Summary
Vi beskriver en robust genet erstatning strategi for å genetisk manipulere sote sopp Ustilago maydis. Denne protokollen forklarer hvordan å generere delesjonsmutanter å undersøke smitte fenotyper. Den kan utvides til å modifisere gener i enhver ønsket måte, for eksempel ved å legge til en sekvens som koder for en fluorescerende protein tag.
Abstract
Gene sletting spiller en viktig rolle i analysen av genfunksjon. En av de mest effektive metoder for å forstyrre gener i en målrettet måte er utskifting av hele genet med en selekterbar markør via homolog rekombinasjon. I løpet av homolog rekombinasjon, utveksling av DNA finner sted mellom sekvenser med høy likhet. Derfor kan lineære genomiske sekvenser som flankerer et målgen kan brukes for spesifikt å dirigere en selekterbar markør til den ønskede integreringssete. Butte ender av konstruksjonen slettingen aktiverer cellens DNA reparasjonssystemer og derved fremmer integrering av konstruksjonen enten via homolog rekombinasjon eller ved ikke-homolog-ende-sammenføyning. I organismer med effektiv homolog rekombinasjon, kan graden av vellykket genet delesjon nå mer enn 50% gjør denne strategien en verdifull gen avbrudd system. Den sote sopp Ustilago maydis er en eukaryot modell mikroorganisme som viser en slik effektiv homolog rekombinantion. Ut fra sine ca 6900 gener, mange har blitt funksjonelt preget med hjelp av delesjonsmutanter, og gjentatt svikt i genet erstatning forsøk punkter viktig funksjon av genet. Påfølgende karakterisering av genet funksjon ved å merke med fluorescerende markører eller mutasjoner av predikerte domener er også avhengig av DNA utveksling via homolog rekombinasjon. Her presenterer vi U. maydis belastning generasjon strategi i detalj ved hjelp av de enkleste eksempel genet sletting.
Introduction
Ustilago maydis er en fytopatogene modell sopp som har blitt studert i flere tiår 1,2. Det finnes i to morfologi, en gjær-aktig, ikke-patogene scenen og en trådformede, smittsomme skjema 3. Universal gjennombrudd funn som homolog rekombinasjon og DNA-reparasjonsmekanismer ble gjort i gjær-lignende vekst stadium av denne soppen 4. Videre morfologiske bryteren til smittsomme filament og virulensfaktorer viktige for smitte er godt karakterisert 5,6. Den økende molekyl kunnskap om biologi og virulens av denne sote sopp er avhengig av en enkelt gen erstatning strategi 7-9 støttet av en utmerket genom merknad 10 og den enkle revers genetikk bruker, for eksempel den velorganiserte plasmid samlingen på vårt institutt (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserte, raske smitteforsøk i mais seedlings tillate detaljerte studier av patogenitet faktorer 11.
Genomet til U. maydis inneholder rundt 6900 gener 10. For å studere deres funksjon, kan de slettes enkeltvis eller i kombinasjon på grunn av en effektiv homolog rekombinasjon system. Flankerende regioner av omtrent 1 kb inneholdende en perfekt homologe ender er ideelle for forekomst av homolog rekombinasjon større enn 50%, men allerede 250 bp med ikke-homologe ender tillate en viss grad av riktig integrering av konstruksjonen 9. Foreløpig fem forskjellige motstands kassetter, hygromete, cbxR, natR, G418R og phleoR formidling motstand mot hygromycin, karboksin, nourseothricin, G418 og phleomycin, er ansatt for å velge for trans 7,9. I tillegg har hygromycin resistens blitt utviklet til en resirkulerbar kassett (FRT-hygromete) som kan fjernes ved den forbigående ekspresjon av et heterologt FLP rekombinase 12. Dette tillater fjerning av motstanden kassetten og derved i teorien ubegrenset genetiske modifikasjoner. Phleomycin er mutagent 13, slik at med de nye kassetter, spesielt den resirkuler hygromete kassetten, bruk av phleoR er avtagende. Firedoble mutanter kan således bli generert ved hjelp av de øvrige fire kassetter, men for firemannsrom mutanter, blir FRT-hygromete system anbefales 14.
Denne generelle strategien genet sletting har blitt overført til andre sote sopp som Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, eller U. esculenta 17 og derfor tilbyr muligheter for videre søknader i ennå genetisk låste organismer med en effektiv homolog rekombinasjon system. Videre kan organismer som mangler homolog rekombinasjon bli modifisert for å forbedre genetisk modifisering som eksemplifisert ved sletting av gener som er involvert i ikke-homolog-end-bli med i Neurospora crassa 18,19.
Her beskriver vi publiserte genet sletting strategi for U. maydis 7,9 i eksperimentell detalj med fokus på rask og nøyaktig verifisering av kandidatene. Som et eksempel, bruker vi sopp kitinaser og skildrer generasjonen av enkelt mutanter samt flere sletting stammer 20,21. Kitinaser er interessante eksempler, fordi de handler på kitin i den stive celleveggen. Celleveggen ombygging er nødvendig for morfologiske endringer under celledeling, bytte til trådformede vekst, og sporedannelse. Derfor, i delesjonsmutanter fenotyper gjennom hele livssyklusen kan forventes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon Sletting konstruerer
- Generer et plasmid inneholdende konstruktet delesjon (figur 1) som omfatter et respektivt 1 kb oppstrøms flanke (UF) og nedstrøms flanke (DF) hver, og den passende motstand kassetten flankert av butte skjærerestriksjonsseter.
MERK: Enhver kloning strategi kan brukes (for kloning se referanse 22) anbefaler vi Golden Gate kloning for slike plasmider 9. - Eksisere sletting konstruere fra plasmidet ved hjelp av en stump cutter for å få en ug DNA av slettingen konstruere 9. Rens slettingen konstruksjon for å eliminere enzymet og buffer 22 f.eks ved hjelp av kommersielle reagenser og følg produsentens anvisninger.
MERK: vektor ryggraden kan forbli i transformasjonen blanding.
2. Utarbeidelse av Protoplaster
MERK: Hold sterile forhold i alle tider av eXperiment. Celleveggen er en sterk beskyttende barriere som begrenser tilgangen av molekyler til plasmamembranen. For å tillate opptak av den DNA-inneholdende konstruktet delesjon, må celleveggen for å bli fjernet av celleveggnedbrytende enzymer i en protoplasting reaksjon. Kritiske trinn i protoplast forberedelse er 1) osmotiske stabilisering av medium og 2) å unngå mekanisk stress på protoplaster.
- Mark 2 ml rør med en rund bunn for å fryse protoplastene og kjøle dem ned ved -20 ° C. Start en pre-kultur i 3 ml YEPS-lys fra en fersk plate av belastningen med ønsket genetisk bakgrunn. Inkuber på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C.
MERK: Den belastningen kan være solopathogenic belastningen SG200 10, hvete stammer, tester stammer som AB33 23, eller noen mutant bakgrunn for generering av doble mutanter. Sørge for at belastningen er fri for den ønskede motstand. - Fortynn kulturen i 50 ml YEPS-lys i en baffled flask og inkuberes på en orbital-rystemaskin ved 28 ° C med 200 rpm.
MERK: dobling tid er ca 2 timer for villtype stammer. Tillat tre duplikasjoner minimum. - Vokse til eksponensiell fase. Sikre at den optiske densitet, målt ved en bølgelengde på 600 nm (OD 600), som er rundt 0,8 (0,6 til 1,0 er akseptabelt). En OD 600 på 1,0 tilsvarer omtrent 1 til 2 x 10 7 U. maydis celler pr ml.
- Kontroller celler for forurensning under et mikroskop. Bruk 40x forstørrelse. Pellet cellene av den fullstendige 50 ml kultur i 5 minutter, 1500 xg og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 25 ml natriumcitrat, sorbitol-løsning (SCS), sentrifuge 5 min, 1500 xg, og supernatanten kastes.
MERK: Bakterie forurensninger kan identifiseres som små og ofte bevegelige celler. Sopp forurensninger kan identifiseres basert på en annen celle form eller størrelse i forhold til de sigarformede celler av U. maydis. - under CENtrifugation forberede protoplasting løsning (12,5 mg / ml Trichoderma lyse enzymer i SCS, forbered 3 ml per celle pellet, filter sterilisere gjennom et 22 um filter, løsningen må være frisk for optimal enzymatisk aktivitet). SCS er en osmotisk stabilisator for å hindre brudd av protoplast ved fjerning av celleveggen.
- Resuspender pelleten i 2 ml protoplasting oppløsning. Inkuberes i 5 til 20 minutter ved romtemperatur og kontroller under mikroskop inntil 30 til 40% av cellene er runde eller lignende pinheads (figur 2).
MERK: Utfør alle trinn på isen fra nå av og håndtere protoplaster med forsiktighet! - Vask 3 x i 10 ml kaldt (4 ° C) SCS, sentrifuger ved 1000 xg i 5 min.
- Suspender pelleten i 10 ml kald sorbitol, TrisHCl, CaCl 2 løsning (STC), spin på 1000 xg i 5 min, kast supernatanten. Resuspender pelleten i 1 ml kald STC, få 100 ul alikvoter i de avkjølte rør. Fryse alikvoter ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
3. Transformasjon av U. maydis
MERK: Omformingen av U. maydis protoplaster er avhengig av polyetylenglykol (PEG) -mediert transformasjonsmetoden, som er teknisk enkel og i motsetning til elektroporering eller biolistic omforming ikke krever spesialisert utstyr.
- Forbered to-lags seleksjonsplater (2 plater per transformasjon reaksjon). Bunnlaget inneholder antibiotikumet i en fordoblet konsentrasjon. Pipetter 12 ml RegLight inneholdende 400 ug / ml hygromycin (eller 300 ug / ml nourseothricin eller 4 ug / ml karboksin eller 1 mg / ml G418) i en petriskål. Unngå bobler.
MERK: nederste laget plater kan lagres et par dager ved 4 ° C, men forberede det øverste laget fersk under transformasjon (se nedenfor). - Tine protoplaster på is (en tube / transformasjon). Tilsett 1 mL heparin (15 mg / ml). Tilsett 1 mikrogram DNA (linearisert konstruksjon) eller 10 mL H 2
- I løpet av denne tid, for det øvre lag spres 12 ml flytende RegLight (koke og avkjøl til 60 ° C) på RegLight bunnplaten.
MERK: Dette laget inneholder ikke antibiotika. - Tilsett 500 ul STC / PEG (polyetylenglykol) til transformasjon rør (3. 2) og bland forsiktig ved å vende røret. Inkuber 15 min på is.
- Fordel hver transformasjon reaksjon på to av to-lags RegLight plater. Spre forsiktig og langsomt til et glass pipette. Inkuber platene oppreist ved 28 ° C i 5 til 7 dager før transformantene blir som kolonier. Skaffe omtrent 100-200 kolonier per plate.
MERK: Lavere tall kan være forårsaket av "dårlige" protoplaster som enten inneholder for mye celleveggen, og kan derfor ikke ta opp DNA eller ikke kan regenerere. Førstnevnte kan testes ved transformasjon med et selv-replikerende plasmid, det sistnevnte ved å teste regenerering på platene uten antibiotika. <li> Forbered YEPS-Lys plater inneholdende det passende antibiotikum ved 200 ug / ml hygromycin (eller 150 ug / ml nourseothricin eller 2 ug / ml karboksin eller 500 ug / ml G418, og disse konsentrasjoner lik halvparten av den som brukes for bunnplater). Re-rense minst 24 mulige transformante kolonier på disse platene. Enkeltkolonier skal innhentes. Samtidig strek ut den opprinnelige belastningen på ikke-selektivt medium.
MERK: Platene kan lagres ved 4 ° C i 1-2 uker.
4. Verifisering av Riktige Sletting Hendelser
MERK: Mutasjonene er verifisert i en tre-trinns prosedyre (figur 1). Først blir kandidater som inneholder villtype-kopi av genet utelukket ved hjelp av PCR. For det andre, er integrering av motstanden kassetten i locus bekreftet ved PCR. For det tredje, er integrering av motstanden kassetten bare i den ønskede locus verifisert ved Southern blot-analyse. Nøye belastning verifisering er essential, slik at mutante fenotyper virkelig korrelerer med slettingen.
- Først Diagnostic PCR 20
- Design primere sammenkobling i genet som skal slettes som resulterer i et produkt av 250-600 bp (Figur 1). Slike små produkter er lett å forsterke i en koloni PCR, og lenge nok for deteksjon i standard gel-elektroforese.
- For hver kandidat og den opprinnelige stamme som en positiv kontroll, resuspender en liten bit (mengde av et knappenålshode) av cellemateriale fra en enkelt koloni med en tannpirker i 20 pl 0,02 M NaOH. Inkuber ved RT i 30 min.
MERK: Bruk friske kolonier. Dersom platene er eldre enn en uke re-strek for å oppnå en frisk koloni. - Bruke 1 pl av cellesuspensjonen for PCR umiddelbart. Kjør en standard PCR reaksjon og analysere resulterende fragmenter.
MERK: Disse prøvene kan ikke lagres.
MERK: Denne PCR tester for nærvær av villtype-genet og dermed muliggjør rask identifisering av negativ candidates hvor genet av interesse har ikke blitt erstattet. Kloner ettergivende bånd i denne PCR reaksjonen vil bli forkastet. En slik negativ klon bør likevel bæres sammen som en ytterligere negativ kontroll. Kandidater uten et PCR-produkt må analyseres ytterligere. For genene uten skadevirkninger omtrent halvparten av kandidatene bør inneholde hvete genet, mens den andre halvparten ikke bør resultere i et band. Dette ville tilsvare en homolog rekombinasjon på 50%.
- Second Diagnostic PCR
- Fremstilling av genomisk DNA.
MERK: Genomisk DNA (gDNA), kan fremstilles ved hjelp av to forskjellige protokoller. Den første innebærer giftige reagenser som fenol og kloroform, og derfor bør kun håndteres av erfarne forskere (beskrevet i 4.2.1.1 til 4.2.1.5), mens den andre kan også bli håndtert av mindre erfarne studenter (beskrevet i 4.2.1.6 til 4,2. 1.11). Begge protokollene fungerer pålitelig. Trinn 4.2.1.1 er identisk for både protocols.- Vaksinere 5 ml YEPS-lys med hver kandidat og ruge på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Slipp 2 pl av kulturen på en CM plate. Hold kultur sterile.
MERK: Følgende er en standard protokoll (OBS: giftige trinn). - Sett en scoop (~ 200 mL) av HCl-vasket glassperler til 2 ml rør. Tilsett 2 ml av U. maydis kultur. Spin 12.000 xg i 5 min. Kast supernatanten (pellet kan fryses på dette trinn). Tilsett 500 pl fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) til pelleten. FORSIKTIGHET! PHENOL er giftig!
- Legg 500 mL Usti-lysis buffer 1. Rist for 6-10 min på en Vibrax på 1000 rpm. Kontroller at cellen pellet er fullstendig resuspendert, men unngå lengre risting for å hindre klipping av gDNA. Spin på 12 000 xg i 15 min. Overfør 400 mL av vannfase i den nye reaksjonsrøret (ikke berører inter).
- Tilsett 1 ml 100% (v / v) etanol. Snu røret 3x å blande, observere chøyt av DNA som snart vises. Spin på 12 000 xg i 5 min. Fjern supernatanten og vask med 200 mL 70% EtOH. Ikke resuspender pelleten i dette trinn.
- Fjern supernatanten helt (ikke la pellet tørke helt). Tilsett 50 mL TE / RNase. Oppløs gDNA ved risting ved 400 rpm ved 50 ° C i 10 min. Analyser 2 ul av gDNA på en 0,8% agarosegel 20.
MERK: Trinnene nedenfor omfatter en alternativ giftfri protokollen.
- Vaksinere 5 ml YEPS-lys med hver kandidat og ruge på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Slipp 2 pl av kulturen på en CM plate. Hold kultur sterile.
- Alternativ fremstilling av genomisk DNA
- Sett en scoop (~ 200 mL) av HCl vasket glassperler til 2 ml rør. Tilsett 2 ml av U. maydis kultur og spinn på 12 000 xg i 5 min. Kast supernatanten (pellets kan fryses på dette trinn).
- Tilsett 500 ul Usti Lysis-buffer 2 til pelleten. Rist i 5 til 15 min på en Vibrax ved 1000 rpm. Kontroller at cellen pellet er fullstendig resuspendert.
- Inkuber rørene ved 65 ° C i 15 til 20 min. Bruke appromessige inkubatorer designet for å være vert for 2 ml rør er kritisk. Deretter plasserer det på is i 5 min.
- Tilsett 100 pl 8 M kaliumacetat, vortex eller invertere 8 til 10 ganger. Spin 12 000 xg i 15 min ved RT.
- Overføring 500 mL av supernatanten til en frisk 1,5 ml tube og legge 400 mL isopropanol. Vortex eller invertere 8 til 10 ganger. Spin 12 000 xg i 15 min. Fjern supernatanten og vask med 500 mL 70% EtOH. Spin 12.000 xg i 5 min.
- Sug av supernatanten helt! Til slutt legger du til en kort sentrifugering (10 sek) for å fjerne rester av væske. La DNA-pelleten tørke i 3 til 5 min. Tilsett 50 ul TE / RNAase og inkuber ved 50 ° C i 10 til 15 minutter ved 400 rpm.
- PCR
- Design to primer-par med en av de bindende utenfor kantene og den tilsvarende binding i motstanden kassetten (UF-f, RC-r; RC-f, DF-r, figur 1) 9.
- Bruke 1 pl av en 1:10 fortynning av gDNA av hver candidate som en mal i 2 PCR reaksjoner verifisere korrekt innsetting oppstrøms og nedstrøms 9.
- Bruk standard PCR reaksjoner for hver kandidat og analysere resulterende fragmenter 22.
MERK: Disse PCR teste for innsetting av motstanden kassetten i den korrekte genomiske locus. Dersom produkter er fremstilt for begge sider, er kandidaten sannsynlig en riktig innsetting. Imidlertid bør også kandidater hvor bare en side (oppstrøms eller nedstrøms) kan bli bekreftet bæres langs for ytterligere analyse i tilfelle at PCR-reaksjonene bare sviktet for en flanke.
- Fremstilling av genomisk DNA.
- Verifisering av Riktig Genomisk Innsetting av Southern Blot Analysis 22
- Fordøye 15 ul gDNA (4.2.1) av de mutante kandidater og det tilsvarende villtype / progenitor-stamme med et passende enzym som kutter utenfor locus / konstruere og i tillegg har kutt enten i genet eller i motstanden kassetten som fører til tydelig distinguishable mønstre (figur 1) 8.
MERK: Ingen av de forventede band bør være større enn 10 kb, slik at de skiller seg klart fra ufordøyd DNA. - Bruk oppstrøms og den nedstrøms flanke som prober. For å merke dem for eksempel bruke PCR DIG merking Kit eller lignende standard metode. Bland merkede prober i et 1: 1 molforhold og utføre Southern blot. Holde minst to uavhengige riktige trans.
MERK: hvete mønster skal være godt synlig i den opprinnelige belastningen og de riktige kloner bør inneholde bare de forventede band. Andre band bare til stede i kandidatene indikere andre innsetting av konstruksjonen i en feil locus. Slike kloner skal kastes. Den negative kandidat identifisert i den første diagnostiske PCR bør inneholde hvete band og band (uforutsigbare i størrelse) av feilaktig integrert sletting konstruere.
- Fordøye 15 ul gDNA (4.2.1) av de mutante kandidater og det tilsvarende villtype / progenitor-stamme med et passende enzym som kutter utenfor locus / konstruere og i tillegg har kutt enten i genet eller i motstanden kassetten som fører til tydelig distinguishable mønstre (figur 1) 8.
- glyserol aksjer
MERK: glyserol aksjer tjener til å opprettholde de kloner i mange år i strekk samlinger. I det minste to uavhengige transformanter bør holdes for hver mutant. Dette gjør sammenligne fenotyper som skal være identiske.- Vokse 5 ml kulturer av de bekreftede mutant-stammer i YEPS-lys på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C Bland 500 ul av hver kultur med 500 ul NSY-Glycerol-medium. Vend røret til kultur og medium er godt blandet. Glyserol i mediet hindrer dannelse av iskrystaller.
- Fryses ved -80 ° C. Re-strek en del av den frosne kultur for å teste om aksjen er funksjonell.
5. Mikroskopiske fenotyper
- Vokse 5 ml kulturer av villtype og mutante stammer i YEPS-lys på et roterende hjul i 12 timer ved 28 ° C.
- Neste dag fortynnes kulturen til en OD 600 på 0,1 og dyrke det til en OD 600 mellom 0,5 og 0,7. En OD 600 på 1,0 correspsekunder til ca. 1 til 2 x 10 7 U. maydis celler pr ml.
- Inspiser cellemorfologi mikroskopisk.
MERK: Sunn celler vises sigar formet (figur 4, WT). Uttales vakuoler eller filamentdannelse indikerer at cellene blir stresset.
MERK: Avhengig av den forventede mutant fenotype, kan analysen bli tilpasset, for eksempel hvis reporter-stammer anvendes det aktuelle analysen kan utføres på dette trinn. Hvis celle morfologi bør det utføres statistisk analyse endres, for eksempel, for å bestemme den midlere cellelengden.
6. Infeksjon analyse
MERK: frøplante infeksjon analysen har blitt visualisert tidligere i dette tidsskriftet 11. Det kan enten utføres ved anvendelse av en haploid, solopathogenic belastning flater som SG200 10 eller ved å blande kompatible sammenpassende partnere som begge bærer mutasjonen.
- Vokse minst 40 mais frøplanter perbelastning i 7 dager ved en lys syklus på 16 timer, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (dag / natt). De bør være på 3-bladet scenen og 10-15 cm høye på dagen for infeksjon.
- To dager før infeksjonen, starte en pre-kultur av stammene i 5 ml YEPS-lys på en roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Dyrk en hovedkultur i 50 ml YEPS-Light opp til OD 600 = 1,0 (celledeling rate = 2 timer, tillate 3 divisjoner minimum, kan gjøres O / N).
- Spinne ned cellene i 50 ml kultur ved 1500 xg i 5 min og supernatanten kastes. Vask 3x med steril H 2 O. Resuspender cellene i sterilt H2O til en OD 600 på 3,0. Om nødvendig, bland paring partnere.
- Injiser 250 - 500 ul av cellesuspensjonen inn i stammen av 7 dager gamle frøplanter mais ved hjelp av en liten sprøyte. Bruke sterilt H2O som en kontroll. Hold infiserte planter i ytterligere 7-14 dager i samme lys og temperaturforhold. Resultat fenotypen av hver plante enccording til sunn, chlorosis, anthocyanin formasjon, små svulster, store svulster, døde planter 10.
MERK: Scoring kan gjøres så tidlig som 7 dager, og gjentas etter 14 dager for å følge smitte over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slettingen konstruksjoner for alle fire kitinolytiske gener kodet i U. maydis genom ble generert ved Golden Gate-kloning med hygromete kassett for sletting av cts1, den natR for sletting av cts2, den G418R kassett for sletting av cts3 og cbxR for sletting av cts4 20. En generell oversikt over de generstat strategien er eksemplifisert ved sletting av cts3 (figur 1). Enkle og doble mutanter av cts1 med en andre kitinolytiske gen ble samlet i rekkefølge med de samme konstruksjoner som i to forskjellige genetiske bakgrunner for å analysere rollen til kitinaser i virulens. To forskjellige belastningsbakgrunn ble ansatt: AB33 tillater induksjon av trådformede vekst, det første skrittet mot patogenitet 23, er SG200 en solo-fremkallende variant som muliggjør rask sykdoms utføre 10 cts3 -deletion bygge inn i den passende strekk bakgrunnen, ble enkle kolonier av den andre seleksjonsplate testet for korrekt sletting ved diagnostisk PCR (tabell 1) og Southern blot (Figur 3). Interessant, for cts3 homolog rekombinasjon var mye høyere i SG200 enn i AB33, men denne forskjellen var ikke konsekvent observert i sletting av de andre kitinaser.
De strenge stammen verifisering sikrer en enkel innføring av delesjon konstruere ved den ønskede posisjon. Imidlertid kan ytterligere modifikasjon som punktmutasjoner forbli uoppdaget, som kan villede tolkningen av fenotyper. Derfor er i det minste to uavhengige transformanter fenotypiseres.
fig ure 1. Oversikt over strategien slettingen eksemplifisert ved cts3. Denne skjematisk oversikt inkluderer delesjonen konstruere med oppstrøms flanke (UF), nedstrøms flanke (DF) og geneticin motstand kassetten (G418R), den genomiske locus av villtype (WT ) og cts3 delesjonsmutant og alle primere, så vel som de restriksjonssetene som brukes i belastningen verifikasjon. De første diagnostiske PCR resulterer i et produkt bare dersom villtype-genet kopien er til stede, de to andre diagnostiske PCR resultere i produkter hvis motstanden kassetten er riktig integrert. For Southern blot av genom-DNA blir spaltet med PstI, probene spenner UF og DF (røde søyler) som fører til deteksjon av et 6,7 kb bånd i villtype og to band av 5,6 kb og 2,0 kb i mutanten. I tillegg DF sonden svakt gjenkjenner et 2,6 kb produkt. VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Mikroskopisk verifisering av protoplasting reaksjon. (A) Ubehandlet hvete celler (FB2) vises sigar formet. (B) Ved behandling med celleveggnedbrytende enzymer (her i 30 minutter), (b) angir utseendet av runde kuler i den ene enden (e) og tverr-bell lignende strukturer som celleveggen nedbrytning har startet. Til slutt blir protoplastene er helt rund (r), som er på grunn av mangel av celleveggen. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig ure 3. Southern blot for cts3 sletting. Genomisk DNA ble spaltet med PstI. Begge flanker ble merket, blandet i ekvimolare forhold og anvendes som en enkelt sonde. I villtype SG200 og slettinger av kitinaser cts1 og cts2, er et enkelt bånd på 6,7 kb oppdaget. I cts3 slettinger (g og k), to bånd på 5,6 kb og 2,0 kb er synlig indikasjon av korrekt sletting av cts3. En ekstra bånd på 2,6 kb kan visualiseres ved massiv overeksponering. Dette tilsvarer et fragment som er anerkjent av en overlapping på bare 100 bp av nedstrømssiden sonde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Noen mutasjoner føre til åpenbare vekst feil som kan oppdages mikroskopisk. I kitinase slettinger, gjorde enkle mutanter ikke visenoen åpenbar defekt, mens cts1 / 2 doble mutanter viste en markert celle separasjon defekt 20. Farging av septa viste at cytokinese ble gjennomført, men cellene forble tilkoblet sannsynlig via rest kitin (figur 4 fra Langner et al. 2015). En lignende mikroskopisk vekst fenotype er kjent for sletting av khd4 24, et gen som koder for et RNA-bindende protein medierende post-transcriptional RNA omsetning av gener involvert i morfologi og patogenitet 25.
Figur 4. Mikroskopisk analyse av delesjonsmutanter. Cell morfologi og septum dannelse av kitinase delesjonsstammer. Cts1 / 2 S-stammer oppviser et celleseparasjons defekt og danne større aggregater, som ikke er på grunn av en mangel på septum formasjonen. Grunnskole og videregåendesepta (se 5x forstørrelse i innfellinger) ble farget med Calcofluor Hvit (CW) før mikroskopi. Skala barer = 10 mikrometer. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Langner et al. 2015 eukaryot celle 20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å teste bidrag kitinaser til virulens, ble frøplante infeksjon analyser utført ved hjelp av mutanter i SG200 belastning bakgrunnen. Mens mutanter i khd4 ble redusert i virulens, gjorde sletting av kitinaser ikke påvirke infeksjon av mais stiklinger (figur 5) 20,25.
Figur 5. Infeksjon analysen av delesjonsmutanter. Disease rangeringmais frøplanter 9 dager etter infeksjon med de respektive U. maydis stammer. (A) Makroskopiske symptomer som brukes for sykdom scoring. (B) To uavhengige transformanter ble testet med hensyn til hver stamme (N> 100). Alle kitinase mutantene (1/2 / 3Δ: trippel mutant endochitinases, 4Δ: enkelt mutant N-acetylglukosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: firemannsrom mutant) infisert verten anlegget fører til stor tumordannelse som observert i villtype infeksjoner med den solopathogenic belastning SG200. I motsetning til dette ble en stamme som bærer en delesjon av genet som koder for RNA-bindende protein Khd4 redusert virulens som rapportert tidligere 24. Feilfelt angir standardavvik av tre uavhengige forsøk. Dette tallet er modifisert med tillatelse fra Langner et al. 2015 eukaryot celle 20. Klikk her for å se et stortr versjon av denne figuren.
| genetisk bakgrunn | 1 st diagn. PCR (ekskludert / testet) | 2. diagn. PCR (bekreftet / testet) | Sør (bekreftet / testet) | % Recomb. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabell 1:. Strain verifikasjon for cts3 strykninger The kitinase genet cts3 ble slettet i fire ulike genetiske bakgrunn for å tillate studier av trådformede vekst (AB33) og infeksjon (SG200) i én og flere slettinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan å generere delesjonsmutanter for omvendt genetiske studier i U. maydis. Utgangspunktet er en delesjon konstrukt som inneholder flankerende sekvenser av genet interesseinneholdende sekvenser av omtrent 1 kb oppstrøms for start og nedstrøms fra stopp-kodonet, så vel som en passende motstand kassett som den tidligere ble optimalisert 7,9 . Konstruksjonene har å være individuelt genereres for hvert gen og nøye kontrollert for sekvensfeil før sletting av genet. Punktmutasjoner i flankene kan føre til uønskede endringer i den genomiske sekvens, særlig hvis flankene kommer inn i nabo genet eller mutasjon endrer regulatoriske elementer. Dette vil påvirke alle trans og kan føre til fenotyper og bivirkninger som ikke er relatert til det ønskede genet sletting.
Ved planlegging av strategi sletting, har den forventede fenotype å bli vurdert for å velge den genetiske bakgrunnen. I den foreliggende sak, ble AB33 23 og SG200 10 valgt å tillate testing fenotyper i den morfologiske bryteren og anlegg infeksjon. Tilsvarende kan mange andre lese-outs være av interesse, er f.eks fusjoner med cts1 ansatt i eksport av heterologe proteiner 14,26, og en belastning bakgrunn med fluorescerende merket rrm4 tillater analyse av RNA transport på endosomes 27,28.
Under belastning verifisering, high-throughput diagnostisk PCR tillate en hurtig reduksjon av antall kandidater som skal testes i den ganske arbeidskrevende Southern blot. Spesielt tillater den første diagnostisk PCR utelukkelse av kandidater fremdeles inneholdende villtype-kopi av genet, og derved hindrer den massive bruk av giftig fenol i gDNA preparater. I en standard tilfellet med en ikke-essensiell-genet, kan omtrent halvparten av koloniene inneholder villtype-genet. Denne pre-screening kan være av stor interesse for gener med potensielt skadelige vekstfenotyper. Hundrevis av kandidater kan raskt bli vist.
Hvis alle kandidater inneholder villtype-kopien, er genet delesjon mest sannsynlig dødelig. Dette kan bekreftes ved å slette en kopi i en diploid belastning bakgrunn (f.eks D132) og analyse av segregering etter teliospore spiring 29. Alternativt kan en betinget sletting strategi ved hjelp av en induserbar promoter bli valgt til å følge mutant fenotype. Imidlertid kan også forurensning som følge av det rå NaOH-baserte metode for gDNA fremstilling interferere med PCR og føre til falsk-negative, dvs. kandidater ikke viser et bånd og derfor holdes selv om de inneholder genet. Dette kan utelukkes ved å teste en styre gen med et produkt tilsvarende størrelse i en uavhengig PCR-reaksjon eller ved multipleks-PCR med de to genspesifikke primere og primere for en kontroll-gen som resulterer i et større fragment.
innhold "> Hvis en mutant allerede er tilgjengelig, for eksempel, cts1 Δ 30 eller rrm4 Δ, stamme generering av kodede versjoner kan bli fremskyndet ved å erstatte genet delesjon motstand kassett (f.eks hygromete) i genomet med en ny konstruksjon inneholdende, for eksempel, den fluorescensmerkede rrm4 og en annen motstand markør (f.eks natR). i dette tilfelle transformanter kan screenes ved tap av den opprinnelige resistensmarkør 9. Riktige kandidater er resistente bare mot den nye antibiotikum (nourseothricin) og har mistet sin opprinnelige motstand (hygromycin ). i tillegg har komplementering av den mutante fenotype i trans kan utføres for å verifisere funksjonaliteten til merkede konstruksjoner 30,31.Den her beskrevne genet sletting og endring strategi tilbyr en pålitelig og presis verktøy i genetisk analyse av U. maydis. For flere slettinger imidlertid belastningen gerelse kan bli tidkrevende, siden endringer må utføres sekvensielt. Derfor, som en komplementær verktøy, i fjor CRISPR-Cas system er etablert for U. maydis 32. Det gir muligheten til å forstyrre flere gener samtidig og er et utmerket tillegg til den genetiske verktøykasse av U. maydis.
Oppsummert protokollen for genetisk manipulasjon og U. maydis belastning generasjon beskrevet her er en robust metode som har vært mye brukt i samfunnet i mange år. Sammen med den omfattende samlingen av respektive motstandskassett moduler gjør det alle slags genteknologi i denne soppen, adressering ulike spørsmål som spenner fra grunnleggende til anvendt forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Spesiell takk til Dr. Benedikt Steuten for kritisk lesing av manuskriptet. Den opprinnelige arbeidet med kitinaser ble utført av Dr. Thorsten Langner. Laboratoriet av VG støttes av Cluster of Excellence i plantevitenskap (CEPLAS, DFG EXC 1028) og BioSC, er laboratoriet av KS støttet av BioSC. KB er støttet av BioSC. De vitenskapelige aktiviteter av bioøkonomi Science Center (BioSC) ble finansielt støttet av departementet for innovasjon, vitenskap og forskning innenfor rammen av NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF er støttet av en doc av DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
