Introduction
ほとんどの動物は、それらの周囲と対話するために、それらの化学的感覚に大きく依存しています。嗅覚は、適切な交配パートナーを見つけ、食品を評価する、捕食者を回避し、配置するための重要な役割を果たしています。主嗅上皮1,2、Grueneberg神経節3,4、マゼーラ5,6の中隔臓器と鋤鼻器官：ほとんどの哺乳動物では、嗅覚系は、少なくとも4つの解剖学的および機能的に異なる周辺のサブシステムから構成されています。 VNOは、ID、性別、社会的地位や性的な状態7-10についての情報を伝える化学手がかりを検出するのに重要な役割を果たしているアクセサリーの嗅覚システム（AOS）、の末梢感覚構造を含みます。 VNOは、右口蓋上記の鼻中隔の基部に位置しています。マウスでは、軟骨カプセル11-13で囲まれた二国間の盲終わる管です。臓器は、三日月形の内側の感覚epitheの両方で構成されVSNをを保有し、側面上の非感覚一部のlium。両方の上皮との間の狭い鋤鼻ダクト14を介して鼻腔に接続された粘液で満たされた内腔に位置しています。非感覚組織の大きな横方向の血管は負圧15,16を介してVNO腔にそのようなペプチドまたは小型タンパク質のような比較的大きい、主に非揮発性の分子の進入を容易にするために、血管ポンピング機構を提供します。 VNOの構造部品は、出生時に存在し、臓器は、まもなく思春期17の前に大人のサイズに達します。しかし、齧歯類のAOSはすでに少年で機能しているかどうか18-20を議論することが課題です。
VSNを、それらの上皮場所とそれらが発現する受容体のタイプの両方によって区別されます。 VSNをは無髄軸索内腔に向かって突出しており、微絨毛の樹状ノブで終わる単一の先端樹状突起を持つバイポーラ形態を示します。 VSNの斧アドオン束生の、背尾側端での軟骨カプセルを残す中隔に沿って上昇し、副嗅球（AOB）21,22に篩板やプロジェクトを渡し鋤鼻神経を形成します。鋤鼻感覚上皮は2層で構成されています：頂端層が腔側に近い位置に配置し、V1R-とFPR-RS-発現ニューロンの1タイプではなく、すべての両方を保有されています。これらのニューロンは、AOB 23-25 の前部にGタンパク質αサブユニットGのαi2とプロジェクトを共発現します。感覚ニューロンは、GαOと一緒に、より基底層特急V2RsまたはFPR-RS1に位置し、AOB 26-28の後部領域への軸索を送ります。
鋤鼻ニューロンはおそらく、尿、唾液などの各種体液中に分泌し、涙液されているという小さな情報化学物質29-33（V1Rs）またはタンパク質化合物34-38（V2Rs）によって活性化される37,39-41 その場での実験でのVSNもホルミル化ペプチドおよび種々の抗菌剤/炎症結合化合物25,42によって活性化されることが示されています。また、異種FPR-RSタンパク質が（参照43を参照）同種または腐った食物源25で病気のための検出器としての潜在的な役割を示し、免疫系において発現のFPRでアゴニストスペクトルを共有して表明しました。
特定のVSN集団における受容体 - リガンドの関係および下流のシグナル伝達カスケードを理解するための基本的には、ネイティブ環境での基本的な生物物理学的特性の詳細な評価です。過去には、細胞内シグナル伝達の解析が大幅に蛍光マーカータンパク質30,44-49を共発現することによってニューロンの定義された人口をマークする遺伝子改変動物の恩恵を受けています。このプロトコルでは、蛍光マーカー（FPR-RS3-I-ビーナス）と共にFPR-RS3を発現するトランスジェニックマウス系統が使用されます。このアプローチは、急性冠状VNOの組織切片内の単一ニューロンのパッチクランプ記録を用いて光学的に識別可能な細胞集団の電気生理学的分析を行うために、そのような遺伝的に改変されたマウス系統を使用する方法を例示します。感覚刺激と薬理学的薬剤のための空気圧駆動式マルチバレル灌流システムは、録音時に、迅速な可逆焦点神経刺激または阻害することができます。スライス標本における全細胞記録は固有の特性、電圧活性化コンダクタンス、ならびに細胞のネイティブな環境での活動電位放電パターンの詳細な分析を可能にします。
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Protocol
すべての動物の手順は、実験目的のために使用される動物の保護（指令609分の86 / EEC）とで勧告は欧州実験動物学協会連合会（FELASA）によって提唱上のローカルおよび欧州連合の法律を遵守していました。 C57BL / 6マウスとFPR-RS3-I-金星マウスの両方が食料や水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクル上で室温で両性のグループで飼育しました。実験のためのセックスのいずれかの若年成人（6-20週）を使用しました。明らかな性別依存の違いは認められませんでした。
1.溶液の調製
- 細胞外溶液S1を調製する：のCaCl 2、1 145のNaCl、5 KClを、1 4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）は（mM単位）を含有する細胞外溶液を緩衝のMgCl 2、10 HEPES。 pH値= 7.3（NaOHで調整）。 （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。
- extracellu準備LAR溶液S 2：カルボゲン、酸素（95％O 2、5％CO 2）のCaCl 2、1のMgSO 4 125のNaCl、25（mM単位）のNaHCO 3、5のKCl、1を含有する細胞外溶液、5 BES。 pH値= 7.3; （グルコースで調整）浸透圧= 300mOsmで。
- 組織の埋め込 みのために4％の低ゲル化温度アガロース溶液（S 3）を準備します。4％の低ゲル化温度アガロース。一緒にマグネチックスターラーを備えた低ゲル化100mlのガラス実験用瓶にS 1 50mlにアガロースを2g溶解します。アガロースを溶融し、約20分間、または撹拌しながら溶液が透明になるまで70℃で（蓋密閉しないで）水浴中にボトルを置きます。クールダウンし、さらに使用するまで42℃で第2の水浴中で溶融したアガロースを保ちます。
- 細胞内溶液S 4準備：（mM単位）143のKCl、2 KOH、1 EGTA、0.3のCaCl 2（= 110 nMの遊離Ca 2+）、10 HEPES、2をMgATP、1 NaGTPを含むピペット溶液を、pH値= 7.1（KOHで調整）。浸透圧= 290ミリオスモル。
- 個々の実験計画（電位活性化電流の特定の種類を分離する例えば 、薬理学的遮断剤）に応じて変更/ S 1の組成物を調整し、S 2、S 4。
2.ワークスペースの準備
- 継続的に前に解剖、温度およびpH調整のために氷の上の場所や含酸素溶液に、S 2、少なくとも30分で貯蔵室酸素化スライスを埋めます。
- S 2とのセットアップを記録でスライス灌流のための貯蔵を記入し、継続的に酸素化。
- 解剖の前に、S 2でビブラトーム室を充填し、チャンバの周囲に砕いた氷を手配。また、ビブラトーム室に室を酸素化からスペア氷冷酸素化ソリューションを転送し、継続的に酸素化おきます。
- 手術器具や消耗品を配置します。
- 解剖の下でアイスジェルパックを置きます顕微鏡は、皿の底に凍結からVNO組織を防止するために、紙タオルで覆っています。
- 簡単に70％エタノールと蒸留水ですすぎとビブラトームするマウントしたクリーンかみそりの刃。すべてのスライスセッションのために交換してください。
3. VNO解剖と埋め込み
- CO 2への短時間の曝露によって、動物を犠牲にし、鋭い手術用はさみを使って首を切ります。注：氷の上にVNOカプセルを置くことに、動物を犠牲にするから時間が重要であるように、2分未満までの時間を最小限に抑えます。組織の生存率を維持するために、30分未満でアガロースの両方で完全解剖VNOsを埋め込みます。
- 大きな手術用ハサミで下顎を削除します。口腔を介して入力し、個別に各側の下顎の骨と筋肉をカット。
- 大きなペトリ皿に逆さまヘッドの残りの部分を配置します。
- へのより良いアクセスを得るために培地鉗子で上顎のと鼻の先端の周りの皮膚を引き離します門歯。
- 吻側方向（ 図1A）で〜45°の角度で切歯の大部分を切り取るために骨のはさみを使用してください。これは、鼻腔からVNOカプセルの除去を容易にします。
注：VNOカプセルの先端の損傷を防ぐために歯の根に切断しないでください。 - メディア鉗子でその吻側部で剛性上口蓋をつかみ、慎重に平らな角度（ 図1B）で一体に戻って皮をむきます。
注：繰り返しの氷冷S 2で洗い流してください。 - 鋤骨の骨と顎の先端との間の骨の融合をカットするマイクロ春のはさみを使用してください。先端の湾曲部が外側に離れてVNOから指し示すとはさみのヒントを挿入し、慎重にVNOカプセルに横方向の左右両側に小さなステップで骨を切りました。
- VNOカプセルを削除するには、尾部に鋤骨の骨を切断するために、マイクロ春のはさみを使用して、慎重にn個のうち、鋤骨の骨を持ち上げますメディア鉗子を使用してASAL空洞。すぐに解剖の残りのステップが実行されるアイスジェルパックのステレオ顕微鏡下で小さなペトリ皿にVNOを転送します。
- 乾燥から組織を防止するために、氷冷S 2少量のVNOをすすぎます。
- メディア鉗子で鋤骨の骨の後ろをつかむことにより、VNO軟組織が含まれている軟骨カプセルを分離します。位置VNOs両方の間の分割は（ 図1D i）を見えるように背ビュー用カプセル。
- 後部に釘付け鋤骨の骨を維持しながら、中央の骨の両方から軟骨VNOカプセルを分離するために微細な鉗子の先端を使用してください。
注：唯一の軟骨カプセルの縁に鉗子を使用し、繊細な感覚上皮が損傷しやすいように、軟骨を貫通しないよう十分に注意してください。 - 2 VNOsが分離されたら、もみをカプセル化軟骨の除去を開始トンVNO。
- 1微細な鉗子でカプセルの上縁をつかみ、以前鋤骨の骨（内側）に取り付けた軟骨壁を離れて分割します。
- 軟骨は、皿の底に、その湾曲した側面とVNOを回し、しっかりと鉗子を使用して1つの側に軟骨を突き止める残り削除します。慎重組織と軟骨との間の接続を緩めるために軟骨とVNOの間に非常に平坦な角度で背面側から第二の微細鉗子を移動します。
- ゆっくりと感覚上皮の損傷を避けるために、その尾の先端にそれを保持することによって離れて軟骨からVNOの皮をむきます。
- VNOがカプセルからレバレッジされると、スライス工程中にアガロース周囲から組織を切り離します軟骨の任意の残りの部分のように、残りのすべての小さな軟骨部分を削除してください。
- 組織の損傷を防止するために、最初の解剖VNO氷のように冷たいS 2の小滴を置きます。側面ウィルに大きな血管lは器官が無傷のままであり、肉眼で解剖（ 図2A II）中に破損しなかったことを示す目に見えるようになります。血管が損傷してしまった場合、まだ限り、全体的な形態が明らかに損なわれていなかったとしてVNOをスライスして上に運ぶために価値があるだろう。
- すぐに第二VNOを分析。
- VNOsを埋め込 むには、溶融したS 3とリムに小さなペトリ皿の両方を満たす（42℃の水浴中に保存され、1.3を参照してください）。
- 感覚上皮への損傷を避けるために、微細なピンセットで広い尾の端にVNOを保持します。
- アガロースにVNOを浸し、細胞外液のフィルムだけでなく、その表面から任意の気泡を除去するために、前後に水平に数回移動します。
- 皿の底に直面して、尾の先端に垂直にVNOを置きます。代わりに、直接鉗子でVNOをつまんで、近くproximi鉗子先端部を移動させることにより、向きを調整VNOにTY。
注：それは実験中の感覚ニューロンにスライス面とアクセシビリティを決定するように埋め込む時のオリエンテーションは非常に重要です。 - ゲルアイスパック上の皿を置き、アガロースが固化するまで待ちます。
注：アガロースは、これは、周囲のアガロースから組織を離脱するように固化開始した後VNOの向きを変更しないでください。
4.冠状VNO組織スライス
- 大きなペトリ皿のふたに小さな皿からアガロースブロックを削除するには、小さなへらを使用して、逆さまに上向きVNOの尾の先端を残してアガロースを反転。
- 手術用メス（先端で3〜4ミリメートル、底部に8〜10ミリメートル）を使用して、角錐状にブロックをカット。埋め込まれた組織を傷つけないように注意してください。
- ビブラトーム試料プレートの中央にピラミッド型のブロックを固定し、接着剤が完全に乾燥するために〜1分を待つように瞬間接着剤を使用してください。
- スライスcに試料プレートを転送hamberそれに応じて、第二VNOを準備します。使用するまで4℃で第2の検体とプレートを保管してください。
- 厚さ：：次の設定で振動ブレードミクロトームを使用して150〜200ミクロン。スピード：3.5 AU = 0.15ミリメートル/秒。周波数：7.5 AU = 75 Hzの。簡単に解剖顕微鏡下でスライス形態を検査した後に使用するまで酸素供給室にスライスを転送します。スライスは、いくつかの時間のために保持することができます。
5.単一細胞電気生理学的記録
- 記録のために、水浸対物レンズ、Dodtまたは赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）、およびエピ蛍光だけでなく、冷却CCDカメラを搭載した直立固定ステージ顕微鏡を使用しています。データ収集のために、パッチクランプアンプ、ヘッドステージ、AD / DAインターフェースボードと（記録ソフトウェアを含む）は、PCを使用しています。
- 10月20日パッチピペット（4-7MΩ）の株式を準備します。プルピペットホウケイ酸ガラスキャピラリーから（1.50ミリメートルOD / 0.86ミリメートルID）usinマイクロフォージとGAのマイクロピペットプラーと火ポリッシュ。
注：かなり小さいのVSNにパッチを適用する際の火災はピペットチップを研磨することは非常に重要です。これは、高抵抗シールを得るために、負圧を適用する際に、細胞膜を破裂防止するのに役立ちます。ピペット開口部を研磨した後、1μm程度であるべきです。 - 使用するまで損傷や埃の蓄積を防止するために、ピペット保存瓶にピペットを保管してください。
- ソリューションの貯水池を充填し、実験計画に従ってチューブにより灌流システムを準備します。
注：彼らは強く電気生理学的記録を妨害するように完全にチューブから気泡を除去します。 - 〜3ミリリットル/分の流量を達成するための圧力を調整します。
注：高圧力が電気生理学的記録の組織切片の動きだけでなく、終了の原因となります。 - イメージング室にVNOスライスを移し、厚さ0.1mmのSYNTで配線ステンレス鋼のアンカーを使用して、スライス位置を修正hetic繊維（ 図2B - C）。
注：合成繊維糸のいずれかの組織切片ではなく、スライスを囲むアガロースをふさがないでください。 - バスアプリケーションを介して、室温で酸素S 2に設定し、継続的に表面かん流するスライスを記録への転送撮像チャンバ。
- 浴溶液の一定の交換のためのゆっくりと吸引を作成するために、溶液の表面に吸着キャピラリーを調整します。 8イン1マルチバレル「灌流鉛筆」を調整して、上記と血管（ 図2C、3A）50 が含まれているVNOスライスの非感覚の部分に近接しています。反対方向からのスライスに直面する灌流鉛筆と記録ピペットを配置することが有益です。
- （150mMのKClで満たされている）L字型の寒天ブリッジを使用して参照電極と浴溶液を接続します。
- ピペット溶液S 4でパッチピペットを埋めます。
- コーティングを掻き落とすことなく、ヘッドステージに接続された塩化銀でコーティングされたパッチ電極の上にピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。
- お風呂に入る前に、パッチピペットに若干の正圧（10ミリリットルのプラスチックシリンジに約1ミリリットル）を適用します。
- （ 図2D）、それを押すことなく目標を沈めることができるように十分マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを下ろします。
- ヘッドステージに接続された電気生理学ソフトウェアを使用して、（4-7MΩ間のR ピップ 、）ピペット抵抗を監視します。
注：R ピップがある場合は、<4MΩガラスチップが壊れています。 R ピップは > 10MΩの場合、先端が最も可能性の高い目詰まりやピペットの交換が必要です。 - 赤外線最適化された微分干渉コントラスト（DIC）を使用したCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、FPR-RS3-I-金星は蛍光照明を用いて、細胞（または同様に標識ニューロン）を発現する識別そして、適切なフィルターキューブ。
- フォーカスや実験計画に応じて、蛍光または非蛍光細胞を標的とします。
- 細胞体に近づくために、最大感度のためのハンドホイールを使用しています。ピペットチップが近接しているいったん正圧に起因して、細胞体膜の小さな凹みが見えるようになります。
- 正圧を解放し、高抵抗シール（1月20日GΩ）を得るために、細胞膜を吸引するためのわずかな負圧を適用します。細胞膜を破壊し、全細胞構成を確立するために短く穏やかな吸引を適用します。
- 実験中に常にアクセス抵抗を監視します。
注：のみ（R 入力の≤3％を、実験の過程にわたって変化<20％）を小さく、安定したアクセス性を示すニューロン含む分析にを。
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Representative Results
定義された細胞集団の生物物理学的および生理学的特性への洞察を得るために、我々は、マウスVNO（ - 2 図1）の急性冠状組織切片を行います。切開後、切片は、いくつかの時間氷冷酸素化細胞外溶液（S 2）に保つことができます。記録のセットアップでは、新鮮な酸素化溶液（ 図2D）との一定の交換は、実験を通して、組織の生存率を保証します。ここでは、トランスジェニックマウスモデル（FPR-RS3-I-金星）を採用します。この株の共発現でのVSN FPR-RS3と蛍光マーカータンパク質、感覚ニューロンの定義された人口の光学的識別を可能にするFPR-RS遺伝子ファミリーの原型メンバー（ 図3）。電気生理学的記録は、単一細胞レベルでの詳細な分析のための手段を提供します。例えば、電位依存性電流の分析は、電圧クランプで行われますモード（ 図4A - B）。イオン電流の特定のタイプを単離するために、スライスは電位依存性L型Ca 2+電流（ 図4B）をブロックするための電圧依存性Na +電流 （ 図4A）又はニフェジピンを阻害するようなTTXなどの薬剤で灌流されます。さらに、我々は日常的に活動電位放電パターン（ 図4C）を分析するために電流クランプ構成でホールセル記録を行います。ホールセル記録に加えて、細胞接着型の「ルーズシール」の録音は、細胞内成分（図5A）の透析を防止侵襲性の低い方法を提供します。セル51（ 図5B）の集団を定義した活性化し、記録する活動電位駆動型の短い刺激印加時に容量性電流は、感覚のリガンド（MUPS 例えば、主要な尿蛋白）をスクリーニングするための高感度かつ効率的な方法を提供しています。
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図1：VNO の解剖 。マウス頭部の（A）側面図切歯が切断する位置と角度を例示します。 （B）上口蓋（UP）を取得し、バック剥離するための最良のポイントを描いた腹ビュー。 （C）下顎、切歯および口蓋を除去した後VNOと鋤骨の骨（VB）を保有軟骨カプセル（CC）の上に腹ビュー。 （D）VNOs（D i）を両方の二国間の局在を描いた解剖VNOカプセルの背ビュー。側面図は、両方のVNOsは（D ロ ）を分離する必要が背側の軟骨の縁を示しています。スケールバー= 1ミリメートル（A - D）。517 / 54517fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： チャンバーと顕微鏡のステージを記録する組織の調製、上皮（i）の非感覚の部分で大血管（BV）のコースと位置を説明するためのVNO上の概略側面図。破線は冠状スライス層です。 CCのうち剥離VNO上の側面図は、血管を示している（ⅱ）。厚さ0.1mmの合成繊維（SF）スレッドと有線ステンレス鋼アンカーを用いた溶液で満たされた記録チャンバーの底部に固定された（B）アガロース埋め込 み冠状VNOの組織切片。四角で囲んだ領域は、組織切片を囲むアガロースを示します。 （Cは）アガロース（AG）の位置及び姿勢を示す模式図は、二つの繊維の間に位置する冠状VNOスライスを-embedded。 （D）顕微鏡ステージ上に載置された記録チャンバーの概要。チャンバは、酸素S 2と一定の表面灌流のためのバス・アプリケーション（BA）、灌流鉛筆感覚刺激または薬理学的薬剤を適用する（PP）、アンプのヘッドステージに接続された記録ピペット（RP）、参照電極（REが装備されています）吸引毛細管（SC）は、チャンバ内の溶液の一定の交換を維持します。スケールバー= 1ミリメートル（ⅱ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 冠状VNO TISSUEスライス。（A）共焦点画像（最大突起）が150μm急性冠状VNOの組織切片の鋤鼻感覚上皮内の蛍光FPR-RS3タウ-金星は+ニューロン（緑）の分布を示します。血管（BV）、管腔（L）、感覚上皮（SE）。 （B）FPR-RS3のタウ金星+ニューロンは、管腔の境界でノブのような構造で終わる単一の先端樹状突起を示します。全細胞パッチクランプ記録は、VSNのソーマ、パッチピペット（PP）から行われました。 （C）基底側のソーマを残す細長いデンドライト（D）、細胞体（S）及び軸索（A）の先端の樹状ノブ（K）を持つ単一のVSNの形態。スケールバー、50μmの（A）、10ミクロン（B）、5ミクロン（C）。この図は、52から変更されている。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図4：高速FPR-RS3 +のVSN中のNa +電流を活性化させるTTX-敏感の全細胞パッチクランプ記録から分離された電圧依存性Na + およびCa 2+ 電流だけでなく、スパイク放電 （A）代表トレース。制御条件の下で（ⅰ）電圧ステップ録音（細胞外溶液S 1;細胞内の溶液S 4）が内向き電流電圧依存迅速かつ一過性を明らかにする。 （ⅱ）TTX処理（1μM）が強く電流を減少させます。デジタル減算トレース（コントロール-TTX（ⅲ））レーヴTTX感受性の電位依存性Na +電流をALS。制御およびFPR-RS3 +ニューロンから分離されたTTX敏感なのNa +電流の電流-電圧関係（IV）。 （B）代表のCa 2+電流トレースは（10μMのニフェジピン）の薬理学的に単離しました。段階的に正（Cの i）と負（C iii）の電流注入時に発生する（リバウンド）活動電位の脱/過分極や電車を示す（C）代表電流クランプトレース。 0 pAの電流注入（Cⅱ）で測定された自発的活動に注意してください。 （C 静脈 ）制御とFPR-RS3 +（私は注入 ）注入電流の関数としてのニューロンの発火頻度。発火率の緩やかな増加は、コントロールについても同様ですそして、FPR-RS3 + VSNを。 VSNをが低いピコアンペアが53から56の範囲であっても、現在の注射に絶妙に敏感であることに注意してください。 -I曲線fは 0 pAの電流注入での自発的なスパイク周波数を使用して、「バックグラウンド補正された」ことに注意してください。データは、平均±SEMです。この図は、52から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 基礎のVSNから外「緩いパッチの録音感覚上皮の基底層における記録ピペットを描い急性VNOの組織切片の（A）IR-DIC像。 （B）細胞接続構成における基底VSNの代表元の記録（＆＃39;緩いシール'）プールされた組換え発現された主要な尿蛋白（rMUPs）で刺激（3秒）をブリーフィングするためにスパイクの短い過渡バーストで応答し、それぞれ上昇したカリウム濃度（50 mMの、1秒）、（B i）を 。 （B i）を示す記録の高倍率は、刺激に対する応答（Bⅱ）にスパイクのバーストを示しています。赤いバーは、刺激、刺激間間隔= 30秒、連続記録、中断<1秒（カットマーク//）の時間を示しています。スケールバー=5μmの（A）。パネル（A）は、基準38から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
VNOは、情報化学物質を検出する化学感覚構造です。今日まで、鋤鼻受容体の大多数は、ほんの数の受容体 - リガンド対が同定されているようにdeorphanizedされていません。このうち、V1rb2は、特にMHCペプチドSYFPEITHI 48とSEIDLILGY 58によって活性化されることが、男性特有のフェロモンESP1 57と同様にV2r1bとV2rf2によって活性化されることが、男性の尿フェロモン2-ヘプタノン30、V2rp5によって活性化されることが説明されましたそれぞれ。受容体 - リガンドの関係やシグナル伝達を理解するための前提条件は、ネイティブ環境で定義されたVSN集団の生物物理学的特性の知識です。パッシブとアクティブな膜特性、電位依存性イオンコンダクタンスと活動電位放電パターンは、受容体の神経細胞が刺激を化学感覚に応答する手段と範囲を定義します。電気生理学的急性組織スライスでの録音や、特に、人ル細胞パッチクランプ記録は、非常に詳細でこれらの特性を分析するための優れた方法を提供します。
組織切片における成功と信頼性の生理学的記録のための重要なステップは、準備そのものです。実験を行うために期間を最大にするために、組織はすぐに解剖後にスライスし、氷冷酸素化ソリューションに転送する必要があります。それに続いて、切片を、実験日あたりの細胞のかなりの数のいくつかの時間せる分析のために保持することができます。これは、解剖し、30分未満で1動物の両方VNOsを埋め込むための時間を短縮するために、いくつかの練習が必要です。その後、生存細胞をいくつかの無傷の組織切片を得るために、経験豊富な実験の成功率は十分に75％を上回っています。パッチクランプ記録を実行するのCa 2+イメージングと比較して低スループット実験的アプローチです。しかし、それははるかに高い時間的に単一細胞レベルでの活動のより詳細かつ汎用性の高い分析が可能解決。全細胞構成において、細胞内の培地をピペット液で透析します。ピペット溶液は、正確な細胞質ゾルの組成を反映していないかもしれないが、それは、細胞外および細胞内イオン条件の両方の上に正確に制御して実験を提供します。結果の信頼性の解釈については、アクセス抵抗とリーク電流の連続的な監視が重要です。回では、有意な増加またはアクセス抵抗の強い変化や解釈不可能な結果に電流リードを漏らすので、廃棄するこれらの記録を要求します。また、いくつかの薬理学的化合物が不可逆的に、それは必要に応じて各記録後のスライスを交換するレンダリング結合することに留意することが重要です。
セル接続構成で記録することの細胞内成分の透析を防ぎ、細胞の膜電位に影響を与えません。したがって、この技術は、スクリーニングの低侵襲性と、比較的高速な方法を提供します。しかし、このアプロACHは、一般的に、細胞膜の外側から超閾値活動電位駆動型静電容量電流の記録に限定されています。ルーズパッチ記録をVNOスライス38,54における感覚ニューロンの多数のスパイク挙動を分析するために適していることが証明されています。
ここで使用されるトランスジェニックモデルは、VSNをを表現FPR-RS3の人口を識別し、分析するための信頼性の高いツールを提供します。また、ここに記載の技術にかかわらず、それらの遺伝子型の他の行に拡張することができます。使用可能な回線へのトランスジェニックマウス限界実験を使用して、定義された細胞型を調査する多大な利点にもかかわらず。しかし最近では、対象となるゲノムの編集がより速く、より手頃な価格のCRISPR / Cas9技術59となっています。結論として、急性鋤鼻組織切片における標的パッチクランプ記録は、定義されたpopulatの生物物理学的および生理学的特性を特徴付けるための汎用的なアプローチを提供します感覚ニューロンのイオン。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
- Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
- Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
- Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
- Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
- Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
- Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
- Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
- Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
- Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
- Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
- Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
- Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
- Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
- Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
- Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
- Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
- Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
- Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
- Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
- Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
- Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
- Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
- Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
- Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
- Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
- Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
- Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
- Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
- Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
- Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
- Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
- Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
- Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
- Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
- Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
