Summary
Vi beskriver en robust gen ersättningsstrategi för att genetiskt manipulera smut svampen Ustilago maydis. Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter att undersöka infektion fenotyper. Den kan förlängas för att modifiera gener på något önskat sätt, t ex, genom att lägga till en sekvens som kodar för ett fluorescerande protein tagg.
Abstract
Gendeletion spelar en viktig roll i analysen av genfunktion. En av de mest effektiva metoder för att störa gener i ett målinriktat sätt är utbyte av hela genen med en selekterbar markör via homolog rekombination. Under homolog rekombination sker utbyte av DNA mellan sekvenser med hög likhet. Därför kan linjära genomiska sekvenser som flankerar en målgen användas för att specifikt rikta en selekterbar markör till den önskade integrationsstället. Trubbiga ändar deletionskonstruktionen aktiverar cellens DNA-reparationssystem och därigenom främja integrationen av konstruktionen antingen via homolog rekombination eller genom icke-homolog-end-medlemskap. I organismer med effektiv homolog rekombination, kan hastigheten för framgångsrik gendeletion uppgå till mer än 50% vilket gör denna strategi ett värdefullt genavbrott system. Den smuts svampen Ustilago maydis är en eukaryot modell mikroorganism som visar sådan effektiv homolog recombinatJon. Av dess cirka 6900 gener, många har funktionellt karakteriseras med hjälp av deletionsmutanter och upprepad underlåtenhet av genen ersättningsförsök pekar på grundläggande funktion av genen. Efterföljande karakterisering av genfunktion genom att märka med fluorescerande markörer eller mutationer av förväntade domäner bygger också på DNA-utbyte via homolog rekombination. Här presenterar vi U. maydis stam generation strategi i detalj med hjälp av det enklaste exemplet, den gendeletion.
Introduction
Ustilago maydis är en fytopatogena modell svamp som har studerats ingående i årtionden 1,2. Den finns i två morfologier, en jäst-liknande, icke-patogena scen och en fintrådiga, smittsam blankett 3. Universella genombrotts upptäckter såsom homolog rekombination och DNA-reparationsmekanismer gjordes i den jästliknande tillväxten skede av denna svamp 4. Dessutom är den morfologiska övergång till infektions glödlampor och virulensfaktorer viktiga för infektion väl karakteriserad 5,6. Den ökande molekyl kunskap om biologi och virulens denna smut svamp bygger på en enkel gen ersättningsstrategi 7-9 stöds av en utmärkt genom anteckning 10 och enkel omvänd genetik att använda, till exempel, den välorganiserade plasmid samling på vårt institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserade, snabba infektionsanalyser i majs seedlings tillåta detaljerade studier av patogenicitet faktorer 11.
Genomet hos U. maydis innehåller cirka 6900 gener 10. Att studera deras funktion, kan de tas bort individuellt eller i kombination på grund av att en effektiv homolog rekombination system. Flankerande regioner av ca 1 kb innehållande perfekt homologa ändar är idealiska för hastigheter av homolog rekombination som är större än 50%, men redan 250 bp med icke-homologa ändarna tillåter en viss grad av korrekt integrering av konstruktionen 9. För närvarande fem olika motstånds kassetter, hygR, cbxR, natR, G418 ^ och phleoR medla motstånd mot hygromycin, karboxin, nourseothricin, G418 och fleomycin, används för att selektera för transformanter 7,9. Dessutom har hygromycinresistens utvecklats till en återvinnings kassett (FRT-hygR) som kan avlägsnas genom övergående uttryck av en heterolog FLP rekombinas 12. Detta möjliggör avlägsnande av motstånd kassett och därmed i teorin obegränsat genetiska modifieringar. Fleomycin är mutagent 13, så att med de nya kassetterna, i synnerhet återvinningsbart hygR kassetten, användning av phleoR minskar. Fyrdubbla mutanter kan således genereras genom användning av de andra fyra kassetter, men för quintuple mutanter, är FRT-hygR rekommenderas en 14.
Denna allmänna strategi gendeletion har överförts till andra smuts svampar såsom Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, eller U. esculenta 17 och därmed ger möjlighet till ytterligare applikationer i ännu genetiskt svår organismer med en effektiv homolog rekombination systemet. Dessutom kan organismer som saknar homolog rekombination vara modifierad för att förbättra genteknik såsom exemplifieras av deletionen av gener som är involverade i icke-homolog-end-gå med i Neurospora crassa 18,19.
Här beskriver vi den publicerade gendeletion strategi för U. maydis 7,9 i experimentell detalj med fokus på snabb och noggrann kontroll av kandidaterna. Som ett exempel använder vi svamp kitinaser och skildrar generering av enstaka mutanter liksom flera radering stammar 20,21. Kitinaser är intressanta exempel, eftersom de agerar på kitin i den styva cellväggen. Cellväggen ombyggnad krävs för morfologiska förändringar under celldelning, byta till fintrådiga tillväxt och sporbildning. Således, för deletionsmutanter fenotyper i hela livscykeln kan förväntas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av deletionskonstruktioner
- Generera en plasmid som innehåller deletionskonstruktionen (figur 1) innefattande en respektive 1 kb uppströms flanken (UF) och nedströms flank (DF) var och en och den lämpliga motstånd kassetten flankerad av trubbiga skärrestriktionsställen.
OBS: Alla kloningsstrategi kan användas (för kloning se referens 22) vi rekommenderar Golden Gate kloning för sådana plasmider 9. - Excidera rader konstruera från plasmiden med användning av en trubbig fräs för erhållande av en | j, g DNA av deletionen konstruera 9. Rena deletionskonstruktionen att eliminera enzym och buffert 22 till exempel genom att använda kommersiella reagens och följa tillverkarens instruktioner.
OBS! Vektorryggraden kan förbli i transformationsblandningen.
2. Framställning av protoplaster
OBS: Håll sterila förhållanden under alla tider på eXperiment. Cellväggen är en starkt skyddande barriär som begränsar tillgången av molekyler till plasmamembranet. För att tillåta upptagning av DNA innehållande deletionskonstruktionen måste cellväggen för att avlägsnas genom cellväggnedbrytande enzymer i en protoplasting reaktion. Kritiska steg i protoplast preparat är en) osmotisk stabilisering av mediet och 2) att undvika mekanisk påfrestning på protoplastema.
- Mark 2 ml rör med en rund botten att frysa protoplasterna och kyla ner dem vid -20 ° C. Starta en pre-kultur i 3 ml YEPS-ljus från en färsk platta av stammen med den önskade genetiska bakgrunden. Inkubera på ett roterande hjul under 24 h vid 28 ° C.
OBS: Stammen kan vara solopathogenic stammen SG200 10, vild typ stammar, teststammar såsom AB33 23, eller någon mutant bakgrund för generering av dubbla mutanter. Se till att stammen är fri från det önskade motståndet. - Späd kulturen i 50 ml YEPS-ljus i ett avsmalnande blinkak och inkubera på en orbital skakanordning vid 28 ° C med 200 rpm.
OBS: fördubblingstiden är ca 2 h för vildtyp-stammar. Tillåt minst tre dubbel. - Växa tills exponentiella fasen. Säkerställa att den optiska densiteten, uppmätt vid en våglängd av 600 nm (OD 600), är cirka 0,8 (0,6-1,0 är godtagbart). En OD 600 av 1,0 motsvarar ca 1 till 2 x 10 7 U. maydis celler per ml.
- Kontrollera cellerna för kontaminering under ett mikroskop. Använd 40x förstoring. Pelletera cellerna i den fullständiga 50 ml odling i 5 min, 1500 x g och kasta supernatanten. Suspendera pelleten i 25 ml natriumcitrat, sorbitol lösning (SCS), centrifugera 5 min, 1500 XG, och kassera supernatanten.
OBS: Bakteriella föroreningar kan identifieras som små och ofta rörliga celler. Svamp föroreningar kan identifieras baserat på en annan cell form eller storlek jämfört med cigarrformade celler av U. maydis. - under centrifugation förbereda protoplasting lösning (12,5 mg / ml Trichoderma lyse enzymer, i SCS, förbereda 3 ml per cell pellet, filter sterilisera genom ett 22 um filter, lösningen måste vara frisk för optimal enzymatisk aktivitet). SCS är en osmotisk stabilisator för att förhindra bristning av protoplast vid avlägsnande av cellväggen.
- Återsuspendera pelleten i 2 ml protoplasting lösning. Inkubera under 5 till 20 min vid RT och kontrollera under mikroskop tills 30 till 40% av cellerna är runda eller liknande knappnålshuvuden (figur 2).
OBS: Utför alla steg på is från och med nu och hantera protoplaster med omsorg! - Tvätta 3x i 10 ml kall (4 ° C) SCS, centrifugera vid 1000 xg under 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 10 ml kall sorbitol, TrisHCl, CaCl2-lösning (STC), centrifugering vid 1000 x g under 5 min, kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 1 ml kall STC, göra 100 pl alikvoter i de kylda rören. Frysa alikvoter vid -80 ° C tills vidare användning.
3. Transformation av U. maydis
OBS: Omvandlingen av U. maydis protoplaster är beroende av polyetylenglykol (PEG) -medierad transformationsmetod, som är tekniskt enkel och motsatt elektroporering eller biolistisk transformation kräver inte specialutrustning.
- Framställa de två-skiktade selektionsplattor (2 plattor per transformationsreaktionen). Bottenskiktet innehåller antibiotika i en fördubblad koncentration. Pipet 12 ml RegLight innehållande 400 | ig / ml hygromycin (eller 300 ^ g / ml nourseothricin eller 4 | ig / ml karboxin eller 1 mg / ml G418) i en petriskål. Undvika bubblor.
OBS: Bottenskiktsplattor kan lagras ett par dagar vid 4 ° C, men förbereder det översta lagret nyligen under omvandling (se nedan). - Tina protoplaster på is (1 tub / omvandling). Lägg 1 il heparin (15 mg / ml). Tillsätt 1 mikrogram DNA (linjäriserad konstruktion) eller 10 pl H2O
- Under denna tid, för det övre skiktet sprids 12 ml kondenserad RegLight (koka och kyl till 60 ° C) på RegLight bottenplattan.
OBS: Detta skikt innehåller inte antibiotika. - Tillsätt 500 | il STC / PEG (polyetylenglykol) till omvandlingen röret (3. 2) och blanda försiktigt genom att vända röret. Inkubera 15 minuter på is.
- Fördela varje omvandling reaktion på två av de två skiktade RegLight plattor. Sprid försiktigt och långsamt med ett glas pipett. Inkubera plattorna upprätt vid 28 ° C under 5 till 7 dagar tills transformanter växa som kolonier. Skaffa cirka 100-200 kolonier per platta.
OBS: Lägre siffror kan orsakas av "dåliga" protoplaster som antingen innehåller alltför mycket cellväggen och därför kan inte ta upp DNA eller kan inte återhämta sig. Den förstnämnda kan testas genom transformation med en självreplikerande plasmid, det senare genom att testa regenerering på plattor utan antibiotika. <li> Förbered YEPS-Light-plattor innehållande det lämpliga antibiotikumet vid 200 | ig / ml hygromycin (eller 150 ^ g / ml nourseothricin eller 2 | ig / ml karboxin eller 500 | j, g / ml G418; dessa koncentrationer lika hälften av den som används för bottenplattor). Åter rena minst 24 förmodade trans kolonier på dessa plåtar. Enstaka kolonier bör erhållas. Samtidigt strimma ut den ursprungliga stammen på icke-selektiva medier.
OBS: Plattorna kan lagras vid 4 ° C under 1-2 veckor.
4. Kontroll av korrekt Deletion Events
OBS: Mutationerna kontrolleras i ett förfarande i tre steg (figur 1). Först är kandidater som innehåller vildtyp-kopia av genen uteslutas genom PCR. För det andra, är integreringen av motståndet kassetten i lokuset verifierades genom PCR. För det tredje är en integrering av det motstånd kassetten endast till den önskade lokuset verifierades genom Southern blot-analys. Noggrann stam verifiering är essential, så att muterade fenotyper verkligen korrelerar med borttagningen.
- Första diagnostisk PCR 20
- Design primers parning i genen som ska raderas som resulterar i en produkt av 250-600 bp (Figur 1). Sådana små produkter är lätta att amplifiera i en koloni-PCR, och tillräckligt länge för detektering i standard-elektrofores.
- För varje kandidat och den ursprungliga stammen som en positiv kontroll, resuspendera lite (mängd ett knappnålshuvud) av cellmaterial av en enda koloni med en tandpetare i 20 | il 0,02 M NaOH. Inkubera vid RT i 30 min.
OBS: Använd färska kolonier. Om plattorna är äldre än en vecka åter strimma till erhållande av en färsk koloni. - Använda 1 ni av cellsuspensionen för PCR omedelbart. Köra en standard PCR-reaktion och analysera resulterande fragmenten.
OBS: Dessa prover kan inte lagras.
OBS: Denna PCR-test för närvaro av vildtyp-genen och därmed möjliggör snabb identifiering av negativa goidates där genen av intresse inte har bytts ut. Kloner som ger band i denna PCR-reaktion kommer att kasseras. En sådan negativ klon bör ändå göras tillsammans som en ytterligare negativ kontroll. Kandidater utan en PCR-produkt måste analyseras ytterligare. För gener utan skadliga effekter ungefär hälften av de kandidater bör innehålla den vildtyp-genen, medan den andra hälften inte bör resultera i ett band. Detta skulle motsvara en homolog rekombination hastighet av 50%.
- Andra diagnostisk PCR
- Framställning av genomiskt DNA.
OBS: Genomiskt DNA (gDNA) kan framställas med användning av två olika protokoll. Den första handlar om giftiga reagenser som fenol och kloroform och därmed bör behandlas enbart av erfarna forskare (som beskrivs i 4.2.1.1 till 4.2.1.5) medan andra även kan hanteras av mindre erfarna studenter (som beskrivs i 4.2.1.6 till 4,2. 1,11). Båda protokollen arbetar tillförlitligt. Steg 4.2.1.1 är identisk för både protocoler.- Inokulera 5 ml YEPS-Light med varje kandidat och inkubera på ett roterande hjul under 24 h vid 28 ° C. Drop 2 pl av kulturen på en cm platta. Förvara odlingen sterila.
OBSERVERA: Följande är ett standardprotokoll (FÖRSIKTIGHET: giftiga steg). - Sätt en skopa (~ 200 l) av HCI-tvättade glaspärlor till 2 ml rör. Tillsätt 2 ml av U. maydis kultur. Snurra 12.000 xg under 5 min. Kassera supernatanten (pellet kan frysas i detta skede). Tillsätt 500 | il fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) till pelleten. FÖRSIKTIGHET! Fenol är Toxic!
- Tillsätt 500 l Usti-lys-buffert 1. Skaka för 6-10 min på en Vibrax vid 1000 rpm. Verifiera att cellpelleten är helt återsuspenderade, men undvika förlängd skakning för att förhindra skjuvning av gDNA. Snurra vid 12.000 xg under 15 min. Överför 400 | il av vattenfasen i den nya reaktionsröret (inte röra inter).
- Tillsätt 1 ml 100% (v / v) etanol. Vänd röret 3x att blanda, observera chögt av DNA som inom kort visas. Snurra vid 12.000 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och tvätta med 200 pl 70% EtOH. Behöver inte återsuspendera pelleten i detta skede.
- Avlägsna supernatanten fullständigt (låt inte pelleten torka helt). Tillsätt 50 pl TE / RNas. Upplösa gDNA genom skakning vid 400 rpm vid 50 ° C under 10 min. Analysera 2 pl av gDNA på en 0,8% agarosgel 20.
OBS: Stegen nedan innefattar en alternativ ogiftig protokollet.
- Inokulera 5 ml YEPS-Light med varje kandidat och inkubera på ett roterande hjul under 24 h vid 28 ° C. Drop 2 pl av kulturen på en cm platta. Förvara odlingen sterila.
- Alternativ framställning av genomiskt DNA
- Sätt en skopa (~ 200 l) av HCI tvättade glaspärlor till 2 ml rör. Tillsätt 2 ml av U. maydis kultur och centrifugering vid 12.000 xg under 5 min. Kassera supernatanten (pellets kan frysas i detta skede).
- Tillsätt 500 | il Usti Lysbuffert 2 till pelleten. Skaka i 5 till 15 minuter på en Vibrax vid 1000 rpm. Verifiera att cellpelleten är helt återsuspenderade.
- Inkubera rören vid 65 ° C under 15 till 20 min. med användning av lämplämpliga inkubatorer utformade för att vara värd för 2 ml rör är kritisk. Sedan placera den på is i 5 minuter.
- Tillsätt 100 pl 8 M kaliumacetat, virvel eller invertera 8 till 10 gånger. Snurra 12.000 xg under 15 min vid RT.
- Överföring 500 pl av supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 400 pl isopropanol. Vortex eller invertera 8 till 10 gånger. Snurra 12.000 xg i 15 min. Avlägsna supernatanten och tvätta med 500 pl 70% EtOH. Snurra 12.000 xg under 5 min.
- Blöt off supernatanten helt! Slutligen, lägg till en kort centrifugering (10 sek) för att avlägsna kvarvarande vätska. Låt DNA-pelleten torka i 3-5 min. Tillsätt 50 pl TE / RNAas och inkubera vid 50 ° C under 10 till 15 minuter vid 400 rpm.
- PCR
- Konstruktion två primerpar med en av dem bindande utanför flankerna och motsvarande en bindning inom motstånd kassett (UF-f, RC-r; RC-f, DF-r, figur 1) 9.
- Använd 1 | il av en 1:10 utspädning av gDNA av varje cKANDIDAT som en mall i 2 PCR-reaktioner kontrollera korrekt insättning uppströms och nedströms 9.
- Använda vanliga PCR-reaktioner för varje kandidat och analysera resulterande fragment 22.
OBS! Dessa PCR testet för insättning av motståndet kassetten i korrekt genomiska lokuset. Om produkter erhålls för båda sidor, är kandidaten sannolikt en korrekt isättning. Dock bör också kandidater där endast en sida (uppströms eller nedströms) kunde bekräftas föras tillsammans för vidare analys i fall som PCR-reaktioner helt enkelt misslyckats för en flank.
- Framställning av genomiskt DNA.
- Kontroll av korrekt Genomic Insättning av Southern blot-analys 22
- Smälta 15 pl av gDNA (4.2.1) hos de mutanta kandidater och den motsvarande vildtyp / progenitor-stam med ett lämpligt enzym som skär utanför lokus / konstruera och dessutom skär antingen i genen eller i motståndet kassetten som leder till tydligt distinguishable mönster (Figur 1) 8.
OBS: Ingen av de förväntade banden bör vara större än 10 kb, så att de är klart urskiljbara från osmält DNA. - Använd uppströms och nedströms flanken som sönder. Att märka dem till exempel använda PCR DIG märkning Kit eller liknande standardmetod. Blanda de märkta sonderna i ett 1: 1 molförhållande och utföra Southern blöt. Håll minst två oberoende korrekta transformanter.
OBS: vildtyp mönstret ska vara tydligt detekteras i den ursprungliga stammen och korrekta kloner bör endast innehålla de förväntade banden. Ytterligare band endast är närvarande i kandidaterna indikera andra infogningar av konstruktionen i en felaktig lokus. Sådana kloner ska kasseras. Den negativa kandidat som identifierats i den första diagnostisk PCR bör innehålla vildtyp band och banden (oförutsägbara i storlek) av felaktigt integrerade deletionskonstruktionen.
- Smälta 15 pl av gDNA (4.2.1) hos de mutanta kandidater och den motsvarande vildtyp / progenitor-stam med ett lämpligt enzym som skär utanför lokus / konstruera och dessutom skär antingen i genen eller i motståndet kassetten som leder till tydligt distinguishable mönster (Figur 1) 8.
- glycerolstamlösningar
OBS: Glycerol lager tjänar till att upprätthålla klonerna åratal i stam samlingar. Minst två oberoende trans bör hållas för varje mutant. Detta gör det möjligt att jämföra fenotyper som ska vara identiska.- Väx 5 ml kulturer av de bekräftade mutantstammar i YEPS-Light på ett roterande hjul under 24 timmar vid 28 ° C Mix 500 ul av varje kultur med 500 pl NSY-Glycerol-medium. Vänd röret tills kultur och medel är väl blandade. Glycerol i mediet förhindrar bildningen av iskristaller.
- Frysa vid -80 ° C. Åter strimma en del av den frysta kulturen för att testa om beståndet är funktionell.
5. Mikroskopiska fenotyper
- Växa 5 ml kulturer av vildtyp och mutanta stammar i YEPS-Light på ett roterande hjul för 12 timmar vid 28 ° C.
- Nästa dag, späd kulturen till en OD 600 av cirka 0,1 och växa till en OD 600 mellan 0,5 och 0,7. En OD 600 på 1,0 CORRESPder till ca 1 till 2 x 10 7 U. maydis celler per ml.
- Inspektera cellmorfologin mikroskopiskt.
OBS: Friska celler visas cigarrformat (Figur 4, WT). Uttalas vakuoler eller filamentbildning indikerar att cellerna är stressade.
OBS! Beroende på den förväntade mutantfenotypen kan analysen anpassas till exempel, om reporter stammar används lämplig analys kan utföras i detta skede. Om cellmorfologi ändras statistisk analys bör genomföras, t.ex., för att bestämma den genomsnittliga celllängden.
6. Infektion analys
OBS: plantinfektionsanalysen har visualiseras tidigare i denna tidning 11. Det kan antingen utföras genom att använda en haploid, solopathogenic stam bakgrund såsom SG200 10 eller genom att blanda kompatibla parningspartners som båda bär mutationen.
- Växa minst 40 majsplantor perstam under 7 dagar vid en ljuscykel av 16 timmar, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (dag / natt). De bör vara i 3-bladstadiet och 10-15 cm hög vid infektionsdagen.
- Två dagar före infektion, starta en förodling av stammarna i 5 ml YEPS-Light på ett roterande hjul under 24 timmar vid 28 ° C. Odla en huvudkultur i 50 ml YEPS-Lys upp till OD 600 = 1,0 (celldelningshastigheten = 2 tim, tillåta minst 3 divisioner, kan göras O / N).
- Centrifugera ner cellerna i 50 ml odling vid 1500 xg under 5 min och kasta bort supernatanten. Tvätta 3x med steril H2O Resuspendera cellerna i steril H2O till en OD 600 av 3,0. Om så erfordras, blanda de passande partner.
- Injicera 250 - 500 l av cellsuspensioner i stammen av 7 dagar gamla majs plantor med hjälp av en liten spruta. Använda sterilt H2O som en kontroll. Håll infekterade plantor under ytterligare 7-14 dagar i samma ljus och temperaturförhållanden. Betyg fenotypen av varje växt ennligt frisk, kloros, antocyanin bildning, små tumörer, stora tumörer, döda växter 10.
OBS: Scoring kan göras så tidigt som 7 dagar och upprepades vid 14 dagar för att följa infektion med tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strykningen konstruktioner för alla fyra kitinolytisk gener kodas i U. maydis genom genererades av Golden Gate kloning med hjälp av hygR kassetten för borttagning av cts1, den natR för borttagning av cts2, den G418 ^ kassett för borttagning av cts3 och cbxR för borttagning av cts4 20. En allmän översikt av genersättningsstrategi exemplifieras av strykningen av cts3 (Figur 1). Enkla och dubbla mutanter av cts1 med andra kitinolytisk gen genererades sekventiellt med samma konstruktioner i två olika genetiska bakgrunder för analys av den roll som kitinaser i virulens. Två olika stam bakgrunder användes: AB33 tillåter induktion av fintrådiga tillväxt, är en solo patogen stam som möjliggör snabb sjukdom dödat 10 det första steget mot patogenicitet 23 SG200 cts3 -deletion bygga i lämplig stam bakgrunden ades enskilda kolonier av andra urvalsplåten testas för korrekt raderingen genom diagnostiska PCR (Tabell 1) och Southern blöt (Figur 3). Intressant för cts3 homolog rekombination hastigheten var mycket högre i SG200 än i AB33, men denna skillnad var inte konsekvent observerats i deletioner av de andra kitinaser.
De stränga stammen verifiering garanterar en enda insättning av deletionen konstruera vid den önskade positionen. Emellertid kan ytterligare modifiering såsom punktmutationer förblir oupptäckt, som kan vilseleda tolkningen av fenotyper. Därför är åtminstone två oberoende transformanter fenotypades.
Fikon ure 1. Översikt av deletionen strategi exemplifieras av cts3. Denna schematisk översikt omfattar deletionen konstrukt med flanken uppströms (UF), nedströms flank (DF), och geneticin resistans kassetten (G418 ^), det genomiska lokuset av vildtyp (WT ) och cts3 deletionsmutant och alla primrar samt de restriktionsställen som används i stammen verifiering. De första diagnostiska PCR resulterar i en produkt endast om vildtyp genen kopian är närvarande, de två andra diagnostiska PCR resulterar i produkter om motståndskassetten är korrekt integrerade. För Southern blot det genomiska DNA: t digereras med PstI, sonderna sträcker sig över UF och DF (röda staplar) som leder till detektion av en 6,7 kb band i vildtyp och två band av 5,6 kb och 2,0 kb i den mutanta. Dessutom DF sonden svagt känner igen en 2,6 kb produkt. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikroskopisk kontroll av protoplasting reaktion. (A) Obehandlade vild typ celler (FB2) visas cigarrformat. (B) Vid behandling med cellväggnedbrytande enzymer (till här för 30 min), (b) indikerar uppträdandet av runda sfärer vid en ände (er) och bar-klockliknande strukturer som cellväggen nedbrytningen har startat. Slutligen protoplasterna är helt runda (r), vilket beror på avsaknaden av cellväggen. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Fig ure 3. Southern blöt för cts3 radering. Genomiskt DNA spjälkades med Pstl. Båda flankerna märktes, blandades i ekvimolära förhållanden och användes som en enkel sond. I vildtyp SG200 och deletioner av kitinaser cts1 och cts2, är ett enda band av 6,7 kb detekterades. I cts3 deletioner (g och k), två band av 5,6 kb och 2,0 kb är synliga tecken på rätt strykningen av cts3. Ett ytterligare band på 2,6 kb kan visualiseras genom massiv överexponering. Detta motsvarar ett fragment som känns igen av en överlappning av endast 100 bp nedströms flanken sonden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vissa mutationer leder till uppenbara tillväxtdefekter som kan detekteras mikroskopiskt. I kitinas strykningar, gjorde enkla mutanterna inte visanågon uppenbar defekt, medan cts1 / 2 dubbla mutanter visade en uttalad cellseparation defekt 20. Färgning av septa visade att cytokines fördes men cellerna förblev anslutna sannolikt via rest kitin (Figur 4 från Langner et al. 2015). En liknande mikroskopisk tillväxt fenotyp är känd för att stryka khd4 24, en gen som kodar för ett RNA-bindande protein medierar posttranskriptions RNA omsättning av gener involverade i morfologi och patogenicitet 25.
Figur 4. Mikroskopisk analys av deletionsmutanter. Cell morfologi och septum bildningen av kitinas deletions-stammar. Cts1 / 2 A-stammar uppvisar en cellseparationsdefekt och bildar stora aggregat, vilket inte beror på en brist på septum bildning. Primär och sekundärsepta (se 5x utvidgningen inläggningar) färgades med Calcofluor White (CW) före mikroskopi. Skalstrecken = 10 | im. Denna siffra återges med tillstånd från Langner et al. 2015 eukaryot cell 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att testa bidraget av kitinaser till virulens, var fröplanta infektionsanalyser utfördes med användning av mutanterna i SG200 stammen bakgrunden. Medan mutanter i khd4 reducerades i virulens, gjorde strykningen av kitinaser inte påverka infektion av plantor majs (Figur 5) 20,25.
Figur 5. Infektion analys av deletionsmutanter. Sjukdom ratingplantor majs 9 dagar efter infektion med respektive U. maydis stammar. (A) Makroskopiska symtom som används för sjukdoms poäng. (B) Två oberoende transformanter testades för varje stam (N> 100). Alla kitinas-mutanter (1/2 / 3Δ: trippel muterade endochitinases, 4A: enkel mutant N-acetylglukosaminidas, 1/2/3 / 4A: fyrdubbla mutant) infekterade värdväxten som leder till kraftig tumörbildning som observeras i vildtyp infektioner med den solopathogenic stammen SG200. Däremot var en stam som bär en deletion av genen som kodar för det RNA-bindande proteinet Khd4 reduceras i virulens såsom tidigare 24 rapporterats. Felstaplar anger standardavvikelsen för tre oberoende försök. Denna siffra är modifierad med tillstånd från Langner et al. 2015 eukaryot cell 20. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.
| genetisk bakgrund | 1 st Diagn. PCR (uteslutna / testade) | 2 nd Diagn. PCR (bekräftat / testade) | Sydlig (bekräftat / testade) | % Recomb. |
| AB33 | 22/07 | - | 15/07 | 32 |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 10/08 | 08/07 | 70 |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabell 1:. Stam verifiering för cts3 deletioner Den kitinasgen cts3 ströks i fyra olika genetiska bakgrunder för att möjliggöra studier av fintrådiga tillväxt (AB33) och infektion (SG200) i enkla och flera strykningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man skapar deletionsmutanter för omvända genetiska studier i U. maydis. Utgångspunkten är en deletion konstruktion som innehåller flankerande sekvenser av genen av intresse som innehåller sekvenser av ca 1 kb uppströms om starten och nedströms om stopp-kodonet samt ett lämpligt motstånd kassett som det var tidigare optimerad 7,9 . Konstruktionerna måste vara individuellt genereras för varje gen och noggrant kontrolleras för sekvens fel innan du tar bort genen. Punktmutationer i flankerna kan orsaka oönskade förändringar i den genomiska sekvensen, i synnerhet om flankerna nå in i angränsande genen eller mutationen modifierar regulatoriska element. Detta skulle påverka alla transformanter och kan orsaka fenotyper och biverkningar inte är relaterade till den önskade gendeletion.
Vid planering rader strategi, har den förväntade fenotypen övervägas att välja den genetiska bakgrunden. I förevarande fall har AB33 23 och SG200 10 valt att göra det möjligt att testa fenotyper i morfologiska switch och växt infektion. På liknande sätt kan många andra avläsningar vara av intresse är t.ex. fusioner med cts1 används i export av heterologa proteiner 14,26, och en stam bakgrund med fluorescerande taggade rrm4 tillåter analys av RNA transport på endosomer 27,28.
Under stam kontroll, hög genomströmning diagnostiska PCR möjliggöra en snabb minskning av antalet kandidater som ska testas i den ganska mödosam Southern blöt. I synnerhet tillåter den första diagnostisk PCR uteslutning av kandidater som fortfarande innehåller vildtyp-kopia av genen och därigenom förhindrar den massiva användningen av giftig fenol i gDNA beredningar. I en standard fallet med en icke-essentiell gen, kan ungefär hälften av kolonierna innehåller vildtyp-genen. Denna pre-screening kan vara av stort intresse för gener med potentiellt skadliga tillväxt fenotyper. Hundratals kandidater kan snabbt screenas.
Om alla kandidater innehåller vildtypen kopia, är troligen dödlig det gendeletion. Detta kan bekräftas genom att ta bort en kopia i en diploid stam bakgrund (t.ex. D132) och analys av segregationen efter teliospore groning 29. Alternativt kan en villkorad radering strategi med hjälp av en inducerbar promotor väljas för att följa mutantfenotypen. Men kan också smitta till följd av den råa NaOH-baserad metod för gDNA beredning störa PCR och leda till falskt negativa, dvs kandidater inte visar ett band och därför hålls trots att de innehåller genen. Detta kan uteslutas genom att testa en kontroll gen med en jämförbar storlek produkt i en oberoende PCR-reaktion eller genom multiplex-PCR med två genspecifika primers och primers för en kontroll gen som resulterar i en större fragment.
innehåll "> Om en mutant redan tillgänglig, t.ex. cts1 Δ 30 eller rrm4 Δ, stam generation märkta versioner kan påskyndas genom att ersätta gendeletion motstånd kassett (t.ex. hygR) i genomet med en ny konstruktion som innehåller t.ex. den fluorescerande rrm4 och en annan resistensmarkör (t.ex. natR). i detta fall, transformanter kan screenas genom förlust av den initiala motståndet markör 9. Rätt kandidater är resistenta endast mot den nya antibiotika (nourseothricin) och har förlorat sin ursprungliga motstånd (hygromycin ). Dessutom, komplettering av den mutanta fenotypen i trans kan utföras för att verifiera funktionalitet taggade konstruktioner 30,31.Den här beskrivna gendeletion och modifiering strategi erbjuder en pålitlig och exakt verktyg i genetisk analys av U. maydis. För flera deletioner dock stammen GEningar kan få tidskrävande, eftersom de ändringar som skall utföras sekventiellt. Därför, som ett kompletterande verktyg, förra året crispr-Cas system har upprättats för U. maydis 32. Det ger möjlighet att störa flera gener samtidigt och är ett utmärkt komplement till den genetiska verktygslåda av U. maydis.
Sammanfattningsvis protokollet för genetisk manipulation och U. maydis stam generation som beskrivs här är en robust metod som har använts i stor utsträckning i samhället i flera år. Tillsammans med den omfattande samling av respektive motståndskassettmoduler det tillåter alla typer av genteknik i denna svamp, ta itu med olika frågor som sträcker sig från grundläggande till tillämpad forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ett särskilt tack till Dr. Benedikt Steuten för kritisk läsning av manuskriptet. Det ursprungliga arbetet på kitinaser utfördes av Dr. Thorsten Langner. Laboratorium VG stöds av Cluster of Excellence i Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) och BioSC är laboratorium KS stöds av BioSC. KB stöds av BioSC. De vetenskapliga verksamhet Bioekonomi Science Center (BioSC) fick ekonomiskt stöd från ministeriet för innovation, vetenskap och forskning inom ramen för NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF stöds av en doktorandtjänst i DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
