Summary
Biz genç farelerde omurilik eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu preparat, ventral köklerin uyarılması için izin verir.
Abstract
omurilik dilimleri gelen elektrofizyolojik kayıtlar ağ özelliklerine hücresel soruları geniş bir yelpazede araştırmak için değerli bir tekniktir olduğu kanıtlanmıştır. Biz genç farelerde (- P11 P2) spinal kord canlı eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu hazırlıkta, motor nöronlar aksonları omuriliğin ventral köklerin çıkan korur. Bu akson uyarılması omurilik içinde motornöron Somas ve heyecan verici motor nöron teminatlar istila geri yayılan aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarır. antidromik aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesi diğer kimlik yöntemlerini aşan motonöron kimliğini, karakterize ivedi, kesin ve zarif bir yoldur. Ayrıca, motor nöron teminatları uyarıcı gibi diğer motor nöronlar veya R omurilik içindeki motor nöronlar teminat hedeflerini, heyecanlandırmak için basit ve güvenilir bir yoldurhücreleri enshaw. Bu protokol, ventral kök uyarılmasından kaynaklanan, motor nöron Somas olarak Renshaw hücre uyarma gelen antidromik kayıtları sunuyoruz.
Introduction
Tarihsel olarak, keskin elektrodu kullanılarak motonöron kayıtları kedi, sıçan 1 ya da fareler 2 izole edilmiş bir bütün omurilik büyük hayvanlarda in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. somas gerekli sızdırmazlık olarak motor nöron doğrudan erişim için çağrıda 1980'li yıllarda patch-kelepçe kayıt tekniğinin ortaya çıkması, görsel rehberliği altında elde edilecek. Böylece, omurilik dilim hazırlık kolayca 1990'ların başından bu yana 3 elde edilmiştir. Ancak, erken dilim hazırlık genellikle ventral köklerinin uyarılması için izin vermedi. Bizim bildiğimiz kadarıyla, sadece iki çalışma enine dilim ventral köklerin başarılı uyarılması bildirilmiştir ve hiçbiri fareler 4,5 elde edilmiştir.
motonöron havuzu ventral kök kalkan aksonlar elinde bulundurduğu - (P11 P2) Bu yazıda yenidoğan farelerin canlı omurilik dilim elde etmek için bir teknik sunuyoruz. delikral kök stimülasyon aynı ventral kök çıkan motonöron havuz mis geri antidromik aksiyon potansiyelini tetikler. Aynı zamanda motor nöron teminat hedefleri, diğer motor nöronlar 6-10 ve Renshaw hücreleri 11-13 heyecanlandırıyor. Sadece motor nöronlar ventral kökleri kendi aksonlar aşağı göndermek yana, motor nöronlar 10 belirlemek physiologicaly için basit ve kesin yolu olarak antidromik aksiyon potansiyelleri kayıt kullanın.
Motonöron kimliğini doğrulamak için potansiyel olmayan kapsayıcı veya yanıltıcı elektrofizyolojik ve morfolojik kriterler kullanılarak ek olarak, omurilik motor nöronlar üzerinde son çalışmalar da post hoc sıkıcı ve zaman alıcı Renklendirmeler 16 dayanmıştır. Bu tanımlama genellikle kaydedilen bir hücre numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Diğer kimlik stratejileri motor nöronlar endojen floresan ifade ettiği fare hatları güveniyor
Ayrıca, ventral kök stimülasyon güvenilir diğer motor nöronlar 22,23 ya da hedef uyarmak için kullanılabilir. Renshaw hücreleri 10,24,25. Burada motonöron mis gelen antidromik aksiyon potansiyeli kayıtlarında şeklinde ventral kök stimülasyon uygulamaları yanı sıra, Renshaw hücre uyarma sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler Avrupa direktiflerine (86/609 / CEE ve 2010-63-UE) ve Fransız mevzuatına uygun olarak yapıldı ve Paris Descartes Üniversitesi etik kurul tarafından onaylandı.
1. Omurilik Dilim Hazırlık
- Aşağıdaki günlük çözümler ya da bir gün önceden hazırlayın. Bir gecede devam ederse,% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile kabarcık ve sıkıca kapalı şişelerde buzdolabında tutun.
- Düşük Na yapay serebrospinal sıvı (ACSF) + Hazırlama: 3 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM sakaroz, 26 mM NaHCO 3, 0.8 mM CaCl2, 8 mM MgCI2, 25 mM glükoz, 0.4 mM askorbik asit, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvat. % 95 O2 ve% 5 CO2 (pH 7.4) Kabarcık. Na-kynurenate genellikle çözünmesi zor olduğundan, malzeme tabloda listelenen satın almak için emin olun.
- K-glukonat Solu hazırlanmasıtion KOH ile pH 7.4'e ayarlanmış 130 mM K-glukonat, 15 mM KCI, 0.05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glükoz, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvat,.
- ACSF hazırlayın: 130 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 25 mM glükoz, 0.4 mM askorbik asit, 2 mM Na-piruvat. % 95 O2 ve% 5 CO2 (pH 7.4) Kabarcık.
- diseksiyon başlamadan önce, K-glukonat çözeltisi 80 ml% 2 agar çözülür ve 60 ° C 'de sıcak tutun.
- intrakardiyak perfüzyon
- yaş P2 P11 kadar, dişi ve erkek farenin bu hazırlık gerçekleştirin.
- 25 mM sodyum pentobarbital (50 mg / kg), 0.1 ml intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
- iğneler veya bant kullanılarak, silikon ile dolu büyük bir petri sırtında fare hareketsiz. Diseksiyon mikroskop kullanındiseksiyon geri kalanı için e.
- sternum ucu Holding, göğüs kaldırın ve ince makas kullanarak diyafram kesti. Sonra kalp maruz kaburga ile keserek her iki tarafta kutuyu açın.
- 27G iğne ile sol ventrikül delme önce sağ atrium kesin.
- Buz gibi soğuk düşük Na + ACSF serpmek. 30 saniye sonra, düşük Na + ACSF atrium dışarı akan görülmelidir. sodyum düşük miktarda spiking hücreleri önlemek ve diseksiyon sırasında hücresel ölüm azaltır.
- Kan boşaltılır karaciğer sarı olana kadar mikroskop altında kalbinde iğne basılı tutun.
- Omurilik diseksiyonu
- hayvan başını kesmek ve mide üzerine koydu.
- Hızla arkasına (Şekil 1A1) cilt kaldırın. İki kesim omuzları ve göğüs kafesini (Şekil 1A2) aşağı gidiyor olun. Sonra l olarak kablosunu kesiphayvan alt kısmından kaburga başlangıcı ile gezilebilen omurga izole etmek üzere kaudal bölümünde olduğu gibi mümkün olan akış. Yine hayvan çevirmek ve hala kaburga bağlı iç organ kaldırın.
- Başka vertebral sütun transfer daha küçük silikon dolu petri ve dorsal yüzü yukarı (Şekil 1A) tutmak için 4 böcek işaretçilerine kullanın.
- Sırt tarafında bir laminektomi gerçekleştirerek, ve rostral sonunda (Şekil 1B) den omurilik teşhir ederken Sürekli (yaklaşık 4 ° C'de) carbogen-kabarmış ACSF ile hayvan serpmek. Bunu yapmak için, kemik ve omurilik arasındaki ince makas ucu yerleştirin ve beyaz maddeden uzak kalmak için emin olun, rostral ucundan azar azar kemiği kesti. Her iki tarafta alternatif kemik bant zaten kesilmiş (Şekil 1B1) uzak tutmak için cımbız kullanarak.
- en küçük kullanılabilir yaylı makas ve cımbız kullanarak, dura kaldırın ve kesmemakasla omurilik zarar vermemek amacıyla her iki tarafta duranın gevşek kısmını tutarken. postero-kaudal ekseni boyunca kesin.
NOT: Dura yarı saydam sürekli zardır; Bu yaşta pia mater çok kırılgan ve diseksiyon ve dilimleme (Şekil 1B2) sırasında ayrı gelecektir. - Dura kaldırılan kullanımı kez künt cam veya plastik uç hafifçe yarım kesilmiş omurga oluşturduğu oluğun sol tarafındaki kabloyu itin ve rostral taraftan başlayarak, sağ tarafta ventral ve dorsal kökleri kesmek için onlar (en azından birkaç mm Şekil 1B2) kordon girmek yerden uzak.
- her zaman rostral gelen kaudal gidiyor, sol tarafta işlemi tekrarlayın. solak, sol taraftan başlamak ve daha sonra sağ tarafa hareket ettirin.
- Agar gömme
- Vertebral kolon dışına kablosunu Kayma. aşağı pin küçük bir böcek pin kullanındorsal kordon yukarı yüzey ve ince zarın herhangi bir parçası hala ona bağlı (Şekil 1C1) çıkarın.
- Temizlenmiş sonra, her iki ucu (Şekil 1C2) kırpın. Kablosunu işlemek ve yönünü not kord ön kısmında bir bükülmüş böcek pin yerleştirin (Şekil 1C2 ok). Daha sonra, bir buz-soğuğu K-glukonat çözeltisine omurilik aktarın.
Not: Bu çözüm BOS hücre içi kompozisyon taklit ve motor nöronlar 26 kesilecektir kez ozmotik şok ölen hücrelerini engeller. - Omurilik hücre içi çözelti içinde olduğunda, kuru banyo üzerinden agar ile beher almak ve bir buz ve su karışımı üzerine soğuma.
- sıcaklık ölçüm sırasında karıştırmaya devam edin. Sıcaklık 38 ° ulaştığında böcek pimi tutarak, omurilik batırmak ve aşağı rostral tarafı yerleştirin C. Omurilik st olarak olduğundan emin olunraight mümkün olduğunca uzak kaudal kısmı, duvarlar hafifçe yukarı doğru (Şekil 1D1).
- Agar olabildiğince hızlı bir şekilde katılaşmasına izin buz ve su karışımı içinde beher bırakın. Emin kordon mümkün (Şekil 1D1) gibi düz olduğu yerde kalır ve emin olun.
- Dilimleme
- Sertleştikten sonra, (Şekil 1D2 ok) bloğun tabanı kablosunun bel kısmı ile 35 ° 'lik açıyla olduğu bir şekilde omuriliği ihtiva eden agar kesti. Dorsal yüzey tabanı (Şekil 1D2) uzağa dönük olmalıdır.
Not: Bu çıktıkları ventral köklerine motornöron havuzları sürekliliğini korumak için prosedür kritik bir adımdır. - siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak vibratome odasına blok Tutkal. K-glukonat solüsyonu içinde daldırın ve korumak için slushed dondurulmuş K-glukonat çözüm ekleyinbanyo (2 ° C'nin altında) soğutulmuş.
- (Onun eğrilik ve büyük çaplı tarafından tanımlanabilir) bel bölgesinde 400 mikron kalınlığında dilimler - 350 kesin. kendi doğru yönde (1.4.1 bakınız.) 'de, ventral yüzeyi dorsalden kesip dilimler sürekli daha rostral yapmak için bıçak kullanın. Tipik olarak, 2 mm veya daha fazla uzanan ventral kökleri ile 4-5 uygun dilimler vardır. 10 ° açı, 70 Hz titreşim frekansı ve dilimleme 10 mm / dk hızı: Aşağıdaki parametreleri kullanın.
- Sertleştikten sonra, (Şekil 1D2 ok) bloğun tabanı kablosunun bel kısmı ile 35 ° 'lik açıyla olduğu bir şekilde omuriliği ihtiva eden agar kesti. Dorsal yüzey tabanı (Şekil 1D2) uzağa dönük olmalıdır.
- kuluçka
- 34 ° C'de ACSF dilimleri aktarın. Yaklaşık 30 dakika sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya dilimleri ve kayıt oturumunu başlatmak.
Şekil 1. Diseksiyon
A1:. Dorsal kolon maruz arka derinin çıkarılması A2:. Omuzlar ve kaburga kesme dorsal kolon B1 serbest: silikon dolu petri üzerine tutturulmuş Omurga sütunu (yukarı sırt tarafı, sol kaudal tarafı) B2:. Maruz kalan ve disseke omurilik ile aynı C1:. Omurilik izole . (rostral tarafı sol) C2: yerleştirilmeye hazır Omurilik (yukarı ventral tarafta, sol rostral tarafı). Rostral tarafında küçük böcek pin Not D1:.. Agar beher Omurilik (rostral tarafı dow, dip bakan ventral tarafı) D2: gömülü omurilik ile Kes agar bloğu. 35 ° açısı bloğunun taban ve lomber genişleme (Ok) ile omurilik formları unutmayın. Ölçek çubukları 1 cm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Odası'na Slice Yerleştirme
NOT: Ventral kökleri, değişken bir alana yayılır.
- 40 peşin 170 um arasında değişen uç çapları çeşitli pipetler bir kutu hazırlayın. Emme pipetler hazırlamak uzun konik birçok pipetler hazırlamak. Bir elmas bıçak kullanarak, farklı pozisyonlarda bir kesim yapmak. Sonra bir mikroskop altında, cımbız ile ucu vurarak kırmak.
- Kayıt mikroskop odasına çıkarın ve bir mikroskop altında yerleştirin.
- bir emme stimülasyon elektrodu monte edilmesi için yeterli uzunlukta (2 mm veya daha fazla) bir ventral kök içeren bir dilim seçin. Ventral kökleri ile dilim yukarı (Şekil 2A) doğru yönünü seçin ve dilim (Şekil 2B) etrafında agar geri kalanını terk ederken ince ventral kökleri etrafında agar kesti.
NOT: Agar dilim daha sıkı olduğundan, bu dilimin çapa konuları ağar ziyade böylece dilim ve dinlenmek için izin verecektirnchor dokuya zarar vermez. Dilimin çapa ipler (Şekil 2C kırmızı ile gösterilen) motonöron havuzu üzerinde olduğundan emin olun. - mikroskop üzerine geri bölmesini monte sürekli 1 bir oranda ACSF kayıt odasına serpmek - oda sıcaklığında, 2 ml / dakika. Cam pipet ACSF ile doldurulur ve bir şırıngaya bağlanmış kullanarak, ventral kök (Şekil 2C ok) bir emmeye. ventral kök iyi hareketini elde etmek için, pipet ucu ventral kök etrafında sıkı olması gerekmektedir. Bir kutup uyarıcı elektrot ve (yama-sıkma elektrot referans bağlı veya) banyosunda diğeri olmalıdır.
- Istenen hücre tipi yama-kelepçe kayıt ulaşmak ve previsouly 10 açıklandığı gibi ventral kök stimülasyon etkisi kaydedin.
- Burada, veri toplama için bir amplifikatör kullanın. 3 kHz tam hücre kayıtları Filtre. 10 kHz Digitize. curre köprü direnci telafint-kelepçe modu.
Şekil 2. Ventral Kök Hazırlık
A: ventral kök yukarı bakacak şekilde agar gömülü Lomber spinal kord dilim B:.. Agar C kurtulmuş ventral kökleri ile Lomber spinal kord dilim: sıkıca (ok) ventral kökleri etrafında yerleştirilmiş bir uyarıcı elektrot ile Lomber spinal kord dilim . Fare muhabiri R26 Tom 17. Ölçek çubukları 1 mm çapraz chrna2-Cre fare 28 kırmızı floresan ifade Renshaw hücreleri konumunu not alın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antidromic Eylem Potansiyelleri Kullanarak Motonöron Kimlik Onayı
Hücre hedefleme
Motor nöronlar Karın boynuzuna (Şekil 2C kırmızı görünür) bulunur. ventral kök oluşturan akson demeti başlayın ve paket tamamen dağılır ve bir (20 mikron üzerinde, uzun soma ekseni) büyük hücreler görmeye başlayana kadar gidebilir. 4 M? 3 ila ilk direnç bir elektrot kullanarak bir yuvarlak sağlıklı görünen hücrenin tam hücreli kayıt elde edin. Kullanılan dahili solüsyon ağırlık: 140 mM K-glukonat, 6 mM KCI, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na-2 GTP. damıtılmış su eklemek suretiyle 295 mOsm - 285 KOH ile 7.3 pH ve osmolarite ayarlayın.
. Ventral kordon kaydedilen hücrelerde bir antidromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için (0.3 msn - - 50 V, 0.1 1) 3A1 ve 3A2 gösteri antidromik eylem Şekiller tam hücreli kayıt sağlandıktan sonra, ventral kök tek iki fazlı uyarımın uygulamak sırasıyla gerilim-kelepçe veya akım-kelepçe, potansiyeller. 1 (Şekil 3A1) V 5 ve dan stimülasyon yoğunluğu artan zaman 10 (Şekil 3A2) V 15 antidromik aksiyon potansiyeli sırasıyla 0,9 msn ve 1.1 msn, bir gecikme ile bir all-ya hiç moda görünür. Sadece motor nöronlar ventral kökleri aracılığıyla kendi aksonları göndermek göz önüne alındığında, antidromik aksiyon potansiyeli hücre kimliğinin bir kanıtıdır. motonöronlar (yaklaşık% 10) bir azınlık olarak, ventral kök stimülasyonu başarısızantidromik aksiyon potansiyelini ortaya koyan, ancak daha çok ortodromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı. 3B1 ve 3B2, sırasıyla, voltaj-kelepçe veya akım-clamp ortodromik aksiyon potansiyelleri göstermektedir Şekil. 30 V (Şekil 3B1) ve 25 V 40 (Şekil 3B2) ila 20 uyarımı artırılırken, bir aksiyon potansiyeli önceki uyarıcı post-sinaptik (EPSC) mevcut veya post-sinaptik potansiyel (EPSP) uyarıcı aşağıdaki görünür. aksiyon potansiyelinin gecikmeleri (5.1 msn 5.3 msn, sırasıyla) daha uzundur. Bu iki hücrelerde, ventral kök uyarıcı bir ortodromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için yeterince güçlü bir ileri beslemeli uyarım (motor nöronlar diğer motor nöronlar kendilerine ve akson teminatlar göndermek) ortaya çıkardı. Böyle hücrelerde, bir antidromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için başarısızlık bize bu hücrelerin ar sonucuna izin vermez (onun hep ya hiç moda ve gecikme daha kısa 5 ms ile karakterize) e motor nöronlar. gerekli uyarım yoğunluğu ileri beslemeli uyarım bir antidromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için gerekli olandan daha yüksek olduğu ortaya çıkarmak için dikkat edin. burada gösterilen tüm uyarımlar 0.1 msn ama bazen, (0.3 ms kadar) uzun stimülasyonun antidromik aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için gerekli olabilir vardır. Renshaw hücre stimülasyonu Hücre hedefleme Renshaw hücreleri Karın boynuzuna 27,28 bulunmaktadır. 20x ve 63X hedefleri kullanarak diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme ile akson demetleri gözünüzde canlandırın. Ventral kök oluşturan akson demeti başlayın ve aksonlar dağıtmak başlar ama yine de (Şekil 4A, oklar) ayırt edilebilen kadar gidin. (- Çapı 15 mikron, Şekil 4A, ok uçları yaklaşık 10) orta büyüklükte hücreler hedefleyin. 7 MQ 5'te ilk direnç bir elektrot kullanarak yuvarlak sağlıklı görünen hücrenin tam hücreli kayıt elde edin. deney bağlı olarak, ei kullanılanther Cs + tabanlı veya K + dahili çözümler 10 tabanlı. Cs-tabanlı çözüm mV -45 civarında görünür büyük potasyum akımları engelledi. Bazı deneylerde, aynı zamanda kayıt hücresinde spike sorumlu sodyum kanallarını bloke 5 mM QX-314 ilave edildi. Cs + merkezli çözeltisi içerir: pH 125 mM CS-glukonat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, ve 0.4 mM Na-GTP, CsOH ile 7.3 değerine ayarlanır. K + merkezli çözeltisi hem voltaj ve akım kelepçe olarak analiz etmek için kullanılmalıdır, koşullarında ventral kök uyarılmasına Renshaw hücresi tepkileri, fizyolojik olanlar mümkün olduğu kadar yaklaşan. Bu çözelti içerir: KOH ile 7.3 pH'ta 125 mM K-glukonat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0.4 mM Na-GTP,. 10 ve 100 V ve süresi arasında değişiyordu uyaran yoğunluğu 50 ve 300 mikro-sn arasında değişmektedir. BİFO lar darbeleri her durumda kullanılmıştır. Ventral kök uyarısına Renshaw hücreleri Tepki Ventral kök uyarılması Renshaw hücreleri 10 üzerine glutamat ve motonöron teminatların asetilkolin corelease tetikler. GABA ve glisin aracılığıyla ileri-beslemeli inhibisyon da 10. Şekil 4B ventral kök tek uyarılmasına yanıtları görüntüler işe alınır. Hücre -45 mV voltajda sezyum tabanlı bir çözüm olan bir gerilim kelepçe modunda kaydedilen ve muhafaza edildi. QX-314 hücre içi çözelti içinde ateşleme ve GABA hücreyi engelledi ve glisin tepkileri, sırasıyla 3 uM gabazine ve 1 uM striknin, bloke edilmiştir. Şekil 4B'de içe sinaptik akımı glutamaterjik ve nikotinik akımının toplamıdır. 
Ventral Kök Uyarım Şekil 3. Motonöron Cevapları
A1: 1 V (kırmızı iz) ve 5 V (siyah iz) uyarımlar A2:.. 10 V (kırmızı iz) ve 15 V (siyah iz) uyarımlar B1: 20 V (kırmızı iz) ve 30 V (siyah iz) uyarımlar . B2: 25 V (kırmızı iz) ve 40 V (siyah iz) uyaranlar. Siyah noktalar uyaran zamanlamasını gösterir. Çift ok başları orto ve antidromik sivri arasındaki gecikmeleri farkı vurgulamak.m / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Ventral Root gelen Şekil 4. Renshaw Hücre Uyarım
A: Renshaw hücre havuzu görüntüleri iki farklı büyütme (20X ve 40X hedefleri) alınan aynı dilim eğik bir soğutucu vasıtasıyla satın aldı. ventral kök (ok) içine birleştirme motonöron aksonlar unutmayın. Varsayılan Renshaw hücreleri ok uçları ile gösterilir. Ölçek çubukları: A1 100 mikron, A2 B 50 mikron. Ventral kök (siyah nokta) uyarımı takiben Renshaw hücresi Gerilim-kelepçe kayıtları. kırmızı iz gri olanları ortalamasıdır. Holding gerilimi -45 mV olarak belirlendi. QX-314 hücre içi çözelti içinde ateşleme ve GABA hücreyi engelledi ve glisin tepkileri, sırasıyla 3 uM gabazine ve 1 uM striknin, bloke edilmiştir. Siyah nokta uyaran zamanlamasını gösterir.com / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir, güvenilir, kapsamlı ve belirli bir şekilde tek bir omurga segmentinde motornöron havuzları ve Renshaw hücreleri tek taraflı uyarılması için izin verir çünkü omurilik eğik dilimleme önemlidir. Ayrıca, kaydedilen motor nöronlar, hızlı, zarif ve olmayan belirsiz tanımlanmasına izin verir. Sonra, diğer dilim hazırlama yöntemlerine göre bu tekniğin avantajlarını vurgulamak olacaktır, ve sonra biz bu yordamı gerçekleştirirken önlemek için en yaygın tuzaklar stres olacak.
Enine kesitlerle çalışmaların çoğu içsel elektriksel özellikleri 3,14,15,29 kendi kimlik dayandırırlar. Ancak, bu belirli bir havuz (alfa, beta ve gama-motor nöronlar 30) içinde motornöron havuzları arasında yanı sıra motornöron alt tipleri arasında büyük farklılıklar göstermektedir. Bu nedenle, boyut parametreleri kullanılarak çalışmalar, daha küçük bir y-motor nöronlar dahil muhtemeldir. Öte yandan, Cooper ve Sherrington Daksonları 31,32 artan geçmişti maymunlar ve kediler lomber spinal kord Ventrolateral gri cevherde 1940 yılında büyük sinir hücrelerinin bir grup escribed. motonöron mis yakın olmasının yanı sıra, onlar motor nöronlar gelen histolojik ayırt edilemez ortaya çıktığını kaydetti. Yeni bir makale fare 33 bu hücrelerin varlığını doğruladı. Nedeniyle bu hücrelerin ve konumlarını büyük boyutu, onlar yanlışlıkla eski çalışmalara dahil olabilirdi. büyüklükleri ne olursa olsun tüm motor nöronlar güvenilir kimlik izin verirken onların akson, ventral kök proje olmadığından bizim kimlik kriter, olası omurilik sınır hücreleri hariç. Ayrıca, içsel elektriksel özelliklere analiz, (örneğin, giriş direnci), bir antidromik aksiyon potansiyelinin basit gözlem daha daha zaman alıcı.
Bazı Studie iç elektriksel özellikleri kullanmanın yanı sıraenine kesitlerle s, (örneğin Islet-1/2 16 gibi) ya da labelings 14,17 biocytin kullanarak morfolojisi görselleştirerek motor nöronlar için moleküler belirteç post hoc analiz yaparak kendi kimliğini onaylamak. Bu tür tanımlamalar ancak sıkıcı ve doğrudan kimlik vermeyin. Bu nedenle nadiren sistematik yapılmaktadır.
Bazı çalışmalar, genetik olarak kodlanmış motonöron floresan işaretleyici (Hb9-GFP fare hattı 18 ifade fare hatları faydalanmak motor nöronlar 19 veya G85R SOD1-YFP transgenik farelerin de dahil olmak üzere kolinerjik hücrelerde eGFP ifade eden transgenik fareler, EGFP ChAT çalıştı hangi kuvvetle) motonöronlar 17 YFP füzyon proteini ifade eder. Genetik markör ifade genellikle zaman ve dilimler yana koşullanır Ancak, genellikle, embriyolar veya çocukların alınır, marker sentezleme yaşı s yeterli olmayabilirtudy gerçekleştirilir. Diğer çalışmalar motonöron havuzu 34 görselleştirmek için retrograd ajan enjeksiyonu kullandık. Biz de soleus veya EDL (kişisel gözlem) içine Kolera toksini beta enjeksiyonu yapılır. Böyle etiketleme teknikleri, belirli bir motor nöron havuzu etiket değeri büyüktür ama deney öncesinde birkaç gün sıkıcı ameliyat gerektirir. Ayrıca, dilim deneyleri yapılmaktadır hangi genç yaşta, önemli ölçüde zor özellikle kasları hedef yapar. Son olarak, bir eksojen madde enjekte edilerek motornöron perturbing gerçek bir endişe var.
Optimum koşullar altında biz kaydedilen motor nöronlar neredeyse tüm antidromik aksiyon potansiyelleri elde başardık. kullanılan 35 ° 'lik açı yeterli uzunlukta arka kökler elde edilmesi için çok önemlidir. Sonuç olarak, eğik dilim hazırlama diğer kimlik tekniklerine üstün her motonöron, tanımlamak için hızlı ve güvenilir bir yol sunar.
Giriş bölümünde belirtildiği gibi, sadece iki çalışma enine dilim ventral köklerin başarılı uyarılması bildirdi. İlk çalışma sıçan servikal nöronlar kaydedildi ve ventral kök saplama 4 ortaya beyaz madde uyarılır. Onlar başarılı kaydedilen nöronların% 85'inde antidromik aksiyon potansiyelini kaynaklı. Biz onların yüksek başarı oranı servikal düzeyde, akson ve motor nöronlar somas aynı düzlemde olmasına dayanıyordu inanıyorum. Bu daha kaudal dilim söz konusu değildir. Hatta servikal düzeyde, kendi enine dilim sadece uyarmak için daha az güvenilir ventral köklerinin koçanları, korudu. İkinci çalışma civciv embriyo dorsolomber segmentini 5 uyarılmış. Ancak, tek hücre düzeyinde bir antidromik aksiyon potansiyelleri uyaran başarısını göstermek için uzaysal çözünürlüğü yoksun gerilim duyarlı boya kayıt kullandı.
Bizim dilim preparatiyon de son yazıda 28 belirtildiği gibi Renshaw hücreleri uyarmak için üstün bir yol sunar. Eğik dilim kullanarak,% 10 başarı oranı bir büyük gelişme oldu olguların% 46 monosinaptik Renshaw hücreleri yanıtları kaydetmek başardık enine dilim 35 kullanılarak karşılaştı. Biz motonöron havuzları uyarılması için benzer bir karşılaştırma bulamadık rağmen, Renshaw hücrede bu gözlem motor nöronlar da daha fazla bağlantı korumak inanmak bizi götürür.
Omuriliğin eğik dilimleme güvenilir bir kayıt hangi bir hazırlık almadan önce çok pratik gerektirir son derece zorlu bir tekniktir. çok ince ve keskin cımbız ve mikro-makas kullanılarak esastır. Tüm prosedür soğutulmuş carbogen-kabarmış diseksiyon ortamda yapılır olarak diseksiyon harcanan zamanı sürece (1 saat kadar) oldukça uzun olabilir. Bazı yazarlar intrakardiyak perfusio herhangi bir fayda kabul etmezkenn, dilim 36 hazırlanmasında olarak, bu işlem adımı muhafaza etmeye karar verdi. Objektif yaşla birlikte değişir çünkü özellikle, kayıtların kalitesi için intrakardiyak perfüzyon yararı ölçmek zordur.
en kritik faktör fare yaştır. Başarıyla yukarıdaki protokol kullanılarak P2 ve P11 ile farelerden kaydedilen. Bu yaş geçmiş, omurilik miyelin çok yoğun olur ve büyük hücreler (motor nöronlar) nedeniyle oksijen yoksunluğu, dilimleme önce büyük olasılıkla ölmektedir. O pencereden sonra, giderek zor sağlıklı dilimler elde etmek bulundu. Son zamanlarda, yeni teknikler yaşlı hayvanlarda 17,36 sağlıklı dilimler elde etmek bildirilmiştir. Eff sınırlamak için hücreler 37,38 ve polietilen glikol onkoz bilmek konsantrasyonları - böyle enerji (etil-piruvat) tamamlayıcı kaynakları, düşük Na ve Cl olarak kesme ve kayıt ortamına ilave katkı maddeleri kullanılandilimleme sırasında meydana kapsamlı membran kesilerde ECTS. Bu tür geliştirmeler ile, 6 aylık hayvanlardan kadar kayıt başardık.
Gelecekte iki tekniğin avantajlarını birleştirmek için yetişkin hayvanlarda eğik dilim hazırlıkları girişimi ilginç olacaktır. iki protokolü birleştiren nispeten kolay ispatlamak zorundadır ve yetişkin farelerde motor nöronlar akson teminatlar ile hedeflenen nüfus motonöron kimliğinizi doğrulamak ve incelemek için güvenilir bir araç sağlayacaktır. Ayrıca, bir embriyo fare eğik dilim elde deneyebilirsiniz. Dikkate değer, bizim hazırlık da aktivasyon monosinaptik incelemek için teşvik edilebilir dorsal kökleri, korur ben motor nöronlar bir innervasyon yanı sıra dorsal omurilik nöron popülasyonlarının aktivasyon. Sonuç olarak, ventral kök uyarımlar güvenilir bir araç motonöron kimliğini doğrulamak için ve motonöron akson teminatlarının tarafından hedeflenen nüfus incelemek için sunuyoruz. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar fotoğraf çekmek onların yardım için Marin Manuel ve Olivia Goldman-Szwajkajzer teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca yazının redaksiyon için Arjun Masukar ve Tobias Bock teşekkür ederiz. Mali destekler la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) dökün Agence Nationale tarafından sağlanan, NIH-NINDS (R01NS077863), Thierry Latrán Vakfı (OHEX Projesi), miyopati Fransız derneği ( hibe sayısı 16026) ve Hedef ALS minnetle kabul vardır. Felix Leroy Ecole Normale Supérieure Cachan'da bir "contrat Doktora" layık görüldü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2 |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
