Summary
نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.
Abstract
الجينات الحذف يلعب دورا هاما في تحليل وظيفة الجين. واحدة من أكثر الوسائل فعالية لتعطيل الجينات بطريقة هادفة هو استبدال الجينات كامل مع علامة اختيار عبر إعادة التركيب مثلي. خلال إعادة التركيب مثلي، وتبادل الحمض النووي يحدث بين متواليات مع تشابه عالية. لذلك، تسلسل الجينوم الخطية المحيطة الجينات المستهدفة يمكن استخدامها لوجه التحديد توجيه علامة اختيار إلى الموقع التكامل المنشود. نهايات حادة للبناء حذف تفعيل نظم إصلاح الحمض النووي للخلية، وبالتالي تعزيز التكامل بين بناء إما عن طريق إعادة التركيب مثلي أو من خلال الانضمام إلى غير المتجانسة نهاية. في الكائنات الحية مع إعادة التركيب مثلي كفاءة، يمكن أن معدل حذف الجينات نجاح تصل إلى أكثر من 50٪ صنع هذه الاستراتيجية قيما نظام تعطيل الجين. فطر التفحم السوادية الذروية هو الكائنات الحية الدقيقة نموذج حقيقية النواة تظهر مثل recombinat مثلي كفاءةأيون. من إزاء 6،900 الجينات، وكثير اتسمت ظيفيا مع مساعدة من المسوخ الحذف، وتكرار فشل محاولات استبدال الجينات نقاط في وظيفة أساسية من الجين. توصيف لاحق من وظيفة الجين عن طريق وضع علامات مع علامات الفلورسنت أو طفرات من المجالات توقع يعتمد أيضا على تبادل الحمض النووي عبر إعادة التركيب مثلي. هنا، نقدم U. الذروية استراتيجية الجيل سلالة بالتفصيل باستخدام أبسط مثال، حذف الجينات.
Introduction
السوادية الذروية هو نموذج الفطريات الممرضة للنبات التي تمت دراستها على نطاق واسع لعقود 1،2. ويوجد في اثنين الأشكال التضاريسية، لذلك، مرحلة تشبه الخميرة غير المسببة للأمراض والخيطية، شكل المعدية 3. وقدمت الاكتشافات اختراق عالمية مثل آليات إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي المتجانسة في مرحلة النمو تشبه الخميرة من هذه الفطريات 4. وعلاوة على ذلك، والتحول المورفولوجي للخيوط والفوعة العوامل المعدية الهامة للعدوى وجيدا تتميز 5،6. المعرفة الجزيئية زيادة عن علم الأحياء والفوعة من هذه الفطريات التفحم تعتمد على استراتيجية استبدال الجينات مباشر 7-9 بدعم من الجينوم الشرح ممتاز 10 وسهولة علم الوراثة العكسية باستخدام، على سبيل المثال، منظمة تنظيما جيدا لجمع البلازميد في معهدنا (HTTP : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). موحدة، فحوصات العدوى السريعة في الذرة الصورةالسماح eedlings دراسات تفصيلية المرضية عوامل 11.
جينوم U. الذروية يحتوي على حوالي 6900 الجينات 10. لدراسة وظيفتها، ويمكن حذف منفردة أو مجتمعة بسبب نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. المناطق المحيطة من حوالي 1 كيلو بايت تحتوي على نهايات مثلي تماما مثالية لمعدلات إعادة التركيب مثلي أكبر من 50٪، ولكن بالفعل 250 نقطة أساس مع نهايات غير المتجانسة تسمح بعض درجة من التكامل الصحيح للبناء 9. حاليا، خمسة أشرطة مقاومة مختلفة، hygR، cbxR، natR، G418R، وphleoR التوسط المقاومة ضد هيغروميسين، carboxin، nourseothricin، G418 وphleomycin، ويعمل لتحديد لtransformants 7،9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير المقاومة هيغروميسين إلى شريط كاسيت القابلة لإعادة التدوير (FRT-hygR) التي يمكن إزالتها عن طريق التعبير عابرة من recombinase FLP مغاير 12. وهذا يسمح إزالة كاسيت المقاومة، وبالتالي في نظرية التعديلات الجينية غير محدودة. Phleomycin غير مطفرة 13، بحيث مع أشرطة جديدة، ولا سيما hygR كاسيت القابلة لإعادة التدوير، واستخدام phleoR آخذ في التناقص. ومن ثم لا يمكن المسوخ رباعية توليد باستخدام أربعة أشرطة أخرى، ولكن لالمسوخ خماسية، ينصح نظام FRT-hygR 14.
وقد تم نقل هذه الاستراتيجية حذف الجينات العامة بنجاح الفطريات التفحم أخرى مثل Sporisorium reilianum 15، U. hordei 16، أو U. esculenta 17، وبالتالي توفر إمكانية لمزيد من التطبيقات في الكائنات بعد المستعصية وراثيا مع نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. وعلاوة على ذلك، والكائنات التي تفتقر إلى إعادة التركيب مثلي يمكن تعديلها لتحسين الهندسة الوراثية كما يدل على ذلك حذف الجينات المسؤولة عن غير مثلي أوند-في الانضمام العصيباء المبوغة crassa 18،19.
نحن هنا وصف الاستراتيجية حذف الجينات التي تنشر لU. الذروية 7،9 في التفاصيل التجريبية مع التركيز على التحقق السريع والدقيق للمرشحين. وكمثال على ذلك، ونحن نستخدم chitinases الفطرية وتصوير جيل من المسوخ واحدة وكذلك حذف عدة سلالات 20،21. Chitinases أمثلة مثيرة للاهتمام، لأنها تعمل على كيتين في جدار الخلية جامدة. مطلوب إعادة جدار الخلية لتغيرات شكلية أثناء انقسام الخلية، والتحول إلى النمو الخيطية، وتشكيل بوغ. وبالتالي، في المسوخ الحذف يمكن توقع الظواهر طوال دورة الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد حذف التركيبات
- توليد البلازميد التي تحتوي على بناء الحذف (الشكل 1) يتألف من 1 كيلوبايت الجناح منها المنبع (UF) والمصب الجناح (DF) كل والكاسيت المقاومة المناسب يحيط بها تقييد مواقع قطع حادة.
ملاحظة: أي استراتيجية الاستنساخ يمكن استخدامها (لاستنساخ أنظر المرجع 22) نوصي جولدن جيت استنساخ لهذه البلازميدات 9. - استئصال الحذف بناء من البلازميد باستخدام قطع حادة للحصول على 1 ميكروغرام الحمض النووي للحذف بناء 9. تنقية بناء الحذف للقضاء على انزيم والعازلة 22 على سبيل المثال باستخدام الكواشف التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: العمود الفقري ناقلات يمكن أن يبقى في الخليط التحول.
2. إعداد جبلة مجردة
ملاحظة: حافظ على ظروف معقمة خلال جميع الأوقات من البريدxperiment. جدار الخلية هو حاجز وقائي قوي يحد من وصول جزيئات إلى غشاء البلازما. للسماح امتصاص الحمض النووي الذي يحتوي على بناء الحذف، يحتاج جدار الخلية لا بد من إزالة جدار الخلية المهينة الانزيمات في رد فعل protoplasting. خطوات حاسمة في إعداد البروتوبلازم هي 1) الاستقرار الاسموزي من المتوسط و 2) تجنب الإجهاد الميكانيكي على جبلة مجردة.
- مارك 2 مل أنابيب مع قاع مستديرة لتجميد جبلة مجردة وتبريد عليهم في -20 درجة مئوية. بدء الثقافة قبل في 3 مل YEPS الضوء من لوحة جديدة من سلالة مع الخلفية الوراثية المطلوبة. احتضان على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية.
ملاحظة: سلالة يمكن أن يكون solopathogenic سلالة SG200 10، سلالات wildtype، سلالات اختبار مثل AB33 23، أو أي خلفية متحولة لجيل من المسوخ مزدوجة. تأكد من أن سلالة خال من المقاومة المطلوبة. - تمييع الثقافة في 50 مل YEPS الضوء في إف إل أي إس حيرةك واحتضان على شاكر المداري عند 28 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: مضاعفة الوقت حوالي 2 ساعة لسلالات wildtype. سماح ثلاث الازدواجية الحد الأدنى. - تنمو حتى مرحلة الأسي. تأكد من أن الكثافة الضوئية، ويقاس عند طول موجي 600 نانومتر (OD 600)، حوالي 0.8 (0،6-1،0 غير مقبول). وOD 600 من 1.0 يتوافق مع حوالي 1 إلى 2 × 10 7 U. الذروية خلايا لكل مل.
- فحص الخلايا للتلوث تحت المجهر. استخدام التكبير 40X. بيليه خلايا كاملة ثقافة 50 مل لمدة 5 دقائق، 1500 x ج وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 25 مل سيترات الصوديوم، محلول السوربيتول (SCS)، الطرد المركزي 5 دقائق، 1500 x ج، وتجاهل طاف.
ملاحظة: يمكن تحديد الملوثات البكتيرية مثل خلايا صغيرة، وغالبا ما تتحرك. ويمكن تحديد التلوث الفطرية على أساس شكل الخلية أو حجم مختلف بالمقارنة مع السيجار على شكل خلايا U. الذروية. - خلال CENtrifugation إعداد حل protoplasting (12.5 ملغ / مل الترايكوديرما الناشر الإنزيمات، في SCS، وإعداد 3 مل لكل بيليه الخلية؛ تصفية تعقيم من خلال مرشح 22 ميكرون، الحل يجب أن تكون طازجة للنشاط الأنزيمي الأمثل). SCS هو استقرار الاسموزي لمنع تمزق البروتوبلازم على إزالة جدار الخلية.
- Resuspend وبيليه في 2 مل protoplasting حل. احتضان لمدة 5 إلى 20 دقائق على RT والاختيار تحت المجهر حتى 30 إلى 40٪ من الخلايا هي جولة أو ما شابه pinheads (الشكل 2).
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد من الآن فصاعدا، والتعامل مع جبلة مجردة مع الرعاية! - غسل 3X في 10 مل الباردة (4 درجة مئوية) SCS، الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend وبيليه في 10 مل السوربيتول البارد، TrisHCl، CaCl 2 الحل (STC)، وتدور في 1000 x ج لمدة 5 دقائق، ونبذ طاف. resuspend الكرية في 1 مل البارد STC، وجعل 100 مكل في أنابيب تبريد. تجميد aliquots في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
3. التحول من U. الذروية
ملاحظة: التحول من U. جبلة مجردة الذروية تعتمد على البولي ايثيلين جلايكول (PEG) بوساطة طريقة التحول، التي هي بسيطة من الناحية الفنية وبدلا من Electroporation للأو التحول biolistic لا يتطلب معدات متخصصة.
- إعداد لوحات اختيار الطبقات اثنين (2 لوحات لكل رد فعل التحول). تحتوي الطبقة السفلى من المضادات الحيوية في تركيز الضعف. الماصة 12 مل من RegLight تحتوي على 400 ميكروغرام / مل هيغروميسين (أو 300 ميكروغرام / مل nourseothricin أو 4 ميكروغرام / carboxin مل أو 1 ملغ / مل G418) في طبق بتري. تجنب الفقاعات.
ملاحظة: لوحات طبقة القاع قد يتم تخزين بضعة أيام في 4 درجات مئوية، ولكن إعداد الطبقة العليا حديثا خلال التحول (أنظر أدناه). - جبلة مجردة ذوبان الجليد على الجليد (1 أنبوب / التحول). إضافة 1 ميكرولتر الهيبارين (15 ملغ / مل). إضافة 1 ميكروغرام الحمض النووي (خطي بناء) أو 10 ميكرولتر H 2
- خلال هذا الوقت، للطبقة العليا نشر 12 مل المسال RegLight (يغلي وباردة إلى 60 درجة مئوية) على لوحة أسفل RegLight.
ملاحظة: لا يحتوي هذا طبقة المضادات الحيوية. - إضافة 500 ميكرولتر STC / PEG (البولي ايثيلين جلايكول) إلى أنبوب التحول (3. 2) وتخلط بعناية من قبل قلب الأنبوب. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
- توزيع كل رد فعل التحول على اثنين من لوحات RegLight الطبقات اثنين. نشر بعناية وببطء مع الماصة الزجاج. احتضان لوحات تستقيم عند 28 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام حتى تنمو transformants كما المستعمرات. الحصول على حوالي 100-200 المستعمرات في لوحة.
ملاحظة: قد يكون سبب انخفاض أرقام التي كتبها جبلة مجردة "السيئة" التي تحتوي على أي الكثير من جدار الخلية، وبالتالي لا يمكن أن يستغرق الحمض النووي أو لا يمكن أن تتجدد. الأول يمكن اختبارها من قبل التحول مع البلازميد الذاتي تكرار، وهذا الأخير عن طريق اختبار تجديد على لوحات من دون المضادات الحيوية. <لى> إعداد YEPS الضوء لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة في 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين (أو 150 ميكروغرام / مل nourseothricin أو 2 ميكروغرام / carboxin مل أو 500 ميكروغرام / مل G418، وهذه التركيزات نصف متساو من تلك المستخدمة لوحات أسفل). إعادة تنقية لا يقل عن 24 المستعمرات المحولة المفترضة على هذه اللوحات. ويجب الحصول على المستعمرات واحد. في نفس خط المهلة سلالة الأصلي على وسائل الاعلام غير انتقائي.
ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
4. التأكيد على حذف الأحداث الصحيحة
ملاحظة: يتم التحقق من الطفرات في إجراء ثلاث خطوات (الشكل 1). أولا، يتم استبعاد المرشحين التي تحتوي على نسخة wildtype من الجينات التي PCR. ثانيا، يتم التحقق من تكامل الكاسيت المقاومة في مكان من قبل PCR. ثالثا، يتم التحقق من تكامل الكاسيت المقاومة فقط في مكان المطلوب عن طريق تحليل الجنوبي لطخة. التحقق سلالة الدقيق هو ESSEntial، بحيث الظواهر متحولة ترتبط حقا مع الحذف.
- أولا التشخيص PCR 20
- تصميم الاشعال الاقتران في الجين المراد حذفه تلك النتيجة في منتج من 250-600 سنة مضت (الشكل 1). هذه المنتجات الصغيرة من السهل تضخيم في مستعمرة PCR، وطويلة بما فيه الكفاية للكشف في الكهربائي للهلام القياسية.
- لكل مرشح وسلالة الأصلي كما تحكم إيجابية، و resuspend قليلا (مبلغ رأس الدبوس) من المواد خلية من مستعمرة واحدة مع المسواك في 20 ميكرولتر 0.02 M هيدروكسيد الصوديوم. في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: استخدم مستعمرات جديدة. إذا لوحات أقدم من 1 أسبوع إعادة متتالية للحصول على مستعمرة جديدة. - استخدام 1 ميكرولتر من تعليق خلية لPCR على الفور. تشغيل تفاعل PCR القياسية وتحليل الشظايا الناتجة عن ذلك.
ملاحظة: هذه العينات لا يمكن تخزينها.
ملاحظة: اختبارات هذا PCR لوجود الجين wildtype وبالتالي تتيح التعرف السريع على و cand سلبيidates التي لم يتم استبدال الجينات في المصالح. سيتم تجاهل استنساخ ذات العوائد العصابات في هذا رد فعل PCR. يجب على أي حال أن تقوم واحدة من هذه استنساخ السلبي على طول كعنصر تحكم سلبية إضافية. المرشحين دون منتج PCR يتعين مواصلة تحليلها. لجينات دون آثار ضارة يجب أن يحتوي على ما يقرب من نصف المرشحين الجين wildtype، في حين أن النصف الآخر لا يؤدي إلى الفرقة. هذا من شأنه أن تتوافق مع معدل إعادة التركيب مثلي من 50٪.
- التشخيص PCR الثانية
- إعداد الحمض النووي الجيني.
ملاحظة: الجينوم الحمض النووي (gDNA) يمكن إعدادها باستخدام اثنين من بروتوكولات مختلفة. الأول ينطوي الكواشف السامة مثل الفينول والكلوروفورم، وبالتالي، ينبغي التعامل معها إلا من خلال الباحثين من ذوي الخبرة (وصفها في 4.2.1.1 ل4.2.1.5) في حين أن الثاني يمكن أيضا أن يتم التعامل معها من قبل الطلاب ذوي الخبرة أقل (الموصوفة في 4.2.1.6 4.2. 1.11). كلاهما بروتوكولات تعمل بشكل موثوق. خطوة 4.2.1.1 مطابق لكلا protocشريان الحياة.- تطعيم 5 مل YEPS الضوء مع كل مرشح واحتضان على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. إسقاط 2 ميكرولتر من ثقافة على طبق من ذهب سم. الحفاظ على ثقافة عقيمة.
ملاحظة: فيما يلي بروتوكول قياسي (تنبيه: خطوات السامة). - وضع 1 مغرفة (~ 200 ميكرولتر) من الخرز الزجاجي غسلها حمض الهيدروكلوريك إلى 2 مل أنابيب. إضافة 2 مل من U. ثقافة الذروية. تدور 12000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف (بيليه يمكن تجميدها في هذه المرحلة). إضافة 500 ميكرولتر الفينول / الكلوروفورم / Isoamylalcohol (25: 24: 1) لبيليه. الحذر! الفينول سامة!
- إضافة 500 ميكرولتر أوستي-تحلل العازلة 1. هزة لمدة 6 إلى 10 دقائق على vibrax في 1000 دورة في الدقيقة. تحقق من أن بيليه الخلية هو معلق تماما، ولكن تجنب الموسعة تهتز لمنع القص من gDNA. تدور في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل 400 ميكرولتر من المرحلة المائية في أنبوب رد فعل جديد (لا تلمس البيني).
- إضافة 1 مل 100٪ (ت / ت) الإيثانول. عكس 3X أنبوب لخلط، ومراقبة جبصوت عال من الحمض النووي التي تظهر قريبا. تدور في 12000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ويغسل مع 200 ميكرولتر 70٪ ETOH. لا resuspend الكرية في هذه المرحلة.
- إزالة طاف تماما (لا تدع بيليه يجف تماما). إضافة 50 ميكرولتر TE / ريبونوكلياز. حل gDNA التي تهز في 400 دورة في الدقيقة عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحليل 2 ميكرولتر من gDNA على 0.8٪ هلام الاغاروز 20.
ملاحظة: تشمل الخطوات التالية بروتوكول بديل غير سامة.
- تطعيم 5 مل YEPS الضوء مع كل مرشح واحتضان على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. إسقاط 2 ميكرولتر من ثقافة على طبق من ذهب سم. الحفاظ على ثقافة عقيمة.
- إعداد بديل من الحمض النووي الجيني
- وضع 1 مغرفة (~ 200 ميكرولتر) من حمض الهيدروكلوريك غسلها الخرز الزجاجي إلى 2 مل أنابيب. إضافة 2 مل من U. ثقافة الذروية وتدور في 12000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف (الكريات يمكن تجميدها في هذه المرحلة).
- إضافة 500 ميكرولتر أوستي تحلل العازلة 2 إلى بيليه. يهز لمدة 5 إلى 15 دقائق على vibrax في 1000 دورة في الدقيقة. تحقق من أن بيليه الخلية هو معلق تماما.
- احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. باستخدام APPROحاضنات priate مصممة لاستضافة 2 مل أنابيب أمر بالغ الأهمية. ثم، وضعه على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة 100 ميكرولتر 8 M خلات البوتاسيوم، دوامة أو عكس 8-10 مرات. تدور 12000 x ج لمدة 15 دقيقة في RT.
- نقل 500 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 مل الطازجة وإضافة 400 ميكرولتر الأيسوبروبانول. دوامة أو عكس 8-10 مرات. تدور 12000 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف ويغسل مع 500 ميكرولتر 70٪ ETOH. تدور 12000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نقع قبالة طاف تماما! في نهاية المطاف، إضافة تدور قصيرة (10 ثانية) لإزالة السائل المتبقي. السماح الحمض النووي بيليه الجافة لمدة 3 إلى 5 دقائق. إضافة 50 ميكرولتر TE / RNAase واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 400 دورة في الدقيقة.
- PCR
- تصميم اثنين من أزواج التمهيدي مع واحد منهم ملزم خارج الأجنحة والمناظرة واحد ملزم ضمن كاسيت المقاومة (UF-و، RC-R، RC-F، DF-R، الشكل 1) 9.
- استخدام 1 ميكرولتر من 1:10 التخفيف من gDNA من كل جandidate كنموذج في 2 ردود الفعل PCR التحقق من التركيب الصحيح المنبع والمصب 9.
- تستخدم تفاعلات PCR القياسية لكل مرشح وتحليل شظايا 22 الناتجة عن ذلك.
ملاحظة: هذه تقارير إنجاز المشروعات اختبار لإدخال الكاسيت المقاومة في موضع الجيني الصحيح. إذا تم الحصول على المنتجات لكلا الجانبين، من المرجح أن يكون المرشح على الإدراج الصحيح. ومع ذلك، ينبغي أن يتم أيضا المرشحين حيث جانب واحد فقط (المنبع أو المصب) يتسن التأكد على طول لمزيد من التحليل في حالة أن ردود الفعل PCR فشلت ببساطة عن الجناح واحدة.
- إعداد الحمض النووي الجيني.
- التحقق من الإدراج الجينوم الصحيح من جنوب تحليل وصمة عار 22
- هضم 15 ميكرولتر من gDNA (4.2.1) من المرشحين متحولة والمقابلة سلالة wildtype / السلف مع انزيم المناسب الذي يمر خارج مكان / بناء وبالإضافة إلى ذلك، يقطع إما في الجينات أو في الكاسيت المقاومة مما يؤدي إلى حي بوضوحأنماط inguishable (الشكل 1) 8.
ملاحظة: أي من العصابات المتوقعة ينبغي أن تكون أكبر من 10 كيلو بايت، بحيث يمكن تمييزها بوضوح من الحمض النووي عسر الهضم. - استخدام المنبع والمصب الجهة كما تحقيقات. لتسمية لهم على سبيل المثال استخدام PCR DIG وضع العلامات كيت أو أي طريقة قياسية مماثلة. مزيج تحقيقات وصفت في نسبة 1: 1 الجزيئية وتنفيذ اللطخة الجنوبية. حفاظ على اثنين على الأقل transformants الصحيحة مستقلة.
ملاحظة: يجب أن يكون نمط wildtype كشفها بوضوح في سلالة الأصلي ويجب أن تحتوي على استنساخ الصحيحة فقط العصابات المتوقع. العصابات إضافية موجودة فقط في المرشحين تشير الإدراج أخرى للبناء في موضع الخطأ. يجب التخلص من هذه الحيوانات المستنسخة. يجب أن تحتوي على مرشح السلبي المحددة في أول التشخيص PCR العصابات wildtype وعصابات (غير متوقعة في حجم) من بناء حذف متكاملة خطأ.
- هضم 15 ميكرولتر من gDNA (4.2.1) من المرشحين متحولة والمقابلة سلالة wildtype / السلف مع انزيم المناسب الذي يمر خارج مكان / بناء وبالإضافة إلى ذلك، يقطع إما في الجينات أو في الكاسيت المقاومة مما يؤدي إلى حي بوضوحأنماط inguishable (الشكل 1) 8.
- الأسهم الجلسرين
ملاحظة: الأسهم الجلسرين تعمل على الحفاظ على الحيوانات المستنسخة لسنوات في مجموعات الضغط. يجب أن تبقى اثنين على الأقل transformants مستقلة لكل متحولة. وهذا يسمح بمقارنة الظواهر التي يجب أن تكون متطابقة.- تنمو 5 مل ثقافات سلالات متحولة أكد في YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية مزيج 500 ميكرولتر من كل ثقافة مع 500 ميكرولتر NSY-الجلسرين متوسطة. عكس أنبوب حتى الثقافة ومتوسطة مختلطة جيدا. الجلسرين في المتوسط يمنع تكوين بلورات الثلج.
- تجميد في -80 درجة مئوية. إعادة خط جزء من ثقافة المجمدة لاختبار إذا كانت الأوراق المالية وظيفية.
5. مجهرية الظواهر
- تنمو 5 مل ثقافات wildtype وسلالات متحولة في YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 12 ساعة على 28 درجة مئوية.
- وفي اليوم التالي، يخفف من ثقافة إلى OD 600 من حوالي 0.1 وتنمو فيه حتى على OD 600 بين 0.5 و 0.7. وOD 600 من 1.0 الموافقonds إلى حوالي 1-2 × 10 7 U. الذروية خلايا لكل مل.
- تفقد شكل الخلية مجهريا.
تظهر صحي خلايا السيجار على شكل (الشكل 4، WT): ملاحظة. فجوات منطوقة أو تشكيل خيوط تشير إلى أن وشدد على الخلايا.
ملاحظة: اعتمادا على النمط الظاهري متحولة المتوقع، يمكن تكييف هذا التحليل، على سبيل المثال، إذا تم استخدام سلالات مراسل ويمكن إجراء الفحص المناسب للخروج في هذه المرحلة. إذا كان يجب إجراء التحليل الإحصائي تغير شكل الخلية، على سبيل المثال، لتحديد متوسط طول الخلية.
6. العدوى الفحص
ملاحظة: تم تصور الفحص إصابة الشتلات سابقا في هذه المجلة 11. ما في وسعها إما أن تنفذ باستخدام فرداني، الخلفية سلالة solopathogenic مثل SG200 10 أو عن طريق خلط شركاء التزاوج متوافق كلاهما تحمل التحور.
- تنمو لا يقل عن 40 شتلات الذرة فيسلالة لمدة 7 أيام في دورة الخفيفة من 16 ساعة، 200 μE، 28 ° C / 22 ° C (يوم / ليلة). يجب أن يكونوا في المرحلة 3 أوراق و10-15 سم في اليوم من الإصابة.
- قبل يومين من الإصابة، وبدء ثقافة ما قبل السلالات في 5 مل YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. تنمو ثقافة الرئيسية في 50 مل YEPS الضوء تصل إلى OD 600 = 1.0 (معدل انقسام الخلايا = 2 ساعة، والسماح الشعب 3 كحد أدنى، ويمكن أن يتم O / N).
- تدور باستمرار خلايا ثقافة 50 مل في 1500 x ج لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. غسل 3X مع H 2 O. معقم resuspend الخلايا في H 2 O معقمة إلى OD 600 من 3.0. إذا لزم الأمر، مزيج من شركاء التزاوج.
- حقن 250-500 ميكرولتر من تعليق خلية في الجذعية من 7 أيام شتلات الذرة القديمة باستخدام حقنة صغيرة. استخدام H 2 O معقمة كمجموعة تحكم. الحفاظ الشتلات المصابة لمدة 7-14 أيام إضافية في نفس ظروف الإضاءة ودرجة الحرارة. تسجيل النمط الظاهري لكل مصنعccording لصحي، الاخضرار، تشكيل الأنثوسيان، الأورام الصغيرة، وأورام كبيرة، النباتات الميتة 10.
ملاحظة: يمكن أن يتم تسجيل النقاط في وقت مبكر من 7 أيام، وكرر في 14 يوما لمتابعة العدوى مع مرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بنيات الحذف لجميع الجينات chitinolytic أربعة المشفرة في U. تم إنشاؤها الذروية الجينوم عن طريق الاستنساخ جولدن جيت باستخدام كاسيت hygR للحذف من cts1، وnatR للحذف من cts2، الكاسيت G418R للحذف من cts3 وcbxR للحذف من cts4 20. ويتمثل لمحة عامة عن استراتيجية استبدال الجينات التي حذف cts3 (الشكل 1). تم إنشاء المسوخ مفردة ومزدوجة من cts1 مع جين chitinolytic الثاني بالتتابع مع نفس البناءات في اثنين من خلفيات وراثية مختلفة لتحليل دور chitinases في الفوعة. كانوا يعملون خلفيتين سلالة مختلفة: AB33 يسمح تحريض نمو الخيطية، فإن الخطوة الأولى نحو المرضية 23، SG200 هو سلالة منفردا الإمراض التي تمكن المرض سريعا بتسجيله 10 cts3 -deletion بناء في الخلفية سلالة المناسبة، تم اختبار المستعمرات واحد من لوحة الاختيار الثاني لحذف الصحيح من خلال تقارير إنجاز المشروعات التشخيص (الجدول 1) واللطخة الجنوبية (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام، لcts3 معدل إعادة التركيب مثلي كان أعلى من ذلك بكثير في SG200 من في AB33، ولكن لم يكن لوحظ هذا الاختلاف باستمرار في الحذف من chitinases الآخرين.
التحقق سلالة صرامة يضمن الإدراج واحد من الحذف بناء على الموضع المطلوب. ومع ذلك، وتعديل إضافي مثل الطفرات نقطة يمكن أن تبقى غير مكتشفة، والتي قد تضليل تفسير الظواهر. لذلك، يتم phenotyped اثنين على الأقل transformants مستقلة.
تين لدى عودتهم 1. نظرة عامة على استراتيجية الحذف والتي تجسدت cts3. وتشمل هذه نظرة تخطيطية الحذف بناء مع الجناح المنبع (UF)، المصب الجناح (DF)، والمقاومة geneticin كاسيت (G418R)، موضع الجيني من wildtype (WT ) وcts3 حذف متحولة وجميع الاشعال فضلا عن تقييد مواقع تستخدم في التحقق سلالة. أول نتائج PCR التشخيص في منتج إلا إذا كان نسخة wildtype الجينات موجودة، وهما تقارير إنجاز المشروعات التشخيصية الثانية تسفر عن المنتجات إذا كانت كاسيت المقاومة تم دمجها بشكل صحيح. لطخة الجنوبية يتم هضم الحمض النووي الجيني مع PstI، تحقيقات تغطي الجبهة المتحدة وDF (الحانات الحمراء) مما يؤدي إلى الكشف عن عصابة 6.7 كيلو بايت في wildtype وشريطين من 5.6 كيلو بايت و 2.0 كيلوبايت في متحولة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق DF يعترف بضعف المنتج 2.6 كيلوبايت. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبدو أن الشكل 2. التحقق المجهري protoplasting رد فعل. (أ) الخلايا غير المعالجة wildtype (FB2) شكل السيجار. (ب) عند المعاملة مع جدار الخلية مهينة الأنزيمات (هنا لمدة 30 دقيقة)، وظهور مجالات مستديرة في نهاية واحدة (ق) وشريط جرس مثل الهياكل (ب) تشير إلى أن تدهور جدار الخلية قد بدأ. أخيرا جبلة مجردة هي تماما الجولة (ص)، والذي يرجع إلى عدم وجود جدار الخلية. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التين لدى عودتهم 3. تم هضمها وصمة عار جنوب لcts3 الحذف. الجينوم الحمض النووي مع PstI. وصفت كلا الجناحين، ويخلط في نسب متساوي المولية واستخدامها كأداة من تحقيق واحد. في SG200 wildtype والحذف من cts1 chitinases وcts2، تم الكشف عن فرقة واحدة من 6.7 كيلو بايت. في الحذف cts3 (ز) و (ك)، شريطين من 5.6 كيلو بايت و 2.0 كيلوبايت هي واضحة تدل على حذف الصحيح من cts3. فرقة إضافية من 2.6 كيلو بايت يمكن تصور عن التعرض المفرط واسعة النطاق. وهذا يتوافق مع جزء معترف بها من قبل وجود تداخل من بي بي 100 فقط من التحقيق الجناح المصب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعض الطفرات تؤدي إلى عيوب النمو الواضحة التي يمكن أن يتم الكشف مجهريا. في الحذف كيتيناز، لم المسوخ واحدة لا يتم عرضأي خلل واضح، في حين cts1 / أظهرت 2 المسوخ مزدوجة فصل خلية وضوحا عيب 20. أظهر تلطيخ الحاجز الذي تم الانتهاء الانقسام السيتوبلازمي ولكن ظلت الخلايا متصلة على الأرجح عبر كيتين المتبقية (الشكل 4 من انغنر وآخرون 2015). ومن المعروف النمط الظاهري النمو المجهري مماثل لحذف khd4 24، جين ترميز بروتين ملزمة RNA التوسط دوران RNA بعد النسخي من الجينات المسؤولة عن التشكل والإمراضية 25.
الشكل 4. تحليل المجهري للطفرات الحذف. مورفولوجيا خلية والحاجز تشكيل سلالات كيتيناز الحذف. cts1 / 2 Δ سلالات يحمل عيب فصل الخلية وتشكل مجاميع كبيرة، وهي ليست بسبب عدم تشكيل الحاجز. الابتدائي والثانويكانت ملطخة الحاجز (انظر توسيع 5X في إدراجات) مع Calcofluor الأبيض (CW) قبل المجهري. الحانات النطاق = 10 ميكرون. لقد طبع هذا الرقم بإذن من انغنر وآخرون. 2015 خلية حقيقية النواة 20. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
لاختبار مساهمة chitinases لالفوعة، وأجريت فحوصات إصابة الشتلات خارج باستخدام المسوخ في الخلفية SG200 سلالة. في حين تم تخفيض المسوخ في khd4 في الفوعة، لم حذف chitinases لن يؤثر على إصابة شتلات الذرة (الشكل 5) 20،25.
الرقم 5. العدوى فحص من المسوخ الحذف. تصنيف الأمراض منشتلات الذرة 9 أيام بعد الإصابة مع U. منها الذروية السلالات. (أ) أعراض مجهري التي تستخدم لتسجيل المرض. تم اختبار (ب) اثنين transformants مستقلة لكل سلالة (N> 100). كل المسوخ-كيتيناز ناقصة (1/2 / 3Δ: endochitinases متحولة ثلاثة أضعاف، 4Δ: متحولة واحد N-acetylglucosaminidase 1/2/3 / 4Δ: متحولة الرباعي) المصابة النبات المضيف مما يؤدي إلى تكوين ورم الثقيلة كما لوحظ في التهابات wildtype مع سلالة SG200 solopathogenic. على النقيض من ذلك، تم تخفيض سلالة يحمل الحذف من الجينات التي تشفر بروتين ملزم RNA Khd4 في الفوعة كما ذكرت سابقا (24). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من انغنر وآخرون. 2015 خلية حقيقية النواة 20. الرجاء انقر هنا لعرض كبيرةنسخة ص من هذا الرقم.
| الخلفية الوراثية | 1 شارع diagn. PCR (مستبعد / اختبار) | 2 الثانية diagn. PCR (أكد / اختبار) | جنوبي (أكد / اختبار) | ٪ recomb. |
| AB33 | 22/07 | - | 15/07 | 32 |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 10/08 | 7/8 | 70 |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
الجدول 1: التحقق سلالة لحذف cts3 تم حذف cts3 كيتيناز الجينات في أربعة خلفيات وراثية مختلفة للسماح للدراسات النمو الخيطية (AB33) وإصابة (SG200) في الحذف واحدة ومتعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وكيفية توليد المسوخ الحذف للدراسات الوراثية العكسية في U. الذروية. نقطة البداية هي بنية الحذف الذي يحتوي تسلسل المرافقة لهذا الجين في المصالح التي تحتوي على تسلسل حوالي 1 كيلو بايت المنبع من بداية والمصب لوقف كودون وكذلك كاسيت المقاومة المناسب كما كان عليه في السابق الأمثل 7،9 . وإلى أن يتم إنشاء بنيات بشكل فردي لكل الجينات والتحقق منها بعناية عن الأخطاء تسلسل السابقة لحذف هذا الجين. الطفرات نقطة في جنباته يمكن أن تسبب تغيرات غير مرغوبة في تسلسل الجينوم، ولا سيما إذا كانت الأجنحة تصل إلى الجينات المجاورة أو الطفرة يعدل العناصر التنظيمية. هذا من شأنه أن يؤثر على جميع transformants ويمكن أن يسبب الظواهر والآثار الجانبية لا علاقة لها حذف الجين المطلوب.
عند التخطيط لاستراتيجية الحذف، النمط الظاهري المتوقع أن يتم النظر في اختيار الخلفية الوراثية. في هذه الحالة، وقد تم اختيار AB33 23 و SG200 10 للسماح لاختبار الظواهر في التبديل ومصنع العدوى الصرفي. وبالمثل، فإن العديد من الأخرى الرافضة قراءة قد تكون ذات فائدة، ويعمل مثل اندماج مع cts1 في تصدير البروتينات مغاير 14،26، وعلى خلفية التوتر مع الموسومة fluorescently rrm4 يسمح تحليل الحمض النووي الريبي النقل على الإندوسومات 27،28.
أثناء التحقق من سلالة، وتقارير إنجاز المشروعات التشخيص الإنتاجية العالية تسمح التخفيض السريع لعدد من المرشحين لفحصها في اللطخة الجنوبية شاقة نوعا ما. على وجه الخصوص، أول PCR التشخيص يسمح استبعاد المرشحين لا تزال تحتوي على نسخة wildtype من الجينات، وبالتالي يمنع الاستخدام المكثف للالفينول السامة في الاستعدادات gDNA. في حالة عادية مع الجين غير الضرورية، قد تحتوي على ما يقرب من نصف المستعمرات الجين wildtype. هذا الفرز المسبق يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة للجينات مع الظواهر النمو الضارة المحتملة. يمكن أن بسرعة مئات المرشحين سيتم عرضها.
إذا يحتوي على جميع المرشحين نسخة wildtype، هو على الأرجح حذف الجينات القاتلة. ويمكن التأكد من ذلك عن طريق حذف نسخة واحدة في خلفية مضاعفا سلالة (مثل D132) وتحليل الفصل بعد بوغ نهائي إنبات 29. بدلا من ذلك، استراتيجية حذف مشروطة باستخدام المروج محرض ويمكن اختيار لمتابعة النمط الظاهري متحولة. ومع ذلك، أيضا التلوث الناجم عن طريقة الخام على هيدروكسيد الصوديوم لإعداد gDNA يمكن أن تتداخل مع PCR ويؤدي إلى السلبيات كاذبة، أي المرشحين لا تظهر الفرقة، وبالتالي يتم الاحتفاظ على الرغم من أنها تحتوي على الجين. يمكن استبعاد ذلك عن طريق اختبار الجينات التحكم مع المنتج حجم مماثل في رد فعل PCR مستقل أو متعدد-PCR مع اثنين الاشعال والاشعال الجينات المحددة لجين السيطرة التي تنتج في جزء أكبر.
إذا المسخ هو متاح بالفعل، على سبيل المثال، cts1 Δ 30 أو Δ rrm4، وتوليد السلالة من الإصدارات الموسومة يمكن تسريع المحتوى "> بالاستعاضة عن حذف الجينات المقاومة كاسيت (على سبيل المثال hygR) في الجينوم مع بناء الرواية التي تحتوي، على سبيل المثال، rrm4 fluorescently المسمى والمقاومة علامة مختلفة (على سبيل المثال natR). في هذه الحالة، transformants يمكن فحص عن فقدان علامة المقاومة المبدئية 9. المرشحين الصحيح ومقاومة فقط ضد الجديد المضاد الحيوي (nourseothricin) وفقدوا المقاومة المبدئية (هيغروميسين ). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم تكامل من النمط الظاهري متحولة في عبر ذلك للتحقق من وظائف من بنيات الموسومة 30،31.وتقدم استراتيجية حذف الجينات والتعديل هنا وصف أداة موثوقة ودقيقة في التحليل الجيني للU. الذروية. لحذف متعددة ومع ذلك، فإن سلالة جنرال الكتريكneration يمكن الحصول تستغرق وقتا طويلا، لأن التعديلات التي يتعين الاضطلاع بها بشكل متتالي. لذلك، كأداة تكميلية في العام الماضي وقد تم تأسيس نظام كريسبر-CAS لU. الذروية 32. فإنه يوفر إمكانية لتعطيل العديد من الجينات في وقت واحد وإضافة ممتازة إلى الأدوات الجينية للU. الذروية.
وباختصار، فإن بروتوكول للتلاعب الجيني وU. جيل سلالة الذروية الموصوفة هنا هو وسيلة قوية التي استخدمت على نطاق واسع في المجتمع لعدة سنوات. جنبا إلى جنب مع مجموعة شاملة من وحدات كاسيت مقاومة كل ذلك يتيح لجميع أنواع الهندسة الوراثية في هذا الفطر، ومعالجة مسائل متنوعة تتراوح من أساسية إلى البحوث التطبيقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
شكر خاص للدكتور بينيديكت Steuten لقراءة نقدية للمخطوطة. تم تنفيذ العمل الأصلي على chitinases بها الدكتور تورستن انغنر. يتم اعتماد مختبر VG التي كتبها عنقود التميز في علوم النبات (CEPLAS، DFG EXC 1028) وBioSC، يتم اعتماد مختبر KS التي كتبها BioSC. ويدعم KB من BioSC. الأنشطة العلمية لمركز العلوم الاقتصاد الحيوي (BioSC) ودعما ماليا من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في إطار من NRW Strategieprojekt BioSC (رقم 313 / 323-400-00213). ويدعم LF من قبل زمالة الدكتوراه من DFG المجموعة الدولية والبحوث والتدريب 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
