Summary
Vi viser, hvordan du forbereder skrå skiver af rygmarven hos unge mus. Dette præparat giver mulighed for stimulering af de ventrale rødder.
Abstract
Elektrofysiologiske optagelser fra rygmarv skiver har vist sig at være en værdifuld teknik til at undersøge en lang række spørgsmål, fra cellulær til netværk egenskaber. Vi viser, hvordan du forbereder levedygtige skrå skiver af rygmarven af unge mus (P2 - P11). I dette præparat, de motoriske neuroner bibeholder deres axoner kommer ud fra de ventrale rødder rygmarven. Stimulering af disse axoner fremkalder back-udbreder aktionspotentialer invaderer motoneuron SOMA og spændende at motoriske soeskende inden rygmarven. Optagelse af antidrom aktionspotentialer er en umiddelbar, definitiv og elegant måde at karakterisere motoneuron identitet, som overgår andre identifikationsmærker metoder. Endvidere stimulere motoriske soeskende er en enkel og pålidelig måde at excitere de kollaterale mål for de motoriske neuroner i rygmarven, såsom andre motorneuroner eller Renshaw celler. I denne protokol, præsenterer vi antidrom optagelser fra motoneuron SOMA samt Renshaw celle excitation, som følge af ventrale rod stimulation.
Introduction
Historisk set blev motoriske optagelser ved hjælp af skarpe elektrode udført in vivo på store dyr såsom katte eller rotter 1 eller på en isoleret hele rygmarven i mus 2. Fremkomsten af plasteret-clamp optagelse teknik i 1980'erne, opfordrede til direkte adgang til motoneuron SOMA som forsegling skulle opnås under visuel vejledning. Således har rygmarven skive forberedelse været let opnået siden begyndelsen af 1990'erne 3. Men tidlig skive forberedelse ofte ikke gav mulighed for stimulering af de ventrale rødder. Så vidt vi ved, har kun to studier rapporteret vellykket stimulering af de ventrale rødder i tværgående skiver, og ingen blev opnået fra mus 4,5.
I denne artikel præsenterer vi en teknik til at opnå levedygtige rygmarvs skiver af neonatale mus (P2 - P11), hvori motoneuron pool bevarer sine ventrale rod afgående axoner. Aftrækral rod stimulation udløser antidrom aktionspotentiale tilbage i listen over SOMA af motoneuron poolen kommer ud fra den samme ventrale rod. Det ophidser også målene for motoriske sikkerhedsstillelse, andre motorneuroner 6-10 og Renshaw celler 11-13. Da der kun motoriske neuroner sender deres axoner ned de ventrale rødder, bruger vi registrering af antidrom aktionspotentialer som en enkel og definitiv måde at physiologicaly identificere motoriske neuroner 10.
Ud over at bruge potentielt ikke-inclusive eller vildledende elektrofysiologiske og morfologiske criterions at bekræfte motoneuron identitet, de seneste undersøgelser af rygmarv motorneuroner også påberåbt sig kedelig og tidskrævende post hoc farvninger 16. En sådan identifikation er normalt kun udføres på en prøve af de optagne celler. Andre strategier identifikation afhængige muselinjer, hvor motoriske neuroner udtrykker endogen fluorescens
Endvidere kan ventrale rod stimulation anvendes til en pålidelig excitere andre motorneuroner 22,23 eller deres mål. The Renshaw celler 10,24,25. Vi præsenterer her ansøgninger fra den ventrale rod stimulation i form af antidrom aktionspotentiale optagelser fra motoneuron SOMA samt excitation af Renshaw-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført i overensstemmelse med EU-direktiver (86/609 / EØF og 2010-63-UE) og fransk lovgivning, og blev godkendt af Paris Descartes University etiske komité.
1. Spinal Cord Slice Forberedelse
- Forbered følgende løsninger dagligt eller en dag i forvejen. Hvis holdt natten, holde boble med 95% O 2 og 5% CO2 og nedkølet i tætsluttende flasker.
- Forbered lav Na + kunstig cerebrospinalvæske (ACSF): 3 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO4, 230 mM sucrose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 25 mM glucose, 0,4 mM ascorbinsyre, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat. Boble med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,4). Da Na-kynurenat er ofte svært at opløse, så sørg for at købe den ene opført i materialer tabellen.
- Forbered K-gluconat Solution: 130 mM K-gluconat, 15 mM KCI, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat, indstillet til pH 7,4 med KOH.
- Forbered ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO4, 26 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0,4 mM ascorbinsyre, 2 mM Na-pyruvat. Boble med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,4).
- Forud for starten af dissektion, opløses 2% agar i 80 ml K-gluconat opløsning og holdes varm ved 60 ° C.
- intrakardial perfusion
- Udfør dette præparat på kvindelige og mandlige mus, der spænder i alder fra P2 til P11.
- Bedøver musen med en intraperitoneal injektion af 0,1 ml 25 mM natrium pentobarbital (50 mg / kg).
- Brug af nåle eller tape, immobilisere musen på ryggen på en stor petriskål fyldt med silicium. Brug en dissekere mikroskopete for resten af dissektion.
- Hold spidsen af brystbenet, løft brystet og skære membranen ved hjælp fine saks. Derefter åbne brystet på begge sider ved at skære gennem ribben at blotlægge hjertet.
- Skær højre atrium før punktering af venstre ventrikel med en 27G nål.
- Perfundere med iskold lav Na + ACSF. Efter 30 sek, bør lav Na + ACSF ses strømmer ud af atrium. Lave mængder af natrium forhindre cellerne i spiking og reducere celledød under dissektion.
- Hold Hold på nålen i hjertet under dissektionsmikroskop indtil leveren bliver gul, når blodet er drænet.
- Rygmarven dissektion
- Halshugge dyret og sætte det på sin mave.
- Hurtigt at fjerne huden på ryggen (figur 1A1). Lav to skærer igennem skuldrene og går ned brystet bur (figur 1A2). Derefter skæres ledningen som low som muligt i den kaudale afsnit for at isolere rygsøjlen med begyndelsen af ribberne fra den nedre del af dyret. Flip dyret igen og fjern indvoldene stadig knyttet til ribbenene.
- Overfør rygsøjlen til en anden, mindre silicium fyldt petriskål og anvende 4 insekt stifter til at holde det dorsale opad (figur 1A).
- Kontinuerligt perfundere dyret med carbogen-boblet ACSF (ved ca. 4 ° C), mens der udføres en laminektomi af den dorsale side, og udsætte rygmarven fra rostral ende (figur 1B). For at gøre dette, skal du indsætte spidsen af fine sakse mellem knoglen og rygmarven og skære knoglen lidt efter lidt fra rostralt ende, og sørg for at holde sig væk fra den hvide substans. Suppleant på hver side, mens du bruger en pincet til at holde sig væk bandet af knogle allerede skåret (Figur 1B1).
- Brug de mindste tilgængelige foråret saks og pincet, løft dura og skærespå begge sider, mens du holder den løse del af dura for at undgå at beskadige rygmarven med saksen. Skær langs Rostro-caudale akse.
BEMÆRK: dura er en semi transparent kontinuerlig membran; i denne alder pia mater er for skrøbeligt og vil komme fra hinanden i løbet af dissektion og udskæring (Figur 1B2). - Når dura er fjernet brug en stump glas eller plastik tip til forsigtigt at skubbe ledningen på venstre side af rillen dannet af den halv-cut rygsøjlen, og skære de ventrale og dorsale rødder i højre side, startende fra rostrale side , længst fra hvor de kommer ind i ledningen (nogle få mm i det mindste, fig 1B2).
- Gentag operationen på venstre side, altid går fra rostral til caudale. Hvis venstre-hånds, starte fra venstre side og derefter flytte til højre side.
- Integrering i agar
- Slip ledningen ud af rygsøjlen. Brug en mindre insekt pin til pin nedledningen med dorsale overflade op og forsigtigt fjerne et stykke membran stadig knyttet til det (figur 1C1).
- Når renset, trim begge ender (figur 1C2). Sæt en bøjet insekt pin i forreste del af ledningen til at manipulere ledningen og bemærk dens orientering (pil i figur 1C2). Derefter overføre rygmarven til en iskold K-gluconatopløsning.
BEMÆRK: Denne løsning efterligner den intracellulære sammensætning af FSR og vil forhindre cellerne fra at dø af osmotisk chok, når de motoriske neuroner vil blive skåret 26. - Når rygmarven er inden for det intracellulære opløsning, tage bægerglasset med agar ud af den tørre bad og køle den ned på en blanding af is og vand.
- Hold omrøring under måling af temperaturen. Når temperaturen når 38 ° C nedsænkes rygmarven, holder det i insekt pin og læg den rostral nedad. Sørg for, at rygmarven er så straight som muligt, væk fra væggene, caudale del lidt opad (fig 1D1).
- Opløsningen henstår i blandingen af is og vand for at tillade agar størkne så hurtigt som muligt. Sørg for, at det forbliver på plads, og at ledningen er så lige som muligt (figur 1D1).
- skiveskæring
- Efter størkning, sender en agar blokken med rygmarven på en sådan måde, at bunden af blokken er ved en 35 ° vinkel med den lumbale del af snoren (pil i figur 1D2). Den dorsale overflade skal vende væk fra bunden (figur 1D2).
BEMÆRK: Dette er et afgørende skridt i proceduren, for at opretholde kontinuiteten i de motoriske puljer til de ventrale rødder, hvorfra de udgår. - Lim blokken ind i kammeret af vibratome hjælp cyanoacrylat lim. Fordyb det i K-gluconatopløsning og tilføje slushed frosne K-gluconatopløsning at opretholdebadet afkølet (under 2 ° C).
- Cut 350 - 400 um tykke skiver af lænden (som er karakteriseret ved krumning og større diameter). I sin korrekte retning (se 1.4.1.), Skal du bruge kniven til at skære fra dorsale til den ventrale overflade og gøre skiver løbende mere rostral. Der er typisk 4-5 egnede skiver med ventrale rødder, der strækker sig 2 mm eller mere. Brug følgende parametre: 10 ° vinkel, 70 Hz vibrationer frekvens og 10 mm / min hastighed af udskæring.
- Efter størkning, sender en agar blokken med rygmarven på en sådan måde, at bunden af blokken er ved en 35 ° vinkel med den lumbale del af snoren (pil i figur 1D2). Den dorsale overflade skal vende væk fra bunden (figur 1D2).
- inkubation
- Overfør skiverne til ACSF ved 34 ° C. Efter ca. 30 min, afkøl skiverne ned til stuetemperatur og begynde indspilningen.
Figur 1. Dissektion
A1:. Fjernelse af huden på ryggen for at blotlægge den dorsale kolonne A2:Skæring af skuldre og ribben at befri dorsale kolonne B1:. Rygsøjlen fastgjort på silicium fyldt petriskål (dorsale side op, caudale side til venstre) B2:. Samme med rygmarven eksponeret og dissekeret C1:. Isoleret Rygmarv . (rostralt side til venstre) C2: Rygmarv klar til at blive indlejret (ventrale side op, rostralt side til venstre). Bemærk den mindre insekt pin på rostralt side D1:.. Rygmarv i agaren bæger (rostralt side dow, ventral side mod bunden) D2: Skær agar blok med den integrerede rygmarven. Bemærk den 35 ° vinkel rygmarven danner med bunden af blokken og den lumbale udvidelsen (pil). Scale barer 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Placering af Slice ind i mødesalen
BEMÆRK: Ventral rødder er af variabel størrelse.
- Forbered en kasse med forskellige pipetter med tip diametre spænder fra 40 til 170 um på forhånd. For at forberede suge pipetter, forberede mange pipetter med en lang tilspidsning. Ved hjælp af en diamant kniv, lave et snit i forskellige positioner. Så under et dissektionsmikroskop, bryde det ved at ramme spidsen med en pincet.
- Fjern kammeret fra kontrolapparatet mikroskop og placere den under et dissektionsmikroskop.
- Vælg et udsnit, der indeholder en ventrale rod af tilstrækkelig længde (2 mm eller mere), der skal monteres på en suge stimulering elektrode. Vælg den korrekte orientering af den pågældende del med de ventrale rødder opad (figur 2A) og fint skåret agaren omkring de ventrale rødder og efterlader resten af agar omkring skive (figur 2B).
BEMÆRK: Da agaren er fastere end udsnittet, vil dette give mulighed trådene i udsnittet anker til at hvile på agaren snarere end på skive og dermed ennchor vil ikke skade vævet. Sørg gevindet på skive anker er over motoneuron pool (vist med rødt i figur 2C). - Monter kammeret tilbage på mikroskopet og kontinuerligt perfuse optagelsen kammer med ACSF ved en hastighed af 1 - 2 ml / min, ved stuetemperatur. Under anvendelse af en glaspipette fyldt med ACSF og forbundet til en sprøjte, suge en af den ventrale rod (pil i figur 2C). For at opnå en god stimulering af den ventrale rod, pipettespidsen skal være stramt omkring den ventrale rod. Ene pol bør være i stimulerende elektrode og den anden i badet (eller forbundet til patch-fastspænding elektrode reference).
- Opnå patch-clamp optagelse af den ønskede celletype og registrere virkningen af den ventrale rod stimulation som beskrevet previsouly 10.
- Her skal du bruge en forstærker til dataopsamling. Filter hel-celle optagelser ved 3 kHz. Digitalisere ved 10 kHz. Kompensere bro modstand i current-clamp modus.
Figur 2. ventrale Root Fremstilling
A: Lumbar rygmarven skive indlejret i agar med den ventrale rod opad B:. Lumbar rygmarven skive med de ventrale rødder befriet fra agar C:. Lumbar rygmarven skive med en stimulerende elektrode stramt placeret rundt de ventrale rødder (pil) . Bemærk placeringen af Renshaw celler, der udtrykker rød fluorescens i chrna2-Cre mus 28 krydset med musen reporter R26 Tom 17. Scale barer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bekræftelse af motorisk Identity Brug antidrom aktionspotentialer
cellemålrettet
Motoriske neuroner findes i det ventrale horn (synlig med rødt i figur 2C). Start fra bundtet af axoner danner ventrale rod og gå indtil bundt spreder fuldt ud og man begynder at se store celler (lang soma akse, over 20 pm). Opnå helcelle-optagelse af en rund sundt udseende celle ved anvendelse af en elektrode af indledende modstand af på 3 til 4 MOhm. Den interne opløsning anvendes indeholdt: 140 mM K-gluconat, 6 mM KCI, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na 2 GTP. PH justeres til 7,3 med KOH, og osmolariteten til 285 - 295 mOsm ved tilsætning af destilleret vand.
Når helcelle-optagelse opnås, anvende en enkelt tofaset stimulering af den ventrale rod (1 - 50 V, 0,1 - 0,3 msek) for at fremkalde en antidrom aktionspotentiale i de registrerede celler fra den ventrale ledningen Figur 3A1 og 3A2 viser antidrom handling. potentialer i spænding-clamp eller strøm-clamp, hhv. Når øge stimulering intensitet fra 1 til 5 V (figur 3A1) og fra 10 til 15 V (figur 3A2) den antidrom aktionspotentialet vises i en alt-eller-intet mode med en latenstid på 0,9 ms og 1,1 msek. I betragtning af, at kun motorneuroner sender deres axoner gennem de ventrale rødder, den antidrom handling potentiale er et bevis på cellens identitet. I et mindretal af motorneuroner (ca. 10%), ventrale rod stimulation undladt atfremkalde antidrom handling potentiale, men snarere fremkaldte orthodrom aktionspotentialer. Figur 3B1 og 3B2 viser orthodrom aktionspotentialer i spænding-clamp eller strøm-clamp, hhv. Når øge stimuleringen fra 20 til 30 V (Figur 3B1), og fra 25 til 40 V (Figur 3B2), vises en handling potentiale, efter en tidligere excitatorisk post-synaptiske strøm (EPSC) eller excitatoriske postsynaptiske potentiale (EPSP). De latenstider af aktionspotentialer er længere (5,1 ms og 5,3 ms, henholdsvis). I disse to celler, stimulere den ventrale rod fremkaldte en feed-forward excitation (motoneuroner Send Axon soeskende til sig selv og til andre motorneuroner), der var stærk nok til at fremkalde en orthodrom aktionspotentiale. I sådanne celler, den manglende fremkalde en antidrom handling potentiale (kendetegnet ved sin alt-eller-intet mode og en latenstid kortere end 5 ms) ikke tillade os at konkludere, at disse celler ar e motoriske neuroner. Bemærk, at den krævede stimulation intensitet for at fremkalde feed-forward excitation er højere end den, der kræves for at fremkalde et antidrom aktionspotentiale. Alle viste her stimulationer er 0,1 ms, men nogle gange, længere stimulation (op til 0,3 ms) kan være nødvendig for at fremkalde en antidrom handling potentiale. Renshaw cellestimulering cellemålrettet Renshaw celler findes i det ventrale horn 27,28. Visualiser Axon bundter med differential interferens kontrast (DIC) billeddannelse ved hjælp af en 20X og en 63x mål. Start fra bundtet af axoner danner ventrale rod og gå frem axoner begynder at dispergere, men er stadig mærkbar (figur 4A, pile). Målet for cellerne i mellemliggende størrelse (cirka 10 - 15 pm i diameter, figur 4A, pilespidser). Opnå helcelle-optagelse af en rund sundt udseende celle ved anvendelse af en elektrode af indledende modstand mellem 5 og 7 MOhm. Afhængigt af forsøget anvendte vi eiTher Cs + -baseret eller K + -baseret interne løsninger 10. CS-baseret løsning forhindrede store kalium strømninger, der var synlige omkring -45 mV. I nogle forsøg har vi tilføjet også 5 mM QX-314 til at blokere natriumkanaler ansvarlige for spiking i den optagede celle. The Cs + -baseret opløsning indeholder: 125 mM Cs-gluconat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP og 0,4 mM Na-GTP, med pH justeret til 7,3 med CsOH. K + -baseret opløsning bør anvendes til at analysere, både i spændings- og strøm-clamp, The Renshaw cellereaktioner på ventrale rod stimulation i forhold tilnærme så meget som muligt de fysiologiske dem. Denne opløsning indeholder: 125 mM K-gluconat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,4 mM Na-GTP, med pH justeret til 7,3 med KOH. Stimulus intensitet varierede mellem 10 og 100 V og dens varighed varierede mellem 50 og 300 mikrosekunder. Bipo nende pulser blev anvendt i alle tilfælde. Reaktion af Renshaw celler til ventrale rod stimulation Stimulering af den ventrale rod udløser corelease af glutamat og acetylcholin fra motoriske soeskende onto Renshaw celler 10. Feed-forward hæmning medieret af GABA og glycin er også rekrutteret 10. Figur 4B viser reaktioner på det indre stimulering af den ventrale rod. Cellen blev indspillet i en spænding-clamp-mode med cæsium-baseret løsning, og holdes ved en spænding på -45 mV. QX-314 i den intracellulære opløsning forhindrede cellen fra fyring og GABA og glycin responser blev blokeret af 3 uM gabazine og 1 uM stryknin hhv. Den indadgående synaptiske strøm i figur 4B er summen af den glutamaterge og nicotiniske strømninger. 
Figur 3. motoneuron Svar på ventrale Root Stimulation
A1: 1 V (rød spor) og 5 V (sort spor) stimulationer A2:.. 10 V (rød spor) og 15 V (sort spor) stimulationer B1: 20 V (rød spor) og 30 V (sort spor) stimulationer . B2: 25 V (rød spor) og 40 V (sort spor) stimulationer. Sorte prikker indikerer stimulus timing. Dobbelt pilespidser understrege forskellen i latenstider mellem ortho- og antidrom spikes.m / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4. Renshaw cellestimulering fra den ventrale Root
A: Billeder af den Renshaw celle pool erhvervet ved hjælp af en skrå kondensator i samme skive taget på to forskellige forstørrelser (20X og 40X mål). Bemærk motoriske axoner fusionerende ind i ventrale rod (pil). Formodede Renshaw celler er angivet med pilespidser. Scale barer: 100 um i A1, 50 um i A2 B:. Spænding-clamp optagelser af en Renshaw celle efter stimulering af den ventrale rod (sort prik). Den røde spor er gennemsnittet af de grå dem. Holding spænding blev fastsat til -45 mV. QX-314 i intracellulære opløsning forhindrede cellen fra fyring og GABA og glycin responser blev blokeret af 3 uM gabazine og 1 uM stryknin hhv. Sort prik indikerer stimulus timing.dk / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skrå udskæring af rygmarven er vigtigt, da det giver mulighed for ensidig stimulering af motoriske pools og Renshaw celler på et enkelt vertebral segment på en pålidelig, omfattende og specifik måde. Desuden giver det mulighed for en hurtig, elegant og ikke-tvetydige identifikation af indspillede motoriske neuroner. Dernæst vil vi fremhæve fordelene ved denne teknik i forhold til andre skive forberedelse metoder, og så vil vi fremhæve de mest almindelige faldgruber at undgå, mens de udfører denne procedure.
De fleste undersøgelser anvender tværgående skiver baserer deres identifikation på iboende elektriske egenskaber 3,14,15,29. Men disse varierer meget mellem motoriske puljer samt mellem motoriske undertyper inden for en given pulje (alfa-, beta- og gamma-motorneuroner 30). Derfor undersøgelser med anvendelse af parametrene størrelse sandsynligvis at udelukke mindre gamma-motoriske neuroner. På den anden side, Cooper og Sherrington described i 1940 en gruppe af store nerveceller i Ventro-lateral grå substans i lumbale rygmarv af aber og katte, der havde krydset stigende axoner 31,32. Ud over at være tæt på motoneuron SOMA, bemærkede de, at de optrådte histologisk skelnes fra motorneuroner. En nylig artikel bekræftede eksistensen af sådanne celler i musen 33. På grund af den store størrelse af disse celler og deres placering, de kunne have været fejlagtigt medtaget i tidligere undersøgelser. Vores kriterium identifikation udelukker formodede spinal grænserne celler, da deres axon ikke rager i den ventrale rod, samtidig med at pålidelig identifikation af alle motoriske neuroner uanset deres størrelse. Desuden analyserer de iboende elektriske egenskaber, (f.eks input modstand), er mere tidskrævende end den simple observation af en antidrom aktionspotentiale.
Ud over at anvende iboende elektriske egenskaber, nogle studies Brug tværgående skiver, bekræfte deres identifikation ved at udføre post-hoc analyse af den molekylære markør for motorneuroner (såsom Islet-1/2 16) eller ved at visualisere morfologien hjælp biocytin Skiltemalerer 14,17. Sådanne identifikationer er dog kedelig og giver ikke en direkte identifikation. De er derfor sjældent systematisk udført.
Nogle undersøgelser har forsøgt at gøre brug af musen, der udtrykker et genetisk kodet motoneuron fluorescerende markør (Hb9-GFP muse linie 18, chat-EGFP transgene mus, som udtrykker eGFP i cholinerge celler, herunder motoneuroner 19 eller G85R SOD1-YFP transgene mus, der kraftigt udtrykker YFP fusionsproteinet i motorneuroner 17). Men fordi den genetiske markør ekspression sædvanligvis er betinget i tid og da skiverne sædvanligvis taget fra embryoner eller yngel kan ekspressionen af markøren ikke være tilstrækkelig i en alder af sgelse udføres. Andre undersøgelser har anvendt retrograd agent injektion for at visualisere motoneuron pool 34. Vi udførte også choleratoxin beta injektioner i soleus eller EDL (personlig observation). Sådanne mærkning teknikker er af stor værdi for mærke et bestemt motoneuron pool men kræver kedelige kirurgi et par dage før eksperimentet. Endvidere den unge alder, hvor de skive forsøgene bliver gjort, gør det betydeligt sværere at specifikt at målrette musklerne. Endelig er der en reel bekymring for forstyrrende det motoneuron ved at injicere et eksogent middel.
Under optimale forhold kunne vi opnå antidrom aktionspotentialer i stort set alle de optagede motoriske neuroner. 35 ° vinkel anvendes, er kritisk for opnåelse ventrale rødder tilstrækkelig længde. Som konklusion skrå skive forberedelse giver en hurtig og pålidelig måde at identificere hver motoneuron, som er overlegen i forhold til andre identifikationsmærker teknikker.
Som nævnt i indledningen, rapporterede kun to studier vellykket stimulering af de ventrale rødder i tværgående skiver. Den første undersøgelse registrerede cervikale neuroner hos rotter og stimuleret den hvide substans, hvor den ventrale rod stub dukker 4. De med held induceret antidrom aktionspotentiale i 85% af de registrerede neuroner. Vi mener, at deres høje succesrate påberåbt sig, at der ved den cervikale niveau, de axoner og SOMA af motorneuroner er på samme plan. Dette er ikke tilfældet i mere caudale skiver. Selv på den cervikale niveau, deres tværgående skiver kun beholdt stubbe af de ventrale rødder, som er mindre pålidelige til at stimulere. Den anden undersøgelse stimulerede chick embryo dorso-lumbal segment 5. Men de anvendte spænding farvestof optagelse, som manglede den rumlige opløsning for at indikere succes inducere et antidrom aktionspotentialer på enkelt celle niveau.
Vores skive forberedelse;ion tilbyder også en overlegen måde at stimulere Renshaw celler som anført i en nylig papir 28. Brug de skrå skiver, de var i stand til at registrere monosynaptisk Renshaw celler reaktioner i 46% af tilfældene, hvilket var en stor forbedring fra succesraten 10% stødt hjælp tværgående skiver 35. Selvom vi ikke kunne finde en lignende sammenligning for stimulering af motoriske puljer, denne iagttagelse i Renshaw cellen fører os til at tro, at motorneuroner også fastholde mere tilslutningsmuligheder.
Skrå udskæring af rygmarven er en meget krævende teknik, der kræver meget praksis inden pålideligt at opnå et præparat, hvorfra man kan optage. Brug meget fine og skarpe pincet og mikro-saks er afgørende. Tiden brugt dissekere kan være ganske lang (op til 1 time), så længe hele proceduren føres i afkølet carbogen-boblet dissektion medium. Mens nogle forfattere ikke anerkender nogen fordel af intrakardiale perfusion ved fremstilling af skiver 36, besluttede vi at opretholde dette trin af proceduren. Det er svært at måle objektivt fordelen ved intrakardial perfusion for kvaliteten af optagelserne, især fordi det varierer med alderen.
Den mest kritiske faktor er muse alder. Vi har med held registreret fra mus mellem P2 og P11 hjælp af ovenstående protokol. Forbi denne alder, rygmarven myelin bliver for tæt og de største celler (de motoriske neuroner) dø før udskæring, mest sandsynligt på grund af iltmangel. Efter dette vindue, fandt vi det mere og mere vanskeligt at opnå sunde skiver. For nylig har nye teknikker blevet rapporteret at opnå sunde skiver i ældre dyr 17,36. De brugte ekstra additiver til deres dissekere og optagemedie fx supplerende energikilder (ethyl-pyruvat), lavere Na + og Cl - koncentrationer for at forhindre oncosis af cellerne 37,38 og polyethylenglycol at begrænse effects af de omfattende membran transections der opstår under udskæring. Med sådanne forbedringer, de var i stand til at optage fra op til 6 måneder gamle dyr.
I fremtiden vil det være interessant at forsøge skrå skive præparater i voksne dyr at kombinere fordelene ved de to teknikker. Ved at kombinere de to protokoller skulle vise sig forholdsvis let og vil give et pålideligt værktøj til at bekræfte motoneuron identitet og studere befolkningen ramt af Axon soeskende af motorneuroner i voksne mus. Derudover kunne man forsøge at få skrå skiver i embryo mus. Bemærkelsesværdigt, vores forberedelse bevarer også de dorsale rødder, som kan stimuleres til at studere aktivering monosynaptiske jeg en innervation til motorneuroner, samt aktiveringen af dorsale rygmarv neuronale populationer. Afslutningsvis ventrale rod stimulationer tilbyde et pålideligt værktøj til at bekræfte motoneuron identitet og til at studere befolkningen målrettet efter motoneuron Axon soeskende. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Marin Manuel og Olivia Goldman-Szwajkajzer for deres hjælp i at tage billederne. Forfatterne også takke Arjun Masukar og Tobias Bock til korrekturlæsning manuskriptet. Finansielle bærere blev leveret af Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-Blan-1429-1401), NIH-NINDS (R01NS077863), den Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franske forening for myopati ( tilskud nummer 16026) og Target ALS er taknemmeligt anerkendt. Felix Leroy var modtageren af en "Contrat Doctoral" fra Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2 |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
