Introduction
Die meisten Tiere verlassen sich stark auf ihre chemischen Sinne mit ihrer Umgebung interagieren. Der Geruchssinn spielt eine wesentliche Rolle für die Suche nach und das Essen der Bewertung, Räuber und Ortung geeigneten Paarungspartner zu vermeiden. Bei den meisten Säugetieren, besteht das olfaktorische System von mindestens vier anatomisch und funktionell unterschiedlichen peripheren Subsysteme: Haupt Riechepithel 1,2, das Grueneberg Ganglion 3,4, der Septalorgan von Masera 5,6 und das Vomeronasalorgan. Die VNO umfasst die periphere sensorische Struktur des akzessorischen olfaktorischen System (AOS), die bei der Aufdeckung von chemischen Signale eine große Rolle spielt , die 7-10 Informationen über Identität, Geschlecht, sozialen Rang und sexuellen Zustand vermitteln. Das VNO ist an der Basis der Nasenscheidewand direkt über dem Gaumen befindet. Bei Mäusen, ist es ein bilaterales blind endende Rohr in einer knorpeligen Kapsel eingeschlossen 13.11. Die Orgel besteht sowohl aus einem sichelförmigen medialen Sinnes epithelium, die die VSNs und eines nicht-sensorische Teil auf der lateralen Seite beherbergt. Zwischen beiden Epithelien liegt ein Schleim gefüllten Lumen , das 14 in die Nasenhöhle über die schmalen vomeronasal Kanal verbunden ist. Eine große seitliche Blutgefäß in dem nicht-sensorischen Gewebe stellt einen vaskulären Pumpmechanismus Eintritt von relativ großen, meist nicht flüchtigen Moleküle wie Peptide oder kleine Proteine in die VNO Lumen durch Unterdruck 15,16 zu erleichtern. Die Bauteile des VNO sind bei der Geburt vorhanden und das Organ erreicht Erwachsenengröße kurz vor der Pubertät 17. Doch ob das Nagetier AOS bei Jugendlichen bereits funktionsfähig ist , ist noch Gegenstand von 18-20 zu diskutieren.
VSNs beide zeichnen sich durch ihre epithelialen Lage und der Art des Rezeptors sie zum Ausdruck bringen. VSNs zeigen eine bipolare Morphologie mit einem unmyelinated Axon und einem einzigen apikalen Dendriten, die in Richtung des Lumens ragt und endet in einem mikrovillösen dendritischen Knopf. VSN axons fasciculate die vomeronasal Nerven zu bilden, die die Knorpelkapsel an der dorso-kaudalen Ende verlässt, steigt entlang der Scheidewand, übergibt die Siebbeinplatte und Projekte mit dem Zubehörriechkolben (AOB) 21,22. Die vomeronasal Sinnesepithel besteht aus zwei Schichten: die apikale Schicht näher an der luminalen Seite befindet und Häfen sowohl V1R- und alle, aber eine Art von FPR-rs-exprimierenden Neuronen. Diese Neuronen koexprimiert die G-Protein - α-Untereinheit G & agr; i2 und Projekt an den vorderen Teil des AOB 23-25. Sensorischen Neuronen befindet sich in den mehr Basalschicht express V2Rs oder FPR-RS1 neben G & agr; o und ihre Axone zu den hinteren Bereich des 26-28 AOB senden.
Vomeronasal Neuronen werden durch ziemlich kleine Semiochemicals 29-33 (V1Rs) oder proteinöse Verbindungen 34-38 (V2Rs) , die sezerniert werden in verschiedene Körperflüssigkeiten, wie Urin, Speichel und Tränenflüssigkeit wahrscheinlich aktiviert 37,39-41 In situ - Experimente haben gezeigt , dass auch durch VSNs formylierte Peptide und verschiedene antimikrobielle / Entzündung-verknüpften Verbindungen 25,42 sind aktiviert. Darüber hinaus äußerte heterolog FPR-rs - Proteine Agonisten Spektren mit FPR im Immunsystem in jedem Fall teilen, eine mögliche Rolle als Detektoren für Krankheit in Artgenossen oder verdorbene Lebensmittel Quellen angibt , 25 (siehe 43 Referenz).
Fundamental zum Verständnis Rezeptor-Ligand-Beziehungen und nachgeschalteten Signalkaskaden in spezifischen VSN Populationen ist eine detaillierte Bewertung ihrer grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften in einer natürlichen Umgebung. In der Vergangenheit hat die Analyse von zellulären Signal stark von gentechnisch veränderten Tieren zugute , die eine definierte Population von Neuronen durch Koexpression ein fluoreszierendes Markerprotein 30,44-49 markieren. In diesem Protokoll eine transgene Mauslinie, die FPR-RS3 zusammen mit einem fluoreszierenden Marker (fPr-RS3-i-Venus) wird zum Ausdruck verwendet.Dieser Ansatz zeigt, wie eine solche genetisch veränderten Mausstamm zu verwenden, um durchführen elektro Analyse einer optisch erkennbaren Zellpopulation mit einzelnen Neurons Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten koronaren VNO Gewebeschnitten. Ein Luftdruck getriebene Mehr barrel Perfusionssystem für Sinnesreize und pharmakologische Mittel ermöglicht eine schnelle, reversible und fokale neuronale Stimulation oder Hemmung während Aufnahmen. Ganzzellableitungen in Schnittpräparaten ermöglichen eine detaillierte Analyse der Eigenschaften, der spannungsaktivierte Leitwerte sowie Aktionspotential Entladungsmuster in der natürlichen Umgebung der Zelle.
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Protocol
Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen und Rechtsvorschriften der Europäischen Union über den Schutz von Tieren zu Versuchszwecken (Richtlinie 86/609 / EWG) und mit Empfehlungen von der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) vorgelegt verwendet. Sowohl C57BL / 6 - Mäuse und Fpr-RS3-i-Venus - Mäuse wurden in Gruppen beider Geschlechter bei Raumtemperatur auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Für Experimente junge Erwachsene (6-20 Wochen) beiderlei Geschlechts wurden verwendet. Keine offensichtlichen geschlechtsabhängige Unterschiede beobachtet.
1. Herstellung der Lösung
- Bereiten extrazelluläre Lösung S 1: 4- (2-Hydroxy-ethyl) -piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) gepufferten extrazelluläre Lösung , enthaltend (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH); Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt).
- bereiten Sie extracellular Lösung S 2: Carbogen-oxygenierten (95% O 2, 5% CO 2) extrazelluläre Lösung (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; Osmolarität = 300 mOsm (mit Glucose eingestellt).
- Bereiten Sie 4% Nieder Geliertemperatur Agarose - Lösung (S 3) für die Gewebeeinbettung: 4% Nieder Geliertemperatur Agarose. Löse 2 g Tief Gelieren Agarose in 50 ml S 1 in einem 100 - ml - Glaslaborflasche zusammen mit einem Magnetrührer. Um die Agarose schmelzen, stellte die Flasche in einem Wasserbad (mit Deckel nicht dicht geschlossen) bei 70 ° C für ca. 20 Minuten oder bis die Lösung transparent wird unter Rühren. Abkühlen und halten geschmolzener Agarose in einem zweiten Wasserbad bei 42 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Bereiten intrazellulärem Lösung S 4: Pipettenlösung , enthaltend (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (freie Ca 2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (eingestellt mit KOH); Osmolarität = 290 mOsm.
- Modifizieren / anpassen Zusammensetzung S 1, S 2 und S 4 nach individuellen Versuchsplanung (zB pharmakologische Blocker zu isolieren bestimmte Arten von spannungsaktivierten Ströme).
2. Arbeitsbereich Vorbereitung
- Füllen Scheibe mit Sauerstoff mit S 2 mindestens 30 Minuten vor der Präparation, auf Eis für Temperatur und pH - Einstellung und oxygenate Lösung kontinuierlich Speicherkammer.
- Füllen Reservoir für Scheibe Superfusions bei der Aufnahme - Setup mit S 2 und Sauerstoff kontinuierlich.
- Vor der Präparation, füllen Vibratom Kammer mit S 2 und zerstoßenem Eis um die Kammer anordnen. Alternativ übertragen Ersatz eiskalt mit Sauerstoff angereicherte Lösung aus der Kammer in Vibratom Kammer mit Sauerstoff und kontinuierlich mit Sauerstoff zu halten.
- Vereinbaren Sie chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien.
- Legen Sie Eis Gelpack unter SezierenMikroskop, Deckel mit einem Papiertuch VNO Gewebe gefriert zu Boden der Schale zu verhindern.
- Saubere Rasierklinge durch kurz in 70% Ethanol und destilliertem Wasser gespült und montieren zu Vibratom. Ersetzen Sie für jede Slicing-Sitzung.
3. VNO Dissection and Embedding
- Sacrifice Tier durch kurze Exposition zu CO 2 und enthaupten scharfe chirurgische Schere. Hinweis: Im Laufe der Zeit zu opfern, das Tier auf die Verwirklichung des VNO Kapsel auf Eis kritisch ist, minimieren die Zeit auf weniger als 2 min. Zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes, einbetten sowohl vollständig seziert VNOs in Agarose in weniger als 30 min.
- Entfernen Sie den Unterkiefer mit großen chirurgischen Schere. Geben Sie durch die Mundhöhle und schneiden Sie die Unterkiefer Knochen und Muskel von jeder Seite getrennt.
- Platzieren Sie den restlichen Teil der Kopf auf den Kopf in der großen Petrischale.
- Ziehen Sie die Haut des Oberkiefers und um die Nasenspitze mit mittlerer Pinzette entfernt einen besseren Zugang zu den zu gewinnenSchneidezähne.
- Verwenden Sie Knochen Schere , um den größten Teil der Schneidezähne in der rostralen Richtung (Abbildung 1A) in einer ~ 45 ° Winkel wegzuschneiden. Dies wird die Entfernung des VNO Kapsel aus der Nasenhöhle zu erleichtern.
Hinweis: Nehmen Sie an die Wurzel des Zahns nicht geschnitten Schäden an der Spitze der VNO Kapsel zu verhindern. - Besorgen Sie sich die starren oberen Gaumen an seinem rostralen Teil mit mittlerer Pinzette und sorgfältig schälen zurück in einem Stück in einem flachen Winkel (1B).
Hinweis: Wiederholt spülen mit eiskaltem S 2. - Verwenden Sie Mikro-Feder Schere, um die Knochenfusion zwischen der Spitze des Vomers und den Kiefer zu schneiden. Legen Sie die Scherenspitzen mit dem gekrümmten Teil der Spitze nach außen weg von der VNO und sorgfältig sowohl den Knochen in kleinen Schritten auf schnitt der linken und rechten Seite lateral der VNO-Kapsel.
- Um die VNO Kapsel zu entfernen, verwenden Mikro Feder Schere durch den Vomers am kaudalen Teil zu schneiden und vorsichtig heben Sie den Vomers aus dem nasal Hohlraum mit mittlerer Pinzette. Unmittelbar übertragen Sie die VNO auf eine kleine Petrischale unter einem Stereomikroskop auf einem Eis-Gel-Packung, wo die restlichen Schritte der Präparation wird ausgeführt.
- Spülen Sie das VNO in einer kleinen Menge eiskaltem S 2 in das Gewebe ein Austrocknen zu verhindern.
- Trennen Sie die knorpelige Kapseln, die die VNO Weichgewebe durch Greifen der Rückseite des Vomers mit mittlerer Zange enthalten. Positionieren Sie die Kapsel für eine dorsale Ansicht , so dass eine Spaltung zwischen den beiden VNOs sichtbar wird (Abbildung 1D i).
- Verwenden Sie die Spitze der feinen Pinzette beide Knorpel VNO Kapseln vom zentralen Knochen zu trennen, während die Vomers am hinteren Teil festgenagelt zu halten.
Hinweis: Verwenden einer Pinzette nur am Rand des Knorpels Kapsel und sehr vorsichtig sein, nicht durch den Knorpel zu durchdringen, wie die zarte ist Sinnesepithel leicht beschädigt werden. - Sobald die beiden VNOs getrennt sind, starten Sie den Knorpel Entfernen der Tannen Einkapselnt VNO.
- Besorgen Sie sich die oberen Rand der Kapsel mit einer feinen Pinzette und spaltete die Knorpelwand weg, die zuvor mit dem Vomers (mediale Seite) befestigt war.
- verbleibenden Knorpel drehen Sie den VNO mit seinen geschwungenen seitlichen Seite auf den Boden der Schale zu entfernen und den Knorpel sicher auf der einen Seite festzunageln Pinzette. bewegen vorsichtig die zweite feinen Pinzette von der Rückseite in einem sehr flachen Winkel zwischen Knorpel und VNO die Verbindung zwischen Gewebe und Knorpel zu lösen.
- Langsam das VNO schälen aus dem Knorpel entfernt, indem sie es an seiner Schwanzspitze hält, eine Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden.
- Sobald die VNO aus der Kapsel gehebelt wird, stellen Sie sicher, alle verbleibenden kleinen Knorpelteile wie verbleibenden Knorpelstücke zu entfernen, wird das Gewebe aus den umliegenden Agarose während des Schneidprozesses lösen.
- Setzen Sie einen kleinen Tropfen eiskalten S 2 im ersten seziert VNO zu Gewebeschäden zu verhindern. Ein großes Blutgefäß an der lateralen Seite will werden sichtbar anzeigt , dass das Organ noch intakt ist und nicht grob beschädigt während der Präparation (2A ii). Im Falle wurde das Blutgefäß beschädigt, wird es dennoch sinnvoll sein, die VNO, solange die Gesamtmorphologie war nicht eindeutig beeinträchtigt weitermachen mit dem Schneiden.
- Unmittelbar nach der zweiten VNO sezieren.
- So betten die VNOs, füllen die beiden kleinen Petrischalen bis zum Rand mit geschmolzenem S 3 (gespeichert in einem Wasserbad bei 42 ° C; siehe 1.3).
- Halten Sie die VNO auf den breiteren Schwanzende mit einer feinen Pinzette Beschädigung des Sinnesepithel zu vermeiden.
- Tauchen Sie die VNO in der Agarose und bewegen Sie ihn horizontal hin und her mehrere Male den Film von extrazellulären Lösung sowie alle Luftblasen von der Oberfläche zu entfernen.
- Positionieren Sie die VNO vertikal mit der Schwanzspitze den Boden der Schale zugewandt ist. Anstatt das VNO mit der Zange direkt Kneifen, justieren Orientierung durch die Zangenspitze in der Nähe proximi bewegenty zum VNO.
Hinweis: Orientierung bei der Einbettung ist entscheidend, da es Schnittebene und die Zugänglichkeit zu sensorischen Neuronen während des Experiments bestimmt. - Legen Sie Gerichte auf Gel Eisbeutel und warten, bis Agarose erstarrt ist.
Hinweis: VNO Orientierung nicht ändern, sobald die Agarose verfestigt hat begonnen, da dies das Gewebe aus dem umgebenden Agarose zu lösen.
4. Koronar VNO Gewebe Slicing
- Verwenden Sie kleine Spachtel Agaroseblock von der kleinen Schale in den Deckel einer großen Petrischale zu entfernen, drehen Sie die Agarose den Kopf, die Schwanzspitze des VNO verlässt nach oben.
- Schneiden Sie den Block in eine pyramidale Form eines chirurgischen Skalpells (3-4 mm an der Spitze, 8-10 mm an der Unterseite) mit. Achten Sie darauf, nicht das eingebettete Gewebe zu beschädigen.
- Verwenden Sie Superkleber der pyramidenförmigen Block auf der Mitte der Vibratom Probenplatte zu reparieren und warten ~ 1 min für den Kleber vollständig trocknen.
- Übertragen Sie die Probenplatte zum Schneiden chamber und die zweite VNO vorzubereiten, entsprechend. Halteplatte mit der zweiten Probe bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Verwenden Sie ein vibrierender Klinge Mikrotom mit den folgenden Einstellungen: Dicke: 150-200 & mgr; m; Geschwindigkeit: 3,5 au = 0,15 mm / sec; Frequenz: 7.5 au = 75 Hz. Übertragen Scheiben zu Sauerstoffanreicherungskammer bis zur Verwendung für Scheibe Morphologie unter dem Binokular kurz inspizieren. Scheiben können für mehrere Stunden gehalten werden.
5. Einzelzelle elektrophysiologischen Ableitungen
- Für Aufnahmen, verwenden Sie eine aufrechte Fest Bühne Mikroskop ausgestattet mit Wassertauchziele, Dodt oder Infrarot-Differential störenden Kontrast (IR-DIC) und Epi-Fluoreszenz sowie eine gekühlte CCD-Kamera. Zur Datenerfassung, verwenden Sie ein Patch-Clamp-Verstärker, Kopfstufe, AD / DA-Schnittstellenkarte und einem PC (einschließlich Aufnahme-Software).
- Bereiten Sie einen Vorrat von 10-20 Patch-Pipetten (4-7 MOhm). Pull-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) usinga Mikropipette Abzieher und Feuerpolitur mit einem Mikroschmiede.
Hinweis: Feuerpolieren der Pipettenspitzen von entscheidender Bedeutung ist, wenn die eher kleinen VSNs Patchen. Dadurch wird die Zellmembran Bersten zu verhindern helfen, wenn Unterdruck anwenden, um eine hohe Beständigkeit Dichtung zu erhalten. Nach der Pipettenöffnung Polieren sollte etwa 1 & mgr; m sein. - Halten Sie Pipetten in eine Pipette Vorratsgefäß Schaden und Staubansammlung bis zur Verwendung zu verhindern.
- Bereiten Sie Perfusionssystem durch Lösungsbehälter füllen und Schläuche nach experimentellen Design.
Hinweis: Entfernen Sie Luftblasen aus Schlauch vollständig, da sie stark mit elektrophysiologischen Ableitungen stören. - Passen Druck zu erreichen ~ 3 ml / min fließen.
Hinweis: Hohe Drücke Bewegung des Gewebeschnitts verursachen sowie Beendigung der elektrophysiologischen Ableitungen. - Übertragen VNO Scheibe zu Abbildungskammer und befestigen Sie die Schnittposition Edelstahlanker mit Kabel mit 0,1 mm dicken synthetic Fasern (2B - C).
Hinweis: Nicht die Gewebescheibe bedecken mit einer der Kunstfasergarne, sondern die Agarose die Scheibe umgibt. - Transfer Imaging - Kammer zur Einrichtung der Aufnahme und kontinuierlich superfuse Scheibe mit Sauerstoff angereichertem S 2 bei Raumtemperatur über eine Bad - Anwendung.
- Stellen Sie die Saug-Kapillare an der Oberfläche der Lösung eine langsame Absaugung für ständigen Austausch von Bad Lösung zu schaffen. Stellen Sie die 8-in-1 Multi-barrel "Perfusion Bleistift" oben und in der Nähe der Nicht-sensorische Teil des VNO Scheibe, die das Blutgefäß (2C, 3A) 50 enthält. Es wird von Vorteil sein Perfusion Bleistift und Aufnahme Pipette zu ordnen aus entgegengesetzten Richtungen gegenüber der Scheibe zu sein.
- Verbinden Referenzelektrode und Badlösung einen L-förmigen Agarbrücke Verwendung (gefüllt mit 150 mM KCl).
- Füllen Sie Patch - Pipette mit Pipettenlösung S 4.
- Montieren Sie die Pipette über das Silberchlorid beschichteten Patch-Elektrode mit der Kopfstufe verbunden, ohne dass die Beschichtung abgekratzt und befestigen fest.
- Mit leichtem Überdruck (etwa 1 ml auf 10 ml Plastikspritze) mit dem Patch-Pipette, bevor Sie das Bad betreten.
- Senken Sie die Pipette in das Bad Mikromanipulatoren mit weit genug , um das Ziel zu versenken , ohne auf sie (2D).
- Monitor - Pipette Widerstand (R pip, zwischen 4-7 M & Omega;) unter Verwendung von Elektro Software auf die Kopfstufe verbunden.
Hinweis: Wenn R pip <4 MOhm die Glasspitze gebrochen ist. Wenn R pip> 10 M & OHgr; ist die Spitze wahrscheinlich verstopft , und die Pipette ersetzt werden müssen. - Visualisieren Sie die VNO Scheibe mit einer CCD-Kamera mit Infrarot-optimierte differentiellen Interferenzkontrast (DIC) und identifizieren FPR-RS3-i-Venus-Zellen, die (oder ähnlich markierten Neuronen) unter Verwendung von Fluoreszenzbeleuchtungund eine entsprechende Filterwürfel.
- Fokus und Ziel fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Zellen in Abhängigkeit von experimentellen Design.
- Um den Zellkörper nähern, verwenden Handräder für maximale Empfindlichkeit. Aufgrund der positiven Druck, eine kleine Delle in der Zelle soma Membran sichtbar wird, sobald die Pipettenspitze in der Nähe ist.
- Lassen Sie positiven Druck und mit leichtem Unterdruck zu saugen in der Zellmembran, um eine hohe Widerstands Dichtung (1-20 G & Omega;) zu gewinnen. Tragen Sie kurze und sanfte Saugwirkung die Zellmembran und stellen Sie die Gesamtzellkonfiguration zu stören.
- Überwachen Sie den Zugriff Widerstand ständig während Experiment.
Hinweis: Nur umfassen Neuronen zeigen kleine und stabile Zugangswiderstand (≤3% der R - Eingang; Änderung <20% über den Verlauf des Experiments) in Analyse.
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Representative Results
Um einen Einblick in die biophysikalischen und physiologischen Eigenschaften von definierten Zellpopulationen zu gewinnen, führen wir akuten koronaren Gewebeschnitten der Maus VNO (Abbildung 1 - 2). Nach der Dissektion Scheiben können in eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung (S 2) für mehrere Stunden gehalten werden. Bei der Aufnahme - Setup, ein ständiger Austausch mit frischem Sauerstoff angereicherten Lösung (2D) sorgt für die Lebensfähigkeit des Gewebes während des gesamten Experiments. Wir beschäftigen hier ein transgenes Mausmodell (FPR-RS3-i-Venus). VSNs in diesem Stamm koexprimiert ein fluoreszierendes Markerprotein mit FPR-RS3, ein prototypisches Mitglied des FPR-rs - Genfamilie (Abbildung 3) ermöglicht , optische Identifikation einer definierten Population von sensorischen Neuronen. Elektrophysiologische Aufnahmen stellen die Mittel für eine gründliche Analyse auf der Ebene einzelner Zellen. Zum Beispiel Analyse von spannungsabhängigen Ströme wird in der Spannung-Clamp ausgeführtModus (4A - B). Um bestimmte Arten von Ionenströmen zu isolieren, Scheiben sind mit pharmakologischen Mitteln, wie TTX superfused spannungsgesteuerten Na + -Ströme (4A) oder Nifedipin zu hemmen spannungsabhängigen L-Typ - Ca 2+ Ströme (4B) zu blockieren. Darüber hinaus führen wir regelmäßig Ganzzellableitungen in der Stromklemme Konfiguration Aktionspotential Entladungsmuster (4C) zu analysieren. Neben Ganzzellableitungen, Cell-Attached "loose-Siegel 'Aufnahmen bieten eine weniger invasive Methode , die Dialyse von intrazellulären Komponenten (5A) verhindert. Aufzeichnungsaktionspotential-driven kapazitive Ströme auf kurzen Reizapplikation verfügt über eine empfindliche und effizient für die sensorische Liganden (zB Haupturinproteine; MUPs) zu screenen , die Populationen von Zellen 51 (5B) definiert aktivieren.
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Abbildung 1: Dissektion der VNO. (A) Seitenansicht auf der Maus den Kopf zu veranschaulichen , die Position und Winkel , in dem die Schneidezähne geschnitten werden. (B) Ventralansicht den besten Punkt der Darstellung der oberen Gaumen zu greifen und ziehen zurück (UP). (C) ventralen Blick auf die Knorpelkapsel (CC), die die VNO und die Vomers hegt (VB) nach dem Unterkiefer, Schneide- und Gaumen zu entfernen. (D) Dorsal Ansicht der Kapsel seziert VNO die bilateralen Lokalisation von sowohl VNOs (D i) darstellt. Die Seitenansicht zeigt den Rand des Knorpels auf der dorsalen Seite , wo sowohl VNOs müssen (D ii) getrennt werden. Maßstabsbalken = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: Gewebepräparation, Aufnahmekammer und Mikroskoptisch schematische Seitenansicht auf einem VNO zu veranschaulichen den Verlauf und die Position des großen Blutgefäßes (BV) in den nicht-sensorischen Teil des Epithels (A i). Die gestrichelte Linie stellt die koronalen Slicing-Schicht. Seitenansicht auf einem VNO aus dem CC geschält zeigt das Blutgefäß (A ii). (B) Agarose eingebettete Scheibe koronalen VNO Gewebe an der Unterseite der Lösung gefüllten Aufnahmekammer fixiert , um einen Edelstahlanker mit Kabel mit 0,1 mm dicken Kunststofffaser (SF) Fäden. Der eingerahmte Bereich stellt die Agarose die Gewebescheibe umgibt. (CSchematische Darstellung) veranschaulicht die Position und Ausrichtung eines Agarose (Ag) -embedded coronal VNO Scheibe, die zwischen zwei Fasern. (D) Überblick über die Aufnahmekammer auf dem Mikroskoptisch platziert. Die Kammer ist mit Badanwendung (BA) für konstante Superfusions ausgerüstet mit Sauerstoff angereichert S 2, mit dem Perfusionssystem Bleistift (PP) Sinnesreize oder pharmakologische Mittel anwenden, die Aufzeichnungs Pipette (RP) an den Verstärker Kopfstufe verbunden ist , die Bezugselektrode (RE ) und der Saug-Kapillare (SC) einen konstanten Austausch von Lösung in der Kammer aufrechtzuerhalten. Maßstabsbalken = 1 mm (A ii). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Koronar VNO tissue in Scheiben schneiden. (A) konfokale Bild (maximale Projektion) eines 150 & mgr; m akuten koronaren VNO Gewebeschnitt die Verteilung von fluoreszierenden FPR-RS3 Tau-Venus + Neuronen (grün) im vomeronasal Sinnesepithel zeigt. Blutgefäße (BV), Lumen (L), Sinnesepithel (SE). (B) FPR-RS3 Tau-Venus + Neuronen einen einzigen apikalen Dendriten an der luminalen Grenze in einer noppenartigen Struktur endet aufweisen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen wurden von der VSN soma, Patch-Pipette (PP) durchgeführt. (C) Morphologie eines einzelnen VSN mit dem dendritischen Knopf (K) an der Spitze des langen und schmalen Dendriten (D), die Zellsoma (S) und dem Axon (A) die soma an der basalen Seite zu verlassen. Maßstabsbalken 50 & mgr; m (A), 10 & mgr; m (B), 5 & mgr; m (C). Diese Zahl hat sich von 52 geändert. Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Getrennte spannungsabhängigen Na + und Ca 2+ Ströme sowie Spike - Entladung (A) Repräsentative Spuren von Ganzzell Patch-Clamp - Aufnahmen einer TTX-empfindliche schnell aktivierenden Na + Strom in FPR-RS3 + VSNs.. (A i) Spannungs Schritt Aufzeichnung unter Kontrollbedingungen (extrazelluläre Lösung S 1; intrazelluläre Lösung S 4) zeigt einen spannungsabhängigen schnell und vorübergehend nach innen gerichteten Strom. (A ii) TTX - Behandlung (1 & mgr; M) verringert den Strom stark. Digital subtrahiert Spur (control-TTX (A iii)) reveKü die TTX-empfindliche spannungsabhängigen Na + Strom. Strom-Spannungs - Beziehungen von TTX-sensitive Na + Ströme getrennt von den Steuer- und FPR-RS3 + Neuronen (A iv). (B) Repräsentative Ca 2+ aktuelle Spuren isoliert pharmakologisch (10 uM Nifedipin). (C) Repräsentative Stromklemme Spuren zeigt de- / Hyperpolarisation und Züge (Rebound) Aktionspotentiale erzeugt auf schrittweise positiv (C i) und negativen (C iii) Stromeinspeisung. Beachten Sie die spontane Aktivität gemessen bei 0 pA Strominjektion (C ii). (C iv) Abfeuerungsfrequenz von Steuer- und FPR-RS3 + Neuronen als Funktion des injizierten Stroms (I injizieren). Die schrittweise Erhöhung Rate in dem Brennen ist ähnlich für die Kontrolleund FPR-RS3 + VSNs. Beachten Sie, dass VSNs zu aktuellen Injektionen auch in den niedrigen Pico - Ampere reichen 53-56 außerordentlich empfindlich sind. Beachten Sie, dass f -I Kurven wurden "background-korrigiert" mit der spontanen Spicken Frequenz bei 0 pA Stromeinspeisung. Daten sind Mittelwerte ± SEM. Diese Zahl hat sich von 52 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die extrazelluläre 'lose Patch' Aufnahmen von basalen VSNs (A) IR-DIC Bild einer akuten Scheibe VNO Gewebe um die Aufnahme Pipette in der basalen Schicht des Sinnesepithel darstellt.. (B) Repräsentative Originalaufnahme eines basalen VSN in der Zelle-Attached - Konfiguration (&# 39; lose Dichtung ') mit kurzen vorübergehenden Ausbrüchen von Spikes reagiert Stimulationen auf kurze (3 sec) mit gepoolten rekombinant exprimiert großen Harnproteine (rMUPs) und eine erhöhte Kaliumkonzentration (50 mM, 1 sec) bzw. (B i) . Eine stärkere Vergrößerung der Aufnahmen in (B i) gezeigt zeigt platzt der Spitzen in der Antwort auf Stimulationen (B ii). Rote Balken zeigen die Zeit der Stimulation, Inter-Stimulus-Intervall = 30 sec, kontinuierliche Aufzeichnung, Unterbrechungen <1 sec (Schnittmarken //). Maßstabsbalken = 5 & mgr; m (A). Panel (A) wurde von Referenz 38 geändert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das VNO ist eine chemosensorischen Struktur, die Semiochemicals erkennt. Bis heute ist die Mehrheit der vomeronasal Rezeptoren werden deorphanized da nur wenige Rezeptor-Ligand-Paare wurden identifiziert. Unter denen, 58 V1rb2 beschrieben wurde spezifisch durch die männlichen Urin Pheromon 2-Heptanon 30, V2rp5 aktiviert zu werden durch das männliche spezifischen Pheromon ESP1 aktiviert werden 57 sowie V2r1b und V2rf2 SYFPEITHI 48 und SEIDLILGY von den MHC - Peptide aktiviert zu werden, beziehungsweise. Eine Voraussetzung für das Verständnis Rezeptor-Ligand-Beziehungen und Signaltransduktion ist die Kenntnis der biophysikalischen Eigenschaften von definierten VSN Populationen in einer natürlichen Umgebung. Passive und aktive Membraneigenschaften, spannungsabhängige Ionenleitfähigkeiten und Aktionspotential Entladungsmuster definieren, die Mittel und Ausmaß der Rezeptorneuronen reagieren chemosensorischen Stimuli. Elektrophysiologische Aufnahmen in akuten Gewebeschnitten und insbesondere, diele-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen bieten eine hervorragende Methode, um diese Eigenschaften im Detail zu analysieren.
Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche und zuverlässige physiologische Aufnahmen in Gewebeschnitten ist die Zubereitung selbst. Um die Zeitspanne zu maximieren Experimente durchzuführen, muss das Gewebe in Scheiben geschnitten und mit eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte Lösung unmittelbar nach der Präparation übertragen werden. Im Anschluss daran Scheiben kann für mehrere Stunden ermöglicht Analyse einer wesentlichen Anzahl von Zellen pro Versuchstag gehalten werden. Es braucht einige Übung Zeit zu reduzieren, zu sezieren und sowohl VNOs von einem Tier in weniger als 30 min einbetten. die Erfolgsquote für einen erfahrenen Experimentator Danach werden mehrere intakte Gewebeschnitten mit lebenden Zellen zu erhalten, ist deutlich über 75%. Patch-Clamp - Aufnahmen durchführen ist ein Low-Durchsatz experimenteller Ansatz im Vergleich zu Ca 2+ Bildgebung. Dennoch ermöglicht es eine detailliertere und vielseitige Analyse der Aktivität auf der Ebene einzelner Zellen mit einer viel höheren zeitlichenLösung. In der whole-cell-Konfiguration, das intrazelluläre Medium wird durch die Pipettenlösung dialysiert. Während die Pipettenlösung nicht die genaue cytosolische Zusammensetzung widerspiegeln könnte, bietet es dem Experimentator mit genauen Kontrolle über extra- und intrazellulären ionischen Bedingungen. Für eine zuverlässige Interpretation der Ergebnisse ist eine kontinuierliche Überwachung der Zugangswiderstand und Leckstrom von entscheidender Bedeutung. Manchmal eine deutliche Zunahme oder starken Veränderungen in den Zugangswiderstand oder Stromleitungen zu interpretierbaren Ergebnisse auslaufen und fordert damit diese Aufnahmen verworfen werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass einige pharmakologische Verbindungen zu beachten irreversibel binden wodurch es notwendig Scheiben nach jeder Aufnahme zu ersetzen.
Aufnahme in der Zelle-Attached-Konfiguration verhindert Dialyse von intrazellulären Komponenten und hat keinen Einfluss auf das Membranpotential der Zelle. So stellt diese Technik eine weniger invasive und relativ schnelle Weise des Screenings. Doch diese approACH ist der Aufzeichnung von super-Schwellenaktionspotential-driven kapazitiven Ströme von der Außenseite der Zellmembran beschränkt. Lose Patch - Aufnahmen haben sich als geeignet erwiesen , um das Spicken Verhalten von einer größeren Anzahl von sensorischen Neuronen in VNO Scheiben 38,54 zu analysieren.
Die hier verwendeten transgenen Modell stellt ein zuverlässiges Werkzeug, um die Bevölkerung von FPR-RS3 zum Ausdruck VSNs zu identifizieren und zu analysieren. Außerdem beschriebene Technik kann hier unabhängig von ihrem Genotyp zu anderen Linien erweitert werden. Trotz der enormen Vorteil einer definierten Zelltyp zu untersuchen, transgene Mäuse mit begrenzt Experimente zu den zur Verfügung stehenden Leitungen. Vor kurzem wurde jedoch gezielte Genom Bearbeitung schneller und günstiger mit dem CRISPR / Cas9 Technik 59 geworden. Abschließend gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen bei akuten vomeronasal Gewebeschnitten eine vielseitige Ansatz bieten zu charakterisieren biophysikalischen und physiologischen Eigenschaften eines definierten populatIon von sensorischen Neuronen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
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