Introduction
Большинство животных в значительной степени зависят от их химических чувств, чтобы взаимодействовать с окружающей средой. Обоняние играет существенную роль в поиске и оценке пищи, избегая хищников и поиск подходящих брачных партнеров. У большинства млекопитающих, обонятельная система состоит из по меньшей мере четырех анатомически и функционально различных периферийных подсистем: основной обонятельный эпителий 1,2, в Грюнеберг ганглии 3,4, септального органа MASERA 5,6 и вомероназального органа. ВНО включает периферическую сенсорную структуру вспомогательной обонятельной системы (АОС), которая играет важную роль в выявлении химические сигналы , которые передают информацию о личности, пола, социального положения и сексуального состояния 7-10. ВНО расположен у основания носовой перегородки, прямо над неба. У мышей, это двусторонний слеп окончание трубки , заключенный в хрящевую капсулу 11-13. Орган состоит как серповидным медиальной сенсорной epitheлиево, что таит в VSNs и не-сенсорной части на боковой стороне. Между обоими эпителий лежит слизистая заполненный просвет , который соединен с носовой полостью через узкий сошниково трубопровод 14. Большой боковой кровеносный сосуд в несенсорных ткани обеспечивает сосудистый насосный механизм для облегчения ввода относительно крупных, в основном нелетучих молекул , таких как пептиды или небольшие белки в просвет ВНО через отрицательное давление 15,16. Структурные компоненты ВНО присутствуют при рождении и орган достигает взрослого размера незадолго до полового созревания 17. Тем не менее, является ли грызун AOS уже функционирующий в несовершеннолетних все еще является предметом для обсуждения 18-20.
VSNs отличаются как их эпителиальной местоположения и типа рецепторов они выражают. VSNs показывают биполярную морфологию с немиелинизированных аксона и одного верхушечного дендрита, который выступает в направлении просвета и заканчивается в microvillous дендритных ручки. ВСН топорДополнения , чтобы сформировать расположенный пучком вомероназальный нерв , который покидает хрящевую капсулу в дорсо-каудального конца, восходит по перегородке, проходит решетчатой пластины и проекты к вспомогательной обонятельной луковице (АОВ) 21,22. Вомероназального чувствующий эпителий состоит из двух слоев: верхушечный слой расположен ближе к стороне просвету и гаваней как V1R- и все, кроме одного типа РСП-RS-экспрессирующих нейронов. Эти нейроны coexpress G-белок α-субъединицы G αi2 и проект в передней части АОБ 23-25. Чувствительные нейроны , расположенные в более базального слоя экспресс V2Rs или РСП-RS1 наряду с G αo и отправить свои аксоны в задней области АОБ 26-28.
Вомероназальные нейроны, вероятно , активируются сравнительно небольшими semiochemicals 29-33 (V1Rs) или белковыми соединениями 34-38 (V2Rs), которые секретируются в различных телесных жидкостей , таких как моча, слюна и слезной жидкости 37,39-41 В экспериментов на месте показали , что VSNs также активируются формилируют пептидов и различных антимикробных / воспаление-сшитый соединений 25,42. Кроме того, гетерологично выразили FPR-RS белки имеют агонистических спектры с FPRs выраженными в иммунной системе, что указывает на потенциальную роль в качестве детекторов для болезни в конспецификов или испорченными источников пищи 25 (см ссылку 43).
Фундаментальный для понимания рецептор-лиганд отношения и вниз по течению сигнальных каскадов в конкретных группах населения ВСН является детальная оценка их основных биофизических характеристик в родной среде. В прошлом, анализ клеточной сигнализации значительно извлек выгоду из генетически модифицированных животных , которые отмечают определенную популяцию нейронов путем совместной экспрессии флуоресцентного белка в качестве маркера 30,44-49. В этом протоколе, трансгенная линия мышь, которая выражает FPR-RS3 вместе с флуоресцентным маркером (FPR-RS3-я-Венера) используется.Такой подход иллюстрирует, как использовать такой генетически модифицированный штамм мыши, чтобы выполнить электрофизиологических анализ оптически идентифицируемой популяции клеток с использованием одного нейрона записи патч-зажим в острых корональных срезов ткани ВНО. Воздуха под давлением управляемый мульти-ствольной системы перфузии для сенсорных стимулов и фармакологических агентов позволяет быстро, обратимо и фокусного нейронную стимуляцию или торможение во время записи. записи цельноклеточная в срезами препаратов позволяют детальный анализ внутренних свойств, проводимостей напряжения активированные, а также действий потенциальных моделей разряда в родной среде клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были в соответствии с местным и Европейским Союзом законодательства о защите животных, используемых для экспериментальных целей (Директива 86/609 / EEC) и с рекомендациями, выдвинутое Европейской федерации лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA). Оба мышей C57BL / 6 и у мышей Fpr-RS3-I-Венера были размещены в группах обоих полов при комнатной температуре на 12 ч цикле свет / темнота с пищей и водой , доступными по желанию. Для экспериментов были использованы молодые люди (6-20 недель) или другого пола. Не наблюдалось никаких явных гендерных различий зависит.
1. Получение раствора
- Готовят внеклеточный раствор S 1: 4- (2-гидрокси-этил) пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) буферным внеклеточный раствор , содержащий (в мМ) 145 NaCl, 5 KCl, CaCl 2 , 1, 1 MgCl 2, 10 HEPES; рН = 7,3 (регулируют при добавлении NaOH); осмолярность = 300 мОсм (скорректированная с глюкозой).
- Подготовка extracelluLAR решение S 2: карбогена-окисленный (95% O 2, 5% СО 2) внеклеточный раствор , содержащий (в мМ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, CaCl 2 , 1, 1 MgSO 4, 5 БЭС; рН = 7,3; осмолярность = 300 мОсм (скорректированная с глюкозой).
- Готовят 4% раствор температура агарозы с низкой желирующего (S 3) для вложения ткани: 4% низкой температуры желирующий агарозы. Растворить 2 г с низким желирующий агарозы в 50 мл S 1 в 100 мл стеклянный флакон вместе лаборатории с помощью магнитной мешалки. Для расплавления агарозы, поставил бутылку на водяной бане (с крышкой не плотно закрытой) при 70 ° С в течение приблизительно 20 мин, или пока раствор станет прозрачным при перемешивании. Охладить и держать расплавленную агарозу во второй водяной бане при температуре 42 ° С до дальнейшего использования.
- Приготовьте внутриклеточных решение S 4: Пипетка раствор , содержащий (в мМ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (свободный Ca 2+ = 110 нМ), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;рН = 7,1 (регулируют при добавлении KOH); осмолярность = 290 мОсм.
- Изменить / отрегулировать состав S 1, S 2 и S 4 в соответствии с индивидуальной опытно - конструкторских (например, фармакологические блокаторы выделить определенные типы напряжения активируемых токов).
2. Подготовка рабочего пространства
- Заполните оксигенировать ломтик хранения камеры с S 2 , по меньшей мере за 30 мин до рассечения, место на льду для температуры и рН перестройки и кислородсодержащих соединений раствора непрерывно.
- Заполните резервуар для среза суперфузии при записи установки с S 2 и непрерывно оксигенации.
- Перед вскрытием, заполнить vibratome камеру с S 2 и организовать дробленый лед вокруг камеры. В качестве альтернативы, передача запасной лед холодный окисленный раствор из оксигенировать камеры в vibratome камеру и держать непрерывно оксигенировать.
- Упорядочить хирургические инструменты и расходные материалы.
- Поместите лед пакет геля под рассекаетмикроскоп, крышка с бумажным полотенцем, чтобы предотвратить ВНО ткани от замерзания до нижней части блюда.
- Чистый лезвие бритвы коротким полоскание в 70% этаноле и дистиллированной воды и смонтировать на vibratome. Заменить на каждой сессии нарезания.
3. ВНО Вскрытие и встраивание
- Жертвоприношение животных путем кратковременного воздействия СО 2 и обезглавить с помощью острых хирургических ножниц. Примечание: Поскольку время от ущерба животному положить капсулу VNO на льду имеет решающее значение, минимизировать время до менее чем за 2 мин. Для поддержания жизнеспособности тканей, встраивать как полностью расчленены ВНО в агарозе менее чем за 30 мин.
- Снимите нижнюю челюсть с большими хирургическими ножницами. Введите через полость рта и вырезать кости нижней челюсти и мышцы каждой из сторон по отдельности.
- Поместите оставшуюся часть головы с ног на голову в большую чашку Петри.
- Отодвигать кожу верхней челюсти и вокруг кончика носа со средними щипцами, чтобы получить более широкий доступ крезцы.
- Используйте кости ножницы , чтобы отрезать большую часть резцами при ~ 45 ° угол в ростральной направлении (рис 1А). Это облегчит удаление капсулы VNO из носовой полости.
Примечание: Не обрезать до корня зуба, чтобы предотвратить повреждение кончика капсулы ВНО. - Возьмите жесткую верхнего нёба на своей ростральной части со средними пинцетом и аккуратно отогните в одной части на плоском угле (рис 1B).
Примечание: Несколько раз промыть охлажденной льдом S 2. - С помощью микро пружинные ножницы, чтобы разрезать костную слияние между наконечником сошника кости и челюсти. Вставьте ножничные наконечники с изогнутой частью наконечника направлены наружу от ВНО и аккуратно вырезать кости небольшими шагами на левой и правой стороны сбоку по отношению к капсуле ВНО.
- Чтобы удалить капсулу ВНО, использовать микро пружинные ножницы, чтобы вырезать через сошника кости в хвостовой части и осторожно поднимите уотег кость из пASAL полости с использованием средних щипцов. Немедленно передать ВНО в небольшую чашку Петри под микроскопом стерео на упаковке льда геля, где будет выполняться остальные шаги рассечение.
- Промыть ВНО в небольшом количестве охлажденного льдом S 2 , чтобы предотвратить ткани от высыхания.
- Отдельные хрящевые капсулы, которые содержат мягкие ткани ВНО, захватывая заднюю часть сошника кости со средними щипцами. Поместите капсулу для спинной , так что раскол между обоими ВНО становится видимым (рис 1D я).
- Используйте кончик тонких щипцов для разделения обоих хрящу ВНО капсулы из центральной кости при сохранении сошника кости скована в задней части.
Примечание: Используйте пинцет только на краю капсулы хряща и быть очень осторожным, чтобы не проколоть через хрящ, как хрупкое чувствующий эпителий легко повреждается. - После того, как два ВНО разделены, начать удаление хрящей, инкапсулирующего пихтыт ВНО.
- Возьмите верхний край капсулы с одним тонким пинцетом и откололись хрящевой стенки, который ранее был прикреплен к уотег кости (медиальная сторона).
- Для того, чтобы удалить остатки хрящей превратить ВНО с изогнутой боковой стороной к нижней части блюда и надежно придавить хрящ на одной стороне с помощью щипцов. Аккуратно перенести второй тонкий пинцет с задней стороны при очень плоском углу между хрящом и VNO, чтобы ослабить соединение между тканью и хрящом.
- Медленно снимите ВНО от хряща, держа его на своем каудальном конце, чтобы избежать повреждения чувствительного эпителия.
- После того, как ВНО будет рычажная из капсулы, убедитесь, чтобы удалить все оставшиеся мелкие детали хрящей, как все оставшиеся кусочки хряща отделится ткани от окружающих агарозы в процессе нарезания.
- Поместите небольшую каплю ледяной S 2 на первом расчлененным ВНО , чтобы предотвратить повреждение тканей. Большой кровеносный сосуд на боковой стороне Вильл становятся видимыми указывая , что этот орган до сих пор нетронутыми и не был сильно поврежден во время рассечения (рис 2А II). В случае, если кровеносный сосуд получил повреждения, он по-прежнему будет целесообразно вести с нарезка ВНО тех пор, пока общая морфология не было явно нарушено.
- Немедленно рассекают второй ВНО.
- Чтобы встроить ВНО, заполнить как небольшие чашки Петри на ободе с растопленным S 3 (хранится в водяной бане при температуре 42 ° С, см 1.3).
- Держите ВНО на широком хвостового конца с тонким пинцетом, чтобы избежать повреждения чувствительного эпителия.
- Опустить VNO в агарозы и переместить его в горизонтальном направлении назад и вперед несколько раз, чтобы удалить пленку внеклеточном растворе, а также любые воздушные пузырьки с ее поверхности.
- Поместите ВНО вертикально с хвостовым наконечником, обращенной к нижней части блюда. Вместо того, чтобы щипать ВНО с пинцетом непосредственно, отрегулируйте ориентацию, перемещая кончик пинцетом в тесном Proximiти к ВНО.
Примечание: Ориентация во вложении имеет решающее значение, поскольку он определяет плоскость среза и доступность сенсорных нейронов во время эксперимента. - Поместите посуду на гелевой рукавицей и подождать, пока агароза не затвердеет.
Примечание: Не изменяйте ВНО ориентацию, как только агарозы начал твердеть, так как это будет отделить ткани от окружающей агарозы.
4. Корональные ВНО ткани нарезка
- Используйте маленькую лопаточку, чтобы удалить агарозы блок с маленьким блюдом в крышке большую чашку Петри, перевернуть вверх дном агарозы оставляя хвостовую кончик ВНО вверх.
- Вырезать блок в пирамидальной формы с помощью хирургического скальпеля (3-4 мм на конце, 8-10 мм в нижней части). Будьте осторожны, чтобы не повредить внедренный ткани.
- Используйте супер клей, чтобы зафиксировать блок пирамидальной формы в центре vibratome образца пластины и подождите ~ 1 мин для клея, чтобы полностью высохнуть.
- Передача образца пластины к нарезания грHamber и подготовить вторую ВНО, соответственно. Удерживающую плиту со второго образца при температуре 4 ° С до использования.
- Используйте вибрирующие лезвия микротома со следующими параметрами: толщина: 150-200 мкм; Скорость: 3.5 а.е. = 0,15 мм / сек; частота: 7,5 а.е. = 75 Гц. Перенесите ломтики в Oxygenating камере до использования после краткого осмотра срезов морфологии под микроскопом рассекает. Ломтики может храниться в течение нескольких часов.
5. Одноклеточные Электрофизиологические Записи
- Для записей, используйте вертикальное фиксированной столик микроскопа оснащенную целей погружения в воду, Dodt или инфракрасного дифференциального мешая контраста (ИК-ДИК) и эпи-флуоресценции, а также охлаждаемой ПЗС-камеры. Для получения данных, используйте патч-зажим усилителя, этап головки, AD / DA платы интерфейса и ПК (в том числе программное обеспечение для записи).
- Подготовить запас 10-20 патч-пипеток (4-7 МОм). Напряжения Пипетки из боросиликатного стекла капилляров (1,50 мм OD / 0,86 мм ID) USINга микропипетка съемник и противопожарная польский с microforge.
Примечание: Огонь полировки наконечников имеет решающее значение при обновлении сравнительно небольшие VSNs. Это поможет предотвратить разрывания клеточной мембраны при подаче отрицательного давления для того, чтобы получить высокую запечатывание. После того, как полирование отверстие пипетки должно быть приблизительно 1 мкм. - Держите пипетки в банку для хранения пипеток, чтобы предотвратить повреждение и накопление пыли до использования.
- Подготовка системы перфузии путем заполнения резервуаров раствора и трубки в соответствии с экспериментальным дизайном.
Примечание: Удалить пузырьки воздуха из трубки полностью, как они будут сильно мешать электрофизиологических записей. - Отрегулировать давление для достижения ~ 3 мл / мин поток.
Примечание: Высокое давление вызовет движение среза ткани, а также прекращение электрофизиологических записей. - Передача ломтик ВНО в камеру формирования изображения и зафиксировать положение среза с помощью якоря из нержавеющей стальной проволокой с 0,1 мм толщиной Synthetic волокна (рис 2B - C).
Примечание: Не закрывайте кусочек ткани с одним из синтетических нитей волокна, а скорее агарозы окружающий срез. - Камера изображения Переход к записи установку и непрерывно переливать срез с окисленной S 2 при комнатной температуре с помощью приложения ванны.
- Отрегулировать всасывающую капилляр к поверхности раствора, чтобы создать медленное отсасывание для обеспечения постоянного обмена раствор бани. Отрегулируйте 8-в-1 мульти-бочка "перфузионного карандаш" выше и ближе к несенсорных части среза ВНО , который содержит кровеносные сосуды (рис 2С, 3А) 50. Это будет полезно организовать перфузионного карандаш и записи пипетку, чтобы быть лицом к ломоть с противоположных направлений.
- Подключение электрода и раствора ванны, используя L-образный мост агара (заполненный 150 мМ KCl).
- Заполните патч пипетки с пипеткой раствором S 4.
- Установите пипетку над серебряным хлоридом покрытием заплаты электрода, подключенного к стадии головки без соскабливания покрытия и прикрепить надежно.
- Нанесите небольшое положительное давление (приблизительно 1 мл в расчете на 10 мл пластмассовый шприц) на патч пипетки перед входом в ванну.
- Опустите пипетку в ванну с помощью микро - манипуляторы достаточно далеко , чтобы быть в состоянии погрузить цели , не задев его (рис 2D).
- Монитор сопротивление пипеток (R Пип, между 4-7 МОм) с использованием программного обеспечения электрофизиологии , подключенного к стадии головы.
Примечание: Если R пип является <4 МОм кончик стекло разобьется. Если R пип> 10 МОм, наконечник скорее всего засорен и пипетка необходимо заменить. - Визуализируйте ломтик ВНО с CCD-камеры с помощью инфракрасного оптимизированной дифференциального интерференционного контраста (DIC) и идентифицировать FPR-RS3-я-Венера клеток, экспрессирующих (или аналогичным образом маркированные нейроны) с помощью флуоресцентной подсветкии соответствующий фильтр куба.
- Фокус и целевой флуоресцентный или нефлуоресцентной клетки в зависимости от экспериментального проектирования.
- Для того, чтобы приблизиться к телу клетки, использовать ручные колеса для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления, небольшая вмятина в клеточной мембране сомы становится видимым, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.
- Освободить положительное давление и применить небольшое отрицательное давление, чтобы всасывать в клеточной мембране, чтобы получить высокую запечатывание (1-20 ГОм). Применить короткое и нежное всасывание, чтобы разрушить клеточную мембрану и установить конфигурацию целой клетки.
- Контролировать устойчивость доступа к постоянно во время эксперимента.
Примечание: включают в себя только нейроны , проявляющих малый и стабильное сопротивление доступа (≤3% от входа R, изменение <20% в течение эксперимента) в анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы получить представление о биофизических и физиологических свойств определенных клеточных популяций, мы проводим острые коронарные срезы ткани мыши ВНО (Рисунок 1 - 2). После рассечения, ломтики можно хранить в ледяном окисленной внеклеточный раствор (S 2) в течение нескольких часов. При установке записи, постоянный обмен со свежим насыщенным кислородом раствором (рис 2D) обеспечивает жизнеспособность тканей в течение всего эксперимента. Мы здесь используем трансгенной модели мыши (FPR-RS3-я-Венера). VSNs в этот штамм coexpress флуоресцентный маркер белка с РСП-RS3, прототипическим член FPR-Rs семейства генов (рисунок 3) , позволяющей оптическую идентификацию определенной популяции сенсорных нейронов. Электрофизиологические записи предоставляют средства для углубленного анализа на уровне одной клетки. Например, анализ напряжения закрытого токов выполняется в фиксации потенциалаРежим (Рисунок 4A - В). Для выделения конкретных типов ионных токов, срезы орошали с фармакологическими агентами , такими как ТТХ ингибировать потенциалзависимыми Na + токи (рис 4а) или нифедипин блокировать напряжения закрытого L-типа Ca 2+ токи (рис 4б). Кроме того, мы регулярно выполнять записи целых клеток в текущей конфигурации зажима для анализа действий потенциальных моделей разряда (рис 4в). В дополнение к записи целых клеток, записи Клеточноподобные придает 'отрывными уплотнение' обеспечивают менее инвазивный метод , который предотвращает диализ внутриклеточных компонентов (рис 5А). Запись потенциала действия управляемых емкостных токов при применении короткого стимула предлагает чувствительный и эффективный способ экран для сенсорных лигандов (например, основных мочевых белков;) МУП, активирующие определенных популяций клеток 51 (рис 5б).
= "Jove_content" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> 
Рисунок 1: Препарирование ВНО. (А) вид сбоку на головку мыши , чтобы проиллюстрировать положение и угол , при котором резцы нарезают. (B) Брюшной вид , показывающий лучшие точки , чтобы захватить и отогните верхнюю часть неба (UP). (C) Брюшной вид на хрящевой капсулы (CC) , который таит в себе ВНО и сошника кости (VB) после удаления нижней челюсти, резцы и нёбо. (D) Спинной вид расчлененного ВНО капсулы , изображающие двустороннюю локализацию обоих ВНО (D I). Вид сбоку иллюстрирует край хряща на спинной стороне , где оба ВНО должны быть разделены (D II). Шкала бар = 1 мм (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Приготовление тканевых препаратов, записи камеры и столик микроскопа Схематический вид сбоку на VNO , чтобы проиллюстрировать ход и положение большого кровеносного сосуда (BV) в несенсорных части эпителия (A I). Пунктирная линия представляет корональной нарезки слой. Боковой вид на ВНО лущеного из ЦК показывает кровеносный сосуд (A II). (Б) в агарозном встраиваемый корональной VNO срез ткани , прикрепленный к нижней части записи растворной камеры заполненные с использованием якоря из нержавеющей стальной проволокой с 0,1 мм толщиной синтетического волокна (SF) нитей. Коробочный область изображает агарозы окружающий срез ткани. (C) Схематический вид, иллюстрирующий положение и ориентацию агарозы (Ag) -вложено корональной ВНО срез, расположенный между двумя волокнами. (D) Обзор записи камеры помещают на предметный столик микроскопа. Камера оборудована с применением ванны (BA) для постоянного суперфузии с кислородом S 2, перфузия карандаш (РР) для применения сенсорных стимулов или фармакологических агентов, пипетка записи (РП) , подключенный к стадии предварительного усилителя, опорный электрод (RE ) и всасывающий капиллярная (SC) для поддержания постоянного обмена раствора в камере. Шкала бар = 1 мм (A II). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Корональные Tiss VNOуе срез. (A) конфокальной изображение (максимальная проекция) острого коронального среза ткани ВНО 150 мкм , показывающая распределение флуоресцентных FPR-RS3 тау-Венера + нейронов (зеленый) в вомероназальном сенсорного эпителия. Кровеносных сосудов (BV), Просвет (L), чувствующий эпителий (SE). (B) FPR-RS3 тау-Венера + нейроны демонстрируют одну верхушечный дендрит , оканчивающимся на ручку-подобную структуру при просвете границе. Цельноклеточная записи патч-зажим были выполнены из сомы ВСН, патч пипетки (PP). (С) Морфология одной ВСН с дендритной ручкой (K) на кончике длинной и узкой дендритов (D), ячейка сома (S) и аксон (А) , выходящий из сома на базальной стороне. Шкала баров, 50 мкм (а), 10 мкм (Б), 5 мкм (с). Эта цифра была изменена с 52. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рисунок 4: Изолированные напряжения закрытого Na + и Са 2+ токи, а также разряд спайка (A) Характерные следы от целых клеток записи патч-фиксатор TTX-чувствительных быстро активирующего Na + ток в РСП-RS3 + VSNs.. (A I) шагового напряжения записи в контрольных условиях (внеклеточный раствор S 1; внутриклеточный раствор S 4) показывает зависимые от напряжения быстрый и переходный процесс тока внутрь. (A II) лечение ТТХ (1 мкМ) , что сильно уменьшает ток. Цифровым вычитают след (контрольно-ТТХ (A III)) ReveALS ТТХ-чувствительную потенциалзависимыми Na + ток. Отношения вольт-амперные ТТХ-чувствительных Na + токов , выделенных из нейронов и управления РСП-RS3 + (A IV). (B) представитель Ca 2+ в настоящее время следы изолированных фармакологически (10 мкМ нифедипин). (С) Представительные токовые клещи следы , показывающие De- / гиперполяризации и поезда потенциалов (отскока) действий , генерируемых при ступенчатом положительный (C I) и отрицательной (C III) инжекции тока. Обратите внимание на спонтанную активность , измеренный при 0 Па инжекции тока (C II). (С IV) частота Обжиг контроля и РСП-RS3 + -нейронов в зависимости от вводимого тока (я впрыснуть). Постепенное увеличение скорости стрельбы одинакова для контроляи FPR-RS3 + VSNs. Обратите внимание , что VSNs являются чрезвычайно чувствительными к текущим инъекциями даже в низких picoamperes диапазоне 53-56. Заметим , что F -I кривые были "фон скорректированной" с использованием спонтанной частоты подсадки при 0 рА инжекции тока. Данные представляют собой средние значения ± SEM. Эта цифра была изменена с 52. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: внеклеточной 'свободные' патч записи из базальных VSNs (A) IR-DIC образ острого ВНО ткани среза , изображающей пипетку записи в базальном слое чувствительного эпителия.. (B) представитель оригинальная запись базальной ВСН в конфигурации клеточного прилагается (&# 39; отрывными уплотнение ") реагирует с короткими переходными всплесков пиков к краткому раздражений (3 сек) с обобщённые рекомбинантно выраженные основные мочевые белки (rMUPs) и повышенную концентрацию калия (50 мМ, 1 сек), соответственно (B I) , Более высокое увеличение записей , показанных в (B I) иллюстрирует всплесков пиков в ответ на раздражений (B II). Красные полоски указывают на время стимуляции, между стимулом интервал = 30 сек, непрерывная запись, ОСТАНОВКИ <1 сек (срезанные знаки //). Шкала бар = 5 мкм (А). Панель (A) было изменено из ссылки 38. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ВНО является хемосенсорных структура, которая обнаруживает semiochemicals. На сегодняшний день большинство вомероназальных рецепторов остается быть deorphanized, как было выявлено лишь несколько пар рецептор-лиганд. Среди тех, V1rb2 был описан быть специально активирован мужского мочевого феромонов 2-гептаноне 30, V2rp5 быть активирован для самцов феромонов ESP1 57, а также V2r1b и V2rf2 быть активированы с помощью пептидов ГКГ SYFPEITHI 48 и SEIDLILGY 58, соответственно. Предпосылкой к пониманию рецептор-лиганд отношения и трансдукции сигнала является знание биофизических характеристик определенных групп населения ВСН в родной среде. Пассивные и активные свойства мембран, напряжения закрытого ионных проводимостей и потенциала действия модели разряда определяют средства и степень, в которой нейроны рецепторов реагируют на хемосенсорных стимулы. Электрофизиологические записи в срезах ткани острых и, в частности, ктоле-клеточные патч-зажим записи обеспечивают превосходный метод для анализа этих свойств в мельчайших подробностях.
Важным шагом для успешных и надежных физиологических записей в срезах тканей является сам препарат. Для того, чтобы максимально увеличить промежуток времени, для проведения экспериментов, ткань должна быть нарезана и переносили на ледяную насыщенным кислородом раствором сразу же после того, как рассечение. После этого срезы могут быть сохранены в течение нескольких ч позволяет анализа значительного количества клеток на день эксперимента. Это требует некоторой практики, чтобы сократить время, чтобы рассекать и встраивать как ВНО одного животного менее чем за 30 мин. После этого, вероятность успеха для опытного экспериментатора, чтобы получить несколько ломтиков неповрежденной ткани с жизнеспособными клетками значительно выше 75%. Выполнение патч-зажим записи является низкая пропускная способность экспериментальный подход по сравнению с Ca 2+ визуализации. Тем не менее, она позволяет более точный и универсальный анализ деятельности на уровне одной клетки с гораздо более высоким временнымразрешающая способность. В конфигурации цельноклеточной, внутриклеточная среда диализовали раствором пипеткой. Хотя решение пипетка может не отражать точную цитозольного композицию, она обеспечивает экспериментатору с точным контролем над обоими вне- и внутриклеточных ионных условиях. Для надежной интерпретации результатов, непрерывный контроль сопротивления и тока утечки имеет решающее значение. Иногда, значительное увеличение или сильное изменение сопротивления доступа или утечки тока приводит к интерпретируемы результатов и, таким образом, требует, чтобы эти записи быть отброшена. Кроме того, важно отметить, что некоторые фармакологические соединения связываются необратимо делает его необходимо заменить ломтиков после каждой записи.
Запись в конфигурации ячейки подключением предотвращает диализ внутриклеточных компонентов и не влияет на мембранный потенциал клетки. Таким образом, эта методика обеспечивает менее инвазивную и относительно быстрый способ скрининга. Тем не менее, это соответствуюACH обычно ограничивается записью супер-порога потенциала действия управляемых емкостных токов с внешней стороны клеточной мембраны. Записи с отрывными патч оказались пригодны для анализа поведения подсадки из большего числа сенсорных нейронов в ВНО ломтиками 38,54.
Трансгенная модель, используемое здесь обеспечивает надежный инструмент для определения и анализа популяции РСП-RS3, выражающих VSNs. Кроме того, способ, описанный здесь, может быть распространен на другие линии, независимо от их генотипа. Несмотря на огромное преимущество расследования определенного типа клеток, с использованием трансгенных мышей ограничивает эксперименты по имеющимся линиям. В последнее время , однако, целевые редактирования генома стал более быстрым и доступным с CRISPR / техникой cas9 59. В заключение, целевой патч-зажим записи в острых срезов вомероназального ткани обеспечивают универсальный подход для характеристики биофизических и физиологических свойств определенный populatион сенсорных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
- Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
- Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
- Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
- Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
- Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
- Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
- Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
- Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
- Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
- Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
- Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
- Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
- Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
- Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
- Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
- Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
- Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
- Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
- Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
- Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
- Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
- Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
- Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
- Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
- Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
- Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
- Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
- Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
- Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
- Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
- Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
- Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
- Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
- Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
- Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
