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Genetics

संयंत्र पैथोजन की आनुवंशिक हेरफेर Published: September 30, 2016 doi: 10.3791/54522
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 1,2, 1,2,4
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf
* These authors contributed equally

Summary

हम एक मजबूत जीन प्रतिस्थापन रणनीति का वर्णन आनुवंशिक रूप से मैल कवक Ustilago maydis हेरफेर करने के लिए। इस प्रोटोकॉल कैसे विलोपन म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए संक्रमण phenotypes जांच करने के लिए बताते हैं। यह एक दृश्य एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग एन्कोडिंग जोड़कर, किसी भी वांछित तरह, जैसे जीन संशोधित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

जीन विलोपन जीन समारोह का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सबसे कारगर तरीकों एक लक्षित तरीके में जीन को बाधित करने का एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से एक चयन मार्कर के साथ पूरे जीन के प्रतिस्थापन है। मुताबिक़ पुनर्संयोजन के दौरान, डीएनए के आदान प्रदान के उच्च समानता के साथ दृश्यों के बीच जगह लेता है। इसलिए, रैखिक जीनोमिक लक्ष्य जीन flanking दृश्यों विशेष रूप से वांछित एकीकरण साइट के लिए एक चयन मार्कर को निर्देशित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विलोपन निर्माण के कुंद समाप्त होता सेल के डीएनए की मरम्मत सिस्टम को सक्रिय करने और जिससे या तो मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से या गैर मुताबिक़ के अंत में शामिल होने से निर्माण के एकीकरण को बढ़ावा देने। कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के साथ जीवों में सफल जीन विलोपन की दर 50% से अधिक इस रणनीति के लिए एक मूल्यवान जीन व्यवधान प्रणाली बनाने तक पहुँच सकते हैं। मैल कवक Ustilago maydis एक यूकेरियोटिक मॉडल ऐसे कुशल मुताबिक़ recombinat दिखा सूक्ष्मजीव हैआयन। इसकी 6,900 के बारे में जीनों में से कई कार्यात्मक विलोपन म्यूटेंट की मदद से विशेषता किया गया है, और जीन के आवश्यक कार्य पर जीन प्रतिस्थापन के प्रयास अंक की विफलता को दोहराया। फ्लोरोसेंट मार्करों या भविष्यवाणी डोमेन के परिवर्तन के साथ टैगिंग द्वारा जीन समारोह के बाद के लक्षण वर्णन भी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से डीएनए एक्सचेंज पर निर्भर करता है। यहाँ, हम यू पेश विस्तार से maydis तनाव पीढ़ी रणनीति सरल उदाहरण, जीन विलोपन का उपयोग कर।

Introduction

Ustilago maydis एक phytopathogenic मॉडल कवक है कि दशकों से 1,2 के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। यह दो morphologies, एक खमीर की तरह, गैर रोगजनक मंच और एक filamentous, संक्रामक फार्म 3 में मौजूद है। इस तरह के मुताबिक़ पुनर्संयोजन और डीएनए की मरम्मत तंत्र के रूप में यूनिवर्सल सफलता खोजों इस कवक 4 के खमीर की तरह विकास के चरण में किए गए थे। इसके अलावा, संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण संक्रामक रेशा और डाह कारकों के रूपात्मक स्विच अच्छी तरह से विशेषता रहे हैं 5,6। जीव विज्ञान और इस मैल कवक की डाह के बारे में बढ़ती आणविक ज्ञान एक सीधा जीन प्रतिस्थापन रणनीति 7-9 एक उत्कृष्ट जीनोम एनोटेशन 10 और का उपयोग कर रिवर्स आनुवंशिकी में आसानी, जैसे, हमारे संस्थान में अच्छी तरह से संगठित प्लाज्मिड संग्रह (http द्वारा समर्थित पर निर्भर करता है : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html)। मानकीकृत, मक्का रों में तेजी से संक्रमण assayseedlings pathogenicity का विस्तृत अध्ययन कारकों 11 अनुमति देते हैं।

यू के जीनोम maydis 6,900 के बारे में जीन 10 में शामिल है। उनके कार्य का अध्ययन करने के लिए, वे व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में एक कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन सिस्टम की वजह से हटाया जा सकता। पूरी तरह से समाप्त होता है मुताबिक़ युक्त बारे में 1 केबी का flanking क्षेत्रों में 50% से अधिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दरों के लिए आदर्श होते हैं, लेकिन गैर मुताबिक़ साथ समाप्त होता है पहले से ही 250 बीपी का निर्माण 9 का सही एकीकरण के कुछ डिग्री की अनुमति है। वर्तमान में, पाँच अलग अलग प्रतिरोध कैसेट, hygR, cbxR, NATR, G418R, और phleoR मध्यस्थता hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 और phleomycin के खिलाफ प्रतिरोध, transformants 7.9 के लिए चयन करने के लिए कार्यरत हैं। इसके अलावा, hygromycin प्रतिरोध एक recyclable कैसेट (FRT-hygR) है कि एक heterologous FLP recombinase 12 के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा हटाया जा सकता है के रूप में विकसित किया गया है। यह प्रतिरोध कैसेट की और इस तरह के सिद्धांत के असीमित आनुवंशिक संशोधन में हटाने की अनुमति देता है। Phleomycin mutagenic 13 ताकि नई कैसेट के साथ, विशेष रूप से recyclable hygR कैसेट में, phleoR के उपयोग को कम किया जाता है। चौगुनी म्यूटेंट इस प्रकार अन्य चार कैसेट का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन पचगुना म्यूटेंट के लिए, FRT-hygR प्रणाली 14 की सिफारिश की है।

यह सामान्य जीन विलोपन रणनीति सफलतापूर्वक ऐसी Sporisorium reilianum 15, यू के रूप में अन्य मैल कवक के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है hordei 16, या यू esculenta 17 और इसलिए एक कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रणाली के साथ अभी तक आनुवांशिक रूप से असभ्य जीवों में आगे अनुप्रयोगों के लिए क्षमता प्रदान करता है। इसके अलावा, मुताबिक़ पुनर्संयोजन कमी जीवों के रूप में शामिल जीन का विलोपन द्वारा उदाहरण जेनेटिक इंजीनियरिंग में सुधार करने के लिए संशोधित किया जा सकता गैर मुताबिक़-enडी-में शामिल होने Neurospora घोर 18,19 में।

यहाँ हम यू के लिए प्रकाशित जीन विलोपन रणनीति का वर्णन उम्मीदवारों के तेजी से और सही सत्यापन पर ध्यान देने के साथ प्रयोगात्मक विस्तार से 7.9 maydis। एक उदाहरण के रूप में, हम फंगल chitinases का उपयोग करें और दर्शाती एकल म्यूटेंट की पीढ़ी के साथ ही कई विलोपन तनाव 20,21। क्योंकि वे कठोर कोशिका दीवार में काइटिन पर कार्रवाई Chitinases, दिलचस्प उदाहरण हैं। सेल की दीवार remodeling कोशिका विभाजन के दौरान morphological परिवर्तन के लिए आवश्यक है, filamentous विकास, और बीजाणु गठन के लिए स्विच। इसलिए, विलोपन म्यूटेंट में जीवन चक्र के दौरान phenotypes की उम्मीद की जा सकती है।

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Protocol

1. विलोपन constructs की पीढ़ी

  1. एक प्लाज्मिड विलोपन निर्माण (चित्रा 1) एक संबंधित 1 केबी नदी के ऊपर पार्श्व (यूएफ) और नीचे की ओर पार्श्व (डीएफ) प्रत्येक और उचित प्रतिरोध कैसेट कुंद काटने प्रतिबंध साइटों से घिरे शामिल युक्त उत्पन्न करता है।
    नोट: किसी भी क्लोनिंग रणनीति का प्रयोग किया जा सकता है (क्लोनिंग के लिए संदर्भ 22 देखें) हम अनुशंसा करते हैं ऐसे plasmids 9 के लिए गोल्डन गेट क्लोनिंग।
  2. आबकारी विलोपन विलोपन की 1 ग्राम के डीएनए प्राप्त करने के लिए एक कुंद कटर का उपयोग कर 9 का निर्माण प्लाज्मिड से निर्माण। एंजाइम को खत्म करने और वाणिज्यिक अभिकर्मकों का उपयोग करके 22 जैसे बफर और निर्माता के निर्देशों का पालन करने के विलोपन का निर्माण शुद्ध।
    ध्यान दें: वेक्टर रीढ़ की हड्डी परिवर्तन के मिश्रण में रह सकते हैं।

2. Protoplasts की तैयारी

ध्यान दें: ई के सभी समय के दौरान बाँझ शर्तों रखेंxperiment। सेल की दीवार एक मजबूत सुरक्षात्मक बाधा है कि प्लाज्मा झिल्ली अणुओं के उपयोग की सीमा है। विलोपन का निर्माण युक्त डीएनए के तेज अनुमति देने के लिए, सेल दीवार एक protoplasting प्रतिक्रिया में एंजाइमों अपमानजनक सेल की दीवार से हटा दिया जाना चाहिए। मूलतत्त्व तैयार करने में महत्वपूर्ण कदम 1) माध्यम के आसमाटिक स्थिरीकरण कर रहे हैं और 2) protoplasts पर यांत्रिक तनाव से बचने।

  1. मार्क 2 एक दौर नीचे protoplasts फ्रीज और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर शांत करने के साथ मिलीलीटर ट्यूब। वांछित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ तनाव का एक ताजा थाली से 3 मिलीग्राम YEPS-लाइट में एक पूर्व संस्कृति की शुरुआत करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर सेते हैं।
    नोट: तनाव solopathogenic तनाव SG200 10, wildtype में तनाव, ऐसे AB33 23, या डबल म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए किसी भी उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के रूप में परीक्षक उपभेदों हो सकता है। सुनिश्चित करें कि तनाव वांछित प्रतिरोध से मुक्त है।
  2. एक चकित flas में 50 मिलीलीटर YEPS-लाइट में संस्कृति पतलाकश्मीर और 200 आरपीएम के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर सेते हैं।
    नोट: दुगनी समय wildtype उपभेदों के लिए लगभग 2 घंटा है। तीन दोहराव न्यूनतम अनुमति दें।
  3. घातीय चरण तक बढ़ता है। सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल घनत्व, 600 एनएम (600 आयुध डिपो) की तरंग दैर्ध्य में मापा जाता है, चारों ओर 0.8 है (0.6 करने के लिए 1.0 स्वीकार्य है)। एक आयुध डिपो के 600 1.0 के बारे में 1 से 2 यू को 10 x 7 से मेल खाती है मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं maydis।
  4. एक खुर्दबीन के नीचे संदूषण के लिए कोशिकाओं की जाँच करें। 40x बढ़ाई प्रयोग करें। 5 मिनट, 1500 XG के लिए पूर्ण 50 मिलीलीटर संस्कृति की गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 25 मिलीलीटर सोडियम साइट्रेट, sorbitol समाधान (अनुसूचित जाति), सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट, 1500 XG में गोली Resuspend, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: बैक्टीरियल संदूषण छोटे और अक्सर चलती कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। फफूंद संदूषण यू के सिगार के आकार की कोशिकाओं की तुलना में एक अलग सेल आकार या आकार के आधार पर पहचाना जा सकता है maydis।
  5. सदी के दौरानtrifugation protoplasting समाधान तैयार (12.5 मिलीग्राम / एमएल ट्राइकोडर्मा lysing एंजाइमों, अनुसूचित जातियों में, सेल गोली प्रति 3 मिलीलीटर की तैयारी, फिल्टर एक 22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ; समाधान इष्टतम एंजाइमी गतिविधि के लिए नए सिरे से हो गया है)। अनुसूचित जातियों सेल की दीवार के हटाने पर मूलतत्त्व का टूटना को रोकने के लिए एक आसमाटिक स्थिरता प्राप्त है।
  6. समाधान protoplasting 2 मिलीलीटर में गोली Resuspend। आरटी पर 5 से 20 मिनट के लिए सेते हैं और खुर्दबीन के नीचे की जांच जब तक कोशिकाओं के 30 से 40% गोल या pinheads की तरह (चित्रा 2) कर रहे हैं।
    नोट: अब से बर्फ पर सभी चरणों को पूरा और देखभाल के साथ संभाल protoplasts!
  7. 10 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) अनुसूचित जातियों में धो 3x, 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर 10 मिलीलीटर ठंड sorbitol, TrisHCl, 2 CaCl समाधान (एसटीसी), स्पिन में गोली Resuspend, तैरनेवाला त्यागें। 1 मिलीलीटर ठंड एसटीसी में गोली Resuspend, ठंडा ट्यूबों में 100 μl aliquots बनाते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर aliquots रुक।

3. यू के परिवर्तन maydis

नोट: यू के परिवर्तन maydis protoplasts पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) मध्यस्थता परिवर्तन विधि है, जो तकनीकी रूप से सरल और electroporation या विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है biolistic परिवर्तन करने का विरोध किया है पर निर्भर करता है।

  1. दो स्तरों पर चयन प्लेट (परिवर्तन प्रतिक्रिया प्रति 2 प्लेटें) तैयार करें। नीचे की परत एक दोगुनी एकाग्रता में एंटीबायोटिक होता है। RegLight की pipet 12 मिलीलीटर 400 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin युक्त (या 300 माइक्रोग्राम / एमएल nourseothricin या 4 माइक्रोग्राम / एमएल carboxin या 1 मिलीग्राम / एमएल G418) एक पेट्री डिश में। बुलबुले से बचें।
    नोट: नीचे की परत प्लेटों 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है, लेकिन परिवर्तन के दौरान हौसले से ऊपर परत तैयार (देखें नीचे)।
  2. बर्फ पर पिघलना protoplasts (1 ट्यूब / परिवर्तन)। 1 μl हेपरिन (15 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। 1 माइक्रोग्राम डीएनए (linearized निर्माण) या 10 μl एच 2 जोड़े
  3. इस समय के दौरान, ऊपरी परत के लिए RegLight नीचे की थाली पर 12 मिलीलीटर (60 डिग्री सेल्सियस के लिए फोड़ा और शांत) तरलीकृत RegLight फैल गया।
    ध्यान दें: यह परत एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल नहीं करता।
  4. 500 μl एसटीसी / खूंटी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) परिवर्तन ट्यूब (3. 2) को जोड़ें और inverting ट्यूब द्वारा ध्यान से मिश्रण। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. दो स्तरों पर RegLight प्लेटों में से दो पर प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया बांटो। एक गिलास pipet के साथ सावधानी से और धीरे से बिखरा हुआ है। 5 से 7 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ईमानदार प्लेटें सेते हैं जब तक transformants कालोनियों के रूप में विकसित। प्रति प्लेट के बारे में 100-200 कालोनियों प्राप्त करते हैं।
    नोट: कम संख्या "बुरा" protoplasts कि या तो बहुत अधिक सेल की दीवार होते हैं और इसलिए डीएनए ऊपर नहीं ले जा सकते हैं या पुनर्जीवित नहीं कर सकते हैं की वजह से हो सकता है। पूर्व एक आत्म नकल प्लाज्मिड, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना प्लेटों पर उत्थान के परीक्षण के द्वारा उत्तरार्द्ध के साथ परिवर्तन द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।
    6. <ली> 200 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin पर उचित एंटीबायोटिक युक्त YEPS लाइट प्लेटों की तैयारी (या 150 माइक्रोग्राम / एमएल nourseothricin या 2 माइक्रोग्राम / एमएल carboxin या 500 माइक्रोग्राम / एमएल G418, इन सांद्रता नीचे प्लेटों के लिए इस्तेमाल एक के बराबर आधा)। इन प्लेटों पर कम से कम 24 ख्यात transformant कालोनियों पुनः शुद्ध। एकल कालोनियों प्राप्त किया जाना चाहिए। गैर चयनात्मक मीडिया पर बाहर मूल तनाव एक ही समय लकीर पर।
    नोट: प्लेट्स 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. सही विलोपन घटनाक्रम सत्यापन

नोट: (चित्रा 1) म्यूटेशन एक तीन कदम प्रक्रिया में सत्यापित कर रहे हैं। सबसे पहले, उम्मीदवारों है कि जीन की wildtype प्रतिलिपि पीसीआर से बाहर रखा गया है। दूसरा, लोकस में प्रतिरोध कैसेट के एकीकरण पीसीआर द्वारा सत्यापित है। तीसरा, केवल वांछित लोकस में प्रतिरोध कैसेट के एकीकरण के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा सत्यापित है। सावधान तनाव सत्यापन Esse हैntial, उत्परिवर्ती phenotypes वास्तव में विलोपन के साथ संबंध स्थापित इतना है कि।

  1. सबसे पहले निदान पीसीआर 20
    1. जीन में डिजाइन प्राइमरों बाँधना 250-600 बीपी (चित्रा 1) का एक उत्पाद है कि परिणाम में नष्ट कर दिया जाएगा। इस तरह के छोटे उत्पादों को एक कॉलोनी पीसीआर में बढ़ाना करने के लिए आसान है, और लंबे मानक जेल वैद्युतकणसंचलन में पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं।
    2. प्रत्येक उम्मीदवार और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में मूल तनाव के लिए, 20 μl 0.02 एम NaOH में एक दंर्तखोदनी के साथ एक छोटा सा एक ही कॉलोनी के सेल सामग्री का (एक सिरा की राशि) resuspend। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      ध्यान दें: ताजा कालोनियों का प्रयोग करें। एक ताजा कॉलोनी प्राप्त करने के लिए प्लेटों 1 सप्ताह फिर से लकीर से अधिक पुराने हैं।
    3. तुरंत पीसीआर के लिए सेल निलंबन के 1 μl का प्रयोग करें। एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया चलाने के लिए और परिणामस्वरूप टुकड़े का विश्लेषण।
      नोट: ये नमूने जमा नहीं किया जा सकता है।
      नोट: यह पीसीआर wildtype जीन की उपस्थिति के लिए परीक्षण और जिससे नकारात्मक Cand की तेजी से पहचान की अनुमति देता हैidates जिसमें ब्याज की जीन की जगह नहीं किया गया है। इस पीसीआर प्रतिक्रिया में बैंड उपज क्लोन खारिज कर दिया जाएगा। ऐसा ही एक नकारात्मक क्लोन वैसे भी एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में साथ किया जाना चाहिए। एक पीसीआर उत्पाद के बिना उम्मीदवारों को आगे विश्लेषण किया जाना है। हानिकारक प्रभाव के बिना जीनों के लिए उम्मीदवारों का लगभग आधा है, wildtype जीन होते हैं, जबकि अन्य आधा एक बैंड में परिणाम नहीं चाहिए। यह 50% की एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर के अनुरूप होगा।
  2. दूसरा निदान पीसीआर
    1. जीनोमिक डीएनए की तैयारी।
      नोट: जीनोमिक डीएनए (gDNA) दो अलग अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है। पहले फिनोल और क्लोरोफॉर्म और इसलिए, केवल अनुभवी शोधकर्ताओं (4.2.1.5 करने के लिए 4.2.1.1 में वर्णित), जबकि दूसरा भी कम अनुभवी छात्रों (4.2 4.2.1.6 में वर्णित द्वारा संभाला जा सकता द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए जैसे जहरीले अभिकर्मकों शामिल है। 1.11)। दोनों प्रोटोकॉल मज़बूती से काम कर रहे हैं। चरण 4.2.1.1 दोनों protoc के लिए समान हैOLS।
      1. प्रत्येक उम्मीदवार के साथ 5 मिलीलीटर YEPS लाइट टीका लगाना और 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर सेते हैं। एक मुख्यमंत्री की थाली पर संस्कृति के 2 μl गिरा। संस्कृति बाँझ रखें।
        नोट: निम्न एक मानक प्रोटोकॉल (: विषाक्त कदम सावधानी) है।
      2. 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए 1 स्कूप एचसीएल धोया कांच के मोती की (~ 200 μl) रखो। यू के 2 मिलीलीटर जोड़ें maydis संस्कृति। 5 मिनट के लिए 12,000 XG स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें (गोली इस स्तर पर जमे हुए किया जा सकता है)। (: 24: 1 25) गोली करने के लिए 500 μl फिनोल / क्लोरोफॉर्म / Isoamylalcohol जोड़ें। सावधान! PHENOL विषैला होता है!
      3. 1000 rpm पर एक vibrax पर 500 μl Usti-सेल-बफर जोड़ें 1. 6 से 10 मिनट के लिए शेक। सत्यापित करें कि सेल गोली पूरी तरह से resuspended है, लेकिन gDNA के बाल काटना रोकने के लिए मिलाते हुए विस्तारित करने से बचें। 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर स्पिन। नए प्रतिक्रिया ट्यूब में जलीय चरण के 400 μl स्थानांतरण (अंतरावस्था स्पर्श नहीं है)।
      4. 1 मिलीलीटर 100% (v / v) इथेनॉल जोड़ें। मिश्रण करने के लिए ट्यूब 3x पलटना, निरीक्षण गडीएनए शीघ्र ही प्रतीत होता है कि जोर की। 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर स्पिन। तैरनेवाला निकालें और 200 μl 70% EtOH से धो लें। इस चरण में गोली resuspend मत करो।
      5. सतह पर तैरनेवाला निकालें पूरी तरह से (गोली पूरी तरह से सूखे देना नहीं है)। 50 μl ते / RNase जोड़ें। 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 400 rpm पर झटकों से gDNA भंग। एक 0.8% agarose जेल 20 पर gDNA के 2 μl का विश्लेषण।
        नोट: नीचे दिए गए चरणों के लिए एक वैकल्पिक गैर विषैले प्रोटोकॉल शामिल।
    2. जीनोमिक डीएनए के वैकल्पिक तैयारी
      1. 1 स्कूप (~ 200 μl) रखो की एचसीएल 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए कांच के मोती धोया। यू के 2 मिलीलीटर जोड़ें maydis संस्कृति और 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें (छर्रों इस स्तर पर जमे हुए किया जा सकता है)।
      2. 500 μl Usti lysis बफर 2 गोली में जोड़े। 1000 rpm पर एक vibrax पर 5 से 15 मिनट के लिए हिला। सत्यापित करें कि सेल गोली पूरी तरह से resuspended है।
      3. 15 से 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं। appro का प्रयोगpriate 2 मिलीलीटर ट्यूबों की मेजबानी करने के लिए तैयार इन्क्यूबेटरों महत्वपूर्ण है। फिर, 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है।
      4. 100 μl 8 एम पोटेशियम एसीटेट, भंवर जोड़ें या 8 से 10 बार पलटना। आरटी पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG स्पिन।
      5. स्थानांतरण एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के 500 μl और 400 μl isopropanol जोड़ें। भंवर या पलटना 8 से 10 बार। 15 मिनट के लिए 12,000 XG स्पिन। तैरनेवाला निकालें और 500 μl 70% EtOH से धो लें। 5 मिनट के लिए 12,000 XG स्पिन।
      6. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला बंद सोख! आखिरकार, अवशिष्ट तरल निकालने के लिए एक छोटी स्पिन (10 सेकंड) जोड़ें। 3 से 5 मिनट के लिए डीएनए गोली सूखी। 50 μl ते / RNAase जोड़ें और 400 rpm पर 10 से 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. पीसीआर
      1. डिजाइन उनमें से एक flanks बाहर बंधन और (यूएफ-एफ, आर सी-आर, आर सी एफ, DF-आर, चित्रा 1) प्रतिरोध कैसेट के भीतर बाध्यकारी एक इसी के साथ दो प्राइमर जोड़े 9।
      2. हर ग के gDNA के 1:10 कमजोर पड़ने की 1 μl का प्रयोग करेंandidate सही प्रविष्टि अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम 9 की पुष्टि करने के 2 पीसीआर प्रतिक्रियाओं में एक टेम्पलेट के रूप में।
      3. प्रत्येक उम्मीदवार के लिए मानक पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रयोग करें और टुकड़े 22 परिणामस्वरूप विश्लेषण।
        नोट: ये PCRs सही जीनोमिक ठिकाना में प्रतिरोध कैसेट की प्रविष्टि के लिए परीक्षण। उत्पादों दोनों पक्षों के लिए प्राप्त कर रहे हैं, तो उम्मीदवार की संभावना एक सही प्रविष्टि है। हालांकि, यह भी उम्मीदवारों जहां केवल एक पक्ष (नदी के ऊपर या नीचे की ओर) की पुष्टि की जा सकती मामले में आगे के विश्लेषण कि पीसीआर प्रतिक्रियाओं बस एक पार्श्व के लिए विफल के लिए साथ किया जाना चाहिए।
  3. दक्षिणी धब्बा विश्लेषण 22 द्वारा सही जीनोमिक प्रविष्टि का सत्यापन
    1. एक उचित एंजाइम है कि लोकस बाहर कटौती / निर्माण और इसके अलावा में, या तो जीन में या प्रतिरोध कैसेट स्पष्ट रूप से जिले के लिए अग्रणी में कटौती के साथ उत्परिवर्ती उम्मीदवारों की gDNA के 15 μl (4.2.1) और इसी wildtype / पूर्वज तनाव डाइजेस्टinguishable पैटर्न (चित्रा 1) 8।
      नोट: उम्मीद बैंड में से कोई भी बड़ा की तुलना में 10 KB, ताकि वे पचाया डीएनए से स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है होना चाहिए।
    2. नदी के ऊपर और नीचे की ओर जांच के रूप में दिशा का प्रयोग करें। उन्हें लेबल उदाहरण पीसीआर डीआईजी लेबल किट या किसी भी इसी तरह मानक विधि का उपयोग करने के लिए। एक 1 में लेबल जांच मिक्स: 1 आणविक अनुपात और दक्षिणी धब्बा बाहर ले। कम से कम दो स्वतंत्र सही transformants रखें।
      नोट: wildtype पैटर्न मूल तनाव में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने चाहिये और सही क्लोन केवल उम्मीद बैंड शामिल करना चाहिए। अपर बैंड केवल उम्मीदवारों में मौजूद एक गलत लोकस में निर्माण के अन्य सम्मिलन संकेत मिलता है। इस तरह के क्लोन खारिज किया जाना चाहिए। नकारात्मक उम्मीदवार पहले नैदानिक ​​पीसीआर में पहचान गलत तरीके से एकीकृत विलोपन निर्माण के wildtype बैंड और बैंड (आकार में अप्रत्याशित) को शामिल करना चाहिए।
  4. ग्लिसरॉल शेयरों
    ध्यान दें: ग्लिसरॉल शेयरों तनाव संग्रह में वर्षों के लिए क्लोन बनाए रखने के लिए काम करते हैं। कम से कम दो स्वतंत्र transformants प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए रखा जाना चाहिए। इस तुलना phenotypes कि समान होना चाहिए की अनुमति देता है।
    1. 28 डिग्री सेल्सियस मिक्स 500 500 μl NSY-ग्लिसरॉल माध्यम के साथ प्रत्येक संस्कृति के μl में 24 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर YEPS-लाइट में पुष्टि उत्परिवर्ती उपभेदों के 5 मिलीलीटर संस्कृतियों आगे बढ़ें। ट्यूब पलटना जब तक संस्कृति और मध्यम अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं। मध्यम में ग्लिसरॉल बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचाता है।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर रुक। पुनः लकीर जमे हुए संस्कृति का एक हिस्सा है, तो शेयर कार्यात्मक है परीक्षण करने के लिए।

5. सूक्ष्म phenotypes

  1. 28 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर wildtype और YEPS-लाइट में उत्परिवर्ती उपभेदों के 5 मिलीलीटर संस्कृतियों आगे बढ़ें।
  2. अगले दिन, के बारे में 0.1 के एक आयुध डिपो के 600 संस्कृति को कमजोर और यह एक आयुध डिपो 600 0.5 और 0.7 के बीच तक हो जाना। 1.0 corresp के एक आयुध डिपो के 600onds के बारे में 1 से 2 10 x 7 यू को मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं maydis।
  3. सेल आकृति विज्ञान microscopically का निरीक्षण किया।
    नोट: स्वस्थ कोशिकाओं सिगार के आकार का (चित्रा 4, डब्ल्यूटी) दिखाई देते हैं। उच्चारण रिक्तिकाएं या रेशा गठन का संकेत मिलता है कि कोशिकाओं जोर दिया जाता है।
    नोट: उम्मीद उत्परिवर्ती phenotype पर निर्भर करता है, विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, संवाददाता उपभेदों उपयोग किया जाता है, तो उचित परख इस स्तर पर किया जा सकता है। सेल आकृति विज्ञान बदल सांख्यिकीय विश्लेषण का आयोजन किया जाना चाहिए, जैसे, मतलब सेल लंबाई निर्धारित करने के लिए।

6. संक्रमण परख

नोट: अंकुर संक्रमण परख इस पत्रिका 11 में पहले से कल्पना की गई है। यह या तो इस तरह के SG200 10 के रूप में या संगत संभोग के भागीदारों जो दोनों उत्परिवर्तन ले मिश्रण से एक अगुणित, solopathogenic तनाव की पृष्ठभूमि का उपयोग किया जा।

  1. कम से कम 40 प्रति मक्का बीज बोने16 घंटा, 200 μE, 28 डिग्री सेल्सियस / 22 डिग्री सेल्सियस (दिन / रात) की एक प्रकाश चक्र पर 7 दिनों के लिए तनाव। वे 3-पत्ती मंच और 10-15 सेमी संक्रमण के दिन पर लंबा पर होना चाहिए।
  2. दो दिन पहले संक्रमण, तनाव का एक पूर्व संस्कृति 5 मिलीलीटर YEPS-लाइट में एक घूर्णन पहिया पर 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करते हैं। 50 मिलीलीटर में एक मुख्य संस्कृति विकसित YEPS लाइट अप 600 = 1.0 ओवर ड्राफ्ट के लिए (कोशिका विभाजन दर = 2 घंटा, 3 की अनुमति देने के डिवीजनों न्यूनतम किया जा सकता हे / एन)।
  3. 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर 50 मिलीलीटर संस्कृति की कोशिकाओं नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बाँझ एच 2 ओ के साथ धो 3x एक आयुध डिपो के 600 3.0 बाँझ एच 2 ओ में कोशिकाओं Resuspend। यदि आवश्यक हो, मिश्रण संभोग भागीदारों।
  4. 7 दिन पुराने मक्का के एक छोटे से सिरिंज का उपयोग पौध की स्टेम सेल में निलंबन के 500 μl - 250 इंजेक्षन। एक नियंत्रण के रूप में बाँझ एच 2 ओ का प्रयोग करें। एक ही प्रकाश और तापमान की स्थिति में एक अतिरिक्त 7-14 दिनों के लिए संक्रमित पौध रखें। स्कोर प्रत्येक संयंत्र एक के phenotypeस्वस्थ, हरिद्रोग, एंथोसायनिन गठन, छोटे ट्यूमर, बड़े ट्यूमर, मृत पौधों से 10 ccording।
    नोट: स्कोरिंग के रूप में जल्दी 7 दिन के रूप में किया जा सकता है और 14 दिनों में बार-बार समय के साथ संक्रमण का पालन करने के लिए।

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Representative Results

सभी चार chitinolytic यू में इनकोडिंग जीनों के लिए विलोपन निर्माणों maydis जीनोम cts1 का विलोपन के लिए hygR कैसेट का उपयोग कर गोल्डन गेट क्लोनिंग द्वारा उत्पन्न किया गया, NATR cts2 का विलोपन के लिए, cts3 का विलोपन और cts4 20 का विलोपन के लिए cbxR के लिए G418R कैसेट। जीन प्रतिस्थापन रणनीति का एक सामान्य अवलोकन cts3 का विलोपन (चित्रा 1) द्वारा उदाहरण है। एक दूसरे chitinolytic जीन के साथ cts1 की सिंगल और डबल म्यूटेंट डाह में chitinases की भूमिका के विश्लेषण के लिए दो अलग अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एक ही निर्माणों के साथ क्रमिक रूप से उत्पन्न किया गया। दो अलग अलग तनाव पृष्ठभूमि में कार्यरत थे: AB33 filamentous विकास की प्रेरण की अनुमति देता है, pathogenicity 23 की दिशा में पहला कदम है, SG200 एक एकल रोगजनक तनाव है कि तेजी से रोग 10 रन बनाने के लिए सक्षम बनाता है Cts3 के परिवर्तन के बाद -deletion उचित तनाव की पृष्ठभूमि में निर्माण, दूसरे चयन प्लेट के एकल कालोनियों नैदानिक PCRs (1 टेबल) और दक्षिणी धब्बा (चित्रा 3) द्वारा सही हटाने के लिए परीक्षण किया गया। दिलचस्प बात यह है मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर cts3 के लिए AB33 में से SG200 में काफी ज्यादा था, लेकिन इस अंतर को लगातार दूसरे chitinases का विलोपन में नहीं मनाया गया था।

कड़े तनाव सत्यापन विलोपन का एक भी प्रविष्टि इच्छित स्थान पर निर्माण करता है। हालांकि, ऐसे बिंदु उत्परिवर्तन के रूप में अतिरिक्त संशोधन नहीं चल पाता रह सकते हैं, phenotypes की व्याख्या गुमराह हो सकता है। इसलिए, कम से कम दो स्वतंत्र transformants phenotyped रहे हैं।

आकृति 1
अंजीर Ure 1. विलोपन रणनीति cts3 द्वारा उदाहरण का अवलोकन। यह योजनाबद्ध सिंहावलोकन विलोपन अपस्ट्रीम पार्श्व (यूएफ), नीचे की ओर पार्श्व (डीएफ), और Geneticin प्रतिरोध कैसेट (G418R), wildtype के जीनोमिक ठिकाना साथ निर्माण भी शामिल है (डब्ल्यूटी ) और cts3 विलोपन उत्परिवर्ती और सभी प्राइमरों के रूप में अच्छी तरह से प्रतिबंध तनाव सत्यापन में इस्तेमाल साइटों। एक उत्पाद में पहली नैदानिक ​​पीसीआर परिणाम ही अगर wildtype जीन की नकल मौजूद है, दो दूसरी नैदानिक ​​PCRs उत्पादों में परिणाम अगर प्रतिरोध कैसेट सही ढंग से एकीकृत किया गया है। दक्षिणी धब्बा जीनोमिक डीएनए PstI से पच जाता है के लिए, जांच यूएफ और DF (लाल बार) wildtype में 6.7 केबी बैंड का पता लगाने के लिए अग्रणी और 5.6 केबी के दो बैंड और उत्परिवर्ती में 2.0 केबी अवधि। इसके अलावा, डीएफ जांच दुर्बलता से एक 2.6 केबी उत्पाद को पहचानता है। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रतिक्रिया protoplasting की सूक्ष्म सत्यापन। (ए) अनुपचारित wildtype कोशिकाओं (FB2) सिगार के आकार का दिखाई देते हैं। (बी) के सेल की दीवार अपमानजनक एंजाइमों (यहाँ के लिए 30 मिनट के लिए) के साथ इलाज करने पर, एक छोर (एस) और बार-घंटी संरचनाओं की तरह गोल क्षेत्रों की उपस्थिति (ख) इंगित करता है कि सेल की दीवार गिरावट शुरू हो गई है। अंत में पूरी तरह से protoplasts दौर (आर), जो कोशिका दीवार की कमी के कारण है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
अंजीर ure 3। Cts3 विलोपन। जीनोमिक डीएनए के लिए दक्षिणी धब्बा PstI के साथ पचा गया था। दोनों किनारों लेबल थे, equimolar अनुपात में मिलाया जाता है और एक भी जांच के रूप में इस्तेमाल किया। Wildtype SG200 और chitinases cts1 और cts2 का विलोपन में, 6.7 केबी की एक एकल बैंड का पता चला है। Cts3 विलोपन (छ और कश्मीर), 5.6 केबी के दो बैंड और 2.0 KB में cts3 का सही विलोपन का संकेत दिखाई दे रहे हैं। 2.6 केबी का एक अतिरिक्त बैंड भारी overexposure से देखे जा सकते हैं। यह एक टुकड़ा है कि नीचे की ओर पार्श्व जांच के केवल 100 बीपी के एक ओवरलैप द्वारा मान्यता प्राप्त है से मेल खाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कुछ उत्परिवर्तन स्पष्ट विकास दोष है कि microscopically पता लगाया जा सकता करने के लिए नेतृत्व। काइटिनेस विलोपन में, एकल म्यूटेंट प्रदर्शित नहीं किया थाकिसी भी स्पष्ट दोष है, जबकि cts1 / 2 डबल म्यूटेंट एक स्पष्ट सेल जुदाई दोष 20 दिखाया। सेप्टा का धुंधला से पता चला कि cytokinesis पूरा कर लिया गया है, लेकिन कोशिकाओं (Langner एट अल। 2015 चित्रा 4) अवशिष्ट काइटिन के माध्यम से जुड़ा होने की संभावना बनी हुई है। इसी तरह की एक सूक्ष्म विकास phenotype khd4 24 का विलोपन के लिए जाना जाता है, एक जीन एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन आकृति विज्ञान और pathogenicity 25 में शामिल जीनों के बाद ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कारोबार में मध्यस्थता एन्कोडिंग।

चित्रा 4
चित्रा 4. विलोपन म्यूटेंट का सूक्ष्म विश्लेषण। काइटिनेस विलोपन उपभेदों के सेल आकृति विज्ञान और पट गठन। Cts1 / 2 Δ उपभेदों एक सेल जुदाई दोष दिखा रहे हैं और बड़े समुच्चय है, जो पट गठन की कमी के कारण नहीं है के रूप में। प्राथमिक और माध्यमिकसेप्टा (insets में 5x इज़ाफ़ा देखें) Calcofluor व्हाइट (सीडब्ल्यू) से पहले माइक्रोस्कोपी के साथ दाग रहे थे। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा Langner एट अल। 2015 यूकेरियोटिक सेल 20 से अनुमति के साथ reprinted है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

chitinases डाह के योगदान का परीक्षण करने के लिए, अंकुर संक्रमण assays SG200 तनाव की पृष्ठभूमि में म्यूटेंट का उपयोग कर किए गए। Khd4 में म्यूटेंट डाह में कम हो गई थी, वहीं chitinases का विलोपन (चित्रा 5) 20,25 मक्का पौध के संक्रमण को प्रभावित नहीं किया।

चित्रा 5
चित्रा विलोपन म्यूटेंट के 5. संक्रमण परख। के रोग रेटिंगमक्का पौध 9 दिनों संबंधित यू के साथ संक्रमण के बाद उपभेदों maydis। (ए) Macroscopic लक्षण है कि रोग स्कोरिंग के लिए उपयोग किया जाता है। (ख) दो स्वतंत्र transformants प्रत्येक तनाव (एन> 100) के लिए परीक्षण किया गया। सभी काइटिनेस की कमी म्यूटेंट (1/2 / 3Δ: ट्रिपल उत्परिवर्ती endochitinases, 4Δ: एकल उत्परिवर्ती एन acetylglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: चौगुनी उत्परिवर्ती) मेजबान संयंत्र भारी ट्यूमर गठन के लिए अग्रणी के रूप में संक्रमित साथ wildtype संक्रमण में मनाया solopathogenic तनाव SG200। इसके विपरीत, जीन आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन Khd4 एन्कोडिंग का एक विलोपन ले जाने के एक तनाव डाह में कम हो गया था के रूप में पहले 24 की सूचना दी। त्रुटि सलाखों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा Langner एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। 2015 यूकेरियोटिक सेल 20। एक बड़ी देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की आर संस्करण।

आनुवंशिक पृष्ठभूमि 1 सेंट diagn। पीसीआर
(अपवर्जित / परीक्षण) 		2 एन डी diagn। पीसीआर
(पुष्टि / परीक्षण) 		दक्षिण
(पुष्टि / परीक्षण) 		% Recomb।
AB33 7/22 - 7/15 32
AB33 cts1 Δ 19/24 - 5/5 21
SG200 0/10 8/10 7/8 70
SG200 cts1 Δ 0/20 19/20 14/19 70

तालिका 1:। Cts3 विलोपन के लिए तनाव सत्यापन काइटिनेस जीन cts3 चार अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में नष्ट कर दिया गया था एकल और एकाधिक विलोपन में filamentous विकास (AB33) और संक्रमण (SG200) के अध्ययन की अनुमति है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे यू में रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन के लिए विलोपन म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए maydis। शुरुआती बिंदु एक विलोपन का निर्माण है कि जीन के हित के बारे में 1 केबी स्टार्ट नदी के ऊपर और रोकने के कोडोन के बहाव के साथ ही एक उचित प्रतिरोध कैसेट के दृश्यों से युक्त के flanking दृश्यों के रूप में यह पहले 7.9 अनुकूलित किया गया था होता है । निर्माणों को व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक जीन के लिए उत्पन्न करने के लिए है और ध्यान से जीन हटाने से पहले अनुक्रम त्रुटियों के लिए सत्यापित। flanks में बिंदु उत्परिवर्तन विशेष रूप से जीनोमिक अनुक्रम में अवांछित परिवर्तन, कारण अगर flanks पड़ोसी जीन में उत्परिवर्तन तक पहुंचने या नियामक तत्वों को संशोधित कर सकते हैं। यह सभी transformants को प्रभावित करती है और phenotypes और दुष्प्रभाव वांछित जीन विलोपन के लिए असंबंधित पैदा कर सकता है।

जब विलोपन रणनीति की योजना बना, उम्मीद phenotype आनुवंशिक पृष्ठभूमि का चयन करने के लिए विचार किया जाना है। वर्तमान मामले में, AB33 23 और 10 SG200 रूपात्मक स्विच और संयंत्र संक्रमण में phenotypes के परीक्षण के लिए अनुमति देने के लिए चुने गए हैं। इसी तरह, कई अन्य पढ़ें बहिष्कार ब्याज की हो सकती है, cts1 के साथ जैसे fusions heterologous प्रोटीन 14,26 के निर्यात में कार्यरत हैं, और fluorescently के साथ एक तनाव की पृष्ठभूमि में टैग rrm4 endosomes 27,28 पर शाही सेना को परिवहन के विश्लेषण की अनुमति देता है।

तनाव सत्यापन के दौरान, उच्च throughput नैदानिक ​​PCRs उम्मीदवारों की संख्या की एक तेजी से कमी नहीं बल्कि श्रमसाध्य दक्षिणी धब्बा में परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। विशेष रूप से, पहले नैदानिक ​​पीसीआर अभी भी जीन की wildtype प्रतिलिपि युक्त उम्मीदवारों के बहिष्कार की अनुमति देता है और इस तरह gDNA तैयारी में विषाक्त फिनोल का बड़े पैमाने पर उपयोग से बचाता है। एक गैर जरूरी जीन के साथ एक मानक मामले में, कालोनियों के लगभग आधे wildtype जीन हो सकती है। इस पूर्व स्क्रीनिंग के जीनों के लिए महान ब्याज की हो सकती है संभावित हानिकारक विकास phenotypes के साथ। उम्मीदवारों के सैकड़ों तेजी से जांच की जा सकती है।

सभी उम्मीदवारों wildtype प्रतिलिपि होते हैं, जीन विलोपन की संभावना सबसे अधिक घातक है। इस teliospore अंकुरण 29 के बाद एक द्विगुणित तनाव की पृष्ठभूमि (जैसे d132) और अलगाव के विश्लेषण में एक प्रतिलिपि को हटाने से इसकी पुष्टि की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, एक सशर्त विलोपन एक inducible प्रमोटर का उपयोग कर रणनीति उत्परिवर्ती phenotype का पालन करने के लिए चुना जा सकता है। हालांकि, यह भी gDNA तैयारी के लिए कच्चे तेल की NaOH आधारित पद्धति से उत्पन्न प्रदूषण को पीसीआर के साथ हस्तक्षेप और नेतृत्व झूठी नकारात्मक यानी उम्मीदवारों को एक बैंड शो नहीं है और इसलिए रखा जाता है, भले ही वे जीन को रोकने के लिए कर सकते हैं। यह एक नियंत्रण जीन के लिए दो जीन विशिष्ट प्राइमरों और प्राइमरों है कि एक बड़ा टुकड़ा में परिणाम के साथ एक स्वतंत्र पीसीआर प्रतिक्रिया में या मल्टीप्लेक्स पीसीआर द्वारा एक तुलनीय आकार उत्पाद के साथ एक नियंत्रण जीन परीक्षण से बाहर रखा जा सकता है।

सामग्री "> पहले से ही उपलब्ध है, जैसे, cts1 Δ 30 या rrm4 Δ, Tagged संस्करणों के तनाव पीढ़ी युक्त एक उपन्यास के निर्माण के साथ जीनोम में जीन विलोपन प्रतिरोध कैसेट (जैसे hygR) की जगह है, जैसे, द्वारा तेजी से किया जा सकता है, तो एक उत्परिवर्ती है fluorescently लेबल rrm4 और एक अलग प्रतिरोध मार्कर (जैसे NATR)। इस मामले में, transformants प्रारंभिक प्रतिरोध मार्कर 9 के नुकसान से जांच की जा सकती है। सही उम्मीदवारों को केवल नए एंटीबायोटिक (nourseothricin) के खिलाफ प्रतिरोधी रहे हैं और उनकी प्रारंभिक प्रतिरोध (hygromycin खो दिया है )। इसके अतिरिक्त, ट्रांस में उत्परिवर्ती phenotype के पूरक बाहर टैग निर्माणों 30,31 की कार्यक्षमता को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित जीन विलोपन और संशोधन रणनीति यू के आनुवांशिक विश्लेषण में एक विश्वसनीय और सटीक उपकरण प्रदान करता है maydis। कई विलोपन हालांकि के लिए, तनाव जीईneration समय लेने वाली हो सकता है, के बाद से परिवर्तन क्रमिक रूप से बाहर किया जा रहा है। इसलिए, एक पूरक उपकरण के रूप में, पिछले साल CRISPR कैस प्रणाली यू के लिए स्थापित किया गया है 32 maydis। यह एक साथ कई जीनों को बाधित करने की संभावना प्रदान करता है और अमेरिकी के आनुवंशिक उपकरण बॉक्स के लिए एक उत्कृष्ट इसके अतिरिक्त है maydis।

सारांश में, आनुवंशिक हेरफेर और अमेरिकी के लिए प्रोटोकॉल maydis तनाव पीढ़ी यहाँ वर्णित एक मजबूत तरीका है कि व्यापक रूप से किया गया है साल के लिए समुदाय में इस्तेमाल किया गया है। साथ में संबंधित प्रतिरोध कैसेट मॉड्यूल के व्यापक संग्रह के साथ यह मूल से लागू अनुसंधान से लेकर विविध प्रश्नों को संबोधित इस कवक में जेनेटिक इंजीनियरिंग की सभी प्रकार की अनुमति देता है।

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Acknowledgments

पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ बेनेडिक्ट Steuten लिए विशेष धन्यवाद। chitinases पर मूल काम डॉ Thorsten Langner से बाहर किया गया था। वी.जी. की प्रयोगशाला संयंत्र विज्ञान में उत्कृष्टता (CEPLAS, DFG EXC 1028) और BioSC के क्लस्टर के द्वारा समर्थित है, के एस की प्रयोगशाला BioSC द्वारा समर्थित है। KB BioSC द्वारा समर्थित है। Bioeconomy विज्ञान केंद्र (BioSC) की वैज्ञानिक गतिविधियों को आर्थिक रूप से NRW Strategieprojekt BioSC (नं 313 / 323-400-00213) के ढांचे के भीतर अभिनव, विज्ञान और अनुसंधान के मंत्रालय द्वारा समर्थित थे। वामो DFG अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1525 iGRADplant की एक डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminobenzoeic acid (Free Acid) Sigma Aldrich A-9878
Bacto agar  BD 214010 alternatively use local supplier
Bacto peptone BD 211677 alternatively use local supplier
Bacto yeast extract  BD 212750 alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O Grüssing GmbH 10234 alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) Sigma Aldrich P-2250
Carboxin  Sigma Aldrich 45371
Casamino acids  BD 223050
Cholinchlorid Sigma Aldrich C-1879
Citric acid ChemSolute 24,321,000 alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O Fluka 61240 alternatively use local supplier
D(+)Sucrose  Roth 4621.1 alternatively use local supplier
DNA degr. free acid  Sigma-Aldrich D-3159
EDTA Sigma Aldrich E4378
FeCl3*6H2O Grüssing GmbH 10288 alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt Sigma Aldrich A1720
Trichoderma lysing enzymes Sigma Aldrich L1412
D(+) Glucose Caelo 2580 alternatively use local supplier
Glycerin  Fisher Chemical G065015 alternatively use local supplier
H3BO3 AppliChem A2940 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3393-50KU
Hygromycin B-solution Roth 1287.2 Dangerous substance. 
KCl VWR 26764298 alternatively use local supplier
KH2PO4 AppliChem A3620 alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree Merck 7487-88-9 Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O AppliChem A2087 alternatively use local supplier
myo-Inositol Sigma Aldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2O AppliChem A2937 alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O Roth 0274.2 alternatively use local supplier
Na2SO4 Grüssing GmbH 12174 alternatively use local supplier
NaCl Fisher Chemical S316060 alternatively use local supplier
NaOH ChemSolute 13,751,000 alternatively use local supplier
NH4NO3 Roth K299.1 alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid) Sigma Aldrich N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate   Werner BioAgents 5,001,000
Nutrient broth  Difco local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 Sigma Aldrich P3803 Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG) Sigma Aldrich P-3640
Potassium acetate AppliChem 121479 alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid) Sigma Aldrich P-9755
Riboflavin  Sigma Aldrich R4500
RNaseA Sigma Aldrich R5503
SDS Roth Cn30.3 alternatively use local supplier
small syringe BD 300300 alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm VWR 28145-477 alternatively use local supplier
Sorbitol Roth 6213.1 alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochloride Serva 36020.02 alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate Fisher Chemical S332060 alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane VWR 103156X alternatively use local supplier
Tris hydrochloride Roth 9090.4 alternatively use local supplier
Triton X-100  Serva  37240 alternatively use local supplier
ZnCl2 Fluka 96470 alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of material Composition of solutions
Carboxin Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418) Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
Heparin Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution  0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight 1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8 Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG 40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 8 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase 10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2 mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

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References

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संयंत्र पैथोजन की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; फफूंद जीवविज्ञान और संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए
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Bösch, K., Frantzeskakis, L.,… More

Bösch, K., Frantzeskakis, L., Vraneš, M., Kämper, J., Schipper, K., Göhre, V. Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions. J. Vis. Exp. (115), e54522, doi:10.3791/54522 (2016).

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