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Biochemistry

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

यहाँ हम एक क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं को बाधित जिसके परिणामस्वरूप सेल पाउडर से एक सेल निकालने का उत्पादन, और एंटीबॉडी मिलकर माइक्रोन पैमाने समचुंबक मोती पर संबंध कब्जा द्वारा ब्याज की प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

संबंध कब्जा आगे के अध्ययन के लिए अंतर्जात प्रोटीन परिसरों को अलग-थलग करने के लिए एक प्रभावी तकनीक है। जब एक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस तकनीक को भी बार बार करने के लिए immunoprecipitation के रूप में जाना जाता है। संबंध कब्जा एक बेंच पैमाने में और एक उच्च throughput संदर्भ में लागू किया जा सकता है। जब प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर संबंध कब्जा interactome विश्लेषण का एक workhorse साबित हो गया है। हालांकि वहाँ कई शामिल कदम पर अमल करने के लिए संभावित कई तरीके हैं, निम्नलिखित प्रोटोकॉल हमारे इष्ट तरीकों को लागू करने। दो सुविधाओं विशिष्ट हैं: cryomilled सेल पाउडर का उपयोग आत्मीयता के माध्यम के रूप में सेल के अर्क, और एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती उत्पादन के लिए। कई मामलों में, हम और अधिक परंपरागत संबंध कब्जा प्रथाओं के साथ प्राप्त उन लोगों के लिए बेहतर परिणाम प्राप्त किया है। Cryomilling सेल टूटना के अन्य रूपों के साथ जुड़े कई समस्याओं से बचा जाता है। यह सामग्री के कुशल टूटना प्रदान करता है, जबकि denat परहेजuration हीटिंग या झाग के साथ जुड़े मुद्दों। यह निकासी की बात करने के लिए मूल निवासी प्रोटीन एकाग्रता को बरकरार रखे हुए है, macromolecular हदबंदी को कम। यह समय निकाले प्रोटीन समाधान में खर्च करते हैं, हानिकारक enzymatic गतिविधियों को सीमित करने को कम कर देता है, और यह आत्मीयता के माध्यम से प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना कम कर सकते हैं। माइक्रोन पैमाने चुंबकीय आकर्षण मीडिया में पिछले कई वर्षों से अधिक आम हो गए हैं, तेजी से पारंपरिक agarose- और Sepharose आधारित मीडिया की जगह ले। चुंबकीय मीडिया का प्राथमिक लाभ आम तौर पर कम गैर विशिष्ट प्रोटीन सोखना शामिल हैं; कोई आकार अपवर्जन सीमा नहीं है क्योंकि प्रोटीन जटिल बाध्यकारी नहीं बल्कि pores के भीतर से मनका सतह पर होता है; और और गड़बड़ी की आसानी निपटने चुंबक का उपयोग।

Introduction

प्रस्तुत प्रक्रियाओं का एक विशिष्ट आवेदन interactomic लक्षण वर्णन 1 के लिए स्थिर और एक उच्च उपज और ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन परिसरों की पवित्रता को प्राप्त करने के लिए है। समझा जाता है कि दोनों stably और क्षणिक जुड़े macromolecular परिसर, मुख्यतः प्रोटीन के शामिल के गतिशील नेटवर्क, सेलुलर प्रक्रियाओं 2,3 आर्केस्ट्रा। जबकि वहाँ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं, संबंध कब्जा अलग और शारीरिक प्रोटीन परिसरों 4-6 विदारक के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है। इसके अलावा, इस तकनीक को न सिर्फ एक पढ़ने के लिए बाहर में डेटा बिंदुओं के रूप में भौतिक संस्थाओं, के रूप में macromolecular परिसर उपज का लाभ दिया है; हितकर, प्राप्त परिसरों इस प्रकार अतिरिक्त बहाव के जैव रासायनिक, एंजाइमी, और संरचनात्मक assays 7-9 की मेजबानी में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल protei नक्शा करने के लिए जरूरत के जवाब में विकसित किया गया हैn, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क और कोशिका जीव विज्ञान के प्रेरक अणुओं के रूप में उनकी भूमिकाओं में macromolecular परिसर की विशेषताएँ। वे ऊतक संस्कृति में विकसित स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उनके आवेदन के संबंध में विस्तृत रहे हैं, लेकिन उचित प्रणाली विशेष तोड़ मरोड़ दिया जैविक नमूने की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समान रूप से लागू होते हैं।

संबंध कब्जा का इतिहास बीसवीं सदी के शुरू करने के लिए पहली immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी प्रयोगों के साथ फैला है - जैसी है जो आमतौर पर आजकल कहा जाता है immunoprecipitation के रूप में (आईपी) - 1950 के दशक से साहित्य में दिखाई दे। तकनीक की मुख्यधारा के उपयोग के आगे उपस्थित 10-13 के लिए इस सदी के अंत के माध्यम से विकसित की है। विविध सेल और आणविक जैविक अध्ययन में कम से कम पिछले चालीस वर्षों 14-19 के लिए क्रायोजेनिक तापमान पर मिलिंग द्वारा कोशिकाओं के यांत्रिक टूटना का उपयोग किया है; और आणविक (सुपर) समचुंबक मोती का उपयोग विभाजन बीईसी हैome पिछले दो दशकों में 20 से अधिक तेजी से सामान्य। इन विभिन्न प्रौद्योगिकियों के संयोजन के रूप में काम खुद के द्वारा उत्पादित की एक व्यापक शरीर और व्यापक अनुसंधान समुदाय इसका सबूत है, synergistically परिणाम है कि प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा प्रयोगों 1 में प्राप्त किया जा सकता सुधार करने के लिए सेवा की है 7,9,11,18,19,21 -23। सहायक परिणाम चित्रा 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं।

निरंतर और प्रभावी संबंध कब्जा प्रयोगों को क्रियान्वित करने के लिए लागू विचारों की एक संग्रह संदर्भ 1 में पाया जा सकता है। आमतौर पर इस दृष्टिकोण के लिए सबसे उपयुक्त है: (i) ब्याज की एक प्रोटीन की interactors सूची है, यानी, प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग अब तक अज्ञात copurifying प्रोटीन (खोजपूर्ण विश्लेषण) की पहचान करने के लिए; (द्वितीय) के लिए एक विशेष बातचीत साथी की उपस्थिति के लिए परख, यानी, एमएस या पश्चिमी धब्बा का उपयोग करने के संदिग्ध एक विशेष प्रोटीन या प्रोटीन के सीमित सेट का पता लगाने केब्याज (परिकल्पना परीक्षण) के प्रोटीन के साथ teract; या (iii) endogenously इकट्ठे प्रोटीन अतिरिक्त तकनीक से आगे के अध्ययन (प्रारंभिक workup) के लिए ब्याज की प्रोटीन युक्त परिसरों तैयार करते हैं। एक आकर्षण कब्जा प्रयोगात्मक शासन पर तैयार कर पहले यह एक उच्च गुणवत्ता आत्मीयता के अभिकर्मक कि लक्ष्य प्रोटीन, या ब्याज के मूल लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एक और टैग को एक संलयन प्रोटीन के साथ संलग्न के खिलाफ आम तौर पर एक आईपी सक्षम एंटीबॉडी को बांधता है करने के लिए जरूरी है। सामान्य प्रोटीन धुंधला हो जाना, पश्चिमी सोख्ता, और प्रोटीन एमएस (जैसे Coomassie नीले, Sypro रूबी, या चांदी, निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ के रूप में) सभी आमतौर संबंध कब्जा के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं: यह भी जगह में प्रयोगात्मक readout के उचित तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है 1। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आत्मीयता के माध्यम के रूप में एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग। आत्मीयता के माध्यम के समारोह शुरू करने के लिए, परीक्षण है कि कुछ प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग में मान्य किया जा सकता हैसबसे अच्छा परिणाम एक प्रयोग के अनुभव से 1,11,24 अनुकूलित किया जाना चाहिए प्राप्त करते हैं। प्रोटोकॉल तीन विशिष्ट चरणों में विभाजित हैं: (1) जमे हुए सेल सामग्री की तैयारी; (2) क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा सेल टूटना; और (3) प्रोटीन निकासी और आत्मीयता कब्जा एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती का उपयोग कर।

Protocol

1. सेल कटाई और ठंड

  1. ब्याज 25,26 की सेल लाइन के लिए उचित संवर्धन शर्तों का उपयोग सेल सामग्री के 1-8 ग्राम के लिए आगे बढ़ें। इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं के ऊपर से 8 ग्राम (~ 10 9 कोशिकाओं), संदर्भ 19,27,28 से संशोधित लिए अनुकूलित है। आमतौर पर, ~ HEK-293 या हेला कोशिकाओं के 5 ग्राम आठ 500 सेमी 2 संस्कृति उगाया प्लेटों के लिए ~ 90% confluency से प्राप्त किया जा सकता है।
    चेतावनी: इन प्रोटोकॉल तरल नाइट्रोजन (एल.एन. 2), गंभीर क्रायोजेनिक जलता पैदा करने में सक्षम का उपयोग करें। डॉन सुरक्षात्मक कपड़े और व्यायाम उचित हैंडलिंग सावधानियों।
  2. एक बड़े बीकर में मध्यम विकास (अपशिष्ट) डालो।
  3. बर्फ पर संस्कृति पकवान एक बड़ा आयताकार बर्फ पैन में रखें।
  4. संस्कृति डिश के लिए ठंडा 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 20 मिलीलीटर जोड़ें और एक बड़ी सेल खुरचनी का उपयोग पकवान से कोशिकाओं को रिलीज; एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण, पूर्व ठंडा बर्फ पर; बर्फ पर ट्यूब पकड़ो।
    ध्यान दें: सभी सेल से निपटने के कदम एक विद्युत pipettor सेट करने के लिए "कम" और 25 मिलीलीटर pipettes का उपयोग हस्तांतरण जोड़तोड़ के दौरान कोशिकाओं का अत्यधिक बाल काटना से बचने के लिए। 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब की व्यवस्था है और एक बर्फ बाल्टी में पीबीएस 1x प्रक्रिया की शुरुआत करने से पहले।
  5. एक ही थाली के लिए ठंडा 1x पीबीएस के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें। शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
  6. प्रत्येक पकवान के लिए दोहराएँ; अलग अलग व्यंजन से सेल निलंबन नमूना संख्या और प्लास्टिक कचरे को कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
    नोट: क्योंकि कोशिकाओं को खुद निलंबन की मात्रा का एक बड़ा हिस्सा नहीं माना जाएगा, सेल निलंबन के लायक तीन प्लेटों दो 50 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ा जा सकता है। क्योंकि 50 मिलीलीटर ट्यूबों वास्तव में नाममात्र की मात्रा से अधिक पकड़ है, आठ प्लेटों आम तौर पर इस तरह के पांच नलियों भर में फैल सकता है।
  7. 1,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  8. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना। 10 मिलीलीटर ठंडा 1x पीबीएस में प्रत्येक गोली Resuspend। resu एकीकरणspended छर्रों, 5 से 50 प्रति मिलीलीटर ट्यूब पर निर्भर है, नमूना संख्या को कम करने के लिए।
  9. 1,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट।
  10. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना। 10 मिलीलीटर ठंडा 1x पीबीएस में गोली Resuspend
  11. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें और यह सेट अलग। सिरिंज की नोक टोपी और इसे करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण।
  12. 1,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के अंदर सिरिंज रखें।
  13. कोशिकाओं की बस के ऊपर परत जब तक एक वैक्यूम जाल प्रणाली से जुड़ी एक अच्छी टिप विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला Aspirate चूसा जा करने के लिए शुरू होता है। यह एक गीला सेल गोली में यह परिणाम है।
  14. सिरिंज खुलना, सवार डालने और कोशिकाओं एल.एन. 2 से भरा एक बड़े प्लास्टिक बीकर, एक स्टायरोफोम बॉक्स में एक एल.एन. 2 स्नान में आयोजित में सीधे ड्रिप। जबरन सिरिंज से शेष कोशिकाओं उतर रही है।
  15. गिरने से 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए जमे हुए कोशिकाओं स्थानांतरण। शिथिल अतिरिक्त एल.एन. 2 लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देने के लिए नलियों टोपी; टी पकड़-80 डिग्री सेल्सियस पर हेम रात भर। अगले दिन पूरी तरह से टोपियां मजबूत करनी होगी। जमे हुए सेल cryomilling जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर इस तरह से संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: कसकर सभी एल.एन. 2 दिख हवा हो गया है इससे पहले नलियों बंद न करें, अन्यथा अत्यधिक दबाव ट्यूब में विस्फोट करने के कारण हो सकता है। नलियों को बंद नहीं होने के बाद एल.एन. 2 कोशिकाओं सामग्री पर ठंढ के संचय में परिणाम हो सकता है व्यस्त है, अतिरिक्त पानी वजन जोड़ने और प्रभावी ढंग से मिलिंग पर प्रोटीन एकाग्रता को कम करने।

2. जमे हुए कोशिकाओं के क्रायोजेनिक विघटन

नोट: मिलिंग और जोड़तोड़ के लिए सभी उपकरण एल.एन. 2 के साथ पहले से ठंडा किया जाना चाहिए। एक छोटा सा शीशे की सुराही जार के भीतर एल.एन. 2 जोड़ने के लिए और बंद मिलिंग जार के शीर्ष पर एल.एन. 2 डालने का कार्य के लिए आवश्यक हो जाएगा। एक घर उपकरण संदर्भ 19 में दिखाया गया है। क्रायोजेनिक दस्ताने एल.एन. 2 मिलिंग उपकरण ठंडा संभाल करने की जरूरत होगी। पिसाईजार यहां इस्तेमाल पलकों (सामग्री की तालिका देखें) आम तौर पर एक रबर गैसकेट स्थापित जहाज के साथ; यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Teflon ढक्कन गैसकेट मज़बूती निम्नलिखित प्रोटोकॉल पर अमल करने के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, क्योंकि गैसीय एन 2 के दबाव मिलिंग के दौरान जार के भीतर उच्च स्तर के लिए निर्माण कर सकते हैं, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5 बार / 500 किलो पास्कल दबाव एक सुरक्षा एहतियात के रिलीज के 28 के रूप में वाल्व स्थापित करने की सिफारिश।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेल मोती निकालें और एक एल.एन. 2 स्नान में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब धारक में पकड़।
  2. 50 मिलीलीटर जार, दो गेंदों में 20 मिमी, और एल.एन. 2 युक्त एक साफ आयताकार बर्फ बाल्टी में ढक्कन पूर्व शांत। पूर्व शांत polytetrafluoroethylene (PTFE) इन्सुलेटर अगर एक का उपयोग; या तो (संदर्भ के 27 देखें) pucks का एक सेट है, या एक आस्तीन और पक (चित्रा 2 देखें)। पूर्व ठंडा पूरा हो गया है जब एल.एन. 2 calms के हिंसक उबलते।
  3. पर उचित प्रतिभार सेटचक्की।
    नोट: यह जार जार ढक्कन के द्रव्यमान के बराबर होगा, मिलिंग गेंदों का इस्तेमाल किया जा रहा है, और कोशिकाओं की मात्रा जार करने के लिए जोड़ा जाएगा। किसी भी PTFE इंसुलेटर इस्तेमाल कर रहे हैं, उनके द्रव्यमान भी शामिल किया जाना चाहिए। हम जार, ढक्कन की जनता रिकॉर्डिंग, और गेंदों (और उनके संयुक्त जन, इस्तेमाल किसी भी इन्सुलेटर सहित) और अग्रिम में चक्की के पास संग्रहित एक सूचना पत्रक पर उन्हें रिकॉर्डिंग सुझाव देते हैं।
  4. संदंश का प्रयोग, पूर्व ठंडा मिलिंग जार के अंदर दो पूर्व ठंडा 20 मिमी मिलिंग गेंदों और जमे हुए कोशिकाओं जगह है।
    नोट: मिलिंग के दौरान जार और गेंद सतहों सामग्री के छोटे घाटे के कारण, milled बढ़ जाती है कोशिकाओं की बड़े पैमाने के रूप में बरामद सामग्री का बढ़ता प्रतिशत। विधि वर्णित करके, सामग्री के नुकसान बहुत मामूली हैं, ~ 0.3 ग्राम गीला सेल वजन (WCW) के आदेश पर किया जा रहा है। निर्माता के दिशा निर्देशों का संकेत नमूना की अधिकतम मात्रा लोड ~ 1 / जार मात्रा के 3 होना चाहिए। 29 गेंदों की कुल मात्रा ~ 1/3 और आर होना चाहिएemaining ~ 1/3 मुक्त अंतरिक्ष गेंदों की मुक्त आवाजाही के लिए है।
  5. ~ आधा पूरा करने के लिए जार अप करने के लिए एल.एन. 2 जोड़े, जार पर ढक्कन जगह और चक्की को विधानसभा हस्तांतरण।
    नोट: सबसे पहले चुना इन्सुलेटर यदि एक का उपयोग कर स्थापित करें।
  6. जगह में विधानसभा दबाना और निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग मिलिंग के तीन चक्रों प्रदर्शन: 400 आरपीएम, 3 मिनट, रिवर्स रोटेशन प्रत्येक मिनट, कोई अंतराल को तोड़ने। प्रत्येक चक्र के बीच में एल.एन. 2 के साथ मिलिंग जार कूल।
    नोट: मिलिंग गेंदों ग्रहों की गति में जार के भीतर टकराने के रूप में एक अलग clunking शोर उत्पन्न होता है के दौरान। यदि इन आवाज़ सुनी नहीं कर रहे हैं, मिलिंग होने वाली नहीं है। मिलिंग चक्र बर्खास्त, इस चक्र की गिनती नहीं है, जार विधानसभा वापस एल.एन. 2 के लिए ले जाने और जांच जार की सामग्री। कोई बर्फ का गठन किया है सुनिश्चित करें और अगर यह है, यह जार दीवारों से दूर चिप एक पूर्व ठंडा रंग के साथ। 2.5 कदम से फिर शुरू करें।
    यदि कोई इन्सुलेटर या इन्सुलेटर pucks का उपयोग कर, वापस करने के लिए जार विधानसभा के लिए कदम एल.एन. 2 जोड़ें। एल.एन. 2 मिलिंग के दौरान जार का बढ़ता तापमान के रूप में जार के भीतर लुप्त हो गयी। इस जार के भीतर दबाव बिल्ड-अप में परिणाम है। इसलिए, जब चक्की से जार disengaging, दबाना बहुत धीरे धीरे जारी। दबाना तेजी से जारी किया जाता है, तो सेल पाउडर तेजी depressurization साथ बच सकता है। क्लैंप का एक धीमी गति से जारी एक सौम्य, नियंत्रित फैशन में जार से बचने के लिए दबाव की अनुमति देता है, और सेल सामग्री के नुकसान से बचाता है। यह सामान्य है - गैसीय एन 2 के कोमल भागने अक्सर hissing के रूप में दबाना धीरे-धीरे जारी की है सुना जा सकता है।
    एक आस्तीन और पक इन्सुलेटर का उपयोग करते हैं, जार विधानसभा चक्की में छोड़ा जा सकता है और एल.एन. 2 बगल में इन्सुलेटर / जार विधानसभा के लिए कहा।
  7. जार वापस एल.एन. 2 करने के लिए ले जाएँ, और क्षण भर आराम शांत करने के लिए करते हैं। एक आस्तीन और पक इन्सुलेटर का उपयोग करते हैं, जार आस्तीन w से हटाया जा सकता हैदो spatulas की सहायता, दोनों तरफ का लाभ उठाने को उपलब्ध कराने के ith। एक बार जब जार एल.एन. 2 में आराम कर रहा है, ध्यान से ढक्कन हटा दें, संदंश का उपयोग कर गेंदों को दूर है, और एक पूर्व ठंडा रंग का उपयोग कर एक पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर ट्यूब पाउडर हस्तांतरण। खुले जार / पाउडर के लिए एक छोटी सी एल.एन. 2 जोड़ना पाउडर है कि गेंदों पर caked है बेदखल करने के लिए, उन्हें हटाने से पहले कर सकते हैं।
    नोट: एक बार जार खोल दिया गया है, गेंदों को हटाने से पहले यह करने के लिए एल.एन. 2 की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं। इस सतहों पर caked पाउडर को ठीक करने में मदद मिलेगी। सेल पाउडर -80 डिग्री सेल्सियस पर या नीचे उपयोग करें जब तक आयोजित किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, सेल पाउडर इस तरह से संग्रहित किया जा सकता है, अनिवार्य रूप से अनिश्चित काल के प्रदर्शन को प्रभावित किए बिना।

सेल के अर्क से प्रोटीन परिसरों की 3. संबंध कब्जा

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक समानता ligand के शामिल समानता मीडिया, चारा, या एंटीबॉडी कि ब्याज, सह के प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान को लागू करता हैमाइक्रोन पैमाने को समचुंबक मोती upled। ये घर में 19,30 तैयार किया जा सकता है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर, या रेडीमेड अभिकर्मकों के रूप में खरीदा है।

  1. सेल निकालने की तैयारी
    नोट: जब सेल पाउडर हैंडलिंग, बर्तन और ट्यूबों एल.एन. 2 के साथ पूर्व ठंडा उपयोग करने के लिए याद है। सेल पाउडर युक्त ट्यूबों हमेशा जब -80 डिग्री सेल्सियस पर नहीं एल.एन. 2 पर आयोजित किया जाना चाहिए। 50 मिलीलीटर ट्यूब (ओं) एल.एन. 2 के साथ एक ट्यूब रैक में सेल पाउडर युक्त, एक स्टायरोफोम कंटेनर में रखें।
    1. एक 1.5 या 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में सेल पाउडर के 100 मिलीग्राम वजन।
      नोट: हमने देखा है कि कोशिकाओं की यह मात्रा एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है कि आम तौर nanograms के सैकड़ों के लिए दसियों में लक्ष्य प्रोटीन निकलेगा है प्रति प्रतियों के हजारों में, एक मामूली व्यक्त प्रोटीन (~ 50 केडीए जन के लिए आत्मीयता के कब्जा करने के बाद रेंज पेश सेल), लक्ष्य की निकासी और कब्जा क्षमता रखनेवाला ≳70% हैं। इस तरह की पैदावार प्रत्यक्ष visualiz के लिए प्रदानएसडीएस पृष्ठ और प्रोटीन धुंधला द्वारा शुद्ध अंश का समझना।
    2. खाली microfuge ट्यूब के साथ तारे विश्लेषणात्मक संतुलन। एक ट्यूब एक एल.एन. 2 ठंडा चम्मच या रंग का उपयोग करने में सेल पाउडर बांटना। पाउडर विश्लेषणात्मक संतुलन पर ट्यूब के भीतर तिरस्कृत के द्रव्यमान की जाँच करें।
      नोट: को कम करने के लिए सेल पाउडर के बाहर वजन, छोटे बड़ा चम्मच मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने के लिए (संदर्भ के 19 देखें) पाया गया है। हम पेंच टोपी या 'सुरक्षित ताला' microcentrifuge ट्यूब का उपयोग सबसे अच्छा परिणाम मिल गया है। संभावित नमूना के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप - एल.एन. 2 कि ट्यूब मानक microcentrifuge ट्यूबों सिर्फ निकासी के समाधान के अलावा करने से पहले बाद वार्मिंग के दौरान खुला पॉप करने के लिए पैदा कर सकता है प्रवेश कर सकते हैं वाष्पन से दबाव।
    3. ट्यूब खोलें (या ढीला पेंच टोपी) सेल पाउडर के साथ और 1 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हो जाओ। इस ट्यूब के भीतर दबाव जारी है और निकासी के तत्काल ठंड को रोकने जाएगासमाधान जब पाउडर के लिए कहा। कोई विगलन इस 1 मिनट ऊष्मायन के दौरान मनाया जाता है।
    4. जबकि करने के लिए कदम 3.1.5 आगे बढ़ने से प्रोटीज अवरोधकों और भंवर के साथ पूरक निकासी के 400 μl जोड़े संक्षेप में, फिर बर्फ पर पकड़। नमूने क्षालन तक बाद के सभी जोड़तोड़ के बीच बर्फ पर आयोजित किया जाना चाहिए।
      नोट: निकासी की अच्छी रचना प्रोटीन जटिल (ते) पर निर्भर करेगा शुद्ध किया जा सके। कुछ सामान्य मार्गदर्शन 1 टेबल और समर्थन संदर्भ में प्रदान की जाती है।
    5. एक microtip ultrasonicator का प्रयोग नमूना किसी भी समुच्चय को तितर-बितर करने के लिए एक संक्षिप्त कम ऊर्जा की नाड़ी देने के लिए। (अल्ट्रा) 4 दालों (2 सेकंड प्रत्येक, 2 ए, कुल ऊर्जा का लगभग 15-20 जे) के साथ Sonicate।
      ध्यान दें: vortexing निकासी में सेल पाउडर dispenses, लेकिन समाधान चरित्र पर निर्भर करता है, कुछ समुच्चय देखा जा सकता है। हमने पाया है कि इन समुच्चय dispersing बाद के संबंध कब्जा के दौरान सबसे अच्छा उपज के लिए प्रदान करता है। एक संक्षिप्त microtip soniकेशन आसानी से इन समुच्चय disperses। समाधान, अर्द्ध पारदर्शी लेकिन समरूप दिखाई देनी चाहिए स्पष्ट समुच्चय के बिना। जल स्नान sonicators भी कम बिजली की कुशलता से काफी लंबे समय तक नमूना हैंडलिंग बार बिना इस तरह के समुच्चय को तितर-बितर करने के लिए हो जाते हैं, लेकिन उचित सेटिंग्स के साथ उपयुक्त हो सकता है।
    6. Centrifugation द्वारा निकालने स्पष्ट (जैसे, 20,000 XG, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)।
      नोट: स्पष्ट किया सेल निकालने का एक विभाज्य गोली, पोस्ट-संबंध कब्जा तैरनेवाला की सामग्री की तुलना के लिए बचाया जा सकता है, और भिन्न आत्मीयता के माध्यम से क्षालन के बाद प्राप्त निकासी की क्षमता और लक्ष्य प्रोटीन का कब्जा निर्धारित करने के लिए , जैसे, पश्चिमी धब्बा (चर्चा देखने के लिए)।
    7. सतह पर तैरनेवाला (स्पष्ट किया निकालने) निकालें और संबंध कब्जा करने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: गोली किया 70 डिग्री सेल्सियस पर एसडीएस पृष्ठ नमूना लोड हो रहा बफर में फिर से निकाले लक्ष्य प्रोटीन डी की रिहाई की डिग्री का निर्धारण करने के लिए कर सकते हैंनिकालने कदम 3.1.6 में प्राप्त की तुलना द्वारा प्रारंभिक गैर denaturing निकासी uring।
  2. संबंध कब्जा
    1. चुंबकीय आकर्षण मध्यम prewash। यह जबकि सेल के अर्क centrifuged किया जा रहा है किया जा सकता है।
    2. चुंबक पर ट्यूब (ओं) रखें। मोती सेकंड के भीतर ट्यूब के किनारे पर जमा है, हटाया जा करने की अनुमति देने के भंडारण समाधान होगा।
    3. मोती के लिए निकासी के समाधान के 500 μl जोड़ें। मध्यम गति से संक्षेप में भंवर मिश्रण (resuspend करने के लिए पर्याप्त)। एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों पल्स-स्पिन नीचे करने के लिए सभी सामग्री को इकट्ठा करने के लिए। ऐसा करने से समाधान की न्यूनतम भार सुनिश्चित करता है। चुंबक पर ट्यूबों की जगह और समाधान निकालना।
      नोट: विशिष्ट विशेषताओं के साथ चुंबकीय मीडिया वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं की एक विस्तृत विविधता से उपलब्ध हैं। परिणाम मनका आकार, एकरूपता, सतह कोटिंग, और एंटीबॉडी युग्मन रसायन विज्ञान सहित इन विशेषताओं, के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। साइड-बाई-siअपने आवेदन में डी परीक्षणों के एक विकल्प के अभिकर्मक पर बसने से पहले की सिफारिश की है।
    4. पूर्व धोया आत्मीयता के मध्यम और भंवर युक्त संक्षेप में resuspend करने के लिए एक 1.5-2.0 मिलीलीटर ट्यूब को स्पष्ट किया सेल निकालने के हस्तांतरण से संबंध कब्जा आरंभ करें।
    5. एक रोटेटर पहिया पर निरंतर सौम्य मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं; मोती ऊष्मायन के दौरान निलंबित रहना चाहिए।
    6. एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों पल्स-स्पिन ट्यूब के नीचे करने के लिए सभी सामग्री को इकट्ठा करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और कदम 3.2.3 में वर्णित के रूप में मोती ठंड निकासी के समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। चुंबक पर ट्यूबों रखें। समाधान निकालें। अगले समाधान जोड़ने और दोहराने के लिए आगे बढ़ें। 2 एन डी धोने के दौरान, pipetting द्वारा एक ताजा microfuge ट्यूब के लिए एक साथ माला और धोने के समाधान के लिए स्थानांतरण। यह, नमूना संदूषण कम कर देता है क्षालन के बिंदु पर ट्यूब की दीवारों को adsorbed यादृच्छिक प्रोटीन टी के साथ ऊष्मायन के लिए इस्तेमाल किया द्वारावह निकालने सेल। 3 धोने के बाद, मोती नीचे करने के लिए सभी सामग्री को इकट्ठा करने के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में पल्स-काता संक्षेप में होना चाहिए। ट्यूब चुंबक पर वापस प्लेस, और किसी भी अवशिष्ट तरल हटा दें। यह एल्यूटिंग eluted नमूने सुनिश्चित वर्दी मात्रा में होगा पहले समाधान के पिछले कुछ μl को हटाने की अनुमति देता है। यह भी सुनिश्चित करता क्षालन, प्रभावशाली हो जाएगा के रूप में क्षालन समाधान अवशिष्ट धोने से पतला नहीं किया जाएगा; इस तरह के अवशेषों को भी नमक प्रभाव में योगदान और (देखें नीचे) एसडीएस पृष्ठ में प्रोटीन के पलायन को बदल सकते हैं।
      नोट: पोस्ट-बाध्यकारी सतह पर तैरनेवाला के एक विभाज्य 3.1.6 में उत्पन्न स्पष्ट किया निकालने की तुलना के लिए बचाया जा सकता है। पश्चिमी धब्बा। परिणाम सेल निकालने से लक्ष्य प्रोटीन की कमी की डिग्री का संकेत होगा।
    7. या तो एक देशी या denaturing ढंग से Elute; बहाव के आवेदन 1 के लिए सबसे अच्छी रणनीति पर विचार करें।
      नोट: मूल क्षालन रणनीति का ब्यौराएस आत्मीयता के इस्तेमाल टैग (चर्चा देखें) पर निर्भर करेगा। अधिकांश उपयोगकर्ताओं, एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर प्रोटीन धुंधला 31 के साथ एसडीएस पृष्ठ से नमूने के विश्लेषण के बाद साथ क्षालन denaturing के लिए, सबसे व्यावहारिक प्रारंभिक दृष्टिकोण होगा।
      नोट: नमूना बफर वैद्युतकणसंचलन प्रणाली पर निर्भर करेगा की संरचना का इस्तेमाल किया जा रहा है। कई प्रयोगशालाओं के लिए अपने स्वयं Tris ग्लाइसिन जैल डाली, असंतत वैद्युतकणसंचलन और Laemmli बफर सिस्टम 32-34 का इस्तेमाल कर रही है। एक आम नमूना बफर नुस्खा (1x) शामिल हैं: 10% (w / v) सुक्रोज, 50 मिमी डीटीटी, 2% (w / v) एसडीएस, 62.5 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.8, 0.0004% (w / v) bromophenol नीले 31 । हम एक 1.1X शेयर है कि डीटीटी को छोड़ देता है तैयारी सुझाव देते हैं। 1/10 वें 500 मिमी डीटीटी की मात्रा से पहले एसडीएस पृष्ठ नमूना में जोड़ा जाना चाहिए (देखें नीचे)। कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसडीएस पृष्ठ सिस्टम भी उपलब्ध हैं; इन सिस्टम विशिष्ट नमूना बफ़र्स शामिल हो सकते हैं।
    8. एजेंट को कम करने के बिना एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर जोड़ें (रिहाई कम करने के लिएमोतियों से एंटीबॉडी चेन) और के आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: यह सबसे समानता के आधार पर बातचीत के साथ हस्तक्षेप करेगा सतह पर तैरनेवाला में कब्जा कर लिया प्रोटीन जारी है। अधिक लगातार बातचीत जारी करने के लिए ऊंचा तापमान से लाभ हो सकता है (आमतौर पर 70 डिग्री सेल्सियस के लिए पर्याप्त है)।
    9. लीजिए और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए। नमूने -20 डिग्री संक्षिप्त भंडारण के लिए सी (कुछ दिन) पर जमे हुए किया जा सकता है या -80 डिग्री विस्तारित भंडारण के लिए सी जब तक विश्लेषण वांछित है।
    10. एसडीएस पृष्ठ मानक तकनीक का उपयोग करते हुए 31 प्रोटीन धुंधला द्वारा पीछा करने के लिए नमूने के अधीन। एमएस नमूना रचना 1 चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यक्ति प्रोटीन बैंड की पहचान के लिए excised जा सकता है या पूरे नमूना केवल संक्षिप्त (4-6 जेल में मिमी) नमूना electrophoresing और एक साथ नमूने में सभी प्रोटीन के प्रसंस्करण के लिए एक के रूप में से एक भी विश्लेषण में लक्षण वर्णन किया जा सकता है 'जेल प्लग।'
      नोट: पहल से पहले डीटीटी जोड़ेटिंग वैद्युतकणसंचलन। नियोजन एमएस करने के लिए आगे बढ़ना है, तो नमूने वैद्युतकणसंचलन 35 के बाद alkylated हो सकता है; हालांकि, यह अक्सर अधिक वैद्युतकणसंचलन 36 से पहले alkylate के लिए सुविधाजनक है।

Representative Results

चित्रा 1, पैनल मैं दिखाता है कि cryomilling और चुंबकीय मोती एक साथ नमूना गुणवत्ता में सुधार करने के लिए काम कर सकते हैं। पैनलों IA-सी दिखाना है कि अघुलनशील संबंध कब्जा के लिए इस्तेमाल मध्यम जिसमें सामग्री बरामद proteome 19 प्रभावित कर सकते हैं। ब्याज की प्रोटीन, शुद्ध झंडा टैग बैक्टीरियल alkaline फॉस्फेट (बीएपी), मानव सेल के अर्क में नुकीला था। सी.डी. विशेष के साथ बातचीत और मानव प्रोटीन copurify करने की उम्मीद नहीं है। copurifying प्रोटीन, एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा न्याय के हस्ताक्षर का इस्तेमाल किया, मध्यम के आधार पर विविध। माइक्रोन पैमाने चुंबकीय मोती साफ प्रोफ़ाइल दिखाया, गैर विशिष्ट प्रोटीन सोखना की एक अपेक्षाकृत कम स्तर का संकेत है। पैनलों आईडी और IE वर्णन है कि सेल की विधि भी बरामद proteome प्रभावित कर सकते हैं। दिए गए उदाहरण में, एक अंतर्जात प्रोटीन जटिल (अगले जटिल 37), आत्मीयता captu के अधीन थाcyromilled या sonicated सेल से फिर से 19 निकालता है। कम उच्च द्रव्यमान दूषित पदार्थों को जब सेल निकालने cryomilled सेल पाउडर से तैयार की गई थी मनाया गया।

एक चुनौती है जब संबंध कब्जा का उपयोग कर अंतर्जात प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए यह झूठी सकारात्मक (एफपीएस) से ब्याज की प्रोटीन की सदाशयी शारीरिक interactors भेदभाव करने के लिए मुश्किल हो सकता है। एफपीएस, ट्यूब और जहाजों के लिए गैर विशिष्ट सोखना, आत्मीयता मध्यम, एंटीबॉडी या समानता ligand सहित कई स्रोतों से पैदा होती है और / या ब्याज के ही प्रोटीन कर सकते हैं। नतीजतन, महत्वपूर्ण प्रयास कब्जा करने की प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए समर्पित किया जाना चाहिए। एफपीएस का पता लगाने के लिए एक केंद्रीय चुनौती है जिसके लिए विभिन्न उपकरणों की एक बड़ी संख्या में प्रयोगात्मक 38-40 और कम्प्यूटेशनल 41-43, प्रत्येक दृष्टिकोण अलग पेशेवरों और विपक्ष के साथ शामिल है, विकसित किया गया है बनी हुई है। हमारे अपने प्रयोगों में हम पहले से एफ के एक पैटर्न का उल्लेख कियापी प्रोटीन बाध्यकारी, नियंत्रण सेल के अर्क के साथ α झंडा चुंबकीय माध्यम की ऊष्मायन के बाद प्राप्त की, उस पैटर्न 3xFLAG टैग प्रोटीन की उपस्थिति में प्राप्त से अलग था। इसके अलावा, इन एफपीएस 3xFLAG पेप्टाइड 7 के साथ ऊष्मायन से मध्यम से जारी किया जा सकता है। इस अवलोकन आत्मीय मिलान के अभाव में α झंडा paratope के लिए एफपीएस के अवसरवादी बंधन के साथ संगत है। इस एफपी पृष्ठभूमि की प्रकृति को समझना महत्वपूर्ण है क्योंकि कई अध्ययनों संबंध कब्जा के लिए एक नकली नियंत्रण के रूप में एक untagged 'माता पिता सेल लाइन' का इस्तेमाल होता है; इन नियंत्रणों इसलिए टैग प्रोटीन के साथ बातचीत की विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए अनुपयुक्त हो सकती है। पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए बाध्य हमारे आत्मीयता के माध्यम से योगदान दिया जब एंटीबॉडी paratopes कब्जा कर रहे हैं या नहीं, हम नकली संबंध कब्जा α झंडा चुंबकीय मध्यम और HEK 293T सेल के अर्क (कोई टैग प्रोटीन व्यक्त) उपस्थिति में या एक 3xFLAG के अभाव का उपयोग कर प्रयोगों का आयोजनपेप्टाइड कील में। परिणाम चित्रा 1, पैनल द्वितीय में दिखाए जाते हैं। 7.4 पीएच 20 मिमी HEPES ना में 500 मिमी NaCl और 1% v / v ट्राइटन X-100 युक्त 30 मिनट के लिए (≳10 मिलीग्राम / एमएल कुल प्रोटीन की) संक्षेप में, α झंडा चुंबकीय मध्यम सेल के अर्क में incubated था। मध्यम तो 1 मिलीग्राम / एमएल 3xFLAG पेप्टाइड के साथ incubated था प्रतिस्पर्धात्मक रूप α झंडा paratope natively या एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के साथ करने के लिए बाध्य कर एक अप्राकृतिकरण क्षालन प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रोटीन विस्थापित करने के लिए। इसके अतिरिक्त, एक ही प्रयोग किया गया था जब सेल के अर्क 1 माइक्रोग्राम / एमएल और 10 माइक्रोग्राम / 3xFLAG पेप्टाइड की मिलीलीटर के साथ नुकीला कर रहे थे। सभी eluted अंशों एसडीएस पृष्ठ और चांदी धुंधला के अधीन थे। हमने देखा है कि अपने आत्मीय मिलान के अभाव में, α झंडा मध्यम पृष्ठभूमि प्रोटीन है कि 3xFLAG पेप्टाइड के साथ eluted जा सकता है की एक detectable स्तर पर कब्जा करता है - चित्रा 1-द्वितीय द्वारा दिए गए उदाहरण में, एक प्रमुख प्रजातियों के 37 और बीच में मनाया गया 50 केडीए। पैटर्न के साथ elutedएसडीएस पृष्ठ नमूना बफर अतिरिक्त प्रमुख प्रजातियों के साथ तुलनीय था। हालांकि, 1 माइक्रोग्राम / एमएल 3xFLAG पेप्टाइड की उपस्थिति में, एफपी आत्मीयता के माध्यम के लिए बाध्यकारी का पता लगाने के स्तर से नीचे करने के लिए हटा दिया गया है और या तो देशी या denaturing क्षालन भागों में नहीं मनाया गया। इस परिणाम से पता चलता है खाली एंटीबॉडी paratopes उनकी आत्मीय मिलान के अभाव में अनेक जा सकता है और यहां तक ​​कि proteome एंटीबॉडी कि उच्च संबंध में उनके मिलान बाँध के लिए संबंध कब्जा के दौरान प्राप्त करने के लिए काफी योगदान है, के रूप में 3xFLAG / α झंडा M2 के लिए मामला है बाँधना। यह भी suggestd उच्च नमक, अक्सर बाध्यकारी कम करने के लिए गैर विशिष्ट, चुने का उपयोग बहुत कठोर परिस्थितियों प्रतिजन / एंटीबॉडी बातचीत के अभाव में अप्रभावी हो सकता है। अनुवर्ती करने के लिए हम एसडीएस पृष्ठ के साथ ही मात्रात्मक एमएस (छवि। एस 1) द्वारा एक समान सहित प्रयोग विश्लेषण किया। 347 प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की, हमने देखा है कि हर प्रोटीन एक (झूठी डिस्को के लिए बचाबहुत दर = 1%; के रूप में की तुलना में एक 3xFLAG पेप्टाइड नियंत्रण नमूना नुकीला टेबल S1) 3xFLAG टैग चारा प्रोटीन के साथ जुड़े थे। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे प्रयोगों में मनाया प्रोटीन की भारी बहुमत टैग प्रोटीन के साथ सह-शुद्ध करने के लिए की संभावना है या खाली α झंडा paratopes के उत्पादों के द्वारा बंद लक्ष्य कर रहे हैं। हमारे अनुभव में, उच्च संकेत करने वाली शोर संबंध कब्जा परिणाम, तेज प्रचुर मात्रा में और मोटे तौर पर stoichiometric बैंड के साथ ही अन्य हल्की बैंड से पृष्ठभूमि धुंधला की कमी का एक असतत पैटर्न द्वारा एसडीएस पृष्ठ और प्रोटीन धुंधला में उदाहरण कर रहे हैं; इस सिद्धांत के कई उदाहरण संदर्भ 11 में देखा जा सकता है।

एक PTFE इन्सुलेटर का उपयोग कर (जो सिफारिश की है) जब cryomilling के लिए मकसद मिलिंग के दौरान जार की वार्मिंग की दर को कम करने, मिलिंग की प्रक्रिया के दौरान बार-बार एल.एन. 2 ठंडा करने के बोझ को कम करने, और बर्फ की डिग्री को कम करने के लिए हैजार में गठन। यह लगातार मिलिंग प्रदर्शन की सुविधा और सेल पाउडर की हैंडलिंग को आसान बनाता है। उदाहरण इंसुलेटर संदर्भ में पाया जा सकता है 27 (pucks) और चित्रा 2, नीचे (आस्तीन और पक) में दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि परिणाम का चयन करें। (I) इस पैनल संदर्भ 19 से संशोधित किया गया है। Coomassie ब्लू एसडीएस polyacrylamide जेल दाग। (बाएं) माइक्रोन पैमाने चुंबकीय मोती बंद लक्ष्य agarose आधारित मीडिया से बाध्यकारी कम दिखा। (ए) चुंबकीय मोती; (बी) के पारंपरिक agarose; (सी) लोहे की गर्भवती (चुंबकीय) agarose; प्रत्येक विरोधी झंडा M2 एंटीबॉडी के लिए युग्मित और झंडा टैग बैक्टीरियल alkaline फॉस्फेट पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया (बीएपी, लेबल) cryomilled HEK 293 कोशिकाओं से उत्पादित अर्क में नुकीला। Agarose आधारित शुद्धिकरणगैर विशिष्ट सोखना (लेबल हटाया गया बैंड) के उच्च स्तर से पता चला है। (दाएं) cryomilled हेला कोशिकाओं से उत्पादित अर्क sonication द्वारा उत्पादन की तुलना में एंटीबॉडी मिलकर चुंबकीय मोती पर कम बंद लक्ष्य सोखना दिखा रहे हैं जब एक अंतर्जात प्रोटीन जटिल शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया। एलएपी टैग 44 RBM7 आत्मीयता के अगले जटिल 19,37 (डी) को शुद्ध करने के पॉलीक्लोनल विरोधी GFP एंटीबॉडी के लिए मिलकर चुंबकीय मोती का उपयोग कर कब्जा cryomilled पाउडर से उत्पादित निकालें गया था; (ई) के अर्क बरकरार कोशिकाओं के sonication द्वारा उत्पादन किया। खड़ी काली पट्टी जेल जहां उच्च बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट interactors sonication द्वारा तैयार नमूने में समृद्ध होने के लिए मनाया जाता है की एक क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया। काला तीर उम्मीद विशिष्ट interactors संकेत दिया (लेबल)। गलियों डी और ई में मनाया ~ 50 केडीए बैंड लामा आईजीजी भारी जंजीरों के कारण कर रहे हैं। (द्वितीय) चांदी एसडीएस polyacrylamide जेल दाग। (एसटीडी।) एक नकली संबंध कब्जा HEK-293 पर बाहर कियाटी सेल मानक रास्ते में निकालता है। कब्जा करने के बाद, बाध्य सामग्री का क्षालन के माध्यम से (एन) 1 मिलीग्राम / एमएल 3xFLAG पेप्टाइड या (डी) एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में क्षालन denaturing साथ गैर denaturing क्षालन हासिल की थी; (पीबी 1) एसटीडी के रूप में। लेकिन 3xFLAG पेप्टाइड 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में निष्कर्षण समाधान आत्मीयता के माध्यम पर α झंडा paratopes को ब्लॉक करने में शामिल किया गया था; (पीबी 10) पीबी 1 के रूप में लेकिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल 3xFLAG पेप्टाइड की उपस्थिति में। आईजीजी संबंधी बैंड और 3xFLAG पेप्टाइड लेबल रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: आस्तीन और पक PTFE इन्सुलेटर। एक 250 मिलीलीटर PTFE जार दिखाया गया है (1)। एक 50 मिलीलीटर स्टेनलेस स्टील मिलिंग जार (2) PTFE जार (3) के अंदर फिट बैठता है और प्रदान करता हैअवसर मिलिंग जार चक्रों के बीच चक्की के भीतर स्थापित छोड़ने के लिए। एक ऊपरी PTFE इन्सुलेटर पक (2) दबाना विधानसभा और जार ढक्कन के बीच किया जाता है। स्थापित जार और इन्सुलेटर विधानसभा (3) शांत करने के लिए, एल.एन. 2 इन्सुलेटर के शरीर में सीधे जोड़ा जाता है, जार के आसपास। मिलिंग के अगले चक्र तो शुरू किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक सुझाए गए एकाग्रता टिप्पणियाँ
सोडियम क्लोराइड 0.1-0.5 एम उच्च सांद्रता (> 300 मिमी) कुल प्रोटीन की निकासी में सुधार और पृष्ठभूमि को कम रखने के लिए करते हैं, लेकिन कुछ नहीं तो स्थिर इंटर दूर पट्टी सकता हैअभिनेताओं। 150 मिमी नीचे सांद्रता आम तौर पर गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि को कम करने में प्रभावी नहीं हैं।
अम्मोणिउम असेटट 0.2-2 एम एक नमक, दो बफ़र्स से मिलकर, कि एक तटस्थ पीएच समाधान 57 पैदावार। उच्च सांद्रता कुछ प्रोटीन परिसरों को स्थिर। अम्लीय समाधान अमोनिया नुकसान के कारण वर्ष, अनुचित तरीके से संग्रहीत क्रिस्टलीय शेयरों से परिणाम कर सकते हैं। कोई अतिरिक्त पीएच बफर या लवण अमोनियम एसीटेट युक्त extractants में आवश्यक हैं। प्राप्त परिणामों मिलाना NaCl के साथ जोड़ा जा सकता है।
बीच 20 0.1% v / v एक गैर ईओण डिटर्जेंट 58; आम तौर पर सोडियम क्लोराइड के साथ संयुक्त।
ट्राइटन X-100 0.5-1% v / v एक गैर ईओण डिटर्जेंट 58; आमतौर पर या तो सोडियम क्लोराइड या एनएच 4 सीएच 3 सीओ 2 एच के साथ संयुक्त
CHAPS 5 मिमी एक zwitterionic डिटर्जेंट 58 </ Sup>; आम तौर पर सोडियम क्लोराइड के साथ संयुक्त।
Sarkosyl 1 मिमी एक anionic डिटर्जेंट 58 कि पृष्ठभूमि कम कर देता है और स्थिर जटिल घटक बंद पट्टी कर सकते हैं, संभावित बाइनरी कनेक्टिविटी खुलासा; आम तौर पर सोडियम क्लोराइड के साथ संयुक्त।
Tris-सीएल 20 मिमी pK 4 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस पर 8.1 से 8.8 के एक।
(8.0 पीएच)
HEPES ना 20 मिमी pK 4 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस पर 7.5 से 7.8 के एक। NaOH या Koh नमक के आधार पर पीएच संतुलन के लिए प्रयोग किया जाता है (जैसे, सोडियम क्लोराइड, KCl, या सीएच 3 सीओ 2 कश्मीर) निकासी में इस्तेमाल किया।
(7.4 पीएच)

तालिका 1: प्रोटीन परिसरों सफ़ाई के लिए कुछ सुझाव अभिकर्मकों उपयोगी है। इस तालिका में एलकुछ अभिकर्मकों हम मानव कोशिका लाइनों से शुद्ध प्रोटीन परिसरों के लिए उपयोगी पाया है, काम कर सुझाव सांद्रता के साथ ists। एक ठेठ निकासी सूत्रीकरण एक पीएच बफर, एक नमक, और एक साबुन 1,11,24,45-48 शामिल हैं। सबसे अच्छा अभ्यास है कि वांछित परिणाम पैदावार अभिकर्मकों के कम से कम जटिल संयोजन की पहचान है।

चित्रा एस 1
चित्रा एस 1: झूठी सकारात्मक की शुद्धि (map-) SILAC विश्लेषण के बाद मिक्स। मैं योजनाबद्ध आरेख: इस प्रयोग में 3xFLAG टैग ORF2p प्रोटीन परिसरों (pLD401 से व्यक्त) भारी और हल्के लेबल HEK-293T कोशिकाओं 7 से शुद्ध कर रहे थे, क्रमशः। प्रकाश लेबल सेल निकालने प्रतिस्पर्धी निषेध द्वारा 3xFLAG टैग ORF2p के संबंध कब्जा रोकने के लिए 3xFLAG पेप्टाइड के साथ नुकीला किया गया था; इस प्रोटीन है कि गैर-specifi उत्पन्न हो सकने के बंधन को ब्लॉक करने की उम्मीद नहीं हैचुंबकीय मध्यम या एंटीबॉडी के गैर paratopic संरचनाओं के साथ बड़ी सफाई। चुंबकीय मोतियों से क्षालन के बाद, भारी और हल्के नमूने मिश्रित पोस्ट-शुद्धि और मात्रात्मक एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया (एमएपी-SILAC 39) या तो नमूने के साथ जुड़े प्रोटीन के अंश का निर्धारण करने के लिए; आगे पद्धति टेबल एस 1 में स्थित विस्तार। द्वितीय। रजत को दर्शाता हुआ कि प्रकाश और भारी लेबल सामग्री उपज तुलनीय परिणाम (एच एल के साथ तुलना) दाग जेल, और शुद्धि 3xFLAG कील में (ली) की उपस्थिति में आयोजित प्रतिस्पर्धात्मक रूप से हिचकते था। नीचे, एक Coomassie ब्लू जी 250 दाग जेल, टेबल एस 1 में वर्णित के रूप में मिश्रित एच और लाइट भिन्न, जेल आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण करने से पहले से मिलकर प्लग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

टेबल S1:एमएपी SILAC। इस शीट डाटा मानचित्र-SILAC प्रयोग चित्रा एस 1 में वर्णित के निष्पादन पर प्राप्त होता है। इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ये तीन प्रोटोकॉल मिलकर काम करने के लिए (1), cryomilling द्वारा ठोस राज्य टूटना लिए कोशिकाओं को तैयार (2) एक ग्रहों गेंद चक्की में टूटना प्राप्त करने, और (3) को पकड़ने के साथ परिसर में ब्याज की एक प्रोटीन से एफ़िनिटी के लिए सेल पाउडर से अर्क का उत्पादन अपनी शारीरिक interactors। कई अलग अलग सेल तकनीक मौजूद है, यांत्रिक / शारीरिक कुचल प्रभाव, बाल काटना, और / या दबाव को रोजगार के दृष्टिकोण, साथ ही रासायनिक / एंजाइमी दृष्टिकोण, विभिन्न पेशेवरों और विपक्ष 49,50 के साथ प्रत्येक शामिल है। प्रत्येक अन्वेषक मन है कि सेल टूटना और प्रोटीन निकासी के लिए किसी भी चुना दृष्टिकोण पूर्वाग्रहों 51,52 अनुभवजन्य अनुकूलन (नीचे) पर चर्चा की जरूरत महसूस शुरू करने की संभावना है में रखते हुए उनके विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त तरीकों का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। यांत्रिक तरीकों उच्च गर्मी और / या बाल काटना बलों जो प्रोटीन परिसरों को बाधित कर सकते हैं उत्पादन हो सकता है। Cryomilling रोजगार टी के लिए नमूने एल एन 2 ठंडा करने की हैसियत से हीटिंग प्रभाव से बचा जाता हैवह प्रक्रिया की अवधि। ग्रहों की गेंद मिलों कण आकार में कमी 53,54 के घटक के रूप कतरनी तनाव सहित प्रभाव और घर्षण बलों, पर भरोसा करने के लिए, समझ रहे हैं। सेटिंग्स पर सूचना दी कि हम प्रोटीन परिसरों का अध: पतन नहीं मनाया है। वास्तव में हम निकाला और जाहिरा तौर पर बरकरार ~ 50 एमडीए परमाणु ताकना परिसरों 11 और enzymatically सक्रिय रोजगार 'कोमल' डिटर्जेंट आधारित सेल 7 तैयारियों की तुलना में अधिक विशिष्ट गतिविधि का प्रदर्शन करते retrotransposons लिया गया है। सेल के रासायनिक / एंजाइमी तरीकों सीमा यह है कि सेल की सामग्री को इन विट्रो परिवेश कोशिका झिल्ली और संरचनात्मक अणुओं के विघटन का समर्थन करता है लेकिन प्रोटीन जटिल की अखंडता को बनाए रखने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि (es में जारी कर रहे हैं से ग्रस्त ) ब्याज की। अक्सर, न परिसरों के घटक ब्याज की प्रोटीन के साथ बनाई है और न ही स्थिति को स्थिर करने के लिए लक्ष्य परिसरों हैं की जरूरतअग्रिम में जाना जाता है। ठोस राज्य मिलिंग का एक प्रमुख लाभ यह है कि टूटना और निकासी uncoupled हैं, स्रोत सामग्री की अनुमति देने, कहा तरल से मुक्त करने के लिए तैयार किया, (-80 डिग्री सेल्सियस या नीचे) पर संग्रहीत कमाया, और आसानी से मांग पर प्रयोग के लिए लिया गया है; उदाहरण के लिए, आत्मीयता को पकड़ने के लिए इन विट्रो की स्थिति में अनुकूलित पता लगाने के लिए। प्रोटीन बातचीत उच्च एकाग्रता 55,56 पर सबसे अधिक स्थिर रहे हैं, इसलिए न्यूनतम करने निकासी की मात्रा शारीरिक बातचीत के संरक्षण के लिए फायदेमंद हो सकता है। दूसरी ओर, वहाँ व्यावहारिक विचार कर रहे हैं - प्रोटीन परिसरों, कोशिकाओं के बाहर और एक गैर चिपचिपा जलीय चरण, अघुलनशील समुच्चय के लिए मुफ्त में विभाजित किया जा करने के लिए आदेश आत्मीयता के माध्यम के साथ लक्ष्य परिसरों आपस में मिलना में की जरूरत है। इसके अलावा, कुछ मानकीकरण और इन विट्रो पर्यावरण (पीएच, नमक एकाग्रता, आदि) पर नियंत्रण systematization और reproducibility के लिए आवश्यक है। हम जानते हैं कि जनसंपर्क के अर्क लगानेके कमजोर पड़ने रेंज में oduced 1: 4-1: 9 (डब्ल्यू: वि) व्यावहारिक और सैद्धांतिक चिंताओं, गुणवत्ता परिणाम उपज को संतुष्ट। इसके अतिरिक्त, सेल निकालने का इष्टतम अनुपात मध्यम जरूरतों से एफ़िनिटी के लिए निर्धारित किया जाना है। इस संबंध माध्यम की मात्रा बदलती के साथ अर्क का अनुमापन द्वारा अनुभव से किया जाता है और प्रयोग के संकेत करने वाली शोर अनुपात पर पहचाने जाने प्रभाव हो सकता है, आगे से नीचे चर्चा की। लक्ष्य प्रोटीन की एक बहुत कमी आम तौर पर लक्ष्य प्रोटीन की घुलनशील अंश का ≥70% है, लेकिन> 90% वांछनीय है और निकासी की स्थिति से सावधान parameterization के साथ प्राप्त किया जा सकता है। कई ऐसे व्यावहारिक दृष्टिकोण संदर्भ 1 में कवर कर रहे हैं। समचुंबक मोती, एक विशेष microcentrifuge ट्यूब धारक में neodymium चुंबक का उपयोग चालाकी हालांकि घर का बना लिए विकल्प व्यवहार्य हैं। जब धारक के भीतर रखा, मोती चुंबकीय क्षेत्र के प्रभाव में ट्यूब के पक्ष में इकट्ठा। समाधान तो di बिना हटाया जा सकता हैमोती sturbing।

प्रस्तुत cryomilling प्रोटोकॉल की एक सीमा है, यहां इस्तेमाल किया ग्रहों की गेंद चक्की के साथ विकसित (सामग्री की तालिका देखें), कि सामग्री की एक न्यूनतम राशि को प्रभावी ढंग से मिल करने के लिए आवश्यक है और इस डिवाइस (> 1 ग्राम) का उपयोग सेल पाउडर ठीक हो जाता है। इस तरह की मात्रा में आसानी से कई रोगाणुओं, सेल लाइनों, और मॉडल जीवों के साथ प्राप्त कर रहे हैं, और यह भी अक्सर प्रयोगशाला जानवरों से excised ऊतकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कुछ सेल लाइनों के लिए बहुत मुश्किल बहुतायत और जानवरों के ऊतकों में विकसित करने के लिए दुर्लभ हो सकता है हो सकता है। सामग्री की छोटी मात्रा तुलनात्मक पाउडर सुंदरता हासिल की बलिदान पर छोटे कंटेनरों का उपयोग अन्य उपकरणों का उपयोग कर milled किया जा सकता है, हालांकि संभवतः। इसके अलावा, यांत्रिक मिलिंग उपकरणों की लागत कुछ प्रयोगशालाओं के लिए बेहद महंगा हो सकता है। हाथ से Cryomilling विकल्प setups 14-19 के एक नंबर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता, सहित, सबसे affordably एक कीट का उपयोग करLe और मोर्टार, हालांकि टूटना दक्षता काफी चला जाता है। संबंध कब्जा प्रोटोकॉल आम तौर पर सेल के एक उच्च दक्षता के समाधान में अधिक से अधिक प्रोटीन निकासी और इसलिए, लक्ष्य प्रोटीन परिसरों के कब्जा करने के लिए अधिक से अधिक संभावित सुविधा प्रदान करने के लिए लक्ष्य। दूसरी ओर, यह इन विट्रो splicing में खमीर के लिए प्रदर्शन किया गया है निकालता है कि अधिक से अधिक सेल इन विट्रो जैव रासायनिक गतिविधि 57,58 में अधिक से अधिक के साथ समानता नहीं हो सकती है। हम सिस्टम हम इस प्रकार अब तक का परीक्षण किया है में इस तरह की समस्याओं को नहीं देखा है, और जब cryomilling इसलिए जानबूझकर अपने सेल टूटना सीमित नहीं है। फिर भी, इस संभावना को ध्यान में रखते हुए जब इन विट्रो enzymatic assays के लिए अनुकूलन वहन किया जाना चाहिए। हालांकि cryomilling कोशिकाओं को तोड़ने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी तरीका है, sonication के एक सीमित मात्रा में अक्सर स्तनधारी ऊतकों से उत्पादन समरूप पूरे सेल अर्क लाभ क्योंकि inhomogeneous समुच्चय कभी कभी दृश्य निरीक्षण द्वारा मनाया जा सकता है: आम तौर परनिकासी की स्थिति में कम नमक का उपयोग कर (100-300 मिमी) और गैर ईओण डिटर्जेंट (0.1-1% वी / वी) सांद्रता के लिए उदार। क्योंकि हमने देखा है कि इन समुच्चय की उपस्थिति उपज और / या बाद के संबंध कब्जा की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं, हम नियमित रूप से उन्हें तितर-बितर करने के लिए (यहां तक ​​कि जब वे नग्न आंखों से नहीं मनाया जाता है) sonication को लागू करने। समुच्चय समुच्चयित झिल्ली टुकड़े, पहले से milled खमीर कोशिकाओं 58 से निष्कर्षों की रिपोर्ट में उन लोगों के बराबर के साथ संगत कर रहे हैं। Sonication भी डीएनए कतरनी और समाधान में chromatin टुकड़े आजाद कराने के लिए कुछ प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, हालांकि sonication की डिग्री इस प्रोटोकॉल में लागू appreciably टुकड़ा डीएनए नहीं करता है। सीमित उपलब्धता (या उच्च लागत) एक उत्कृष्ट समानता ligand या ब्याज की विशेष प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का एक और बाधा हो सकती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समानता अभिकर्मकों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया जा सकता है जब मॉडल जीव जीनोमिक टैगिंग या टीआर के लिए उत्तरदायी हैअस्थानिक अभिव्यक्ति वैक्टर, आत्मीयता टैग fusions के रूप में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के साथ ansfection। हालांकि, कस्टम एंटीबॉडी के उत्पादन में तेजी से संभव हो गया है और दोनों पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संबंध कब्जा अनुप्रयोगों में उत्कृष्ट प्रदर्शन कर सकते हैं। ये कई कारणों से भी संदर्भ 1 में अधिक से अधिक विस्तार में शामिल किया जाता है।

कैसे सेल विधि और आत्मीयता के माध्यम के चुनाव परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं के उदाहरण चित्रा 1 में सचित्र हैं। अलग extractants द्वारा लगाए गए प्रभाव के उदाहरण संदर्भों 1,11,24 में देखा जा सकता है। क्योंकि इन और अन्य प्रयोगात्मक मापदंडों संबंध कब्जा की गुणवत्ता को प्रभावित यह मुश्किल एफपीएस भेदभाव करने के लिए कर रही है, "मनका proteomes" और कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण के खजाने को खत्म करने की गैर विशिष्ट contaminants एफपीएस 40-43 की पहचान करने में सहायता करने के लिए विकसित किया गया है। फिर भी, इस तरह के दृष्टिकोण केवल substitएक सीमित डिग्री करने के लिए 59 इष्टतम नमूना तैयार करने के लिए संस्थान। सर्वोत्तम प्रथाओं के अवलोकन और अनुभव से अनुकूलन के संबंध कब्जा प्रयोग बहाव के विश्लेषण के लिए उच्चतम गुणवत्ता के नमूने प्रदान करेगा, आगे नीचे चर्चा की। एक आसानी से लागू अभ्यास है कि नमूना पवित्रता सुधार कर सकते हैं मूल निवासी क्षालन है। मूल निवासी क्षालन सबसे अक्सर समानता पृथक प्रोटीन जटिल, अक्षत, आगे प्रयोग के लिए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है; लेकिन के रूप में यह अक्सर नमूना पवित्रता को बढ़ाता है, यह भी इस कारण अकेले के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, के रूप में चित्रा 1, पैनल द्वितीय में प्रदर्शन, देशी क्षालन की क्षमता नमूना शुद्धता में सुधार करने के लिए सेल निकालने में लक्ष्य प्रोटीन की प्रचुरता के लिए आत्मीयता के माध्यम की मात्रा का एक सटीक अनुमापन पर निर्भर हो सकता है - मध्यम अधिक है जब , खाली paratopes एफपी प्रोटीन natively eluted भागों में नमूदार के बंद लक्ष्य संचय अनुमति दे सकता है। अभिकर्मकों और यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, यह जहमारा अनुभव रहा है कि के रूप में हमारे प्रयोगों के लिए एफपीएस के लिए सबसे बड़ा एकल योगदान टैग प्रोटीन ही एक बार जीवित कोशिका के संदर्भ से हटा दिया है। (छवि। 1.II और अंजीर। एस 1)। ऐसे मामलों में, माता पिता का नियंत्रण सेल लाइन है कि प्रतिजन के अभाव में अप्रासंगिक proteomes उपज कोई व्यावहारिक मूल्य के हैं; वैसे ही-ही टैग या कील में नियंत्रण है कि कुछ भी लेकिन लक्ष्य प्रतिजन से रहित हैं के लिए। इसलिए, जब भी हम व्यावहारिक मैं गंदगी 7,38, जो सीधे पोस्ट-सेल प्रोटीन मात्रात्मक एमएस का उपयोग कर बातचीत के संचय के उपायों को लागू। जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 3.2.7 में उल्लेख किया है, देशी क्षालन के लिए प्रक्रियाओं आत्मीयता के इस्तेमाल प्रणाली के विवरण के साथ अलग अलग होंगे। मूल निवासी क्षालन सबसे अधिक टैग की टैग प्रोटीन जटिल या प्रोटिओलिटिक दरार की प्रतियोगी विस्थापन द्वारा हासिल की है, आत्मीयता के माध्यम से जटिल जारी है। कई आकर्षण सिस्टम छोटे मिलान टैग के शामिल मौजूद हैं, के लिएआर मिलान में ही पेप्टाइड टैग प्रोटीन परिसरों 60 के प्रतिस्पर्धी क्षालन के लिए उपयोगी के रूप में उपलब्ध है। इसी तरह, कई proteases टैग विशेष रूप से आत्मीय साइटों रणनीतिक समानता में रखा फोड़ना के लिए उपलब्ध हैं संलयन प्रोटीन 61। चुने हुए समानता सिस्टम की बारीकियों पर निर्भर करता है, उचित क्षालन योजना को अपनाया जा सकता है।

आम तौर पर, प्राप्त परिणामों की गुणवत्ता में काफी नमूना तैयार की गुणवत्ता से प्रभावित हो जाएगा। यह जबकि देखभाल और परिशुद्धता बनाए रखने इन प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के माध्यम से ध्यान से और ठीक से काम करने के लिए, और के रूप में तेजी से संभव के रूप में महत्वपूर्ण है। यह प्रत्येक चरण के माध्यम से ब्याज की प्रोटीन के विभाजन को ट्रैक करने के लिए प्रत्येक में गड़बड़ी की दक्षता को समझने की सलाह दी जाती है। उदाहरण के लिए: सेल या प्रश्न में ऊतकों में ब्याज की प्रोटीन प्रचुर मात्रा में कैसे है? शायद अध्ययन (और उसके परिसरों) के तहत प्रोटीन जन द्वारा चिह्नित करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगाकम बहुतायत के कारण स्पेक्ट्रोमेट्री। शुद्ध परिसरों सामान्य प्रोटीन धुंधला (लगभग रेंज nanograms) द्वारा detectable हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री सफल होने की संभावना है। ब्याज की कब्जा कर लिया प्रोटीन केवल संवेदनशील बढ़ाया chemiluminescent पश्चिमी सोख्ता (लगभग picogram रेंज) द्वारा पता लगाया जा सकता है, तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री कम प्रभावी होने की संभावना है। यहां तक ​​कि अगर ब्याज की प्रोटीन कोशिका में प्रचुर मात्रा में है, कैसे प्रचुर मात्रा में उत्पादन सेल निकालने में यह क्या है? समाधान के लिए प्रोटीन विभाजन करता है या यह गोली में है? यदि बाद, एक नया निष्कर्षण समाधान तैयार किया जा सकता है कि वसूली में सुधार हो सकता। एक बार सेल निकालने आत्मीयता के माध्यम के साथ संयुक्त है, कैसे प्रभावी ढंग से प्रोटीन कब्जा कर लिया है? प्रोटीन बाद washes के माध्यम से बंधे रहना पड़ता है? क्या अन्य copurifying प्रोटीन के बारे में? प्रोटोकॉल के लिए उचित कदम पर प्रत्येक नमूने की एक विभाज्य बचत करके इन सवालों को आसानी से पश्चिमी सोख्ता से उत्तर दिया जा सकता है, आम तौर पर ब्याज की प्रोटीन के खिलाफया सामान्य प्रोटीन धुंधला है, लेकिन अन्य assays भी उपयुक्त हो सकता है। हर कदम का अनुकूलन, उपज और कब्जा कर लिया परिसरों की शुद्धता को बढ़ाने हालांकि हो सकता है वहाँ एक व्यापार बंद एक विशेषता या अन्य को अधिकतम करने में किए जाने के लिए होगा।

कई शोधकर्ताओं के लिए संबंध कब्जा का एक विशिष्ट आवेदन ब्याज की प्रोटीन की एक छोटी संख्या के लिए विवो interactors में उम्मीदवार की पहचान है; इन उम्मीदवारों में आमतौर पर शारीरिक interactors की जैविक महत्व को प्रदर्शित करने के विवो में ओर्थोगोनल दृष्टिकोण द्वारा सत्यापन के अधीन हैं। संबंध कब्जा भी उच्च throughput अध्ययन से कार्यरत है, एक (लगभग) proteome व्यापक आधार पर मनाया प्रोटीन copurifying विवो परिसरों में ख्यात विषय में कम्प्यूटेशनल अनुमान की सुविधा की सूची उत्पन्न करने के लिए। इस तरह के अध्ययन के कई उदाहरण साहित्य में पाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की खोज के आदमी के पक्ष में किसी भी लक्ष्य के लिए कब्जा की शर्तों के अनुकूलन foregoesY लक्ष्य; इस तरह, अनुमानित परिसरों के रूप में खुद को शायद ही कभी पूरी तरह से बरकरार है और किसी भी नमूने में अत्यधिक शुद्ध प्राप्त कर रहे हैं। दरअसल, कई अलग आकर्षण कब्जा कर लिया नमूनों के बीच मनाया रचनाओं में आंशिक ओवरलैप अनुमान 42 का एक आधार के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। दोनों दृष्टिकोण interactome के बारे में हमारी समझ के लिए मूल्यवान डेटा योगदान करते हैं। फिर भी, संबंध कब्जा से एक बड़ा लाभ यह है कि यह अक्सर परिसरों बरकरार है और उच्च शुद्ध है, बशर्ते कि प्रयासों प्रक्रिया अनुकूलन करने के लिए बना रहे हैं प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। हम मानते हैं कि दृष्टिकोण के भविष्य के शारीरिक interactors और आगे बहाव के जैव रासायनिक, enzymological में अधिक लगातार उपयोग करते हैं, और संरचनात्मक अध्ययन के सरगम की अधिक सटीक आकलन के लिए आसानी और अंतर्जात प्रोटीन परिसरों 11 का कब्जा अनुकूलन की क्षमता, बढ़ाने में निहित है, उदाहरण के लिए, संदर्भ 7,9,23।

Acknowledgments

हम अपने अमूल्य सलाह, समर्थन, और एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए पहुँच है, साथ ही सुश्री केली आर Molloy के लिए प्रोफेसर ब्रायन टी Chait धन्यवाद। हम कॉपी संपादन के साथ समर्थन के लिए सुश्री केली नंगे धन्यवाद। यह काम एनआईएच अनुदान P41GM109824, P41GM103314, और P50GM107632 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

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References

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Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा
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LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).

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