Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ

Published: September 10, 2016 doi: 10.3791/54517
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

Introduction

De fleste dyr avhengige av deres kjemiske sanser for å samhandle med sine omgivelser. Luktesansen spiller en avgjørende rolle for å finne og vurdere mat, unngå rovdyr og finne egnede parring samarbeidspartnere. I de fleste pattedyr, luktsystemet består av minst fire anatomisk og funksjonelt distinkte perifere delsystemer: hoved olfaktoriske epitel 1,2, den Grueneberg ganglion 3,4, septal organ for Masera 5,6 og vomeronasal organ. VNO omfatter perifer sensorisk strukturen av tilbehøret luktsystemet (AOS), som spiller en viktig rolle i å oppdage kjemiske signaler som formidler informasjon om identitet, kjønn, sosial rang og seksuell tilstand 7-10. VNO ligger ved foten av neseskilleveggen rett over ganen. I mus, er det en bilateral blind-ending rør innelukket i en kapsel brusk 11-13. Orgelet består av både en halvmåneformet medial sensoriske epitheLium som havner på VSNs og av en ikke-sensorisk del på den laterale side. Mellom begge epithelia ligger noen slimfylte lumen som er koblet til nesehulen via den smale vomeronasal kanalen 14. En stor lateral blodåre i den ikke-sensorisk vev tilveiebringer en vaskulær pumpemekanisme for å lette innføring av forholdsvis store, hovedsakelig ikke-flyktige molekyler slik som peptider eller små proteiner inn i VNO lumen ved undertrykk 15,16. De strukturelle komponenter i VNO er til stede ved fødselen og orgelet når voksen størrelse kort tid før puberteten 17. Men om den gnager AOS er allerede funksjonelle i yngel er fortsatt gjenstand for debatt 18-20.

VSNs utmerker seg ved både sin epithelial plassering og type reseptor de uttrykker. VSNs viser en bipolar morfologi med en unmyelinated axon og en enkel apikal dendrite som stikker mot lumen og ender i en microvillous dendrittiske knott. VSN øksons fasciculate å danne Vomeronasale nerve som forlater brusk kapsel til dorso-caudal slutten, stiger langs septum, passerer cribriform plate og prosjekter til tilbehøret luktelappen (AOB) 21,22. Den Vomeronasale sensorisk epitel består av to lag: den apikale lag ligger nærmere luminal side og havner både V1R- og alle, men en type FPR-rs-uttrykke nevroner. Disse nevronene coexpress G-protein α-subenheten G αi2 og prosjekt til fremre del av AOB 23-25. Sensoriske nevroner lokalisert i de mer basale lag ekspress V2Rs eller FPR-RS1 sammen G αo og sender sine aksoner til bakre region av AOB 26-28.

Vomeronasal nevroner er sannsynlig aktiveres ved ganske små semiochemicals 29-33 (V1Rs) eller proteinforbindelser 34-38 (V2Rs) som skilles ut i ulike kroppsvæsker som urin, spytt og tårevæske 37,39-41 In situ forsøk har vist at VSNs er også aktiveres av formylert peptider og ulike antimikrobielle / betennelse bundet forbindelser 25,42. Videre, heterologt uttrykt FPR-rs-proteiner dele agonist-spektra med FPRs uttrykt i immunsystemet, noe som indikerer en potensiell rolle som detektorer for sykdom i conspecifics eller fordervet mat kilder 25 (se referanse 43).

Grunnleggende for å forstå reseptor-ligand relasjoner og nedstrøms signalkaskader i bestemte VSN populasjoner er en detaljert evaluering av deres grunnleggende biofysiske egenskapene i en innfødt miljø. I det siste, har analysen av cellesignale sterkt nytte av genmodifiserte dyr som markerer en definert populasjon av nevroner ved coexpressing en fluoriserende fargestoff protein 30,44-49. I denne protokollen, en transgen muselinje som uttrykker FPR-RS3 sammen med en fluoriserende fargestoff (FPR-RS3-i-Venus) brukes.Denne tilnærmingen eksemplifiserer hvordan å ansette en slik genmodifisert mus belastning å utføre elektrofysiologisk analyse av en optisk identifiserbar cellepopulasjon ved hjelp av enkelt nervecellen patch-clamp opptak i akutte koronale VNO vev skiver. En lufttrykket drevet multi-fat perfusjon system for sensoriske stimuli og farmakologiske midler gir rask, reversible og focal neuronal stimulering eller hemming under opptak. Hel-celle opptak i skive forberedelsene gi rom for en detaljert analyse av iboende egenskaper, spenningsaktiverte conductances, samt handlings potensielle utslippsmønstre i cellens opprinnelige miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer var i overensstemmelse med lokale og EU-lovgivning om vern av dyr som brukes til eksperimentelle formål (direktiv 86/609 / EØF) og med anbefalinger fremmet av Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Begge C57BL / 6 mus og fpr-RS3-i-Venus mus ble huset i grupper på begge kjønn ved værelsestemperatur på en 12 timers lys / mørke syklus med mat og vann tilgjengelig ad libitum. For eksperimenter unge voksne (6-20 uker) av begge kjønn ble brukt. Ingen åpenbare kjønnsavhengig forskjeller ble observert.

1. Løsning Forberedelse

  1. Fremstille ekstracellulær løsning S 1: 4- (2-hydroksy-etyl) piperazin-1-etansulfonsyre (HEPES) bufret ekstracellulære oppløsning inneholdende (i mM) 145 NaCl, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (innstilt med NaOH); osmolaritet = 300 mOsm (justert med glukose).
  2. Forbered extracellular oppløsningen S 2: Carbogen-oksygenert (95% O 2, 5% CO2) ekstracellulære oppløsning inneholdende (i mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 BES; pH = 7,3; osmolaritet = 300 mOsm (justert med glukose).
  3. Fremstille 4% lav-geleringstemperatur agarose-oppløsning (S 3) for vev innstøping: 4% lav-geleringstemperatur agarose. Oppløs 2 g lav-geldannende agarose i 50 ml S 1 i en 100 ml glassflaske laboratorium sammen med en magnetrører. Å smelte agarose, satte flasken i et vannbad (med lokket ikke tett lukket) ved 70 ° C i ca 20 minutter eller inntil oppløsning blir gjennomsiktig under omrøring. Kjøle seg ned og holde smeltet agarose i en andre vannbad ved 42 ° C inntil videre anvendelse.
  4. Fremstille intracellulær løsning S 4: Pipette oppløsning inneholdende (i mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (fritt Ca2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, en NaGTP;pH = 7,1 (justert med KOH); osmolaritet = 290 mOsm.
  5. Endre / tilpasse sammensetningen av S 1, S 2 og S-4 i henhold til individuell eksperimentell design (f.eks farmakologiske stopper for å isolere visse typer spenningsaktiverte strøm).

2. Arbeidsområde Forberedelse

  1. Fyll oksygen skive lagringskammeret med S-2 i minst 30 min før disseksjon, sted på is i temperatur og pH-justering og oksygenatom oppløsning kontinuerlig.
  2. Fyll reservoaret for skive superfusjons ved opptak oppsett med S 2 og oxygenate kontinuerlig.
  3. Før disseksjon, fyll vibratome kammer med S 2 og ordne knust is rundt kammeret. Alternativt overføre ledig iskald oksygenert løsning fra oksygenkammer inn vibratome kammer og holde oksygennivået kontinuerlig.
  4. Ordne kirurgiske verktøy og forbruksmateriell.
  5. Plasser is Gelpack henhold dissekeremikroskop, dekk med et papirhåndkle for å hindre VNO vev fra å fryse i bunnen av fatet.
  6. Clean barberblad ved kort skylling i 70% etanol og destillert vann og montere til vibratome. Erstatt for hver slicing økt.

3. VNO Dissection og Inkludering

  1. Sacrifice animalske kort eksponering til CO 2 og halshogge bruker skarpe kirurgiske sakser. Merk: Etter hvert som tiden fra å ofre dyret på å gi VNO kapselen på is er kritisk, minimere tiden til mindre enn 2 min. For å opprettholde vev levedyktighet, legge inn både fullt preparat VNOs i agarose i mindre enn 30 min.
  2. Fjern den nedre kjeve med store kirurgiske sakser. Skriv inn gjennom munnhulen og kutte kjeven bein og muskler av hver side.
  3. Plasser den resterende del av hodet opp ned i store Petri-skålen.
  4. Trekke bort huden på den øvre kjeve og rundt spissen av nesen med middels tang for å oppnå bedre adgang tilfortenner.
  5. Bruk bein saks til å klippe bort den største delen av fortennene på en ~ 45 ° vinkel i rostral retning (figur 1A). Dette vil lette fjerningen av VNO kapselen fra nesehulen.
    Merk: Ikke kutt til roten av tannen for å forhindre skade på spissen av VNO kapsel.
  6. Grab den stive øvre gane på sitt rostralt del med middels pinsett og forsiktig skrelle tilbake i ett stykke med en flat vinkel (figur 1B).
    Merk: Gjentatte skyll med iskald S 2.
  7. Bruk mikro våren saks for å klippe den benete fusjon mellom tuppen av vomer bein og kjeven. Sett sakse tips med den buede delen av spissen pekende utover unna VNO og nøye kutte beinet i små skritt på både venstre og høyre side lateral til VNO kapsel.
  8. For å fjerne VNO kapsel, bruker mikro våren saks til å skjære gjennom vomer bein på haledelen og løft den vomer bein ut av nasal hulrom ved hjelp av mellom tang. Umiddelbart overføre VNO til en liten petriskål under et stereomikroskop på et isblandet Gelpack hvor de gjenværende trinn i disseksjon vil bli utført.
  9. Skyll VNO i en liten mengde av iskald S 2 for å hindre at vevet fra å tørke ut.
  10. Skill brusk kapsler som inneholder VNO bløtvev ved å gripe bak på vomer bein med middels tang. Plasser kapselen for en dorsal visning slik at en splittelse mellom begge VNOs blir synlig (figur 1D i).
  11. Bruk tuppen av fine pinsett for å skille både brusk VNO kapsler fra det sentrale ben mens du holder vomer bein låste ned på den bakre delen.
    Merk: Bruk pinsett bare på kanten av brusk kapsel og være svært forsiktig med å stikke hull gjennom brusken som delikat sensorisk epitel blir lett skadet.
  12. Når de to VNOs er skilt, begynne å fjerne brusk innkapsle first VNO.
  13. Gripe den øverste kant av kapselen med en fin pinsett og splitte bort brusk veggen som tidligere var festet til vomer ben (mediale side).
  14. For å fjerne gjenværende brusk snu VNO med sin buede sideveis side til bunnen av fatet og sikkert peke ut brusken på den ene side ved hjelp av tang. Nøye bevege den andre fin pinsett fra baksiden ved en meget flat vinkel mellom brusk og VNO for å løsne forbindelsen mellom vev og brusk.
  15. Sakte skrelle VNO bort fra brusk ved å holde det på sitt halespissen, for å unngå skade på sensorisk epitel.
  16. Når VNO innbrudd fra kapselen, sørg for å fjerne alle gjenværende små bruskdeler som eventuelle gjenværende biter av brusk vil ta av vev fra omkringliggende agarose under skjæreprosessen.
  17. Plasser en liten dråpe iskald S 2 i første preparat VNO for å hindre skade på vev. En stor blodåre på den laterale side will blir synlige som indikerer at organet er fortsatt intakt og er ikke grovt skadet under disseksjon (figur 2A ii). I tilfelle blodåren ble skadet, vil det likevel være verdt å fortsette med oppstykking av VNO så lenge som den generelle morfologi ikke var tydelig svekket.
  18. Umiddelbart dissekere andre VNO.
  19. For å bygge inn VNOs, fylle både små petriskåler til randen med smeltet S 3 (lagret i vannbad ved 42 ° C, se 1.3).
  20. Hold VNO på den bredere hale enden med fine tang for å unngå skade på sensorisk epitel.
  21. Dyppe VNO i agarose og bevege den horisontalt frem og tilbake flere ganger for å fjerne filmen av ekstracellulær løsning samt eventuelle luftbobler fra overflaten.
  22. Plasser VNO vertikalt med halespissen mot bunnen av fatet. I stedet for å knipe VNO med pinsett direkte, justere orientering ved å flytte tang spissen i nærheten Proximity til VNO.
    Merk: Orientering ved innstøping er avgjørende fordi den avgjør skive flyet og tilgjengelighet til sensoriske nevroner under forsøket.
  23. Plasser retter på gel ispose og vente til agarose har stivnet.
    Merk: Ikke endre VNO orientering når agarose har begynt å størkne som dette vil ta av vev fra omkringliggende agarose.

4. Koronale VNO Tissue Kutting

  1. Bruk liten slikkepott til å fjerne agarose blokk fra den lille fatet i lokket på en stor petriskål, snu agarose opp ned forlate halespissen av VNO vendt oppover.
  2. Skjær blokken inn i en pyramideform ved anvendelse av en kirurgisk skalpell (3-4 mm ved tuppen, 8-10 mm i bunnen). Vær forsiktig så du ikke skader den innebygde vev.
  3. Bruk superlim for å fikse den pyramideformede blokk til midten av vibratome prøveplaten og vente ~ 1 min for limet tørke helt.
  4. Overfør prøveplaten til kutting cHamber og forberede andre VNO, tilsvarende. Hold plate med den andre prøven ved 4 ° C inntil bruk.
  5. Bruk en vibrerende blad mikrotom med følgende innstillinger: tykkelse: 150-200 nm; hastighet: 3,5 au = 0,15 mm / sek; frekvens: 7,5 au = 75 Hz. Overfør skiver til oksygenkammer til bruk etter kort inspeksjon skive morfologi under dissekere mikroskop. Slices kan oppbevares i flere timer.

5. Single-celleElektro Recordings

  1. For opptak, bruker en oppreist fast scene mikroskop utstyrt med vann nedsenking mål, Dodt eller infrarød differensial forstyrre kontrast (IR-DIC), og epi-fluorescens samt et avkjølt CCD-kamera. For datainnsamling, bruk en patch-clamp forsterker, hode scenen, AD / DA grensesnittkort og en PC (inkludert innspillingen programvare).
  2. Forbered en aksje på 10-20 patch pipetter (4-7 mÊ). Trekk pipetter fra borsilikatglass kapillærer (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) øga mikropipette avtrekker og brann-polish med en microforge.
    Merk: Brann polering pipettespissene er avgjørende når patching de ganske små VSNs. Dette vil bidra til å hindre brudd i cellemembranen ved påføring av negativt trykk for å oppnå en høy motstand tetning. Etter polering pipetten åpningen skal være omtrent 1 mikrometer.
  3. Hold pipetter i en pipette lagring krukke å hindre skader og oppsamling av støv inntil bruk.
  4. Forbered perfusjon system ved å fylle løsnings reservoarer og rør i henhold til eksperimentell design.
    Merk: Fjern luftbobler fra tubing helt som de vil sterkt påvirke elektrofysiologiske opptak.
  5. Juster trykk for å oppnå 3 ~ ml / min strømning.
    Merk: Høyt trykk vil føre til bevegelse av vevet skive samt avslutning av elektrofysiologiske opptak.
  6. Overfør VNO skive til bildebehandling kammeret og fikse skive posisjon ved hjelp av rustfritt stål anker kablet med 0,1 mm tykk synthetic fibre (figur 2B - C).
    Merk: Ikke dekk vevet skive med en av de syntetiske fibertråder men heller agarose rundt skive.
  7. Overføring bildebehandling kammer til innspilling oppsett og kontinuerlig superfuse skive med oksygenrikt S 2 ved romtemperatur via et bad søknad.
  8. Justere suge kapillær til overflaten av løsningen for å skape en langsom suge for konstant utveksling av badløsning. Juster 8-i-en multi-barrel "perfusjon blyant" ovenfor og i nærheten av den ikke-sensoriske del av VNO skive som inneholder blodkaret (figur 2C, 3A) 50. Det vil være gunstig å arrangere perfusjon blyant og opptak pipette å være vendt mot skive fra motsatte retninger.
  9. Koble referanseelektrode og bad oppløsning ved hjelp av en L-formet agar bro (fylt med 150 mM KCI).
  10. Fyll patch pipette med pipette løsning S 4.
  11. Monter pipetten over sølvklorid-belagt patch elektrode koblet til hodet scenen uten å skrape av belegget og fest godt.
  12. Påfør svakt positivt trykk (ca. 1 ml på en 10 ml plastsprøyte) til lappen pipette før vi går i badekaret.
  13. Senk pipette i badekaret ved hjelp av mikro manipulatorer langt nok til å være i stand til å senke målet uten å treffe den (figur 2D).
  14. Monitor pipette motstand (R pip, mellom 4-7 Megohm) ved hjelp av elektro programvare koblet til hodet scenen.
    Merk: Hvis R pip er <4 Megohm glasset tips er brutt. Hvis R pip er> 10 Megohm, spissen er mest sannsynlig tett og pipette må skiftes ut.
  15. Visual VNO skive med en CCD-kamera med infrarødt-optimalisert differensial interferens kontrast (DIC) og identifisere FPR-RS3-i-Venus uttrykke celler (eller tilsvarende merket nevroner) med fluorescens belysningog et passende filter kube.
  16. Fokus og mål fluorescerende eller ikke-fluorescerende celler avhengig av eksperimentell design.
  17. Å nærme cellen kroppen, bruke hånd hjul for maksimal følsomhet. På grunn av overtrykk, blir en liten bulk i cellen soma membran synlig når pipettespissen er i umiddelbar nærhet.
  18. Frigjøre overtrykk og anvende svakt undertrykk for å suge i cellemembranen for å oppnå en høy motstand tetning (1-20 GΩ). Anvende kort og lett sug for å forstyrre cellemembranen og etablere helcelle-konfigurasjon.
  19. Overvåk tilgang motstand konstant under forsøket.
    Merk: Bare ta nevroner utviser liten og stabil tilgang motstand (≤3% av R-inngang, endring <20% i løpet av eksperimentet) i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å få innsikt i biofysiske og fysiologiske egenskaper av definerte cellepopulasjoner, utfører vi akutte koronale vev skiver av musen VNO (Figur 1-2). Etter disseksjon, kan skiver holdes i iskald oksygenert ekstracellulær løsning (S 2) i flere timer. Ved opptak oppsett, en konstant utveksling med friskt oksygenrikt oppløsning (figur 2D) sikrer vev levedyktighet gjennom hele eksperimentet. Vi her ansette en transgen musemodell (FPR-RS3-i-Venus). VSNs i denne stammen coexpress et fluoriserende fargestoff protein med FPR-RS3, en prototypiske medlem av FPR-rs genet familien (figur 3) som gjør det mulig optisk identifikasjon av en definert populasjon av sensoriske nerveceller. Elektro innspillinger gi midlene for dybdeanalyse på enkeltcellenivå. For eksempel, er utført analyse av spenningsstyrte strømmer i spenningsklemmenmodus (Figur 4A - B). For å isolere bestemte typer ioniske strøm, blir skiver superfuseres med farmakologiske midler slik som TTX for å hemme spenningsstyrte Na + strømmer (figur 4A) eller nifedipin for å blokkere de spenningsstyrte L-type Ca2 + strømmer (figur 4B). Videre har vi rutinemessig utføre hel-celle opptak i gjeldende klemme konfigurasjon for å analysere handlings potensielle utslippsmønstre (Figur 4C). I tillegg til hel-celle opptak, celle-attached "løs-sel 'innspillinger gi en mindre invasiv metode som hindrer dialyse av intracellulære komponenter (figur 5A). Opptak aksjonspotensial-drevet kapasitive strømmer på kort stimulans program tilbyr en sensitiv og effektiv måte å screene for sensoriske ligander (f.eks store urinproteiner; MUPs) som aktiverer definerte populasjoner av celler 51 (figur 5B).

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 1
Figur 1: Disseksjon av VNO. (A) fra siden på musen hodet for å illustrere stillingen og vinkelen ved hvilken fortenner er kuttet. (B) Ventral visning som viser det beste utgangspunktet for å fange og skrelle tilbake den øvre gane (UP). (C) Ventralt utsikt mot brusk kapsel (CC) som havner VNO og vomer bein (VB) etter fjerning underkjeven, fortenner og gane. (D) Dorsal utsikt over dissekert VNO kapsel som viser bilateral lokalisering av både VNOs (D i). Den sideriss illustrerer kanten av brusk på dorsalsiden hvor både VNOs trenger å bli separert (D ii). Scale bar = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Vevpreparering, opptakskammeret og objektbord skjematisk sideriss av en VNO for å illustrere den kurs og stilling av de store blodkar (BV) i den ikke-sensoriske del av epitelet (A i). Den stiplede linjen representerer den koronale slicing laget. Lateral visning på en VNO skrelles ut av CC viser blodåre (A ii). (B) Agarose-innleiret koronale VNO vev skive festet til bunnen av oppløsningen fylt opptakskammeret ved hjelp av en rustfri stålanker kablet med 0,1 mm tykk syntetisk fiber (SF) tråder. Den eske området viser agarose omliggende vevet skive. (C) Skjematisk oversikt som viser posisjon og orientering av en agarose (Ag) -embedded koronale VNO skive plassert mellom to fibre. (D) Oversikt over opptakskammeret plassert på mikroskoptrinnet. Kammeret er utstyrt med bad søknad (BA) for konstant superfusjons med oksygenert S 2, perfusjonen blyant (PP) for å søke sensoriske stimuli eller farmakologiske midler, innspillings Pipette (Rp) koblet til forsterkerhodet trinnet, referanseelektroden (RE ) og suge kapillar (SC) for å opprettholde en konstant utveksling av oppløsning i kammeret. Scale bar = 1 mm (A ii). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: koronale VNO tissue skive. (A) Confocal image (maks projeksjon) av en 150 mikrometer akutt koronale VNO vev slice som viser fordelingen av fluorescerende FPR-RS3 tau-Venus + nevroner (grønn) i Vomeronasale sensorisk epitel. Blodkar (BV), et hulrom (L), sensorisk epitel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + nevroner viser en enkelt apikal dendrite ender i en knott-lignende struktur på luminal grensen. Hel-celle patch-clamp opptakene ble utført fra VSN soma, patch pipette (PP). (C) Morfologi av en enkelt VSN med dendrittiske knott (K) på tuppen av den lange og smale dendritt (D), celle soma (S) og axon (A) som forlater soma på basal side. Skala barer, 50 um (A), 10 mm (B), 5 um (C). Dette tallet har blitt forandret fra 52. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Isolert spenningsstyrte Na + og Ca 2+ strømninger samt spike utslipp (A) Representative spor fra hel-celle patch-clamp opptak av en TTX-sensitive rask aktivering av Na + strøm i FPR-RS3 + VSNs.. (A i) Spenning trinn opptak i henhold til kontrollbetingelser (ekstracellulær løsning S 1; intracellulære løsning S 4) avslører en spenningsavhengig rask og forbigående innover strøm. (A ii) TTX-behandling (1 uM) sterkt minsker strømmen. Digitalt trukket spor (kontroll-TTX (A iii)) reveals den TTX-sensitive de spenningsstyrte Na + strøm. Nåværende spenning forhold TTX-sensitive Na + strømmer isolert fra kontroll- og FPR-RS3 + nevroner (A iv). (B) Representant Ca 2+ nåværende spor isolert farmakologisk (10 mikrometer nifedipin). (C) Representative nåværende klemme spor som viser de- / hyperpolarisering og rekker (rebound) aksjonspotensialer som genereres ved trinnvis positive (C i) og negativ (C iii) gjeldende injeksjon. Legg merke til spontan aktivitet målt ved 0 pA strøm injeksjon (C ii). (C iv) avfyringsfrekvens av kontroll og FPR-RS3 + neuroner som en funksjon av den injiserte strøm (I injiserer). Den gradvise økning i avfyringshastigheten er lik for kontrollog FPR-RS3 + VSNs. Merk at VSNs er utsøkt følsom for nåværende injeksjoner selv i lave picoamperes varierer 53-56. Legg merke til at f -I kurver har blitt "background-korrigert" ved hjelp av spontane spiking frekvens på 0 pA nåværende injeksjon. Dataene er midler ± SEM. Dette tallet har blitt forandret fra 52. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: ekstracellulære 'løs lapp' innspillinger fra basal VSNs (A) IR-DIC bilde av en akutt VNO vev slice viser opptaket pipette i basal laget av sensorisk epitel.. (B) Representant originale innspillingen av en basal VSN i cellen festet konfigurasjon (&# 39; løs-segl ') reagerer med korte forbigående pakker med pigger til kort stimulering (3 sek) med sammenslåtte rekombinant uttrykte store urin proteiner (rMUPs) og en forhøyet kaliumkonsentrasjonen (50 mm, 1 sek), henholdsvis (B i) . Høyere forstørrelse av opptak vist i (B i) illustrerer utbrudd av toppene i respons til stimulering (B ii). Røde søylene angir tidspunktet for stimulering, inter-stimulus intervall = 30 sek, kontinuerlig opptak, avbrytelser <1 sek (snittkarakter //). Målestokk = 5 um (A). Panel (A) har blitt modifisert fra referanse 38. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VNO er ​​en chemosensory struktur som oppdager semiochemicals. Til dags dato, forblir de fleste vomeronasal reseptorer som skal deorphanized som bare få reseptor-ligand-par er blitt identifisert. Blant disse V1rb2 ble beskrevet å være spesielt aktiveres av mannlig urin feromon 2-heptanon 30, V2rp5 for å bli aktivert av den mannlige spesifikk feromon ESP1 57 samt V2r1b og V2rf2 å bli aktivert av MHC peptidene SYFPEITHI 48 og SEIDLILGY 58, henholdsvis. En forutsetning for å forstå reseptor-ligand relasjoner og signaltransduksjon er kunnskap om de biofysiske egenskapene til definerte VSN populasjoner i en innfødt miljø. Passive og aktive membranegenskaper, spenningsstyrte ioniske conductances og handlingspotensial utslippsmønstre definere midler og i hvilken grad reseptor nerveceller reagerer på chemosensory stimuli. Elektro opptak i akutte vev skiver og, spesielt, somle-celle patch-clamp opptak gir en utmerket metode for å analysere disse egenskapene i stor detalj.

Et kritisk punkt for vellykket og pålitelig fysiologiske opptak i vevssnitt er selve preparatet. For å maksimere tidsrom til å utføre eksperimenter, må vevet skiver og overført til iskald oksygenrikt løsning umiddelbart etter disseksjon. Etter det, kan skiver holdes i flere timer å tillate analyse av et stort antall celler pr eksperimentelle dag. Det tar litt øvelse for å redusere tid til å dissekere og legge begge VNOs av ett dyr i mindre enn 30 min. Etter det, er suksessraten for en erfaren eksperimentator å få flere intakte vevssnitt med levedyktige celler godt over 75%. Utføre patch-clamp opptak er en lav-throughput eksperimentell tilnærming i forhold til Ca 2+ bildebehandling. Likevel, det gir en mer detaljert og allsidig analyse av aktivitet på encellede nivå med en mye høyere timeoppløsning. I det hel-celle-konfigurasjon, blir den intracellulære medium dialyserte av pipetten oppløsning. Mens pipetten løsningen kanskje ikke reflekterer den nøyaktige cytosolic sammensetning, gir det eksperimentator med nøyaktig kontroll over begge ekstra og intracellulære ioniske forhold. For pålitelig tolkning av resultater, er kontinuerlig overvåking av adgangs motstand og lekkstrøm avgjørende. Til tider, en betydelig økning eller sterk endring i tilgangen motstand eller lekkasje nåværende fører til uninterpretable resultater og dermed krever disse innspillingene som skal kastes. Videre er det viktig å merke seg at noen farmakologiske forbindelser som binder irreversibelt som gjør det nødvendig å skifte ut skiver etter hvert opptak.

Opptak i cellen tilkoblet konfigurasjon forhindrer dialyse av intracellulære komponenter og ikke påvirker cellenes membranpotensialet. Således tilveiebringer denne teknikken en mindre invasiv og forholdsvis rask måte for screening. Men dette approACH blir generelt begrenset til opptak av super-terskel aksjonspotensial-drevet kapasitive strømmer fra utsiden av cellemembranen. Loose-patch opptak har vist seg å være egnet for å analysere spiking virkemåten av et større antall sensoriske nevroner i VNO skiver 38,54.

Den transgene modellen ansatt her gir et pålitelig verktøy for å identifisere og analysere befolkningen i FPR-RS3 uttrykker VSNs. Dessuten kan teknikken beskrevet her bli utvidet til andre linjer uavhengig av deres genotype. Til tross for den enorme fordelen av å undersøke en definert celletype, ved hjelp av transgene mus begrenser forsøkene til de tilgjengelige linjene. Nylig har imidlertid målrettet genom redigering blir raskere og rimeligere med CRISPR / Cas9 teknikk 59. I konklusjonen, målrettet patch-clamp opptak i akutte Vomeronasale vevssnitt gi en allsidig tilnærming til karakter biofysiske og fysiologiske egenskapene til et definert population av sensoriske nerveceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature) PeqLab 35-2030
ATP (Mg-ATP) Sigma-Aldrich A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) Sigma-Aldrich B9879
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Glucose Sigma-Aldrich G8270
GTP (Na-GTP) Sigma-Aldrich 51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 03564
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mm VWR decapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mm VWR lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissor Fine Science Tools decapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissors Fine Science Tools cutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2 Fine Science Tools removing skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades  Fine Science Tools cutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 Fine Science Tools dissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatula Fine Science Tools handling agarose block and tissue slices
Surgical scalpel cutting agarose block into pyramidal shape
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amplifier HEKA Elektronik EPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) Science Products
CCD-camera Leica Microsystems DFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 Leica Microsystems I3
Fluorescence lamp Leica Microsystems EL6000
Hot plate magnetic stirrer Snijders 34532
Microforge  Narishige MF-830
Micromanipulator Device  Luigs & Neumann SM-5
Micropipette puller, vertical two-step Narishige PC-10 
Microscope Leica Microsystems CSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) Quest Scientific
Objective  Leica Microsystems HCX APO L20x/1.00 W
Oscilloscope Tektronik TDS 1001B
Osmometer  Gonotec Osmomat 030
Perfusion system 8-in-1 AutoMate Scientific
pH Meter five easy Mettler Toledo
Pipette storage jar World Precision Instruments e212
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Razor blades Wilkinson Sword GmbH Wilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) custom-made
Stereo microscope Leica Microsystems S4E
Trigger interface  HEKA Elektronik TIB-14 S
Vibratome  Leica Microsystems VT 1000 S
Water bath  Memmert WNB 45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Tags

Neuroscience Vomeronasal organ luktesans akutt slice forberedelse patch-clamp elektrofysiologi sensoriske nevroner formyl peptid reseptor
Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M.… More

Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ. J. Vis. Exp. (115), e54517, doi:10.3791/54517 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter