Summary
我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。
Abstract
遺伝子欠失は、遺伝子機能の解析に重要な役割を果たしています。目的の方法で遺伝子を破壊するための最も効率的な方法の一つは、相同組換えを介して選択可能なマーカーで遺伝子全体の交換です。相同組換えの際に、DNAの交換は、高い類似性を有する配列との間で行われます。従って、標的遺伝子に隣接する線形ゲノム配列は、具体的には、所望の組込み部位を選択可能なマーカーを指向するために使用することができます。欠失コンストラクトの平滑末端は細胞のDNA修復系を活性化し、それによって、相同組換えを介して、または非相同末端接合のいずれかによって、構築物の統合を促進します。効率的な相同組換えを有する生物では、成功した遺伝子欠失の割合は、50％以上がこの戦略の貴重な遺伝子破壊システム作りに到達することができます。黒穂菌ウスチラゴmaydisは 、このような効率的な相同recombinatを示す真核生物のモデル微生物でありますイオン。その約6,900の遺伝子のうち、多くは、機能的欠失変異体を利用して特徴づけされており、遺伝子の本質的な機能で遺伝子置換試行点の失敗を繰り返しました。蛍光マーカーまたは予測ドメインの変異とタギングによる遺伝子機能のその後の特徴付けはまた、相同組換えを介したDNA交換に依存しています。ここでは、Uを発表します最も簡単な例を用いて詳細に歪み生成戦略、遺伝子欠失をmaydis。
Introduction
ウスチラゴmaydisは何十年も1,2のために広く研究されてきた植物病原性のモデル菌です。それは2つの形態、酵母様、非病原性ステージと糸状、感染型3内に存在します。このような相同組換えおよびDNA修復機構としてユニバーサル画期的な発見は、この菌4の酵母様成長段階で行われました。また、感染症のための重要な感染性フィラメントと病原性因子への形態学的スイッチは5,6を十分に特徴づけされています。このスマット菌の生物学と病原性についての増加分子の知識は、優れたゲノムアノテーション10と使用して、逆遺伝学の容易さ、 例えば 、当研究所ではよく組織プラスミドコレクション（HTTPでサポートされている簡単な遺伝子置換戦略7-9に依存しています：//www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。トウモロコシの中で標準化され、急速な感染アッセイeedlingsは、病原因子11の詳細な研究を可能にします。
U.のゲノムmaydisは、約6900の遺伝子10が含まれています 。その機能を研究するために、それらが原因で、効率的な相同組換え系を個別にまたは組み合わせて削除することができます。完全に相同末端を含む約1キロバイトの隣接領域は、相同組換え率50％より多くのための理想的ですが、すでに非相同末端を有する250bpのは、構造9の正しい統合をある程度可能にします。現在、5異なる耐性カセット、ハイグロマイシン、カルボキシン、ヌーセオスリシン、G418およびフレオマイシンに対する耐性を仲介hygR、cbxR、NATR、G418R、およびphleoRは 、形質転換体7,9を選択するために使用されています。また、ハイグロマイシン耐性、異種FLPリコンビナーゼ12の一過性発現によって除去することができる再利用可能なカセット（FRT-hygR）に開発されています。これは、耐性カセットの除去とそれによって理論的には無限の遺伝的改変を可能にします。フレオマイシン新しいカセットと、リサイクルhygRカセット特にphleoRの使用が減少されるように、13変異原性です。四重変異体は、このように他の4つのカセットを使用して生成することができますが、五重変異体について、FRT-hygRシステムは、14をお勧めします。
この一般的な遺伝子欠失戦略は成功し、このようなSporisoriumのreilianum 15、Uのような他の黒穂菌類に転送されましたhordei 16、またはU.エスクレンタ 17したがって、効率的な相同組換えシステムとまだ遺伝的難治生物におけるさらなる応用の可能性を提供しています。関与する遺伝子の欠失によって例示されるようにまた、相同組換えを欠く生物が遺伝子操作を改善するために修飾することができる非相同エンD-参加アカパンカビ 18,19インチ
ここでは、Uのための公開された遺伝子欠失戦略を説明します候補者の迅速かつ正確な検証を中心とした実験的な詳細に7,9を maydis。例として、我々は真菌キチナーゼを使用して、単一変異体の生成だけでなく、複数の欠失株20,21を示しています。彼らは剛性の細胞壁にキチンに作用するためのキチナーゼは、興味深い例です。細胞壁リモデリングは、細胞分裂、糸状成長へのスイッチ、および胞子形成の間に形態学的変化のために必要とされます。従って、欠失変異体でライフサイクル全体の表現型が期待できます。
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Protocol
削除構築物の1世代
- それぞれの1 kbの上流側の脇腹（UF）及び下流側腹部（DF）それぞれ鈍い切断制限部位に隣接し、適切な耐性カセットを含む欠失構築物（ 図1）を含むプラスミドを生成します。
注：任意のクローニング戦略は、我々はそのようなプラスミド9のためのゴールデンゲートのクローニングをお勧めします（クローニングのための基準22を参照）を使用することができます。 - 物品税の削除は、削除コンストラクト91μgのDNAを得るために、鈍いカッターを使用してプラスミドから構築します。酵素を除去し、市販の試薬を使用して、22 などを緩衝し、製造業者の指示に従うように欠失構築物を精製します。
注：ベクター骨格は、形質転換混合物中に残ることができます。
プロトプラストの調製
注：電子のすべての時間中に無菌状態を保ちますxperiment。細胞壁は、細胞膜への分子のアクセスを制限する強い保護バリアです。欠失構築物を含むDNAの取り込みを可能にするために、細胞壁はプロトプラスト反応において細胞壁分解酵素により除去する必要があります。プロトプラストの調製における重要なステップは、媒体の1）浸透圧安定化され、2）プロトプラストに機械的ストレスを避けること。
- マーク2プロトプラストを凍結し、-20℃で、それらを冷却するための丸底付きmlチューブ。希望の遺伝的背景を持つ株の新鮮なプレートから3ミリリットルYEPS-ライトで前培養を開始します。 28℃で24時間、回転ホイール上でインキュベートします。
注：株はsolopathogenic株SG200 10、野生型株は、このようなAB33 23、または二重変異体の生成のための任意の変異体背景として試験菌株することができます。株は、所望の抵抗の自由であることを確認してください。 - バッフルのFLAに50ミリリットルYEPS-ライトでの培養を希釈kおよび200rpmで、28℃でオービタルシェーカー上でインキュベートします。
注：倍加時間は、野生型株では約2時間です。 3重複の最小値を許可します。 - 指数増殖期まで成長します。 600 nmの（OD 600）の波長で測定された光学密度は、約0.8（0.6〜1.0が許容可能である）であることを確認してください。 OD 1.0の600は、約1 U. 7〜2×10に対応しますミリリットル当たりの細胞をmaydis。
- 顕微鏡下で汚染について細胞を確認してください。 40倍の倍率を使用してください。 5分、1,500×gでの完全な50ミリリットルの培養物の細胞をペレット化し、上清を捨てます。 25ミリリットルのクエン酸ナトリウム、ソルビトール溶液（SCS）、遠心5分、1,500×gで中にペレットを再懸濁し、上清を捨てます。
注：細菌汚染が小さく、頻繁に移動する細胞として同定することができます。真菌汚染がUの葉巻状細胞と比較して異なるセルの形状や大きさに基づいて同定することができますmaydis。 - CENの間trifugationは、プロトプラスト溶液を調製（12.5 mg / mlでトリコデルマは SCS中の酵素を、溶解、細胞ペレット当たり3ミリリットルを準備し、フィルタは22μmのフィルターを通して滅菌;ソリューションは、最適な酵素活性のために新鮮でなければなりません）。 SCSは、細胞壁を除去するとプロトプラストの破裂を防止するための浸透圧安定剤です。
- ソリューションをプロトプラスト2mlにペレットを再懸濁。 RTで5〜20分間インキュベートし、細胞の30〜40％が円形またはpinheads（ 図2）のようなものまで、顕微鏡下で確認してください。
注：今から氷の上のすべてのステップを実行して、注意してプロトプラストを扱います！ - 10ミリリットルの冷（4°C）SCSでの洗浄3回、5分間1,000×gで遠心。
- 10ミリリットル中にペレットを再懸濁冷たいソルビトール、トリスHCl、 塩化カルシウム溶液（STC）、5分間千×gでスピンし、上清を捨てます。 1ミリリットルの冷STCにペレットを再懸濁し、冷却チューブに100μlのアリコートを作ります。さらに使用するまで-80℃でアリコートを凍結します。
Uの3変容maydis
注：Uの転換maydisプロトプラストは、技術的に簡単で、特別な装置を必要としないエレクトロポレーションまたは微粒子銃形質転換に反対であるポリエチレングリコール（PEG）媒介形質転換方法に依存しています。
- 2層構造の選択プレート（形質転換反応あたり2板）を準備します。底層は倍濃度の抗生物質が含まれています。 400 / mlのハイグロマイシンを含むRegLightのピペット12ミリリットル（または300 / mlのヌーセオスリシンまたは4 / mlのカルボキシンまたは1 mg / mlでのG418）ペトリ皿に。気泡を避けてください。
注：ボトム層プレートは4℃で数日保存されているが、（下記参照）変換時に新鮮にトップ層を作製することができます。 - 氷上で解凍プロトプラスト（1チューブ/変換）。 1μlのヘパリン（15 mg / mlで）を追加します。 1μgのDNA（線状化構築物）または10μlのH 2を追加します。
- この時間の間に、上位層のためRegLight底板上にRegLight（沸騰し、60℃に冷却）に液化12ミリリットルを広げます。
注：この層は、抗生物質が含まれていません。 - 変態チューブ（3 2）に500μlのSTC / PEG（ポリエチレングリコール）を追加し、チューブを反転させて慎重に混ぜます。氷上で15分間インキュベートします。
- 二層RegLightプレート2上の各形質転換反応を配布します。ガラスピペットで慎重にゆっくりと広がった。形質転換体は、コロニーとして成長するまで5〜7日間28℃で直立プレートをインキュベートします。プレートあたり約100から200個のコロニーを取得します。
注：下の数字は、どちらかがあまりにも多くの細胞壁を含んでいるため、DNAを取ることができない、または再生することはできません "悪い"プロトプラストによって引き起こされている可能性があります。前者は自己複製プラスミド、抗生物質を含まないプレート上で再生をテストすることにより、後者を用いた形質転換によって試験することができます。 <李> 200 / mlのハイグロマイシン（;ボトムプレートに使用されるもののこれらの濃度と等しい半分または150 / mlのヌーセオスリシンまたは2 / mlのカルボキシンまたは500 / mlのG418）で、適切な抗生物質を含むYEPS-光板を準備します。これらのプレート上の少なくとも24の推定上の形質転換体コロニーを再精製します。単一のコロニーを得られるはずです。非選択培地上の元の歪みアウト同時にストリークで。
注意：プレートを1〜2週間4℃で保存することができます。
正しい削除イベントの4検証
注：変異は、三段階の手順で確認している（ 図1）。まず、遺伝子の野生型コピーが含まれている候補者は、PCRによって除外されています。第二に、遺伝子座への耐性カセットの組み込みは、PCRによって確認されます。第三に、唯一の所望の軌跡への耐性カセットの組み込みは、サザンブロット分析によって確認されます。慎重な歪みの検証がESSEです変異体の表現型は本当に削除と相関するように、ntial。
- 最初の診断PCR 20
- 250〜600塩基対（ 図1）の生成物に、その結果を削除する遺伝子における設計プライマー対。このような小さな製品は、コロニーPCRで増幅することが容易であり、標準的なゲル電気泳動での検出のために十分に長いです。
- 各候補者と陽性対照として、元の株について、20μlの0.02 M NaOH中の爪楊枝でシングルコロニーの細胞物質の少し（ピンヘッドの量）を再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。
注：新鮮なコロニーを使用してください。プレートは、新鮮なコロニーを得るために再ストリーク1週間以上経過している場合。 - すぐにPCR用の細胞懸濁液1μLを使用してください。標準的なPCR反応を実行し、得られた断片を分析します。
注：これらのサンプルを保存することはできません。
注：このPCR野生型遺伝子の存在について試験し、それによって負CANDの迅速な同定を可能にします目的の遺伝子が置換されていないでidates。このPCR反応においてバンドを生じるクローンは破棄されます。そのような負のクローンがとにかく追加の陰性対照として運ばれるべきです。 PCR産物のない候補者は、さらに分析する必要があります。他の半分はバンドになるべきではありませんしながら、有害な影響のない遺伝子について候補者の約半分は、野生型の遺伝子が含まれている必要があります。これは50％の相同組換え率に対応します。
- 第2の診断PCR
- ゲノムDNAの調製。
注：ゲノムDNA（gDNAを）は、2つの異なるプロトコルを使用して調製することができます。最初は、それゆえ、フェノールやクロロホルムなどの有毒な試薬を必要とする第二も、経験の少ない学生で扱うことができるが、4.2に4.2.1.6で説明した（だけ（4.2.1.5を4.2.1.1に記載されている）経験豊富な研究者によって処理されるべきです。 1.11）。どちらのプロトコルも確実に作業しています。ステップ4.2.1.1は両方protocで同じですオール。- 各候補に5ミリリットルYEPS-ライトに接種し、28℃で24時間、回転ホイール上でインキュベートします。 CMプレート上で培養2μLをドロップします。無菌培養しておいてください。
注：以下は、標準的なプロトコル（：毒性の手順注意）です。 - 2ミリリットルチューブに塩酸洗浄したガラスビーズの1スクープ（〜200μl）を入れてください。 Uの2ミリリットルを追加します。 maydis文化 。 5分間、12,000×gでスピン。上清を捨て（ペレットは、この段階で凍結することができます）。 （：24：1〜25）ペレットに500μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを追加します。注意！フェノールは有毒です！
- 1000rpmでvibraxに500μlのウースチー-溶解緩衝液を6〜10分間1.シェイクを追加します。細胞ペレットを完全に再懸濁されていることを確認したが、gDNAをのせん断を防止するために、揺れ拡張避けます。 15分間、12,000×gでスピン。新しい反応管に水相400μlのを転送（相間には触れないでください）。
- （v / v）エタノール1ミリリットル100％を追加します。 Cを観察、混合するためにチューブの3倍を反転すぐに表示されたDNAの大声。 5分間、12,000×gでスピン。上清を除去し、200μlの70％EtOHで洗浄します。この段階でペレットを再懸濁しないでください。
- （ペレットが完全に乾燥させてはいけない）完全に上清を取り除きます。 50μlのTE / RNアーゼを追加します。 10分間50℃で400rpmで振盪することによりたgDNAを溶解します。 0.8％アガロースゲル20上のgDNAの2μLを分析します。
注：以下の手順は、代替の非毒性のプロトコルを備えます。
- 各候補に5ミリリットルYEPS-ライトに接種し、28℃で24時間、回転ホイール上でインキュベートします。 CMプレート上で培養2μLをドロップします。無菌培養しておいてください。
- ゲノムDNAの代替準備
- HClを1スクープ（〜200μl）を入り、2 mlチューブにガラスビーズを洗浄しました。 Uの2ミリリットルを追加します。 5分間、12,000×gでの文化やスピンをmaydis。上清を捨て（ペレットは、この段階で凍結することができます）。
- ペレットに500μlのウースチー溶解バッファー2を追加します。 1000rpmでvibraxに5〜15分間振ります。細胞ペレットを完全に再懸濁されていることを確認します。
- 15〜20分間、65℃でチューブをインキュベートします。アプロを使用しました2ミリリットルチューブをホストするように設計されたpriateインキュベーターは重要です。その後、5分間氷上に置きます。
- 100μlの8 M酢酸カリウム、渦を追加または8〜10回転倒。 RTで15分間、12,000×gでスピン。
- 新しい1.5mlチューブに上清の500μLを移し、400μlのイソプロパノールを追加します。ボルテックスあるいは反転8〜10倍。 15分間、12,000×gでスピン。上清を除去し、500μlの70％EtOHで洗浄します。 5分間、12,000×gでスピン。
- 完全に上清ソークオフ！最終的には、残留液体を除去するために、短いスピン（10秒）を追加します。 3〜5分間、DNAペレットが乾燥してみましょう。 50μlのTE / RNA分解酵素を添加し、400rpmで10〜15分間50℃でインキュベートします。
- PCR
- デザインそれらの一方が（UF-F、RC-R; RC-F、DF-R、 図1）側面の外側に結合および耐性カセット内のバインディングいずれかを対応有する2つのプライマー対9。
- すべてのCののgDNAの1:10希釈の1μLを使用しますandidate 2のPCR反応におけるテンプレートとして上流と下流の9正しい挿入を検証します。
- 各候補者のための標準的なPCR反応を使用して、断片22を得られた分析。
注：これらのPCRは正しいゲノム遺伝子座における耐性カセットの挿入をテストします。製品は両側のために得られた場合、候補者はおそらく正しい挿入です。しかし、片側のみ（上流または下流）も候補は、PCR反応は、単に1のフランクに失敗しました場合には、さらなる分析のために沿って行われるべきで確認することができました。
- ゲノムDNAの調製。
- サザンブロット分析22によって正しいゲノム挿入の検証
- 15変異体候補のgDNAをμlの（4.2.1）および遺伝子座の外/建設し、加えて切断する適切な酵素を用いて、対応する野生型/前駆細胞株、遺伝子または明確のdistにつながる耐性カセットのいずれかでカットをダイジェストinguishableパターン（ 図1）8。
注：彼らは明らかに未消化のDNAと区別されるように期待されるバンドのいずれも、10キロバイトより大きくてはなりません。 - プローブとして、上流と下流の脇腹を使用してください。例では、PCR DIGラベリングキットまたは任意の同様の標準的な方法を使用するためにそれらを標識するために。 1で標識したプローブを混ぜる：1分子比およびサザンブロットを行います。少なくとも2つの独立正しい形質転換体を保管してください。
注：野生型のパターンは、元の株で明らかに検出すべきであり、正確なクローンのみが予想されるバンドが含まれている必要があります。候補者にのみ存在する追加のバンドは、間違った軌跡内に構築物の他の挿入を示しています。このようなクローンは破棄されるべきです。最初の診断PCRで同定された負の候補者が誤って統合され、削除構築物の野生型バンドと（サイズは予測できない）バンドを含める必要があります。
- 15変異体候補のgDNAをμlの（4.2.1）および遺伝子座の外/建設し、加えて切断する適切な酵素を用いて、対応する野生型/前駆細胞株、遺伝子または明確のdistにつながる耐性カセットのいずれかでカットをダイジェストinguishableパターン（ 図1）8。
- グリセロールストック
注：グリセロールストックは、歪みのコレクションに年間のクローンを維持するのに役立ちます。少なくとも二つの独立した形質転換体は、各変異体のために維持されるべきです。これは、同一でなければなら表現型を比較することができます。- 500μlのNSY-グリセロール培地での各培養物の28°Cミックスを500μlで24時間、回転ホイール上YEPS-ライトで確認された変異株の5ミリリットルの文化を育てます。文化とメディアが十分に混合されるまでチューブを反転。培地中のグリセロールは、氷結晶の形成を防止します。
- -80℃で凍結します。再ストリーク在庫が機能しているかどうかをテストするための凍結培養物の一部。
5.微視的表現型
- 28℃で12時間、回転ホイール上YEPS-ライトで野生型および変異株の5ミリリットルの文化を育てます。
- 次の日は、約0.1のOD 600に文化を希釈し、0.5と0.7の間のOD 600までそれを成長させます。 1.0 correspのOD 600秒単位約1 7〜2×10 Uにミリリットル当たりの細胞をmaydis。
- 顕微鏡で細胞の形態を調べます。
注：健康な細胞は葉巻形（ 図4、WT）を表示されます。発音液胞またはフィラメント形成は、細胞がストレスを受けていることを示しています。
注：予想突然変異表現型に応じて、分析をレポーター株が使用される場合、例えば 、適切なアッセイがこの段階で行うことができ、適合させることができます。細胞の形態を変更した場合、統計的分析は、平均セル長さを決定するために、 例えば 、実施されるべきです。
6.感染アッセイ
注：苗感染アッセイは、本誌11で、以前に可視化されています。これは、いずれかのそのようなSG200 10として、または両方の突然変異を運ぶ互換交配パートナーを混合して半数体、solopathogenic株バックグラウンドを使用して行うことができます。
- 当たり少なくとも40トウモロコシの苗を育てます16時間の光周期で7日、200μE、28℃/ 22℃（昼/夜）のための菌株。彼らは3葉期と10〜15センチメートル感染の日に背の高いであるべきです。
- 感染の2日前に、28℃で24時間、回転ホイール上で5ミリリットルYEPS-ライトで株の前培養を開始します。最大OD 600〜50ミリリットル YEPS -ライトの主な文化を育てる= 1.0（= 2時間細胞分裂速度、3部門の最小値を許可し、O / N行うことができます）。
- 5分間、1500×gで50ミリリットルの培養物の細胞をスピンダウンし、上清を捨てます。滅菌H 2 Oで洗浄3倍OD 3.0の600に滅菌H 2 Oで細胞を再懸濁します。必要に応じて、交配相手を混ぜます。
- 小さな注射器を使用して、7日齢のトウモロコシ苗の幹に細胞懸濁液500μlの - 250を注入します。コントロールとして、滅菌H 2 Oを使用してください。同じ光や温度条件の追加の7〜14日のために、感染苗を保管してください。各工場aの表現型をスコア健康、クロロシス、アントシアニンの形成、小さな腫瘍、大きな腫瘍、枯れた植物10にccording。
注：スコアリングが早く7日として行われ、時間をかけて感染を追跡するために14日目に繰り返すことができます。
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Representative Results
U.でエンコードされたすべての4キチン分解遺伝子に対する欠失構築maydisゲノムはCTS1の削除のためにhygRカセットを使用して、ゴールデンゲートクローニングによって生成された、NATR CTS2の削除のため、CTS3の削除とcts4 20の削除のcbxRためG418Rカセット 。遺伝子置換戦略の概要は、CTS3の欠失（ 図1）が挙げられます。第キチン分解遺伝子とCTS1のシングルと二重変異体は、病原性におけるキチナーゼの役割の分析のための2つの異なる遺伝的背景に、同じ構築物で連続的に発生させました。二つの異なる系統の背景を使用した：AB33は、糸状の成長の誘導を可能にする病原23への第一歩、SG200は、急速な疾患のスコア10を可能にソロ病原性株でありますCTS3の変換は、適切な株背景に構築-deletionした後、第二の選択プレートの単一コロニーは、診断のPCR（ 表1）およびサザンブロット（ 図3）により、正しい削除のために試験しました。興味深いことに、相同組換え率をCTS3ためにAB33に比べSG200ではるかに高かったが、この差は一貫して他のキチナーゼの欠失では観察されませんでした。
厳格な歪みの検証は、所望の位置に欠失構築物の単一の挿入を確実にします。しかし、このような点突然変異などの追加変更が表現型の解釈に誤解を与える可能性がある、検出されないままにすることができます。したがって、少なくとも2つの独立した形質転換体は、表現型されています。
イチジク URE CTS3 により例示削除戦略の1.概要 。この概略図は、WT（削除は、上流側の脇腹（UF）、下流側腹部（DF）、およびジェネティシン耐性カセット（G418R）と野生型のゲノム遺伝子座を構築含み）とCTS3欠失変異体および全てのプライマーと同様にひずみの検証に使用される制限部位。生成物の最初の診断PCR結果耐性カセットが正しく統合されている場合、野生型遺伝子のコピーが存在する場合にのみ、二つの第二の診断のPCR製品をもたらします。ゲノムDNAをPstIで消化されたサザンブロットのために、プローブは、UFとDF（赤いバー）は、野生型で6.7キロバイトバンドの検出につながると5.6キロバイトの2バンドおよび変異体で2.0キロバイトに及びます。また、DFプローブは弱く2.6キロバイトの製品を認識します。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.反応をプロトプラストの顕微鏡検証。（A）未処理の野生型細胞（FB2）は葉巻が整形表示されます。細胞壁（30分間、ここについて）分解酵素で処理して（B）は 、構造体のような一端（S）、バー・ベルに円形球の外観（b）は、細胞壁の分解が開始されたことを示しています。最後に、プロトプラストは、細胞壁の欠如に起因している、完全にラウンド（R）です。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
イチジク URE 3。 CTS3 削除 。ゲノムDNAのためのサザンブロットをPstIで消化しました。両方の側面を等モル比で混合し、単一のプローブとして使用し、標識しました。野生型SG200とキチナーゼのCTS1とCTS2の欠失では、6.7キロバイトの単一のバンドが検出されました。 CTS3の削除（グラム及びk）では、5.6キロバイトと2.0キロバイトの2つのバンドがCTS3の正しい削除を示す表示されます。 2.6キロバイトの追加のバンドが大規模な露出オーバーにより可視化することができます。これは、下流側腹部プローブの唯一の100塩基対のオーバーラップによって認識されるフラグメントに対応しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
いくつかの変異は、微視的に検出することができる明白な成長欠陥につながります。キチナーゼ欠失では、単一変異体は表示されませんでした明らかな欠陥は、CTS1ながら/ 2二重変異体は、欠陥20顕著な細胞分離を示しました。セプタムの染色は細胞質分裂が完了したことを示したが、細胞は、残留キチン（ラングナーらから図4。2015）を介して可能性が接続されたままでした。同様の微視的な成長表現型はkhd4 24の削除、形態および病原性25に関与する遺伝子の転写後RNAの代謝回転を媒介するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子のために知られています。
欠失変異体の 図4. 顕微鏡分析。キチナーゼ欠失株の細胞形態および隔壁形成。CTS1 / 2Δ株は、細胞分離の欠陥を示し、隔壁形成の欠如によるものではないこれは、大きな凝集体を形成します。プライマリおよびセカンダリセプタムは、（挿入図中の5倍の拡大を参照してください）前顕微鏡にカルコフロアホワイト（CW）で染色しました。スケールバー=10μmです。この図は、ラングナーら。2015真核細胞20からの許可を得て転載されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
毒性のキチナーゼの寄与を試験するために、苗の感染アッセイをSG200株バックグラウンド内の変異体を用いて行きました。 khd4における突然変異体は毒性が減少したが、キチナーゼの削除は、トウモロコシの苗（ 図5）20,25の感染に影響を及ぼしませんでした。
欠失変異体の 図5. 感染アッセイ。の疾患の評価それぞれのU.で9日、感染後のトウモロコシ苗株をmaydis。 （A）疾病スコアのために使用される巨視的な症状。 （B）は、2つの独立した形質転換体を、各株（N> 100）を試験しました。すべてのキチナーゼ欠損変異体（1月2日/3Δ：三重変異体endochitinases、4Δ：単一突然変異体N-アセチル、1/2/3 /4Δ：四重変異体）と野生型感染で観察されるように重い腫瘍形成に至る宿主植物に感染しましたsolopathogenic株SG200。以前に報告されているように24対照的に、RNA結合タンパク質Khd4をコードする遺伝子の欠失を有する株は、毒性が低減しました。エラーバーは、3つの独立した実験の標準偏差を示します。この図は、ラングナーらの許可を得て変更される。2015真核細胞20。 大きなを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のRバージョン。
| 遺伝的背景 | 第1 diagn。 PCR （除外/テスト済み） | 2 番目の diagn。 PCR （確認/テスト済み） | 南方の （確認/テスト済み） | ％のrecomb。 |
| AB33 | 7月22日 | - | 7月15日 | 32 |
| AB33 CTS1Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8月10日 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
表1：CTS3の削除のためのひずみ検証キチナーゼ遺伝子CTS3は、単一および複数の欠失で糸状成長（AB33）および感染症（SG200）の研究を可能にするために、四つの異なる遺伝的背景で削除されました。
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Discussion
このプロトコルはU.で逆遺伝学的研究のための欠失変異体を生成する方法について説明しますmaydis。出発点は、それが以前に7,9を最適化したとして、目的遺伝子の約1開始の上流および終止コドンの下流キロバイトだけでなく、適切な耐性カセットの配列を含有するフランキング配列を含む欠失構築物であります。構築物は、個別に各遺伝子のために生成され、慎重に遺伝子を欠損する前にシーケンスエラーを検証する必要があります。フランクは、隣接遺伝子に到達または変異が調節要素を変更する場合脇腹における点突然変異は、特に、ゲノム配列中の不要な変化を引き起こす可能性があります。これは、すべての形質転換体に影響を与えるだろうし、所望の遺伝子の欠失とは無関係の表現型と副作用を引き起こす可能性があります。
削除戦略を計画する場合、予想される表現型は遺伝的背景を選択するように考慮しなければなりません。本発明の場合、AB33 23とSG200 10は、形態学的スイッチと植物感染において表現型のテストを可能にするために選ばれました。同様に、他の多くのリードアウトが対象となり得る、CTS1と例えば融合は、異種タンパク質14,26の輸出で採用されており、蛍光と歪みの背景はrrm4タグ付けされたエンドソーム27,28上のRNAの輸送の分析を可能にします。
歪み検証中に、ハイスループット診断PCRは候補の数の急激な減少がかなり面倒なサザンブロットで試験することを可能にします。特に、第1の診断PCRは、まだ遺伝子の野生型コピーを含む候補者の排除を可能にし、それによって、gDNAの調製物中の有毒フェノールの大規模な使用を防止します。非必須遺伝子で標準場合、コロニーの約半分は、野生型遺伝子を含んでいてもよいです。この事前スクリーニングは、遺伝子のための非常に興味深いことができます潜在的に有害な成長の表現型を有します。候補者の何百も迅速にスクリーニングすることができます。
すべての候補者は、野生型のコピーが含まれている場合、遺伝子の欠失は、おそらく致命的です。これは、二倍体菌株の背景（ 例えば、D132）と冬胞子の発芽29後の分離の分析に一つのコピーを削除することによって確認することができます。代替的に、誘導性プロモーターを使用して条件付き欠失戦略は、変異体の表現型を追従するように選択することができます。しかし、また、原油からのgDNAの調製のためのNaOHベースの方法を結果として生じる汚染は候補者がバンドを示さないため、彼らは遺伝子が含まれているにもかかわらず、保持されている。すなわち 、PCRを妨害し、偽陰性につながることができます。これは、より大きな断片を生じる対照遺伝子のための2つの遺伝子特異的プライマーおよびプライマーを用いて独立したPCR反応において、または多重PCRにより匹敵するサイズの製品にコントロール遺伝子を試験することによって排除することができます。
コンテンツ">変異体はすでに利用可能である場合、 例えば 、CTS1Δ30またはrrm4Δ、タグ付けされたバージョンの歪みの発生は、 例えば 、含む新規構築物でゲノム中の遺伝子欠失耐性カセット（ 例えばhygR）を交換することによって加速することができます蛍光標識rrm4と異なる耐性マーカー（ 例えば NATR）。この場合、形質転換体は、初期の耐性マーカー9の損失によってスクリーニングすることができる。正しい候補が唯一の新しい抗生物質（ヌーセオスリシン）に対して耐性であり、その初期抵抗（ハイグロを失っています）。また、トランスにおける変異体の表現型の相補性は、タグ付けされた構築物30,31の機能を検証するために実施することができます。ここで説明する遺伝子の欠失及び修正戦略はUの遺伝子解析における信頼性の高い、正確なツールを提供していますmaydis。しかし、複数の欠失のために、歪みGE変更が順次行わなければならないためnerationは、時間がかかり得ることができます。そのため、補完的なツールとして、昨年CRISPR-CASシステムはU.のために設立されました32を maydis。それは、同時にいくつかの遺伝子を破壊する可能性を提供し、Uの遺伝的ツールボックスに優れた付加でありますmaydis。
要約すると、遺伝子操作およびUのためのプロトコルここで説明maydis歪みの発生が広く年間コミュニティで使用されている強固な方法です。一緒にそれぞれの耐性カセットモジュールの包括的なコレクションでそれは基本から応用研究に至るまで、多様な質問に対処し、この菌に遺伝子工学のすべての種類を可能にします。
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Acknowledgments
原稿の重要な読書のための博士ベネディクトSteutenに感謝します。キチナーゼ上のオリジナル作品は、博士はThorstenラングナーにより行いました。 VGの研究室は、植物科学優秀（CEPLAS、DFG EXC 1028）とBioSCのクラスタでサポートされている、KSの研究室ではBioSCによってサポートされています。 KBはBioSCによってサポートされています。 Bioeconomy科学センター（BioSC）の科学的な活動は財政NRW Strategieprojekt BioSC（第313 / 323-400-00213）の枠組みの中でイノベーション、科学・研究省によってサポートされていました。 LFはDFG国際研究研修グループ1525 iGRADplantの博士課程の交わりによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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