvordan at ansætte sådan en genetisk modificeret musestamme til at udføre elektrofysiologiske analyse af et optisk identificerbare cellepopulation anvendes enkelt neuron patch-clamp optagelser i akutte koronale VNO væv skiver. Et lufttryk drevet multi-tønde perfusion for sensoriske stimuli og farmakologiske agenter giver hurtig, reversibel og fokal neuronal stimulation eller hæmning under optagelserne. Whole-celle optagelser i slice præparater mulighed for en detaljeret analyse af iboende egenskaber, spænding-aktiverede konduktanser, samt action potentielle udledning mønstre i cellens oprindelige miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer dyr var i overensstemmelse med lokale og EU-lovgivning om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg (direktiv 86/609 / EØF) og med henstillinger fra Sammenslutningen af ​​Europæiske Laboratorium Animal Science Associations (FELASA). Begge C57BL / 6-mus og Fpr-RS3-i-Venus-mus blev holdt i grupper af begge køn ved stuetemperatur på en 12 timers lys / mørke-cyklus med foder og vand tilgængeligt ad libitum. Til forsøg unge voksne (6-20 uger) af begge køn blev anvendt. Ingen åbenlyse køns--afhængige forskelle blev observeret.

1. Fremstilling af opløsning

  1. Forbered ekstracellulær opløsning S 1: 4- (2-hydroxy-ethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (HEPES) bufret ekstracellulær opløsning indeholdende (i mM) 145 NaCl, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (justeret med NaOH); osmolaritet = 300 mOsm (justeret med glucose).
  2. Forbered extracellular opløsning S 2: carbogen-oxygeneret (95% O2, 5% CO2) ekstracellulær opløsning indeholdende (i mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 BES; pH = 7,3; osmolaritet = 300 mOsm (justeret med glucose).
  3. Forbered 4% lav geleringstemperatur agaroseopløsning (S3) for vævs indlejring: 4% lav geleringstemperatur agarose. Opløs 2 g lav-geldannende agarose i 50 ml S 1 i en 100 ml glasbeholder laboratorium flaske sammen med en magnetomrører. At smelte agarose, sætte flasken i et vandbad (med låg ikke tæt lukket) ved 70 ° C i ca. 20 min eller indtil opløsningen bliver transparent under omrøring. Køle ned og holde smeltet agarose i et andet vandbad ved 42 ° C indtil yderligere anvendelse.
  4. Forbered intracellulær opløsning S 4: Pipette opløsning indeholdende (i mM) 143 KCI, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (fri Ca2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (justeret med KOH); osmolaritet = 290 mOsm.
  5. Ændre / juster sammensætningen af S 1, S 2 og S 4 i henhold til individuel eksperimentelt design (fx til farmakologiske blokkere isolere visse typer spænding-aktiverede strømme).

2. Workspace Forberedelse

  1. Fyld iltning skive opbevaring kammer med S 2 mindst 30 minutter før dissektion, sted på is i temperatur og pH-justering og oxygenat opløsning kontinuerligt.
  2. Fyld reservoir for skive superfusionssystem på optagelsen setup med S 2 og ilte kontinuerligt.
  3. Forud for dissektion, fylde vibratome kammer med S 2 og arrangere knust is omkring kammeret. Alternativt overføre ekstra iskold oxygeneret løsning fra iltning kammer ind vibratome kammeret og holde oxygenating kontinuerligt.
  4. Arranger kirurgiske værktøjer og hjælpematerialer.
  5. Placer is gel pack under dissekeremikroskop, dække med en køkkenrulle til at forhindre VNO væv fra indefrysning til bunden af ​​skålen.
  6. Ren barberblad ved kort skylning i 70% ethanol og destilleret vand og montere til vibratome. Erstat for hver udskæring session.

3. VNO Dissektion og Indlejring

  1. Sacrifice dyr ved kort eksponering til CO 2 og halshugge bruge skarpe kirurgiske sakse. Bemærk: Som tiden fra aflivning af dyret at bringe VNO kapsel på is er kritisk, minimere den tid til mindre end 2 min. For at opretholde levedygtigheden væv, integrere begge fuldt dissekeret VNOs i agarose i mindre end 30 min.
  2. Fjern underkæben med store kirurgiske sakse. Indtast gennem mundhulen og skære underkæben knogler og muskler af hver side.
  3. Placer den resterende del af hovedet nedad i den store petriskål.
  4. Trække væk huden af ​​overkæben og omkring spidsen af ​​næsen med medium pincet til at få lettere adgang tilfortænder.
  5. Brug knogle saks til at klippe væk den største del af fortænder på en ~ 45 ° vinkel i rostrale retning (figur 1A). Dette vil lette fjernelse af VNO kapslen fra næsehulen.
    Bemærk: Der må ikke skæres til roden af ​​tanden for at undgå skader på spidsen af ​​VNO kapsel.
  6. Grib den stive øvre gane på sit rostralt del med mellemstore pincet og forsigtigt tilbage i ét stykke i en flad vinkel (figur 1B).
    Bemærk: Gentagne gange skyl med iskold S 2.
  7. Bruge mikro forår saks til at klippe knoglefusion mellem spidsen af ​​vomer knogle og kæben. Sæt saks tips med den buede del af spidsen pegende udad væk fra VNO og forsigtigt skære benet i små trin på både venstre og højre side lateral til VNO kapsel.
  8. For at fjerne VNO kapsel, bruge mikro foråret saks til at klippe igennem vomer knoglen ved caudale del og løft forsigtigt vomer knogle ud af nASAL hulrum ved hjælp medium pincet. overføre Umiddelbart VNO til en lille petriskål under et stereo mikroskop på en is gel pack hvor der vil blive udført de resterende trin i dissektion.
  9. Skyl VNO i en lille mængde iskold S 2 for at forhindre vævet i at tørre ud.
  10. Adskil bruskagtige kapsler, der indeholder VNO bløde væv ved at tage fat i bagsiden af ​​vomer knogle med medium pincet. Placer kapslen for en dorsal visning, så en splittelse mellem både VNOs bliver synlig (figur 1D i).
  11. Brug spidsen af ​​fine tænger til at adskille både brusk VNO kapsler fra den centrale knogle og samtidig holde vomer knogle fangede ved den bageste del.
    Bemærk: Anvend pincet kun på randen af ​​brusk kapslen og være meget omhyggelig med ikke at trænge igennem brusken som den delikate sensoriske epithel let beskadiges.
  12. Når de to VNOs adskilles, begynde at fjerne brusk indkapsler granert VNO.
  13. Grib den øverste kant af kapslen med en fin pincet og splitte væk brusk mur, der tidligere var knyttet til vomer knogle (mediale side).
  14. For at fjerne resterende brusk vende VNO med sin krumme lateral side til bunden af ​​skålen og sikkert pin ned brusken på den ene side med en pincet. Flyt forsigtigt den anden fine tænger fra bagsiden i en meget flad vinkel mellem brusk og VNO at løsne forbindelsen mellem væv og brusk.
  15. skræl langsomt VNO væk fra brusk ved at holde den på sit caudale spids, for at undgå at beskadige det sensoriske epithel.
  16. Når VNO er ​​levered fra kapslen, så sørg for at fjerne alle øvrige små brusk dele som de resterende stykker af brusk vil frigøre væv fra omgivende agarose under udskæring processen.
  17. Placer en lille dråbe iskold S 2 på første dissekeret VNO at forhindre vævsskade. Et stort blodkar på den laterale side will bliver synlige indikerer, at organet er stadig intakt og blev ikke groft beskadiget under dissektion (figur 2A ii). I tilfælde blodkarret fik beskadiget, vil det stadig kunne betale sig at fortsætte med udskæring VNO, så længe den samlede morfologi ikke var klart forringet.
  18. Umiddelbart dissekere den anden VNO.
  19. At indlejre VNOs, fylde både små petriskåle til randen med smeltet S 3 (opbevaret i vandbad ved 42 ° C, se 1.3).
  20. Hold VNO på den bredere caudale ende med fine pincet for at undgå skader på sensoriske epithel.
  21. Fordyb VNO i agarose og flytte det vandret frem og tilbage flere gange for at fjerne filmen af ​​ekstracellulær løsning samt eventuelle luftbobler fra dens overflade.
  22. Placer VNO lodret med caudale spids vender mod bunden af ​​skålen. I stedet for at klemme VNO med direkte pincet, justere orientering ved at flytte pincet spids i tæt Proximity til VNO.
    Bemærk: Orientering under indlejring er afgørende, da det bestemmer skive fly og tilgængelighed til sensoriske neuroner under eksperimentet.
  23. Placer retter på gel ispose og vent agarose er størknet.
    Bemærk: Du må ikke ændre VNO orientering, når agarose er begyndt at størkne, da dette vil frigøre væv fra det omgivende agarose.

4. koronal VNO Tissue Skiveskæring

  1. Benytter små spatel til at fjerne agarose blok fra den lille skål i låget af en stor petriskål, vende agarose hovedet forlader caudale spids af VNO opad.
  2. Skær blokken i en pyramideform anvendelse af en kirurgisk skalpel (3-4 mm på spidsen, 8-10 mm i bunden). Pas på ikke at beskadige den indlejrede væv.
  3. Brug superlim til at fastsætte pyramideformede blok til midten af ​​vibratome prøven plade og vente ~ 1 min for limen tørre helt.
  4. Overfør prøven pladen til udskæring cHamber og forberede den anden VNO, i overensstemmelse hermed. Hold plade med den anden prøve ved 4 ° C indtil anvendelse.
  5. Brug en vibrerende klinge mikrotom med følgende indstillinger: tykkelse: 150-200 um; hastighed: 3.5 au = 0,15 mm / sek; frekvens: 7.5 au = 75 Hz. Overfør skiver til iltning kammeret, indtil brug efter kort inspektion skive morfologi under dissektionsmikroskop. Skiver kan opbevares i flere timer.

5. Single-celle Elektrofysiologiske Optagelser

  1. For optagelser, bruge et opretstående fast fase mikroskop udstyret med nedsænkning i vand mål, Dodt eller infrarød forskellen forstyrrende kontrast (IR-DIC), og epi-fluorescens samt en afkølet CCD-kamera. For dataopsamling, bruge et patch-clamp-forstærker, hoved scene, AD / DA interfacekort og en PC (herunder optagelse software).
  2. Forbered en bestand på 10-20 patch pipetter (4-7 MOhm). Træk pipetter af borsilikatglas kapillærer (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) B rug af funga mikropipette aftrækker og brand-polish med en microforge.
    Bemærk: Fire polering pipettespidserne er afgørende, når lappe de temmelig små VSNs. Dette vil bidrage til at forhindre brud cellemembranen ved anvendelsen undertryk for at opnå en høj modstand tætning. Efter polering pipetten åbning skal være ca 1 um.
  3. Hold pipetter i en pipette opbevaring jar at forebygge skader og støv indtil brug.
  4. Forbered perfusionssystem ved at fylde opløsning reservoirer og slangen ifølge eksperimentelt design.
    Bemærk: Fjern luftbobler fra slangen helt som de kraftigt vil forstyrre elektrofysiologiske optagelser.
  5. Juster tryk til opnåelse ~ 3 ml / min flow.
    Bemærk: Høje tryk vil forårsage bevægelse af væv skive samt opsigelse af elektrofysiologiske optagelser.
  6. Overfør VNO skive til billedbehandling kammer og løse skive position ved hjælp af stål anker rustfrit kablet med 0,1 mm tyk synthetic fibre (figur 2B - C).
    Bemærk: Tildæk ikke vævet skive med en af ​​de syntetiske fibre tråde men snarere agarose omgiver skive.
  7. Overførsel imaging kammer til optagelse af opsætning og løbende superfuse skive med iltet S 2 ved stuetemperatur via et bad ansøgning.
  8. Juster sugning kapillar til overfladen af ​​opløsningen for at skabe en langsom sugning til konstant udveksling af badopløsningen. Juster 8-i-1 multi-tønde "perfusion blyant" ovenfor og tæt på den ikke-sensoriske del af VNO skive, der indeholder blodkarret (figur 2C, 3A) 50. Det vil være en fordel at arrangere perfusion blyant og optagelse pipette til at være mod skive fra modsatte retninger.
  9. Tilslut referenceelektrode og bad opløsning under anvendelse af en L-formet agar bro (fyldt med 150 mM KCI).
  10. Fyld patch pipette med pipette løsning S 4.
  11. Monter pipetten over sølvchlorid-overtrukket patch-elektrode forbundet til hovedet trin uden afskrabning belægningen og vedhæfte fast.
  12. Påfør let positivt tryk (ca. 1 ml på en 10 ml plastik sprøjte) til patch pipette før ind i badet.
  13. Sænk pipette ind i badet ved hjælp af mikro manipulatorer langt nok til at være i stand til at oversvømme målet uden at ramme det (figur 2D).
  14. Overvåg pipette modstand (R pip, mellem 4-7 MQ) under anvendelse elektrofysiologi software forbundet til hovedet scenen.
    Bemærk: Hvis R pip er <4 MOhm glas tip er brudt. Hvis R pip er> 10 MOhm er spidsen sandsynligvis tilstoppede og pipetten skal udskiftes.
  15. Visualiser VNO skive med en CCD-kamera ved hjælp af infrarød-optimeret differential interferens kontrast (DIC) og identificere FPR-RS3-i-Venus udtrykkende celler (eller tilsvarende mærkede neuroner) ved hjælp af fluorescens-belysningog en passende filter terning.
  16. Fokus og mål fluorescerende eller ikke-fluorescerende celler afhængigt af eksperimentelle design.
  17. For at nærme sig celle krop, bruge håndhjul for maksimal følsomhed. På grund af overtryk, en lille bule i cellen soma membran bliver synlig, når pipettespidsen er i tæt nærhed.
  18. Slip positive tryk og anvende let undertryk til at suge i cellemembranen for at opnå en høj modstand tætning (1-20 GQ). Påfør kort og mild sugning at forstyrre cellemembranen og etablere helcelle-konfiguration.
  19. Overvåg adgang modstand konstant under forsøget.
    Bemærk: Medtag kun neuroner udviser lille og stabil adgang modstand (≤3% af R input, ændring <20% i løbet af forsøget) i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at få indsigt i de biofysiske og fysiologiske egenskaber definerede cellepopulationer, vi udfører akutte koronale vævssnit med musen VNO (figur 1 - 2). Efter dissektion, kan skiverne holdes i iskold iltet ekstracellulær opløsning (S 2) til flere timer. Ved opsætningen optagelse, en konstant udveksling med frisk iltet løsning (figur 2D) sikrer levedygtighed væv i hele forsøget. Vi her anvender en transgen musemodel (FPR-RS3-i-Venus). VSNs i denne stamme co-udtrykke en fluorescerende markør-protein med FPR-RS3, et prototypisk medlem af FPR-rs genfamilien (figur 3), som muliggør optisk identifikation af en defineret population af sensoriske neuroner. Elektrofysiologiske optagelser give mulighed for en dybtgående analyse på enkelt-celle niveau. For eksempel er analysen af ​​de spændingsstyrede strømme udføres i spænding-clamp(figur 4A - B). For at isolere specifikke typer af ionstrømme, er skiver overhældt med farmakologiske midler, såsom TTX at inhibere spændingsåbnede Na + -strømme (figur 4A) eller nifedipin at blokere spændingsstyret L-typen Ca2 + strømme (figur 4B). Desuden er vi rutinemæssigt udføre hel-celle optagelser i den aktuelle clamp-konfiguration til at analysere handling potentielle udledning mønstre (figur 4C). Foruden helcelle-optagelser, cell-attached "loose-seal 'optagelser tilvejebringe en mindre invasiv fremgangsmåde, der forhindrer dialyse af intracellulære komponenter (figur 5A). Optagelse aktionspotentiale-drevet kapacitive strømme ved korte stimulus applikation tilbyder en følsom og effektiv måde at screene for sensoriske ligander (f.eks større urinproteiner; MUPS), som aktiverer definerede populationer af celler 51 (figur 5B).

= "Jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> figur 1
Figur 1: Dissektion af VNO. (A) set fra siden på musen hovedet for at illustrere position og vinkel, hvor fortænder skæres. (B) ventrale afbilder den bedste punkt at gribe og skrælle den øvre gane (UP). (C) ventrale udsigt over brusk kapsel (CC), som huser VNO og vomer knogle (VB) efter fjernelse af nedre kæbe, fortænder og gane. (D) Dorsal visning af dissekerede VNO kapsel afbilder den bilaterale lokalisering af både VNOs (D i). Den sidebillede illustrerer randen af brusk på den dorsale side, hvor både VNOs skal adskilles (D ii). Scale bar = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Tissue forberedelse, optagelse kammer og mikroskopobjektbord Skematisk sidebillede på en VNO at illustrere forløbet og positionen af stort blodkar (BV) i den ikke-sensoriske del af epitelet (A i). Den stiplede linie repræsenterer koronale udskæring lag. Lateral visning på en VNO skrællet af CC viser blodkarret (A ii). (B) Agarose-indlejret koronale VNO væv skive fastgjort til bunden af opløsningen fyldt optagelse kammer ved anvendelse af en rustfri stål anker kablet med 0,1 mm tyk syntetisk fiber (SF) tråde. Den indrammede areal afbilder agarose omgiver vævssnit. (C) Skematisk billede viser positionen og orienteringen af ​​en agarose (Ag) -embedded coronal VNO skive anbragt mellem to fibre. (D) Oversigt over optagelsen kammeret anbringes på objektbordet. Kammeret er udstyret med bad ansøgning (BA) for konstant superfusionssystem med oxygeneret S 2, perfusionen blyant (PP) for at anvende sensoriske stimuli eller farmakologiske midler, optagelsen pipette (RP) forbundet til forstærkeren hoved fase, referenceelektroden (RE ) og sugning kapillær (SC) for at opretholde en konstant udveksling af opløsning i kammeret. Skala bar = 1 mm (A ii). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Koronale VNO tissue skive. (A) Konfokal billede (maksimal projektion) af en 150 um akut koronale VNO væv skive der viser fordelingen af fluorescerende FPR-RS3 tau-Venus + neuroner (grøn) i vomeronasale sensoriske epithel. Blodkar (BV), lumen (L), sensoriske epithel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + neuroner udviser en enkelt apikal dendritceller ender i en knop-lignende struktur på den luminale grænse. Whole-celle patch-clamp optagelser blev udført fra VSN soma, patch pipette (PP). (C) Morfologi af en enkelt VSN med den dendritiske knop (K) på spidsen af den lange og smalle dendritceller (D), cellen soma (S) og Axon (A), der forlader soma på den basale side. Målestokke 50 um (A), 10 um (B), 5 um (C). Dette tal er blevet ændret fra 52. Klik herfor at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Isoleret spændingsafhængige Na + og Ca 2 + strømme samt spike udledning (A) Repræsentative spor fra hel-celle patch-clamp optagelser af en TTX-følsom hurtig aktiverende Na + strøm i FPR-RS3 + VSNs.. (A i) Spænding trin optagelse under kontrol betingelser (ekstracellulær løsning S 1, intracellulær løsning S 4) afslører en spændingsafhængig hurtig og forbigående indadgående strøm. (A ii) TTX behandling (1 uM) mindskes kraftigt strømmen. Digitalt trækkes spor (kontrol-TTX (A iii)) reveAls TTX-sensitive spændingsstyrede Na + -strøm. Aktuel spænding relationer TTX-følsomme Na + strømme isoleret fra kontrol- og FPR-RS3 + neuroner (A iv). (B) repræsentant Ca2 + aktuelle spor isoleret farmakologisk (10 uM nifedipin). (C) Repræsentative nuværende clamp spor viser de- / hyperpolarisering og tog af (rebound) aktionspotentialer genereret på trinvis positive (Ci) og negative (C iii) løbende injektion. Bemærk den spontane aktivitet målt ved 0 pA nuværende injektion (C ii). (C iv) affyringsfrekvens af kontrol og FPR-RS3 + neuroner som en funktion af det injicerede strøm (I indsprøjte). Den gradvise stigning i afbrændingstakten er tilsvarende for kontrolog FPR-RS3 + VSNs. Bemærk, at VSNs er udsøgt følsomme over for de nuværende injektioner, selv i de lave picoampere spænder 53-56. Bemærk, at f -I kurver er blevet "background-korrigeret" ved hjælp af spontane spiking frekvens 0 pA nuværende injektion. Data er middelværdier ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra 52. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Ekstracellulære 'løs patch' optagelser fra basale VSNs (A) IR-DIC billede af en akut VNO væv skive afbilder optagelsen pipette i det basale lag af det sensoriske epithel.. (B) repræsentant originale optagelse af basal VSN i cellen-attached-konfiguration (&# 39; loose-seal ") reagerer med korte forbigående byger af pigge til at briefe stimulationer (3 sek) med poolede rekombinant udtrykte store urinen proteiner (rMUPs) og en forhøjet kalium-koncentration (50 mM, 1 sek), henholdsvis (B i) . Højere forstørrelse af optagelser vist i (B i) illustrerer byger af pigge som svar på stimulering (B II). Røde søjler angiver tidspunktet for stimulering, inter-stimulus interval = 30 sek, kontinuerlig optagelse, afbrydelser <1 sek (afskårne mærker //). Scale bar = 5 um (A). Panel (A) er blevet modificeret fra henvisning 38. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den VNO er ​​en chemosensory struktur, der registrerer semiochemicals. Til dato er de fleste af vomeronasal receptorer mangler at blive deorphanized som kun få receptor-ligand-par er blevet identificeret. Blandt disse blev V1rb2 beskrevet for specifikt aktiveres af den mandlige urin feromon 2-heptanon 30, der V2rp5 aktiveres af den mandlige specifikke feromon ESP1 57 samt V2r1b og V2rf2 at blive aktiveret af MHC-peptider SYFPEITHI 48 og SEIDLILGY 58, henholdsvis. En forudsætning for at forstå receptor-ligand relationer og signaltransduktion er viden om de biofysiske karakteristika definerede VSN befolkninger i en indfødt miljø. Passive og aktive membran egenskaber, spændingsafhængige ioniske konduktanser og action potentielle udledning mønstre definere de midler og i hvilket omfang receptor neuroner reagerer på chemosensory stimuli. Elektrofysiologiske optagelser i akutte vævssnit og navnlig, somle-celle patch-clamp optagelser giver en fremragende metode til at analysere disse egenskaber i stor detalje.

Et afgørende skridt for vellykkede og pålidelige fysiologiske optagelser i vævssnit er selve produktet. For at maksimere den tid span til at udføre eksperimenter, skal vævet skiver og overføres til iskold iltet løsning umiddelbart efter dissektion. Efter dette, kan skiverne opbevares i flere timer tillader analyse af et stort antal celler pr forsøgsdag. Det tager lidt øvelse at reducere tid til at dissekere og integrere begge VNOs af et dyr på mindre end 30 min. Efter at succesraten for en erfaren eksperimentator at opnå flere intakte vævssnit med levedygtige celler er langt over 75%. Udførelse patch-clamp optagelser er en lav-throughput eksperimenterende tilgang i forhold til Ca2 + billeddannelse. Men det giver en mere detaljeret og alsidig analyse af aktivitet på single-celle niveau med en meget højere tidsmæssigløsning. I helcelle-konfiguration, er det intracellulære medium dialyseret af pipetten opløsning. Mens pipette løsning ikke kan afspejle den nøjagtige cytosoliske sammensætning, det giver forsøgslederen med nøjagtig kontrol over både ekstra- og intracellulære ioniske betingelser. For pålidelig fortolkning af resultater, løbende overvågning af adgang modstand og lække strøm er afgørende. Til tider en betydelig stigning eller stærk ændring i adgangen modstand eller lække nuværende fører til ufortolkelige resultater og dermed kræver disse optagelser, der kasseres. Desuden er det vigtigt at bemærke, at nogle farmakologiske forbindelser binder irreversibelt gør det nødvendigt at erstatte skiver efter hver optagelse.

Optagelse i celle- vedlagte konfiguration forhindrer dialyse af intracellulære komponenter, og påvirker ikke cellens membranpotentiale. Således tilvejebringer denne teknik en mindre invasiv og relativt hurtig måde til screening. Men denne releACH er generelt begrænset til registrering af super-tærsklen handling potentiale drevet kapacitive strømme fra ydersiden af ​​cellemembranen. Loose-patch optagelser har vist sig at være egnet til analyse af spiking opførsel af et større antal af sensoriske neuroner i VNO skiver 38,54.

Den transgene model ansat her giver et pålideligt værktøj til at identificere og analysere befolkningen i FPR-RS3 udtrykker VSNs. Desuden kan den her beskrevne teknik udvides til andre linjer uanset deres genotype. På trods af den enorme fordel, at undersøge en defineret celletype, ved anvendelse af transgene mus begrænser eksperimenter til tilgængelige linjer. For nylig har imidlertid målrettet genom redigering bliver hurtigere og mere overkommelige med CRISPR / Cas9 teknik 59. Afslutningsvis målrettet patch-clamp optagelser i akutte vomeronasal vævssnit giver en alsidig tilgang til at karakterisere biofysiske og fysiologiske egenskaber for en defineret population af sensoriske neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature) PeqLab 35-2030
ATP (Mg-ATP) Sigma-Aldrich A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) Sigma-Aldrich B9879
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Glucose Sigma-Aldrich G8270
GTP (Na-GTP) Sigma-Aldrich 51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 03564
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mm VWR decapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mm VWR lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissor Fine Science Tools decapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissors Fine Science Tools cutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2 Fine Science Tools removing skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades  Fine Science Tools cutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 Fine Science Tools dissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatula Fine Science Tools handling agarose block and tissue slices
Surgical scalpel cutting agarose block into pyramidal shape
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amplifier HEKA Elektronik EPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) Science Products
CCD-camera Leica Microsystems DFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 Leica Microsystems I3
Fluorescence lamp Leica Microsystems EL6000
Hot plate magnetic stirrer Snijders 34532
Microforge  Narishige MF-830
Micromanipulator Device  Luigs & Neumann SM-5
Micropipette puller, vertical two-step Narishige PC-10 
Microscope Leica Microsystems CSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) Quest Scientific
Objective  Leica Microsystems HCX APO L20x/1.00 W
Oscilloscope Tektronik TDS 1001B
Osmometer  Gonotec Osmomat 030
Perfusion system 8-in-1 AutoMate Scientific
pH Meter five easy Mettler Toledo
Pipette storage jar World Precision Instruments e212
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Razor blades Wilkinson Sword GmbH Wilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) custom-made
Stereo microscope Leica Microsystems S4E
Trigger interface  HEKA Elektronik TIB-14 S
Vibratome  Leica Microsystems VT 1000 S
Water bath  Memmert WNB 45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Tags

Neuroscience vomeronasale organ lugtesansen akut skive forberedelse patch-clamp elektrofysiologi sensoriske neuroner formylpeptidreceptor
Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M.… More

Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ. J. Vis. Exp. (115), e54517, doi:10.3791/54517 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter