Summary
Descrevemos uma estratégia de substituição de genes robusta para manipular geneticamente o fungo Ustilago maydis smut. Este protocolo explica como gerar mutantes de deleção para investigar fenótipos de infecção. Ele pode ser estendido para modificar os genes de qualquer forma desejada, por exemplo, através da adição de uma sequência que codifica uma etiqueta de proteína fluorescente.
Abstract
Deleção do gene desempenha um papel importante na análise da função dos genes. Um dos métodos mais eficazes para interromper genes de forma direcionada, é a substituição de todo o gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Durante a recombinação homóloga, a troca de DNA ocorre entre sequências com alta similaridade. Portanto, sequências genómicas flanqueadoras lineares um gene alvo podem ser utilizados para dirigir especificamente um marcador seleccionável para o local de integração desejada. extremidades rombas do construto eliminação activar sistemas de reparação do ADN da célula e, assim, promover a integração da construção, quer através de recombinação homóloga ou por não-homóloga-fim de aderir. Em organismos com recombinação homóloga eficiente, a taxa de supressão de gene bem sucedida pode chegar a mais de 50%, tornando esta estratégia de um sistema de interrupção de genes valioso. O fungo smut Ustilago maydis é um microorganismo modelo eucariótica mostrando como recombinat homóloga eficienteíon. Fora dos seus cerca de 6900 genes, muitos foram funcionalmente caracterizados com a ajuda dos mutantes de deleção, e repetiu falha de pontos de tentativas de substituição de genes em função essencial do gene. posterior caracterização da função gênica por marcação com marcadores fluorescentes ou mutações de domínios previstos também se baseia na troca de ADN através de recombinação homóloga. Aqui, apresentamos o U. maydis estratégia de geração de tensão em detalhe utilizando o exemplo mais simples, a deleção do gene.
Introduction
Ustilago maydis é um fungo fitopatogénico modelo que tem sido estudada extensivamente durante décadas 1,2. Ela existe em duas morfologias,, um estágio não-patogênica do tipo levedura e uma filamentosos, forma infecciosa 3. Descobertas revolucionárias universais, tais como mecanismos de recombinação e reparo de DNA homólogas foram feitas na fase de crescimento do tipo levedura do fungo 4. Além disso, o interruptor morfológico ao filamento e virulência infecciosas factores importantes para a infecção são bem caracterizado 5,6. O conhecimento molecular crescente sobre a biologia e virulência do fungo ferrugem se baseia em uma estratégia de substituição de genes simples 7-9 apoiado por uma excelente genoma anotação 10 e a facilidade de genética reversa usando, por exemplo, a coleção plasmídeo bem organizado pelo nosso instituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Padronizados, ensaios de infecção rápidas no milho seedlings permitem estudos detalhados de patogenicidade Fatores de 11.
O genoma de U. maydis contém cerca de 6900 genes 10. Para estudar a sua função, eles podem ser suprimidos individualmente ou em combinação, devido a um sistema de recombinação homóloga eficiente. Regiões de f lanqueamento de cerca de 1 kb contendo extremidades perfeitamente homólogas são ideais para as taxas de recombinação homóloga maior do que 50%, mas já de 250 pb com extremidades não homólogas permitir um certo grau de integração correcta da construção 9. Atualmente, cinco cassetes de resistência diferentes, hygR, cbxR, NATR, G418R, e phleor mediar resistência contra higromicina, carboxin, nourseothricin, G418 e fleomicina, são utilizados para seleccionar os transformantes 7,9. Além disso, a resistência à higromicina foi desenvolvido em uma cassete reciclável (FRT-hygR) que pode ser removido por a expressão transiente de uma recombinase FLP heterólogo 12. Isto permite a remoção da cassete de resistência e, portanto, em teoria modificações genéticas ilimitadas. Fleomicina é mutagénica 13, de modo que, com as novas cassetes, em particular, a cassete hygR reciclável, o uso de phleor está a diminuir. Quádruplos mutantes podem, portanto, ser geradas utilizando as outras quatro cassetes, mas para os mutantes quíntuplo, o sistema de DRF-hygR é recomendado 14.
Esta estratégia geral deleção do gene foi transferido com sucesso para outros fungos obscenidade como Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 e, portanto, oferece o potencial para futuras aplicações em organismos geneticamente ainda intratáveis com um sistema de recombinação homóloga eficiente. Além disso, os organismos que carecem de recombinação homóloga pode ser modificado para melhorar a engenharia genética, tal como exemplificado pela deleção de genes envolvidos em não-homóloga-end-unindo em Neurospora crassa 18,19.
Aqui nós descrevemos a estratégia de deleção do gene publicada por U. maydis 7,9 em detalhe experimental com foco na verificação rápida e precisa dos candidatos. Como um exemplo, usamos as quitinases de fungos e descrevem a geração de mutantes individuais, bem como a eliminação múltiplas estirpes 20,21. Quitinases são exemplos interessantes, porque actuam sobre quitina na parede celular rígida. remodelação da parede celular é necessária para modificações morfológicas durante a divisão celular, mudar para o crescimento filamentoso, e a formação de esporos. Assim, em fenótipos mutantes de deleção em todo o ciclo de vida pode ser esperado.
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Protocol
1. Geração de deleção Construções
- Gerar um plasmídeo contendo a construção de eliminação (Figura 1) que compreende um respectivo flanco de 1 kb a montante (UF) e flanco a jusante (DF) cada e a cassete de resistência adequada flanqueada por locais de restrição de corte brusco.
NOTA: Qualquer estratégia de clonagem pode ser utilizada (para clonagem ver referência 22) recomendamos Golden Gate clonagem de tais plasmídeos 9. - Excisar o deleção a construção do plasmídeo utilizando um cortador fechado para se obter 1 ug de DNA da delecção construir 9. Purifica-se o construto de eliminação para eliminar a enzima e o tampão 22 por exemplo, por utilização de reagentes comerciais e seguir as instruções do fabricante.
NOTA: O esqueleto do vector pode permanecer na mistura de transformação.
2. Preparação de Protoplastos
NOTA: Manter condições estéreis durante todos os momentos do eXperiment. A parede celular é uma forte barreira protectora que limita o acesso de moléculas para a membrana plasmática. Para permitir a captação do ADN contendo a construção de eliminação, a parede celular tem de ser removido por parede celular de enzimas que degradam numa reacção protoplasting. As etapas críticas em preparação de protoplastos são: 1) a estabilização osmótica do meio e 2) evitar o estresse mecânico sobre os protoplastos.
- Mark 2 ml tubos com um fundo redondo para congelar os protoplastos e arrefecê-los a -20 ° C. Iniciar uma pré-cultura em 3 ml Yeps-luz de uma placa fresca da estirpe com o fundo genético desejado. Incubar numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C.
NOTA: A tensão pode ser a SG200 solopathogenic estirpe 10, as estirpes de tipo selvagem, cepas teste como AB33 23, ou algum fundo mutante para a geração de mutantes duplas. Certifique-se a tensão está livre da resistência desejada. - Diluir a cultura em 50 ml Yeps-luz em um piscar perplexok e incubar num agitador orbital a 28 ° C com 200 rpm.
NOTA: O tempo de duplicação é de cerca de 2 horas para as estirpes de tipo selvagem. Permitir três duplicações mínimo. - Crescer até fase exponencial. Assegure-se que a densidade óptica, medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600), é de cerca de 0,8 (0,6 a 1,0 é aceitável). Uma OD600 de 1,0 corresponde a cerca de 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml.
- Verificar as células de contaminação sob um microscópio. Use ampliação de 40x. Agregar as células da cultura completo 50 ml durante 5 min, 1,500 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 25 ml de citrato de sódio, solução de sorbitol (SCS), centrifugar 5 min, 1500 xg, e rejeitar o sobrenadante.
NOTA: contaminações bacterianas podem ser identificadas como células pequenas e que se deslocam com frequência. Contaminações fúngicas podem ser identificados com base em um formato diferente ou tamanho de célula em comparação com as células em forma de charuto de U. maydis. - durante centrifugation preparar solução protoplasting (12,5 mg / ml Trichoderma lise enzimas, em SCS; preparar 3 ml por pellet celular; filtro de esterilizar através de um filtro de 22 mm; solução tem de ser fresco para a atividade enzimática ideal). SCS é um estabilizador osmótico para evitar a ruptura de protoplastos após a remoção da parede celular.
- Ressuspender o sedimento em 2 ml de solução protoplasting. Incubar durante 5 a 20 min à temperatura ambiente e sob o microscópio vá até 30 a 40% das células são redondas ou como cabeças de alfinete (Figura 2).
NOTA: Execute todas as etapas no gelo a partir de agora e lidar com protoplastos com cuidado! - Lavar 3x em 10 ml de frio (4 ° C) SCS, centrifugar a 1000 xg durante 5 min.
- Ressuspender o sedimento em 10 ml de sorbitol frio, solução TrisHCl, CaCl2 (STC), giram a 1.000 xg por 5 min, elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de STC frio, fazer alíquotas de 100 ul nos tubos arrefecidos. Congelar as alíquotas a -80 ° C até à sua utilização.
3. Transformação de U. maydis
NOTA: A transformação do U. maydis protoplastos invoca o polietileno glicol (PEG) método de transformação mediada por, o que é tecnicamente simples e oposição a electroporação ou transformação biolística não requer equipamento especializado.
- Prepare as placas com duas camadas de seleção (2 placas por reacção de transformação). A camada inferior contém o antibiótico em uma concentração duplicou. Pipetar 12 ml de RegLight contendo 400 ug / ml de higromicina (ou 300 ug / ml nourseothricin ou 4 ug / ml carboxina ou 1 mg / ml de G418) para uma placa de Petri. Evitar bolhas.
NOTA: placas de camada inferior pode ser armazenado um par de dias a 4 ° C, mas se preparar a camada superior de fresco durante a transformação (ver abaixo). - protoplastos descongelamento em gelo (1 tubo / transformação). Adicionar 1 ml de heparina (15 mg / ml). Adicionar 1 ug de DNA (constructo linearizado) ou 10 ul de H 2
- Durante este tempo, para a camada superior, distribuídos 12 ml liquefeitos RegLight (ferver e arrefecer a 60 ° C) sobre a placa de fundo RegLight.
NOTA: Esta camada não contém antibióticos. - Adicionar 500 ul STC / PEG (polietileno glicol) para o tubo de transformação (3. 2) e mistura-se cuidadosamente por inversão do tubo. Incubar 15 minutos em gelo.
- Distribuir cada reacção de transformação em duas das placas RegLight de duas camadas. Espalhe cuidadosamente e lentamente com uma pipeta de vidro. Incubar as placas na posição vertical a 28 ° C durante 5 a 7 dias, até que os transformantes crescer como colónias. Obter cerca de 100-200 colónias por placa.
NOTA: Os números mais baixos pode ser causado por protoplastos "maus" que ou contêm parede celular muito e, portanto, não podem ocupar DNA ou não pode regenerar. O primeiro pode ser testada por transformação com um plasmídeo auto-replicante, o último por meio de testes em placas de regeneração sem antibióticos. <li> Preparar Yeps-Luz placas contendo o antibiótico apropriado a 200 ug / ml de higromicina (ou 150 ug / ml nourseothricin ou 2 ug / carboxina ml ou 500 ug / ml de G418; estas concentrações iguais a metade do usado para placas de fundo). Re-purificar com pelo menos 24 colónias transformantes putativos sobre estas placas. As colónias simples deve ser obtida. Ao mesmo tempo raia a linhagem original em mídia não-seletivo.
NOTA: As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 1-2 semanas.
4. Verificação da Correta de exclusão Eventos
NOTA: As mutações são verificados num processo de três passos (Figura 1). Em primeiro lugar, que contêm candidatos a cópia de tipo selvagem do gene são excluídos por PCR. Em segundo lugar, a integração da cassete de resistência dentro do locus é verificada por PCR. Em terceiro lugar, a integração da cassete de resistência à única no locus desejado é verificada por análise de mancha de Southern. verificação estirpe cuidado é ESSEntial, de modo que os fenótipos mutantes verdadeiramente correlacionar com a supressão.
- Primeiro diagnóstico PCR 20
- Conceber iniciadores de emparelhamento no gene a ser suprimido que resultam num produto de 250-600 pb (Figura 1). Tais pequenos produtos são fáceis de amplificar por PCR em uma colónia, e tempo suficiente para a detecção na electroforese em gel padrão.
- Para cada um dos candidatos e a estirpe original como um controlo positivo, ressuspender um pouco (quantidade de uma cabeça de alfinete) de material de células de uma única colónia com um palito em 20 ul de NaOH 0,02 M. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
Nota: Use novas colônias. Se as placas são mais velhos do que uma semana re-raia para obter uma nova colônia. - Use 1 ul da suspensão de células para a PCR imediatamente. Executar uma reacção de PCR convencional e analisar fragmentos resultantes.
NOTA: As amostras não pode ser armazenado.
NOTA: Este teste de PCR para a presença do gene de tipo selvagem e, assim, permite a rápida identificação de cand negativoidates em que o gene de interesse não tiver sido substituído. Os clones produzindo bandas nesta reacção de PCR serão descartadas. Um tal clone negativo deve mesmo assim ser levado junto como um controle negativo adicional. Os candidatos sem um produto de PCR tem de ser analisada com mais profundidade. Para genes sem efeitos prejudiciais aproximadamente metade dos candidatos deve conter o gene de tipo selvagem, enquanto a outra metade não devem resultar numa banda. Isto corresponde a uma taxa de recombinação homóloga de 50%.
- Segunda PCR de diagnóstico
- Preparação do ADN genómico.
NOTA: O ADN genómico (ADNg) podem ser preparados utilizando dois protocolos diferentes. O primeiro envolve reagentes tóxicos como o fenol e clorofórmio e, portanto, deve ser tratada apenas por investigadores experientes (descritos no 4.2.1.1 4.2.1.5 a), enquanto o segundo pode também ser tratado por menos experientes estudantes (descritos no 4.2.1.6 para 4,2. 1.11). Ambos os protocolos estão trabalhando de forma confiável. Passo 4.2.1.1 é idêntica tanto para PROTOCols.- Inocular 5 ml Yeps-Light com cada candidato e incubar numa roda rotativa, durante 24 horas a 28 ° C. Queda de 2 ul da cultura sobre uma placa de CM. Manter a cultura estéril.
NOTA: A seguir é um protocolo padrão (ATENÇÃO: passos tóxicos). - Coloque 1 colher (~ 200 mL) de esferas de vidro HCl-lavada para tubos de 2 ml. Adicionar 2 ml de U. cultura maydis. Girar 12000 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante (pelete pode ser congelado nesta fase). Adicionar 500 ul de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25: 24: 1) para o sedimento. CUIDADO! O fenol é tóxico!
- Adicionar 500 ul Usti-lise-buffer 1. Agitar durante 6 a 10 min em um Vibrax a 1.000 rpm. Verificar se o sedimento de células foi ressuspenso completamente, mas evitar estendida agitação para evitar a ruptura do ADNg. Girar a 12.000 xg por 15 min. Transferir 400 ul da fase aquosa para o novo tubo de reacção (não toque na interfase).
- Adicionar 1 ml de 100% (v / v) de etanol. Inverta as 3x tubo para misturar, observar o calta de DNA que logo aparece. Girar a 12.000 xg por 5 min. Remover o sobrenadante e lava-se com 200 ul de EtOH a 70%. Não ressuspender o sedimento em esta fase.
- Remover o sobrenadante completamente (não deixe que o pellet secar completamente). Adicionar 50 ul de TE / RNase. Dissolver ADNg por agitação a 400 rpm a 50 ° C durante 10 min. Analise 2 ul do ADNg num gel de agarose a 0,8% 20.
NOTA: Os passos abaixo compreendem um protocolo não-tóxico alternativo.
- Inocular 5 ml Yeps-Light com cada candidato e incubar numa roda rotativa, durante 24 horas a 28 ° C. Queda de 2 ul da cultura sobre uma placa de CM. Manter a cultura estéril.
- Preparação alternativa de DNA genômico
- Coloque 1 colher (~ 200 ul) de HCl lavada esferas de vidro para tubos de 2 ml. Adicionar 2 ml de U. cultura maydis e centrifugação a 12.000 xg por 5 min. Elimine o sobrenadante (peletes pode ser congelado nesta fase).
- Adicionar 500 ul de tampão de lise Usti 2 ao peletizado. Agita-se durante 5 a 15 min num Vibrax a 1.000 rpm. Verificar se o sedimento de células foi ressuspenso completamente.
- Incubar os tubos a 65 ° C durante 15 a 20 min. usando approincubadoras adequadas destinadas a acolher tubos de 2 ml é crítica. Em seguida, colocá-lo em gelo por 5 min.
- Adicionar 100 ul de 8 M de acetato de potássio, de vórtice ou inverter 8 a 10 vezes. Girar 12.000 xg durante 15 min à temperatura ambiente.
- Transferir 500 ul do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e adicionar 400 uL de isopropanol. Vortex ou invertido de 8 a 10 vezes. Girar 12.000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante e lava-se com 500 ul de EtOH a 70%. Girar 12000 xg durante 5 min.
- Mergulhe off sobrenadante completamente! Eventualmente, adicione uma breve centrifugação (10 seg) para remover o líquido residual. Deixar o sedimento de DNA seco durante 3 a 5 min. Adicionar 50 ul de TE / ARNase e incubar a 50 ° C durante 10 a 15 min a 400 rpm.
- PCR
- Design dois pares de iniciadores com um deles ligação fora dos flancos e a correspondente uma ligação no interior da cassete de resistência (F-f, V-R; RC-F, DF-R, A Figura 1) 9.
- Use 1 ul de uma diluição do ADNg de cada c 1:10andidate como um modelo em reacções de PCR 2 verificar a inserção correcta a montante ea jusante 9.
- Use reações de PCR padrão para cada candidato e analisar fragmentos 22 resultante.
NOTA: Estes PCRs para testar a inserção da cassete de resistência no locus genómico correcto. Se os produtos são obtidos para ambos os lados, o candidato é provável uma inserção correcta. No entanto, também os candidatos que poderiam ser confirmados apenas um lado (a montante ou a jusante) deve ser realizada ao longo de uma análise mais aprofundada no caso de reações de PCR simplesmente falhou por um flanco.
- Preparação do ADN genómico.
- Verificação de Inserção Genomic correta por Southern Blot Analysis 22
- Digest 15 ul de ADNg (4.2.1) dos candidatos mutantes e a estirpe de tipo selvagem correspondentes / progenitora com uma enzima apropriada que corta fora do locus / construir e, além disso, cortes, quer no gene ou na cassete de resistência à levando a claramente distinguishable padrões (Figura 1) 8.
NOTA: Nenhuma das bandas esperadas deve ser maior que 10 kb, de modo que eles se distinguem claramente dos DNA não digerido. - Use a montante ea jusante do flanco como sondas. Para identificá-los, por exemplo, utilizar o kit de rotulagem PCR DIG ou qualquer método padrão similar. Misturar as sondas marcadas em uma proporção de 1: 1 molecular e realizar a transferência de Southern. Mantenha pelo menos dois transformantes corretas independentes.
NOTA: O padrão de tipo selvagem deve ser claramente detectável na estirpe original e os clones corretos devem conter apenas as bandas esperadas. bandas adicionais só presentes nos candidatos indicar outras inserções da construção em um local errado. Tais clones devem ser descartados. O candidato negativo identificado na primeira PCR de diagnóstico devem conter as bandas de tipo selvagem e as bandas (imprevisíveis em tamanho) da construção de eliminação erradamente integrado.
- Digest 15 ul de ADNg (4.2.1) dos candidatos mutantes e a estirpe de tipo selvagem correspondentes / progenitora com uma enzima apropriada que corta fora do locus / construir e, além disso, cortes, quer no gene ou na cassete de resistência à levando a claramente distinguishable padrões (Figura 1) 8.
- Os estoques de glicerol
NOTA: stocks glicerol servem para manter os clones por anos em coleções de tensão. Pelo menos dois transformantes independentes deve ser mantido para cada mutante. Isto permite que comparam fenótipos que devem ser idênticos.- Cresça 5 ml de culturas de estirpes mutantes confirmados em Yeps-luz numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C Misturar 500 mL de cada cultura com 500 ul NSY-glicerol-forma. Inverta tubo até que a cultura e médio são bem misturados. Do glicerol no meio impede a formação de cristais de gelo.
- Congelar a -80 ° C. Re-raia uma parte da cultura congelada para testar se o estoque é funcional.
5. fenótipos microscópicas
- Cresça 5 ml de culturas de tipo selvagem e estirpes mutantes em Yeps-luz numa roda rotativa durante 12 horas a 28 ° C.
- No dia seguinte, dilui-se a cultura a uma DO600 de cerca de 0,1 e crescer até uma OD 600 entre 0,5 e 0,7. Uma OD600 de 1,0 correspgundos para cerca de 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml.
- Inspecione a morfologia das células ao microscópio.
NOTA: Healthy células aparecem em forma de charuto (Figura 4, WT). vacúolos pronunciados ou a formação de filamentos indicam que as células estão estressados.
NOTA: Dependendo do fenótipo mutante esperado, a análise pode ser adaptado, por exemplo, se as estirpes repórter são utilizados no ensaio apropriada pode ser levada a cabo nesta fase. Se a morfologia das células é mudado análise estatística deve ser conduzido, por exemplo, para determinar o comprimento médio de célula.
Ensaio 6. Infecção
NOTA: O ensaio de infecção de plântulas foi visualizado anteriormente nesta revista 11. Ela pode ser levada a cabo usando, um fundo estirpe haplóide solopathogenic tais como SG200 10 ou através da mistura de parceiros de acasalamento compatíveis que são ambos portadores da mutação.
- Crescer pelo menos 40 plântulas de milho porestirpe por 7 dias de um ciclo de luz de 16 horas, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (dia / noite). Eles devem estar na fase de 3 folhas e 10-15 cm de altura, no dia da infecção.
- Dois dias antes da infecção, iniciar uma pré-cultura das estirpes em 5 ml Yeps-Light numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C. Crescer uma cultura principal, em 50 ml Yeps-Light até DO600 = 1,0 (divisão celular rate = 2 horas, permitir que 3 divisões mínimo, pode ser feito O / N).
- Girar as células de cultura de 50 ml a 1500 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Lavar 3x com H 2 O. estéril Ressuspender as células em H 2 O esterilizada para uma DO 600 de 3,0. Se necessário, misturar os parceiros de acasalamento.
- Injectar 250 - 500 ul das suspensões de células para a haste de 7 dias de idade plântulas de milho que utilizam uma pequena seringa. Use H 2 O estéril como controle. Manter mudas infectadas durante um período adicional de 7-14 dias nas mesmas condições de luz e temperatura. Marcar o fenótipo de cada planta umaegundo saudável, clorose, formação de antocianina, pequenos tumores, tumores grandes, plantas mortas 10.
NOTA: A pontuação pode ser feita tão cedo como 7 dias e repetida aos 14 dias a seguir a infecção ao longo do tempo.
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Representative Results
As construções de deleção para todos os quatro genes codificados no quitinolíticas U. maydis genoma foram gerados pela Golden Gate clonagem de utilizar a cassete hygR para eliminação de cts1, o NATR para eliminação de CTS2, a cassete G418R pela exclusão de cts3 eo cbxR para eliminação de cts4 20. Um visão geral da estratégia de substituição genética é exemplificada pela eliminação de cts3 (Figura 1). Mutantes simples e duplos de cts1 com um segundo gene quitinolítica foram gerados sequencialmente com as mesmas construções em dois fundos genéticos diferentes para a análise do papel de quitinases na virulência. Dois diferentes origens de tensão foram empregados: AB33 permite a indução do crescimento filamentosos, o primeiro passo para patogenicidade 23, SG200 é uma cepa de solo-patogênico que permite rápida da doença marcando 10 cts3 -deletion construir no fundo estirpe adequada, colónias individuais da segunda placa de selecção foram testadas para a supressão correcta por PCR de diagnóstico (Tabela 1) e de Southern blot (Figura 3). Curiosamente, para cts3 a taxa de recombinação homóloga foi muito maior no SG200 do que em AB33, mas essa diferença não foi consistentemente observada em eliminações das outras quitinases.
A estirpe de verificação rigorosos garante uma única inserção da deleção a construção na posição desejada. No entanto, a modificação adicionais, tais como mutações pontuais pode passar despercebido, o que pode induzir em erro a interpretação de fenótipos. Por conseguinte, pelo menos, dois transformantes independentes são fenotipados.
FIG ure 1. Visão geral da estratégia de eliminação exemplificado por cts3. Esta visão esquemática inclui a eliminação construir com o flanco ascendente (UF), flanco jusante (DF), e a cassete de resistência geneticina (G418R), o locus genómico de tipo selvagem (WT ) e mutante de deleção cts3 e todos os iniciadores, bem como os locais de restrição utilizados na verificação estirpe. Os primeiros resultados de PCR em um produto de diagnóstico apenas se a cópia do gene de tipo selvagem está presente, as duas reacções de PCR de diagnóstico segundo resultar em produtos, se a cassete de resistência tenha sido correctamente integrado. Para a transferência de Southern do ADN genómico é digerido com PstI, as sondas abrangem o UF e DF (barras vermelhas) que conduz à detecção de uma banda de 6,7 kb de tipo selvagem e duas bandas de 5,6 kb e 2,0 kb no mutante. Além disso, a sonda DF reconhece fracamente um produto de 2,6 kb. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. verificação microscópica do protoplasting reação. (A) células de tipo selvagem não tratados (FB2) aparecem em forma de charuto. (B) Por tratamento com enzimas que degradam a parede celular (aqui por, durante 30 min), o aparecimento de esferas redondas em uma extremidade (s) e barra de sino como estruturas (b) indica que a degradação da parede celular foi iniciado. Finalmente os protoplastos são completamente rodada (R), que é devido à falta de parede celular. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Fig Ure 3. Southern blot de ADN genómico cts3 eliminação. Foi digerido com PstI. Ambos os flancos foram marcados, misturados em proporções equimolares e utilizado como uma sonda única. No SG200 tipo selvagem e deleções do cts1 quitinases e CTS2, uma única banda de 6,7 kb foi detectado. Em eliminações cts3 (G e K), duas bandas de 5,6 kb e 2,0 kb são visíveis indicativo da eliminação correta de cts3. Uma banda adicional de 2,6 kb pode ser visualizada por exposição excessiva maciça. Isto corresponde a um fragmento que é reconhecido por uma sobreposição de apenas 100 pb da sonda flanco jusante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Algumas mutações levam a defeitos de crescimento óbvio que pode ser detectado microscopicamente. Nos eliminações quitinase, mutantes simples não exibirqualquer defeito evidente, enquanto cts1 / 2 duplos mutantes mostraram uma separação pronunciada defeito célula 20. Coloração de septos mostrou que citocinese foi concluída, mas as células permaneceram susceptíveis ligado através de quitina residual (Figura 4 a partir de Langner et al. 2015). Um fenótipo de crescimento microscópica semelhante é conhecido para a eliminação de khd4 24, um gene que codifica uma proteína de ligação a ARN mediar rotatividade ARN pós-transcricional de genes envolvidos na morfologia e patogenicidade 25.
Figura 4. A análise microscópica de mutantes de deleção. A morfologia celular e septo formação das estirpes de deleção de quitinase. Cts1 / 2 ô estirpes exibem um defeito de separação de células e formar grandes agregados, o que não é devido a uma falta de formação de septos. Primário e secundárioseptos (ver alargamento 5x em inserções) foram coradas com calcofluor Branco (CW) antes da microscopia. Barras de escala = 10 uM. Este valor é reproduzido com permissão de Langner et al. 2015 Célula eucariótica 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para testar a contribuição de quitinases à virulência, ensaios de infecção de plântulas foram realizadas utilizando os mutantes na estirpe de fundo SG200. Enquanto mutantes em khd4 foram reduzidos na virulência, eliminação das quitinases não afectou a infecção de plântulas de milho (Figura 5) 20,25.
Figura 5. Ensaio de Infecção de mutantes de deleção. Doença de classificaçãoplântulas de milho 9 dias após a infecção com o respectivo U. maydis estirpes. (A) macroscópicas sintomas que são usados para marcar doença. (B) dois transformantes independentes foram testados para cada estirpe (N> 100). Todos os mutantes quitinase com deficiência (1/2 / 3Δ: endochitinases mutantes triplos, 4Δ: único mutante N-acetilglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: mutantes quadruple) infectado da planta hospedeira, levando à formação de tumores pesado como observado em infecções de tipo selvagem com o SG200 estirpe solopathogenic. Em contraste, uma estirpe possuindo uma deleção do gene que codifica a proteína de ligação a ARN Khd4 foi reduzido em virulência como relatado anteriormente 24. As barras de erro indicam o desvio padrão de três experiências independentes. Este valor é modificado com a permissão de Langner et al. 2015 Célula eucariótica 20. Por favor clique aqui para ver um grander Versão desta figura.
| fundo genético | 1º diagn. PCR (excluídos / testado) | 2 diagn nd. PCR (confirmado / testado) | do sul (confirmado / testado) | % Recomb. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabela 1:. Verificação Strain para exclusões cts3 O cts3 gene quitinase foi eliminado em quatro origens genéticas diferentes para permitir estudos de crescimento filamentosos (AB33) e infecção (SG200) em eliminações simples e múltiplas.
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Discussion
Este protocolo descreve como gerar mutantes de deleção para estudos de genética inversa em U. maydis. O ponto de partida é uma construção de deleção que contém sequências que flanqueiam o gene de interesse que contém sequências de cerca de 1 kb a montante do início e a jusante do codão stop, assim como uma cassete de resistência adequada, tal como foi previamente optimizado 7,9 . As construções têm que ser gerados individualmente para cada gene e cuidadosamente verificada por erros de sequência antes de eliminar o gene. As mutações pontuais nos flancos pode causar alterações indesejáveis na sequência genómica, em particular se os flancos chegar no gene vizinho ou a mutação modifica elementos reguladores. Isso afetaria todos os transformantes e pode causar fenótipos e efeitos colaterais não relacionados com a deleção do gene desejado.
Ao planejar a estratégia de eliminação, o fenótipo esperado tem de ser considerado para escolher o fundo genético. No presente caso, AB33 23 e SG200 10 foram escolhidos para permitir testar os fenótipos na infecção morfológica interruptor e vegetal. Da mesma forma, muitos outros read-outs podem ser de interesse, por exemplo, fusões com cts1 são empregados na exportação de proteínas heterólogas 14,26, e um fundo de tensão com fluorescente etiquetado rrm4 permite a análise do transporte de RNA em endossomas 27,28.
Durante a verificação de tensão, as reacções de PCR de diagnóstico de alto rendimento permitir uma rápida redução do número de candidatos a ser testados no Southern blot bastante trabalhoso. Em particular, o primeiro PCR de diagnóstico permite a exclusão de candidatos contendo ainda a cópia de tipo selvagem do gene e, assim, impede a utilização maciça de fenol tóxico em preparações ADNg. Num caso normal com um gene não essencial, aproximadamente metade das colónias pode conter o gene de tipo selvagem. Este pré-triagem pode ser de grande interesse para genes com fenótipos de crescimento potencialmente prejudiciais. Centenas de candidatos podem ser rapidamente rastreados.
Se todos os candidatos conter a cópia de tipo selvagem, a deleção do gene é mais provável letal. Isto pode ser confirmada por exclusão de uma cópia de uma estirpe diplóide de fundo (por exemplo, D132) e análise da segregação após germinação teliósporos 29. Alternativamente, uma estratégia de deleção condicional utilizando um promotor indutível pode ser escolhida para seguir o fenótipo mutante. No entanto, também a contaminação resultante do método baseado em NaOH em bruto para a preparação ADNg pode interferir com a PCR e levar a falsos-negativos, ou seja, os candidatos não mostram uma banda e, por conseguinte, são mantidas muito embora contenham o gene. Isto pode ser excluída, testando um gene de controlo com um produto de tamanho comparável numa reacção de PCR independentes ou por multiplex-PCR com os dois iniciadores de síntese e iniciadores específicos para o gene para um gene de controlo que resultam num fragmento maior.
conteúdo "> Se um mutante já está disponível, por exemplo, cts1 Δ 30 ou Δ rrm4, geração estirpe de versões marcadas pode ser acelerada através da substituição da cassete de resistência à deleção do gene (por exemplo hygR) no genoma com uma nova construção que contém, por exemplo, a rrm4 marcado por fluorescência e um marcador de resistência diferente (por exemplo NATR). neste caso, os transformantes podem ser rastreadas pela perda do marcador de resistência inicial 9. candidatos correctos são resistentes apenas contra o novo antibiótico (nourseothricin) e perderam a sua resistência inicial (higromicina ). Além disso, a complementação do fenótipo mutante em trans pode ser realizada para verificar a funcionalidade das construções marcadas 30,31.A estratégia de deleção do gene e modificação aqui descrita oferece uma ferramenta confiável e exata na análise genética de U. maydis. Para várias eliminações No entanto, a tensão generação pode obter demorado, uma vez que as alterações devem ser realizadas sequencialmente. Portanto, como uma ferramenta complementar, no ano passado o sistema CRISPR-Cas foi estabelecida para U. maydis 32. Ele oferece a possibilidade de interromper vários genes simultaneamente e é uma excelente adição à caixa de ferramentas genético de U. maydis.
Em resumo, o protocolo para a manipulação genética e U. maydis geração de tensão descrito aqui é um método robusto que tem sido amplamente utilizada na comunidade há anos. Juntamente com o conjunto abrangente de módulos de cassetes respectiva resistência permite que todos os tipos de engenharia genética neste fungo, abordando diversas questões que vão do básico ao pesquisa aplicada.
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Acknowledgments
Um agradecimento especial ao Dr. Benedikt Steuten para a leitura crítica do manuscrito. O trabalho original sobre as quitinases foi realizada pelo Dr. Thorsten Langner. O laboratório de VG é suportado pelo Cluster de Excelência em Ciências Vegetais (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, o laboratório de KS é suportado por BioSC. KB é suportado por BioSC. As atividades científicas do Science Center Bioeconomy (BioSC) foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da Inovação, Ciência e Investigação no âmbito do NRW Strategieprojekt BioSC (No. 313 / 323-400-00213). LF é apoiado por uma bolsa de doutoramento da DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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