Summary
Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.
Abstract
Gendeletion spielt eine wichtige Rolle bei der Analyse der Genfunktion. Eine der effizientesten Methoden Gene gezielt zu unterbrechen ist der Ersatz des gesamten Gens mit einem selektierbaren Marker durch homologe Rekombination. Während der homologen Rekombination, den Austausch von DNA erfolgt zwischen Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit. Daher linearen genomischen Sequenzen ein Zielgen flankieren können gezielt eingesetzt werden, um einen selektierbaren Marker in die gewünschte Integrationsstelle lenken. Blunt Enden des Deletionskonstrukt aktivieren die DNA-Reparatursysteme der Zelle und damit Integration des Konstrukts zu fördern, entweder durch homologe Rekombination oder durch nicht-homologe-end-joining. In Organismen mit effizienten homologe Rekombination, kann die Rate der erfolgreichen Gen-Deletion erreichen mehr als 50% machen diese Strategie zu einem wertvollen Genin System. Der Brandpilz Ustilago maydis ist ein eukaryotischen Modell Mikroorganismus so effiziente homologe recombinat zeigtIon. Aus seiner etwa 6.900 Gene, wurden viele haben funktionell mit Hilfe von Deletionsmutanten gekennzeichnet, und Versagen des Genaustausches Versuche Punkte an wesentlichen Funktion des Gens wiederholt. Die anschließende Charakterisierung der Genfunktion durch auch auf DNA-Austausch beruht über homologe Rekombination mit Fluoreszenzmarkern oder Mutationen der vorhergesagten Domänen-Tagging. Hier präsentieren wir die U. maydis Stamm Generation Strategie im Detail das einfachste Beispiel verwenden, die Gen - Deletion.
Introduction
Ustilago maydis ist ein phytopathogener Modell Pilz, der in großem Umfang für Jahrzehnte 1,2 untersucht wurde. Es existiert in zwei Morphologien, eine Hefe-like, nicht pathogen Stufe und einem fädigen, infektiöse Form 3. Universal - Durchbruch Entdeckungen wie homologe Rekombination und DNA - Reparaturmechanismen wurden in der Hefe-ähnliche Wachstumsphase des Pilzes 4 gemacht. Darüber hinaus sind die morphologischen Schalter auf den infektiöse Glühfaden und Virulenzfaktoren wichtig für Infektions 5,6 gut charakterisierten. Die zunehmende molekulare Wissen über Biologie und Virulenz dieser Brandpilz beruht auf einem einfachen Gen - Ersetzungsstrategie 7-9 durch eine hervorragende Genomannotation unterstützt 10 und die Leichtigkeit der reversen Genetik, zB die gut organisierte Plasmid Sammlung an unserem Institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardisierte, schnelle Infektionstests in Mais seedlings ermöglichen detaillierte Studien der Pathogenität 11 Faktoren.
Das Genom von U. maydis enthält etwa 6900 Gene 10. Um ihre Funktion zu studieren, können sie einzeln oder in Kombination gelöscht werden aufgrund einer effizienten homologe Rekombinationssystem. Flankierende Regionen von etwa 1 kb perfekt homologe Enden enthalten , sind ideal für die Preise der homologen Rekombination von mehr als 50%, aber bereits 250 bp mit nicht-homologe Enden ermöglichen einen gewissen Grad an korrekte Integration des Konstrukts 9. Derzeit sind fünf verschiedene Widerstandskassetten, HYGR, cbxR, NATR, G418R und phleoR vermittelnde Widerstand gegen Hygromycin, Car-, Nourseothricin, G418 und Phleomycin, eingesetzt für Trans auszuwählen 7,9. Darüber hinaus hat der Hygromycinresistenz in eine wiederverwertbare Kassette (FRT-HYGR) entwickelt worden, die durch die transiente Expression einer heterologen FLP Rekombinase entfernt werden kann 12. Dies ermöglicht die Entfernung der Resistenzkassette und damit theoretisch unbegrenzt genetische Veränderungen. Phleomycin ist mutagenen 13, so daß mit den neuen Kassetten, insbesondere das recycelbar HYGR Kassette, die Verwendung von phleoR abnimmt. Quadruple - Mutanten können so erzeugt werden , um die anderen vier Kassetten verwenden, aber für verfünffachen Mutanten, die FRT-HYGR System wird 14 empfohlen.
Diese allgemeine Gen - Deletion Strategie wurde auf andere Brandpilze wie Sporisorium reilianum erfolgreich übertragen 15, U. hordei 16 oder U. esculenta 17 und bietet somit das Potenzial für weitere Anwendungen in noch genetisch hartnäckigen Organismen mit einem effizienten homologe Rekombination System. Außerdem Organismen die homologe Rekombination fehlt modifiziert werden können Gentechnik zu verbessern, wie durch die Deletion von Genen beteiligt exemplifiziert in nicht-homologe-end-Beitritt in Neurospora crassa 18,19.
Hier beschreiben wir die veröffentlichten Gen - Deletion Strategie für U. maydis 7,9 in experimentellen Detail mit einem Fokus auf die schnelle und genaue Überprüfung der Kandidaten. Als Beispiel verwenden wir die Pilz Chitinasen und zeigen die Erzeugung von Einzelmutanten sowie mehrere Lösch 20,21 Stämme. Chitinasen sind interessante Beispiele, weil sie in der starren Zellwand auf Chitin wirken. Zellwand Umbau für morphologische Veränderungen während der Zellteilung benötigt wird, wechseln Sie in das filamentöse Wachstum und die Sporenbildung. Daher kann in Deletionsmutanten Phänotypen während der Lebensdauer zu erwarten.
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Protocol
1. Erzeugung von Deletionskonstrukte
- Generieren Sie ein Plasmid , das das Löschen Konstrukt (Abbildung 1), die jeweils einen 1 kb stromaufwärts Flanke (UF) und Downstream - Flanken (DF) , die jeweils und die entsprechende Resistenz - Kassette flankiert durch stumpfe Schneidrestriktionsstellen enthält.
HINWEIS: Jede Strategie Klonen verwendet werden kann (für das Klonen siehe Referenz 22) wir für solche Plasmide 9 Golden Gate Klonen empfehlen. - Excise die Streichung aus dem Plasmid - Konstrukt eine stumpfe Schneider 1 ug DNA des Löschens zu erhalten 9 konstruieren. Reinige das Löschen Konstrukt Enzym eliminieren und 22 zB Puffer von kommerziellen Reagenzien und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die Vektorgerüst in dem Transformationsgemisch verbleiben kann.
2. Herstellung von Protoplasten
HINWEIS: Halten sterilen Bedingungen in allen Zeiten des experiment. Die Zellwand ist eine starke schützende Barriere, die den Zugang der Moleküle an der Plasmamembran begrenzt. Zur Aufnahme der DNA, enthaltend das Deletionskonstrukt zu ermöglichen, muss die Zellwand durch Zellwand entfernt werden Enzyme in einem Reaktions Protoplastierung zu verschlechtern. Kritischsten Schritte in Protoplastenpräparation sind 1) osmotische Stabilisierung des Mediums und 2) auf den Protoplasten mechanische Beanspruchung zu vermeiden.
- Mark 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden der Protoplasten zu frieren und kühlt sie bei -20 ° C nach unten. Starten Sie eine Vorkultur in 3 ml YEPS-Licht aus einer frischen Platte des Stammes mit der gewünschten genetischen Hintergrund. Inkubieren auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C.
HINWEIS: Der Stamm kann die solopathogenic Stamm SG200 10, Wildtyp- Stämme, Teststämme wie AB33 23, oder jede Mutante Hintergrund für die Erzeugung von Doppelmutanten sein. Stellen Sie sicher, dass der Stamm frei von dem gewünschten Widerstand ist. - Verdünnen Sie die Kultur in 50 ml YEPS-Licht in einem verwirrten flask und Inkubieren auf einem Orbitalschüttler bei 28 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute.
HINWEIS: Die Verdopplungszeit beträgt etwa 2 h für Wildtyp- Stämme. Lassen Sie drei Vervielfältigungen Minimum. - Wachsen bis exponentiellen Phase. Sicherzustellen , dass die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen (OD 600), liegt bei etwa 0,8 (0,6 bis 1,0 ist akzeptabel). Eine OD 600 von 1,0 entspricht etwa 1 bis 2 x 10 7 U. maydis Zellen pro ml.
- Überprüfen Sie die Zellen für die Verunreinigung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie 40-facher Vergrößerung. Pellet die Zellen des gesamten 50-ml-Kultur für 5 min, 1.500 xg und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets in 25 ml Natriumcitrat, Sorbitol-Lösung (SCS), Zentrifuge 5 min, 1.500 x g, und Überstand verwerfen.
HINWEIS: Die bakterielle Verunreinigungen können so klein und oft bewegenden Zellen identifiziert werden. Fungal Verunreinigungen können an die Zigarre förmigen Zellen von U. basierend auf einer anderen Zelle Form oder Größe verglichen identifiziert werden maydis. - Während centrifugation vorbereiten Protoplastierung - Lösung (12,5 mg / ml Trichoderma lysierende Enzyme, SCS, vorbereiten 3 ml pro Zellpellet, Filter sterilisieren durch einen 22 & mgr; m - Filter; Lösung hat für eine optimale enzymatische Aktivität frisch zu sein). SCS ist ein osmotischer Stabilisator Ruptur von Protoplasten nach der Entfernung der Zellwand zu verhindern.
- Das Pellet in 2 ml Protoplastierung Lösung. Inkubieren für 5 bis 20 min bei RT und prüfen Sie unter dem Mikroskop , bis 30 bis 40% der Zellen sind rund oder wie pinheads (Abbildung 2).
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf dem Eis von nun an und behandeln Protoplasten mit Vorsicht! - Wasch 3x in 10 ml kaltem (4 ° C) SCS, Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min.
- Das Pellet in 10 ml kaltem Sorbit, TrisHCl, CaCl 2 -Lösung (STC), Spin bei 1000 × g für 5 min, Überstand verwerfen. Das Pellet in 1 ml kaltem STC, machen 100 ul Aliquots in den gekühlten Rohren. Frieren Sie die Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
3. Transformation von U. maydis
HINWEIS: Die Transformation von U. maydis Protoplasten basiert auf dem Polyethylenglykol (PEG) -vermittelte Transformation Verfahren, das technisch einfach ist und im Gegensatz zur Elektroporation oder Transformation biolistische erfordert keine spezielle Ausrüstung.
- Bereiten Sie die zweischichtige Selektionsplatten (2 Platten pro Transformationsreaktion). Die untere Schicht enthält das Antibiotikum in einer doppelten Konzentration. Pipettieren von 12 ml RegLight enthaltend 400 & mgr; g / ml Hygromycin (oder 300 & mgr; g / ml Nourseothricin oder 4 ug / ml Carboxin oder 1 mg / ml G418) in eine Petrischale. Vermeiden Sie Blasen.
HINWEIS: Die untere Schicht Platten kann ein paar Tage bei 4 ° C gelagert werden, sondern bereiten die oberste Schicht frisch während der Transformation (siehe unten). - Thaw Protoplasten auf Eis (1 Rohr / Transformation). 1 & mgr; l Heparin (15 mg / ml). 1 & mgr; g DNA (linearisierte Konstrukt) oder 10 & mgr; l H 2
- Während dieser Zeit verbreitet für die obere Schicht 12 ml verflüssigtes RegLight (kochen und kühlen bis 60 ° C) auf die RegLight Bodenplatte.
HINWEIS: Diese Schicht enthält keine Antibiotika. - In 500 ul STC / PEG (Polyethylenglykol), um die Transformation Rohr (3 2) und mischen Sie vorsichtig durch den Schlauch zu invertieren. Inkubieren 15 min auf Eis.
- jeder Transformationsreaktion auf zwei der zweischichtigen RegLight Platten verteilen. Verbreiten Sie vorsichtig und langsam mit einer Glaspipette. Die Platten aufrecht bei 28 ° C für 5 bis 7 Tage bis zum Trans als Kolonien wachsen. Erhalten Sie etwa 100-200 Kolonien pro Platte.
HINWEIS: Niedrigere Zahlen könnten durch "schlechte" Protoplasten verursacht werden, die entweder zu viel Zellwand enthalten und daher nicht DNA aufnehmen kann oder nicht regenerieren. Ersteres kann mit einem selbst-replizierenden Plasmid durch Transformation getestet werden, letztere durch Regeneration Testen auf Platten ohne Antibiotika. <li> Bereiten Sie YEPS-Light-Platten das entsprechende Antibiotikum bei 200 ug / ml Hygromycin (oder 150 ug / ml Nourseothricin oder 2 ug / ml Car- oder 500 ug / ml G418, diese Konzentrationen gleich die Hälfte der für die Bodenplatten verwendet man) enthält. Wieder reinigen mindestens 24 putative Transformantenkolonien auf diesen Platten. Einzelne Kolonien sollten erhalten werden. Zur gleichen Zeit Strähne aus dem ursprünglichen Stamm auf nicht-selektiven Medien.
HINWEIS: Die Platten können für 1-2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden.
4. Überprüfung der korrekten Deletionsereignisse
HINWEIS: Die Mutationen in einem Drei-Schritt - Verfahren überprüft werden (Abbildung 1). Zunächst Kandidaten, die die Wildtyp-Kopie des Gens enthalten, werden durch PCR ausgeschlossen. Zweitens wird die Integration des Resistenzkassette in den Locus durch PCR verifiziert. Drittens nur in den gewünschten Ort der Integration der Resistenzkassette wird durch Southern-Blot-Analyse verifiziert. Eine sorgfältige Überprüfung Stamm ist Essential, so dass Mutantenphänotypen wirklich mit der Streichung korrelieren.
- Erste Diagnostische PCR 20
- Design Primer Paarung in dem Gen zu diesem Ergebnis ein Produkt von 250-600 bp (Abbildung 1) gelöscht werden. Solche kleinen Produkte sind einfach in einer Kolonie-PCR, und lang genug für den Nachweis in Standard-Gel-Elektrophorese zu verstärken.
- Für jeden Kandidaten und dem ursprünglichen Stamm als eine positive Kontrolle, resuspendieren ein wenig (Menge eines Stecknadelkopfes) von Zellmaterial aus einer einzelnen Kolonie mit einem Zahnstocher in 20 ul 0,02 M NaOH. 30 min bei RT inkubiert.
HINWEIS: Verwenden Sie frische Kolonien. Wenn die Platten sind älter als 1 Woche wieder Streifen eine frische Kolonie zu erhalten. - Verwenden 1 & mgr; l der Zellsuspension für die unmittelbar PCR. Führen Sie einen Standard-PCR-Reaktion und Analyse resultierenden Fragmente.
ANMERKUNG: Diese Proben können nicht gespeichert werden.
HINWEIS: Diese PCR-Tests auf das Vorhandensein des Wildtyp-Gen und ermöglicht dadurch eine schnelle Identifizierung von negativen candidates in denen das Gen von Interesse ersetzt worden ist. Klone Bänder in dieser PCR-Reaktion ergibt, werden verworfen. Ein solcher negativer Klon sollte auf jeden Fall durchgeführt werden zusammen als zusätzliche negative Kontrolle. Kandidaten ohne PCR-Produkt müssen weiter analysiert werden. Für Gene ohne schädliche Auswirkungen etwa die Hälfte der Kandidaten sollte das Wildtyp- Gen enthalten, während die andere Hälfte nicht in einer Band zur Folge haben sollte. Dies entspräche einer homologen Rekombination Rate von 50%.
- Zweite Diagnostische PCR
- Herstellung von genomischer DNA.
HINWEIS: Genomische DNA (gDNA) kann unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen hergestellt werden. Die erste umfasst toxische Reagenzien wie Phenol und Chloroform, und daher sollten nur von erfahrenen Forscher (in 4.2.1.1 bis 4.2.1.5 beschrieben) behandelt werden, während der zweite auch von weniger erfahrenen Studenten behandelt werden können (in 4.2.1.6 bis 4.2 beschrieben. 1.11). Beide Protokolle arbeiten zuverlässig. Schritt 4.2.1.1 ist identisch für beide Protocols.- Impfen 5 ml YEPS-Light mit jedem Kandidaten und Inkubation bei 28 ° C für 24 Stunden auf einem rotierenden Rad. Drop 2 ul der Kultur auf einer CM-Platte. Danach wird die Kultur steril.
HINWEIS: Im Anschluss ist ein Standardprotokoll (ACHTUNG: toxische Stufen). - Setzen Sie 1 Kugel (~ 200 ul) HCl-washed Glasperlen 2-ml-Röhrchen. 2 ml des U. maydis - Kultur. Spin 12.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen (Pellet kann in diesem Stadium eingefroren werden). Hinzufügen, 500 & mgr; l Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zu dem Pellet. VORSICHT! Phenol ist giftig!
- In 500 ul Usti-Lyse-Puffer 1. Schütteln für 6 bis 10 min auf einem Vibrax bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet vollständig suspendiert ist, aber vermeiden Sie verlängerten Schütteln Scheren des gDNA zu verhindern. Spin bei 12.000 × g für 15 min. Übertragen Sie 400 ul der wässrigen Phase in die neue Reaktionsrohr (berühren Sie nicht die Interphase).
- 1 ml 100% (v / v) Ethanol. Drehen Sie die Röhre 3x zu mischen, beobachten die claut der DNA, die in Kürze erscheint. Spin bei 12.000 xg für 5 min. Überstand entfernen und waschen mit 200 ul 70% EtOH. Nicht das Pellet in dieser Phase suspendieren.
- Überstand entfernen vollständig (Sie das Pellet vollständig trocknen, nicht zulassen). In 50 ul TE / RNase. Auflösen gDNA wurde 10 min bei 400 rpm bei 50 ° C schüttelnd. Analysieren 2 ul der gDNA auf einem 0,8% Agarose - Gel 20.
HINWEIS: Die folgenden Schritte umfassen eine alternative nichttoxische Protokoll.
- Impfen 5 ml YEPS-Light mit jedem Kandidaten und Inkubation bei 28 ° C für 24 Stunden auf einem rotierenden Rad. Drop 2 ul der Kultur auf einer CM-Platte. Danach wird die Kultur steril.
- Alternative Herstellung von genomischer DNA
- Setzen Sie 1 Kugel (~ 200 ul) von HCl Glasperlen 2-ml-Röhrchen gewaschen. 2 ml des U. maydis - Kultur und Schleudern bei 12.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen (Pellets kann in diesem Stadium eingefroren werden).
- In 500 ul Usti Lysepuffer 2 zu dem Pellet. Schütteln für 5 bis 15 min auf einer Vibrax bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet vollständig suspendiert ist.
- Inkubieren der Röhrchen bei 65 ° C für 15 bis 20 min. Mit approfalls Inkubatoren Rohre Host ausgelegt 2 ml ist kritisch. Dann legen Sie es auf Eis für 5 min.
- Füge 100 & mgr; l 8 M Kaliumacetat, Wirbel oder Invertzucker 8 bis 10 mal. Spin 12.000 xg für 15 min bei RT.
- Transfer 500 ul des Überstands in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und fügen 400 ul Isopropanol. Wirbel- oder Invertzucker 8 bis 10 mal. Spin 12.000 xg für 15 min. Überstand entfernen und waschen mit 500 ul 70% EtOH. Spin 12.000 xg für 5 min.
- Tränken weg vom Überstand vollständig! Schließlich fügen Sie einen kurzen Schleuder (10 sec) Restflüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die DNA-Pellet trocken für 3 bis 5 min. Werden 50 & mgr; l TE / RNAase und inkubieren bei 50 ° C für 10 bis 15 min bei 400 Upm.
- PCR
- Design zwei Primerpaare mit einem von ihnen außerhalb der Flanken Bindung und die entsprechende eine Bindung innerhalb der Resistenzkassette (UF-f, RC-R; RC-f, DF-r, 1) 9.
- Verwenden Sie 1 ul einer 1:10 Verdünnung der gDNA jedes candidate als Matrize in zwei PCR - Reaktionen Überprüfung der korrekten Einsetzen Upstream- und Downstream - 9.
- Verwenden Sie Standard - PCR - Reaktionen für jeden Kandidaten und analysieren 22 Fragmente ergeben.
ANMERKUNG: Diese PCRs Test für die Insertion der Resistenzkassette in der korrekten genomischen Locus. Wenn Produkte für beide Seiten gewonnen werden, ist der Kandidat wahrscheinlich eine korrekte Einsetzen. Jedoch auch Kandidaten, wo nur eine Seite (upstream oder downstream) bestätigt werden sollten zusammen für eine weitere Analyse im Falle, dass PCR-Reaktionen einfach ausgefallen für eine Flanke durchgeführt werden.
- Herstellung von genomischer DNA.
- Überprüfung der korrekten Genomische Insertion durch Southern - Blot - Analyse 22
- Digest 15 ul gDNA (4.2.1) der mutanten Kandidaten und das entsprechende Wildtyp- / Progenitor-Stamm mit einem geeigneten Enzym, das außerhalb des locus schneidet / konstruieren und zusätzlich schneidet entweder in dem Gen oder in der Resistenzkassette führt eindeutig zu distinguishable Muster (Figur 1) 8.
HINWEIS: Keine der erwarteten Banden sollte größer als 10 kb sein, so dass sie deutlich von unverdauten DNA sind. - Verwenden Sie den Upstream und Downstream Flanke als Sonden. Zur Kennzeichnung der sie zum Beispiel die PCR DIG Labeling Kit oder ähnliche Standardmethode verwenden. Mischen Sie die markierten Sonden in einem 1: 1-Molekülverhältnis und Durchführung des Southern-Blot. Halten Sie mindestens zwei unabhängige korrekte Trans.
HINWEIS: Die Wildtyp-Muster in dem Ausgangsstamm und die richtigen Klone enthalten sollten nur die erwarteten Banden eindeutig nachweisbar sein sollte. Weitere Bands nur in den Kandidaten zeigen andere Einfügungen des Konstrukts in einem falschen Ort. Solche Klone sollten verworfen werden. Der negative Kandidaten in der ersten diagnostische PCR identifiziert sollten die Wildtyp-Banden und die Bänder (unvorhersehbar in Größe) des falsch integriert Deletionskonstrukt enthalten.
- Digest 15 ul gDNA (4.2.1) der mutanten Kandidaten und das entsprechende Wildtyp- / Progenitor-Stamm mit einem geeigneten Enzym, das außerhalb des locus schneidet / konstruieren und zusätzlich schneidet entweder in dem Gen oder in der Resistenzkassette führt eindeutig zu distinguishable Muster (Figur 1) 8.
- Glycerol Stocks
HINWEIS: Glycerol Bestände dienen, die Klone für Jahre in Stammsammlungen zu halten. Mindestens zwei unabhängige Transformanten sollte für jede Mutante gehalten werden. Dies ermöglicht den Vergleich Phänotypen, die identisch sein sollten.- Wachsen 5 ml-Kulturen der bestätigten mutanten Stämmen in YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C Mix 500 & mgr; l jeder Kultur mit 500 & mgr; l NSY-Glycerol-Medium. Invert Rohr bis Kultur und Medium gut vermischt sind. Glycerol in dem Medium verhindert die Bildung von Eiskristallen.
- Einfrieren bei -80 ° C. Re-Streifen ein Teil der gefrorenen Kultur zu testen, ob das Lager funktionsfähig ist.
5. Mikroskopische Phänotypen
- Wachsen 5 ml Kulturen von Wildtyp- und Mutantenstämmen in YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 12 Stunden bei 28 ° C.
- Am nächsten Tag, verdünnte die Kultur auf eine OD 600 von etwa 0,1 wachsen und es werden bis eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,7. Eine OD 600 von 1,0 entsprSekunden auf etwa 1 bis 2 x 10 7 U. maydis Zellen pro ml.
- Überprüfen Sie die Zellmorphologie mikroskopisch.
HINWEIS: Gesunde Zellen erscheinen in Zigarrenform (Abbildung 4, WT). Ausgesprochen Vakuolen oder Fadenbildung zeigen, dass die Zellen werden betont.
HINWEIS: In Abhängigkeit von dem mutierten Phänotyp zu erwarten, kann die Analyse angepaßt werden, beispielsweise wenn Reporter - Stämme die geeignete Assay verwendet werden , können in dieser Phase durchgeführt werden. Wenn die Zellmorphologie verändert wird die statistische Analyse durchgeführt werden sollte, beispielsweise die mittlere Zellenlänge zu bestimmen.
6. Infection Assay
HINWEIS: Der Test Sämling Infektion wurde 11 zuvor in dieser Zeitschrift visualisiert. Es kann entweder 10 eine haploide, solopathogenic Stamm Hintergrund mit wie SG200 durchgeführt oder von kompatiblen Paarungspartnern Mischen , die sowohl die Mutation tragen.
- Wachsen mindestens 40 Maiskeimlinge proStamm für 7 Tage bei einem Lichtzyklus von 16 Stunden, 200 & mgr; E, 28 ° C / 22 ° C (Tag / Nacht). Sie sollte am Tag der Infektion im 3-Blatt-Stadium und 10-15 cm hoch sein.
- Zwei Tage vor der Infektion, beginnen eine Vorkultur der Stämme in 5 ml YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C. Wachsen Sie eine Hauptkultur in 50 ml YEPS-Light bis 600 bis OD = 1,0 (Zellteilungsrate = 2 h, erlauben drei Divisionen Minimum, kann O / N erfolgen).
- Spin down die Zellen von 50 ml Kultur bei 1500 × g für 5 min und den Überstand verwerfen. Wasch 3x mit sterilem H 2 O. Resuspendieren der Zellen in sterilem H 2 O bis zu einer OD 600 von 3,0. Falls erforderlich, mischen Sie die Paarungspartner.
- Injizieren 250-500 & mgr; l der Zellsuspensionen in den Stamm von 7 Tage alten Maiskeimlinge eine kleine Spritze verwendet wird. Verwenden sterilem H 2 O als Kontrolle. Halten infizierten Sämlinge für weitere 7-14 Tage im selben Licht und Temperaturbedingungen. Ergebnis des Phänotyps jeder Pflanze einN ach gesund, Chlorose, Anthocyan Bildung, kleine Tumoren, großen Tumoren, abgestorbenen Pflanzen 10.
HINWEIS: Scoring so früh wie 7 Tagen erfolgt und werden nach 14 Tagen wiederholt Infektion im Laufe der Zeit zu folgen.
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Representative Results
Die Deletionskonstrukte für alle vier chitinolytischen Gene im U. codierten maydis Genom von Golden Gate Klonen erzeugt wurden unter Verwendung der HYGR Kassette zum Löschen von CTS1, die NATR zum Löschen von CTS2, die G418R Kassette zum Löschen von cts3 und der cbxR zum Löschen von cts4 20. Eine allgemeine Übersicht über Gen - Ersetzungsstrategie wird durch die Deletion von cts3 (Figur 1) beispielhaft angegeben. Einzel- und Doppelmutanten von CTS1 mit einem zweiten chitinolytischen Gens wurden in zwei verschiedenen genetischen Hintergründen für die Analyse der Rolle von Chitinasen in Virulenz sequentiell mit den gleichen Konstrukten erzeugt. Zwei unterschiedliche Dehnungshintergründe wurden eingesetzt: AB33 Induktion von filamentöses Wachstum ermöglicht, ist der erste Schritt in Richtung Pathogenität 23, ist SG200 ein Solo-pathogenen Stamm, die eine schnelle Krankheit ermöglicht 10 Scoring cts3 in den entsprechenden Stamm Hintergrund konstruieren -deletion, einzelne Kolonien der zweiten Selektionsplatte wurden für die korrekte Löschung von diagnostischen PCR - Reaktionen (Tabelle 1) und Southern - Blot (Abbildung 3) getestet. Interessanterweise für cts3 die Rate der homologen Rekombination war viel höher in SG200 als in AB33, aber dieser Unterschied war nicht konsequent in Löschungen der anderen Chitinasen beobachtet.
Die strenge Belastung Überprüfung gewährleistet eine einzige Insertion des Löschens in der gewünschten Position zu konstruieren. Jedoch können zusätzliche Modifikation wie Punktmutationen bleiben unentdeckt, was die Interpretation von Phänotypen, getäuscht werden könnten. Daher sind mindestens zwei unabhängige Transformanten phänotypisiert.
Feige ure 1. Überblick über die von cts3 exemplifiziert Löschstrategie. Diese enthält schematische Übersicht der Lösch mit vorgeschaltetem Flanke (UF), Downstream - Flanken (DF) zu konstruieren, und die Geneticin - Resistenz - Kassette (G418R), der genomischen Locus von Wildtyp (WT ) und cts3 Deletionsmutante und alle Primer sowie die Restriktionsstellen in der Dehnungsprüfung verwendet. Die ersten diagnostischen PCR ergibt ein Produkt nur dann, wenn die Wildtyp-Gen-Kopie vorhanden ist, führen die beiden zweiten diagnostischen PCR-Reaktionen in Produkte, wenn der Widerstand Kassette richtig integriert. Für die Southern-Blot wird die genomische DNA mit PstI verdaut, umspannen die Sonden die UF und DF (rote Balken), die zu Nachweis eines 6,7 kb-Bande in Wildtyp- und zwei Banden von 5,6 kb und 2,0 kb in der Mutante. Darüber hinaus erkennt die DF - Sonde schwach ein 2,6 kb Produkt. Bittehier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die mikroskopische Überprüfung der Reaktion Protoplastierung. (A) unbehandelte Wildtyp - Zellen (FB2) erscheinen Zigarre geformt. (B) Bei der Behandlung mit Zellwand abbauenden Enzymen (für hier 30 min), das Auftreten von runden Kugeln an einem Ende (n) und Bar-Glocke artigen Strukturen (b) zeigt , dass die Zellwand Abbau begonnen hat. Schließlich werden die Protoplasten vollständig rund (r), die auf den Mangel an Zellwand zurückzuführen ist. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb ure 3. Southern - Blot für cts3 Deletion. Genomische DNA wurde mit PstI verdaut. Beide Flanken wurden markiert, in äquimolaren Verhältnissen gemischt und als eine einzige Sonde verwendet. In der Wildtyp- SG200 und Deletionen der Chitinasen CTS1 und CTS2, eine einzelne Bande von 6,7 kb detektiert wird . In cts3 Deletionen (g und k), zwei Banden von 5,6 kb und 2,0 kb sichtbar sind bezeichnend für die korrekte Löschung von cts3. Eine zusätzliche Bande von 2,6 kb durch massiven Überbelichtung visualisiert werden. Dies entspricht einem Fragment , das durch eine Überlappung von nur 100 bp des Downstream - Flanken - Sonde. Erkannt Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Einige Mutationen führen zu deutlichen Wachstumsdefekte, die mikroskopisch nachgewiesen werden kann. In den Chitinase Deletionen, haben einzelne Mutanten nicht anzeigenjeder offensichtlichen Mangel, während CTS1 / 2 Doppelmutanten zeigte eine ausgeprägte Zellseparation Defekt 20. Die Färbung der Septen zeigte , dass cytokinesis abgeschlossen wurde , aber die Zellen verbunden blieben wahrscheinlich über Rest Chitin (Bild 4 von Langner et al. 2015). Eine ähnliche mikroskopische Wachstum Phänotyp für die Löschung der khd4 bekannt 24 ist ein Gen , das ein RNA-Bindungsprotein vermittelnde post-transkriptionale RNA Umsatz von Genen in Morphologie und Pathogenität 25 beteiligt codieren.
Abbildung 4. Die mikroskopische Analyse von Deletionsmutanten. Cell Morphologie und Septum Bildung der Chitinase Deletionsstämme. CTS1 / 2 Δ Stämme weisen eine Zelltrennungsdefekt und große Aggregate bilden, die zu einem Mangel an Septum Bildung zurückzuführen ist. Primär und sekundärSepten (5x Vergrößerung in Einsätzen sehen) wurden mit Calcofluor White (CW) vor gefärbt Mikroskopie. Maßstabsbalken = 10 um. Diese Zahl wird nachgedruckt mit freundlicher Genehmigung von Langner et al. 2015 eukaryotischen Zelle 20. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um den Beitrag von Chitinasen testen, um Virulenz, Sämling Infektionstests wurden durchgeführt unter Verwendung der Mutanten im SG200 Stamm Hintergrund. Während Mutanten in khd4 in Virulenz reduziert wurden, Deletion der Chitinasen beeinflussen Infektion von Maiskeimlinge (Figur 5) nicht 20,25.
Abbildung 5. Infektionstest von Deletionsmutanten. Disease RatingMaiskeimlinge 9 Tage nach der Infektion mit dem entsprechenden U. maydis - Stämme. (A) makroskopischen Symptome , die für Krankheit Scoring verwendet werden. (B) Zwei unabhängige Transformanten wurden für jeden Stamm (N> 100) getestet. Alle Chitinase-defizienten Mutanten (1/2 / 3Δ: Dreifach-Mutante endochitinases, 4Δ: Einzelmutante N-acetylglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: Quadruple-Mutante) infiziert die Wirtspflanze zu schweren Tumorbildung führt, wie in Wildtyp-Infektionen beobachtet, die mit die solopathogenic Stamm SG200. Im Gegensatz dazu ein Stamm mit einer Deletion des Gens trägt , codierend das RNA-bindendes Protein Khd4 wurde in Virulenz vermindert , wie zuvor 24 berichtet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wird mit freundlicher Genehmigung von Langner et al modifiziert. 2015 eukaryotischen Zelle 20. Bitte klicken Sie hier um ein großes zu sehenr Version dieser Figur.
| Genetischer Hintergrund | 1. diagn. PCR (ausgenommen / geprüft) | 2. diagn. PCR (bestätigt / geprüft) | Süd (bestätigt / geprüft) | % Recomb. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 CTS1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabelle 1:. Dehnungsprüfung für cts3 Deletionen Das Chitinasegens cts3 wurde in vier verschiedenen genetischen Hintergründen gelöscht Studien von filamentösen Wachstum zu ermöglichen (AB33) und Infektionen (SG200) in einzelnen und mehreren Deletionen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt , wie Deletionsmutanten für Reverse genetische Studien in U. zu erzeugen maydis. Der Ausgangspunkt ist ein Deletionskonstrukt , die flankierenden Sequenzen des Gens von Interesse enthält Sequenzen von etwa 1 kb stromaufwärts des Starts und stromabwärts des Stop-Codons sowie eine geeignete Resistenz - Kassette enthält , wie es zuvor 7,9 optimiert . Die Konstrukte sind individuell werden für jedes Gen erzeugt und sorgfältig für Folgefehler vor dem Löschen des Gens bestätigt. Punktmutationen in den Flanken können unerwünschte Veränderungen in der genomischen Sequenz verursachen, insbesondere wenn die Flanken in das benachbarte Gen erreichen, oder die Mutation modifiziert regulatorische Elemente. Dies würde alle Transformanten betreffen und Phänotypen und Nebenwirkungen nicht mit dem gewünschten Gen-Deletion verursachen kann.
Wenn die Löschstrategie planen, bietet der erwartete Phänotyp in Betracht gezogen werden, um den genetischen Hintergrund zu wählen. Im vorliegenden Fall, AB33 23 und 10 SG200 wurden zum Testen Phänotypen in der morphologischen Schalter und Pflanzen Infektion zu ermöglichen , gewählt. Ebenso viele andere Lese-outs von Interesse sein könnten, beispielsweise Fusionen mit CTS1 im Export von heterologen Proteinen eingesetzt 14,26, und ein Stamm Hintergrund mit fluoreszierend markierten rrm4 ermöglicht die Analyse von RNA - Transport auf Endosomen 27,28.
Während Stamm Überprüfung, die Hochdurchsatz-diagnostischen PCR-Reaktionen ermöglichen eine schnelle Reduzierung der Anzahl der Kandidaten in der eher mühsamen Southern-Blot getestet werden. Insbesondere erlaubt der erste diagnostische PCR Ausschluss von Kandidaten noch die Wildtyp-Kopie des Gens enthält, und verhindert dadurch, dass die massive Verwendung von toxischen phenol in gDNA Zubereitungen. In einem Standard-Fall mit einem nicht-essentielles Gen, etwa die Hälfte der Kolonien kann das Wildtyp-Gen enthalten. Diese Pre-Screening kann für Gene von großem Interesse sein mit potenziell schädlichen Wachstum Phänotypen. Hunderte von Kandidaten können schnell gescreent werden.
Wenn alle Kandidaten die Wildtyp-Kopie enthalten, ist die Gen-Deletion höchstwahrscheinlich tödlich. Dies kann durch Löschen einer Kopie in einer diploiden Stamm Hintergrund (zB D132) und die Analyse der Segregation nach Teleutospore Keimung 29 bestätigt werden. Alternativ kann eine bedingte Strategie Löschung eines induzierbaren Promotors können die Mutantenphänotyps folgen gewählt werden. Aber auch aus dem rohen NaOH-basiertes Verfahren zur gDNA Zubereitung resultierende Kontamination kann mit der PCR stören und führen zu falsch negativen Kandidaten also nicht über eine Band zeigen und sind daher gehalten , obwohl sie das Gen enthalten. Dies kann durch Testen eines Kontrollgens mit einer vergleichbaren Größe Produkt in einer unabhängigen PCR-Reaktion oder durch Multiplex-PCR mit den zwei genspezifischen Primern und Primern für ein Steuer Gen ausgeschlossen werden, die in einem größeren Fragment führen.
content "> Falls eine Mutante bereits verfügbar ist, beispielsweise CTS1 Δ 30 oder rrm4 Δ Stamm Erzeugung von markierten Versionen können durch Ersetzen der Gendeletion Resistenzkassette (zB HYGR) in das Genom mit einem neuartigen Konstrukt enthalten, beispielsweise die beschleunigt werden , fluoreszenzmarkiertes rrm4 und eine unterschiedliche Resistenzmarker (zB NATR). In diesem Fall werden Transformanten können 9 durch den Verlust des Anfangsresistenzmarker gescreent werden. Correct Kandidaten resistent sind nur gegen das neue Antibiotikum (Nourseothricin) und haben ihre Anfangswiderstand (Hygromycin verloren ). Darüber hinaus können die Komplementierung des mutanten Phänotyps in trans durchgeführt werden Funktionalität von markierten Konstrukte 30,31 zu überprüfen.Die hier beschriebene Gen - Deletion und Modifikation Strategie bietet eine zuverlässige und genaue Werkzeug in der genetischen Analyse von U. maydis. jedoch für mehrere Deletionen, der Stamm generation kann sehr zeitaufwendig, erhalten, da die Veränderungen haben der Reihe nach durchgeführt werden. Deshalb als ergänzendes Instrument, im vergangenen Jahr das CRISPR-Cas - System wurde für U. etabliert maydis 32. Es bietet die Möglichkeit , mehrere Gene gleichzeitig zu stören und ist eine hervorragende Ergänzung zu den genetischen Toolbox von U. maydis.
Zusammenfassend ist das Protokoll für die genetische Manipulation und U. maydis Stamm Generation beschrieben hier ist eine robuste Methode , die seit Jahren in der Gemeinschaft weit verbreitet ist. Zusammen mit der umfassenden Sammlung von jeweiligen Widerstandskassettenmodule ermöglicht es, alle Arten von Gentechnik in diesem Pilz, Adressierung diverse Fragen von Grundlagen- bis zur angewandten Forschung reichen.
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Acknowledgments
Besonderer Dank geht an Dr. Benedikt Steuten für das kritische Lesen des Manuskripts. Die ursprüngliche Arbeit an den Chitinasen wurde von Dr. Thorsten Langner durchgeführt. Das Labor von VG wird durch die Exzellenzcluster in Pflanzenwissenschaften (CEPLAS, DFG EXC 1028) und BioSC unterstützt wird das Labor von KS von BioSC unterstützt. KB wird von BioSC unterstützt. Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center (BioSC) wurden vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr 313 / 323-400-00213) finanziell unterstützt. LF wird durch ein Promotionsstipendium der DFG Graduiertenkolleg 1525 iGRADplant unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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