Summary
Vi viser hvordan du kan forberede skrå skiver av ryggmargen hos unge mus. Dette preparatet gir mulighet for stimulering av de ventrale røttene.
Abstract
Elektro opptak fra ryggmargs skiver har vist seg å være en verdifull teknikk for å undersøke et bredt spekter av spørsmål, fra mobilnettet til nettverksegenskaper. Vi viser hvordan du forbereder levedyktige skrå skiver av ryggmargen av unge mus (P2 - P11). I dette preparatet, de motoneurons beholde sine aksoner kommer ut fra ventrale røttene i ryggmargen. Stimulering av disse axoner utløser back-forplanter aksjonspotensialer invaderer motoneuron Somas og spennende den motoneuron collaterals i ryggmargen. Opptak av antidromic aksjonspotensialer er en umiddelbar, definitive og elegant måte å karakterisere motoneuron identitet, som overgår andre identifikasjonsmetoder. Videre stimulere motoneuron collaterals er en enkel og pålitelig måte å opphisse sikkerhet målene for motoneurons i ryggmargen, for eksempel andre motoneurons eller Renshaw celler. I denne protokollen, presenterer vi antidromic opptak fra motoneuron Somas samt Renshaw celle eksitasjon, som følge av ventral rot stimulering.
Introduction
Historisk sett ble motoneuron opptak med skarp-elektrode utført in vivo på store dyr som katter eller rotter 1 eller på en isolert hele ryggmargen hos mus 2. Fremveksten av patch-clamp opptaksteknikk på 1980-tallet, kalt for direkte tilgang til motoneuron Somas som forsegling måtte oppnås under visuell veiledning. Dermed har ryggmargen skive forberedelse er lett oppnådd siden tidlig på 1990-tallet tre. Men tidlig skive forberedelse ofte ikke tillate for stimulering av ventrale røttene. Så langt vi kjenner til, har bare to studier har rapportert vellykket stimulering av ventrale røtter i tverr skiver, og ingen ble innhentet fra mus 4,5.
I denne artikkelen presenterer vi en teknikk for å oppnå levedyktige ryggmargs skiver av neonatal mus (P2 - P11) hvor motoneuron bassenget beholder sine ventral rot avgang aksoner. Ventral root stimulering utløser antidromic aksjonspotensial tilbake til Somas av motoneuron bassenget spennende fra samme ventral roten. Det interesserer også motoneuron sivile mål, andre motoneurons 6-10 og Renshaw celler 11-13. Siden bare motoneurons sender sine aksoner ned ventrale røttene, bruker vi innspillingen av antidromic aksjonspotensialer som en enkel og definitive måten å, fysiologisk identifisere motoneurons 10.
I tillegg til å bruke potensielt ikke-inkluderende eller villedende elektrofysiologiske og morfologiske kriterier for å bekrefte motoneuron identitet, nyere studier på ryggmargs motoneurons også støttet seg på kjedelig og tidkrevende post hoc stainings 16. Slik identifisering er vanligvis utføres bare på et utvalg av de registrerte celler. Andre identifikasjonsstrategier stole på mus linjer der motoneurons uttrykker endogen fluorescens
Videre kan ventral rot stimulering brukes til pålitelig opphisse andre motoneurons 22,23 eller sine mål. The Renshaw celler 10,24,25. Vi presenterer her anvendelser av den ventrale rot stimuleringen i form av antidromic virkningspotensialet opptak fra motoneuron Somas, samt eksitasjon av Renshaw-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført i henhold til EU-direktiver (86/609 / CEE og 2010-63-UE) og fransk lovgivning, og ble godkjent av Paris Descartes Universitetet etikkomité.
1. Spinal Cord Slice Forberedelse
- Forbered følgende løsninger daglige eller på forhånd en dag. Hvis holdt over natten, boble med 95% O 2 og 5% CO 2 og holde nedkjølt i tett lukkede flasker.
- Forbered lav Na + kunstig cerebrospinalvæske (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 230 mM sukrose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM CaCl2, 8 mM MgCl2, 25 mM glukose, 0,4 mM askorbinsyre, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat. Boble med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,4). Siden Na-kynurenat er ofte vanskelig å oppløse, sørg for å kjøpe den som er oppført i materialer tabellen.
- Forbered K-gluconate Solusjon: 130 mM K-glukonat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM glukose, 1 mM Na-kynurenat, 2 mM Na-pyruvat, justert til pH 7,4 med KOH.
- Forbered ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2PO 4, 26 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 0,4 mM askorbinsyre, 2 mM Na-pyruvat. Boble med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,4).
- Før begynnelsen av disseksjon, oppløses 2% agar i 80 ml av K-glukonat-løsning, og holdes varm ved 60 ° C.
- intrakardial perfusjon
- Utfør dette preparatet på kvinnelige og mannlige mus, som varierer i alder fra P2 til P11.
- Bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av 0,1 ml av 25 mM natrium-pentobarbital (50 mg / kg).
- Ved hjelp av nåler eller tape, immobilisere musen på ryggen på en stor petriskål fylt med silikon. Bruk en dissekere mikroskope for resten av disseksjon.
- Hold spissen av sternum, løfte brystet og kuttet membranen hjelp av gode saks. Deretter åpne brystet på begge sider ved å skjære gjennom ribbene for å blottlegge hjertet.
- Skjær høyre forkammer før punktering venstre ventrikkel med en 27G nål.
- Perfuse med iskald lav Na + ACSF. Etter 30 sek, bør lav Na + ACSF sees som strømmer ut av atriet. Lave mengder av natrium forhindre celler fra spiking og redusere cellulær død under dissekering.
- Hold nålen i hjertet under dissekere mikroskop til leveren blir gul når blodet blir drenert.
- Ryggmargs disseksjon
- Halshogge dyret og satte den på magen.
- Raskt fjerne huden av ryggen (figur 1A1). Lag to skjærer gjennom skuldrene og går ned brystet buret (figur 1A2). Deretter kuttet snoren som low som mulig i haleseksjonen for å isolere virvelsøylen med begynnelsen av ribbene fra den nedre del av dyret. Vend dyret igjen og fjerne innvollene fortsatt festet til ribbeina.
- Overfør ryggsøylen til en annen, mindre silisium-fylt petriskål og bruke 4 insekt pins til å holde den dorsal siden opp (figur 1A).
- Kontinuerlig perfuse dyret med karbogen-boblet ACSF (ved ca. 4 ° C) ved utføring av en laminektomi av dorsalsiden, og utsette ryggmargen fra den rostrale ende (figur 1B). For å gjøre dette, setter spissen av fine saks mellom bein og ryggmargen og kutte benet litt etter litt fra rostral slutten, og pass på å holde seg borte fra den hvite saken. Alternativ på hver side mens du bruker pinsett til å holde unna bandet av bein allerede kuttet (figur 1B1).
- Ved hjelp av de minste tilgjengelige våren saks og pinsett, løft dura og kuttpå begge sider ved å holde den løse del av dura for å unngå skade på ryggmargen med saksen. Skjær langs rostro-caudal aksen.
MERK: dura er en halvt gjennomsiktig sammenhengende membran; i denne alderen pia mater er for skjør og vil falle fra hverandre i løpet av disseksjon og kutting (figur 1B2). - Når dura er fjernet, bruk en sløv glass eller plastspiss til å presse forsiktig ledningen på venstre side av sporet dannet av den halve kuttet ryggmargen, og kutte ventrale og dorsale røtter på høyre side, fra rostral side , lengst fra der de kommer inn i ledningen (noen få mm minst, figur 1B2).
- Gjenta operasjonen på venstre side, alltid kommer fra rostral til kaudal. Hvis venstrehendt, start fra venstre side, og deretter flytte til høyre side.
- Embedding i agar
- Slip ledningen ut av ryggraden. Bruk en mindre insekt pin til pin nedledningen med dorsalflaten opp og delikat fjerne alt av membran fortsatt festet til den (figur 1C1).
- Når renset, trimme begge ender (figur 1C2). Sett inn en bøyd insekt pin i fremre del av ledningen til å manipulere ledningen og merk orientering (pil i figur 1C2). Deretter overfører ryggmargen til en iskald K-glukonat-løsning.
MERK: Denne løsningen etterligner den intracellulære sammensetningen av CSF og vil hindre cellene fra å dø av osmotisk sjokk når motoneurons vil bli kuttet 26. - Når ryggmargen er innenfor den intra-cellulære løsning, ta begerglasset med agaren ut av den tørre bad og kjøle den ned på en blanding av is og vann.
- Rør mens måle temperaturen. Når temperaturen når 38 ° C fordype ryggmargen, holder det med insekt pinnen og legg den rostralt siden ned. Forsikre deg om at ryggmargen er som straight som mulig, vekk fra veggene, hale del litt oppover (figur 1D1).
- La begerglasset i en blanding av is og vann for å tillate agar å stivne så raskt som mulig. Sørg for at den holder seg på plass og at ledningen er så rett som mulig (Figur 1D1).
- kutting
- Etter størkning, kutt agar blokken som inneholder ryggmargen på en slik måte at bunnen av blokken er ved en 35 ° vinkel med den lumbale del av ledningen (pil i fig 1D2). Den dorsale overflate bør være vendt vekk fra foten (figur 1D2).
MERK: Dette er et kritisk trinn i prosedyren, for å opprettholde kontinuiteten i motoneuron bassenger å ventrale røttene som de kommer ut. - Lim blokken inn i kammeret av vibratome hjelp cyanoakrylatlim. Dyppe den i K-glukonat-løsning og legge slushed frossen K-glukonat-løsning for å opprettholdebadekaret kjølt (under 2 ° C).
- Klipp 350 - 400 mikrometer tykke skiver av korsryggen (identifiserbare ved sin kurvatur og større diameter). I sin riktig vei (se 1.4.1.), Bruk kniven til å kutte fra dorsal til ventral overflaten og lage skiver kontinuerlig mer rostralt. Vanligvis er det 4-5 egnede skiver med ventrale røtter som strekker seg 2 mm eller mer. Bruk følgende parametere: 10 ° vinkel, 70 Hz vibrasjon frekvens og 10 mm / min hastighet av slicing.
- Etter størkning, kutt agar blokken som inneholder ryggmargen på en slik måte at bunnen av blokken er ved en 35 ° vinkel med den lumbale del av ledningen (pil i fig 1D2). Den dorsale overflate bør være vendt vekk fra foten (figur 1D2).
- inkubasjon
- Overfør skivene til ACSF ved 34 ° C. Etter ca 30 min, kjøle skiver ned til RT og begynne innspillingen.
Figur 1. Dissection
A1:. Fjerning av huden på baksiden for å eksponere den dorsale kolonne A2:Skjæring av skuldrene og ribber å frigjøre rygg kolonnen B1. Ryggsøylen festet på silikonfylte petriskål (dorsal side opp, hale side venstre) B2. Samme med ryggmargen eksponert og dissekert C1. Ryggmargs isolert . (rostralt side venstre) C2: Ryggmargs klar til å bygges inn (ventral siden opp, rostralt side venstre). Merk mindre insekt pin på rostral side D1:.. Ryggmargs i agar beger (rostralt side dow, ventral siden som vender mot bunnen) D2: Cut agar blokk med den innebygde ryggmargen. Legg merke til 35 ° vinkel ryggmargen danner med undersiden av blokken, og den lumbale utvidelse (pil). Skala barer 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Plassering av Slice inn i kammeret
MERK: Ventral røtter er av variabel størrelse.
- Forbered en boks med ulike pipetter med spissen diameter spenner 40-170 mikrometer i forveien. For å forberede suge pipetter, forberede mange pipetter med en lang taper. Ved hjelp av en diamantkniv, gjør et kutt i forskjellige posisjoner. Så under et dissekere mikroskop, bryte den ved å trykke på spissen med pinsett.
- Fjern kammeret fra innspillingen mikroskop og plassere den under et dissekere mikroskop.
- Velge en skive som inneholder en ventral rot av tilstrekkelig lengde (2 mm eller mer) for å monteres på et sugestimuleringselektrode. Velg riktig orientering av stykket med de ventrale røttene oppover (figur 2A) og delikat kutte agar rundt ventrale røttene samtidig la resten av agar rundt skive (figur 2B).
MERK: Fordi agar er fastere enn snittet, vil dette gi gjengene på skive anker å hvile på agar i stedet for på skive og dermed ennchor vil ikke skade vev. Pass på at gjengene på skive ankeret er over motoneuron basseng (vist i rødt i figur 2C). - Montere kammeret tilbake på mikroskopet og kontinuerlig perfuse opptakskammeret med ACSF med en hastighet på 1 - 2 ml / min, ved romtemperatur. Ved hjelp av en pipette glass fylt med ACSF og koblet til en sprøyte, suger man av den ventrale rot (pilen i figur 2C). For å oppnå god stimulering av den ventrale rot, må pipettespissen for å være tett rundt den ventrale roten. Ene pol bør være i den stimulerende elektrode, og den andre i badekaret (eller koblet til den plasterklem elektrode referanse).
- Oppnå patch-clamp opptak av den ønskede celletype og registrere effekten av den ventrale rot stimulering som beskrevet previsouly 10.
- Her bruker en forsterker for datainnsamling. Filter hel-celle opptak på 3 kHz. Digitalisere på 10 kHz. Kompensere bridge motstand i current-klemme-modus.
Figur 2. Ventralt Root Forberedelse
A: Lumbar ryggmargen skive innebygd i agar med ventrale rot vender opp B:. Korsryggryggmargen skive med ventrale røttene frigjort fra agar C:. Korsryggryggmargen skive med et stimulerende elektrode tett plassert rundt ventrale røttene (pil) . Legg merke til plasseringen av Renshaw celler som uttrykker rød fluorescens i chrna2-Cre mus 28 krysset med musen reporter R26 Tom 17. Scale barer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bekreftelse på Motoneuron identitet ved hjelp Antidromic aksjonspotensialer
Cell målretting
Motoneurons er funnet i den ventrale horn (synlig rødt i figur 2C). Start fra bunt av aksoner danner ventral rot og gå opp til bunten sprer fullt og man begynner å se store celler (lang soma akse, over 20 mikrometer). Oppnå hel-celle opptak av en rund sunn celle ved hjelp av en elektrode av initial motstand på 3 til 4 Megohm. Den interne oppløsning som anvendes inneholdt: 140 mM K-glukonat, 6 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-2 GTP. Juster pH til 7,3 med KOH, og osmolariteten til 285-295 mOsm ved tilsetning av destillert vann.
Når hel-celle opptak er oppnådd, gjelder en enkelt bifasestimulering av ventral root (1-50 V, 0,1 til 0,3 millisekunder) for å lokke fram en antidromic aksjonspotensial i de registrerte cellene i ventral ledningen Figur 3A1 og 3A2 showet antidromic handling. potensialer i spenning-klemme eller strøm-klemme, henholdsvis. Når du øker stimulering intensitet 1-5 V (figur 3A1) og 10-15 V (figur 3A2) den antidromic aksjonspotensialet vises i en alt-eller-ingenting mote med en ventetid på 0,9 ms og 1,1 ms, henholdsvis. Gitt at bare motoneurons sender sine aksoner gjennom ventrale røttene, er det antidromic aksjonspotensial et bevis på cellen identitet. I et mindretall av motoneurons (ca 10%), ventral root stimulering unnlatt åframprovosere antidromic handling potensial, men snarere utløst orthodromic aksjonspotensialer. Figurene 3b1 og 3B2 vise orthodromic aksjonspotensialer i spenning-klemme eller strøm-klemme, henholdsvis. Når du øker stimulering 20-30 V (figur 3b1) og 25-40 V (figur 3B2), vises et aksjonspotensial, etter et tidligere eksitatoriske postsynaptiske strøm (EPSC) eller eksitatorisk postsynaptisk potensial (EPSP). De ventetider av aksjonspotensialer er lengre (5,1 ms og 5,3 ms, henholdsvis). I disse to cellene, stimulere den ventrale rot fremkalte en feed-forward eksitasjon (motoneurons sende axon collaterals til seg selv og til andre motoneurons) som var sterk nok til å lokke fram en orthodromic aksjonspotensial. I slike celler, unnlatelse av å lokke fram en antidromic aksjonspotensial (preget av sin alt-eller-ingenting mote og en ventetid kortere enn 5 ms) ikke tillate oss å konkludere med at disse cellene ar e motoneurons. Legg merke til at den nødvendige stimulering intensitet for å frembringe mate-forward eksitasjon er høyere enn den som kreves for å fremkalle en antidromic aksjonspotensial. Alle stimuleringer som vises her er 0,1 ms, men noen ganger lengre stimulering (opp til 0,3 ms) kan være nødvendig for å lokke fram en antidromic aksjonspotensial. Renshaw Cell Stimulering Cell målretting Renshaw celler er funnet i ventral horn 27,28. Visual axon bunter med differensial interferens kontrast (DIC) avbildning ved hjelp av en 20X og en 63x mål. Start fra bunt av aksoner danner ventral rot og gå opp til aksonene begynner å spre, men er fortsatt merkbar (figur 4A, piler). Mål for cellene i mellomliggende størrelse (omtrent 10 - 15 um i diameter, figur 4A, pilspisser). Oppnå hel-celle opptak av en rund sunt utseende celle ved hjelp av en elektrode av startmotstanden 5 til 7 Megohm. Avhengig av forsøket brukte vi either Cs + -basert eller K + -basert interne løsninger 10. Cs-basert løsning forhindret store kaliumstrømmene som var synlig rundt -45 mV. I noen eksperimenter, vi også tilsatt 5 mM QX-314 for å blokkere natriumkanaler som er ansvarlige for spiking i den innspilte cellen. Cs + -basert oppløsning inneholder: 125 mM Cs-glukonat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, og 0,4 mM Na-GTP, med pH-verdien justert til 7,3 med CsOH. K + -basert oppløsningen skal brukes til å analysere både i spennings- og strøm-klemme, den Renshaw-celleresponser på ventral rot stimulering i forhold som er tilnærmet så mye som mulig de fysiologiske seg. Denne oppløsning inneholder: 125 mM K-glukonat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0,4 mM Na-GTP, med pH justert til 7,3 med KOH. Den stimulus intensitet varierte mellom 10 og 100 V, og dens varighet varierte mellom 50 og 300 usek. BIPO Lar pulser ble brukt i alle tilfeller. Response av Renshaw celler til ventral root stimulering Stimulering av ventral roten utløser corelease av glutamat og acetylkolin fra motoneuron collaterals på The Renshaw celler 10. Feed-forward hemming mediert av GABA og glysin er også rekruttert 10. 4B viser svarene på enkelt stimulering av ventral roten. Cellen ble registrert i en spennings klemme modus med cesium-basert løsning, og holdt ved en spenning på -45 mV. QX-314 i den intracellulære løsning hindret cellen fra avfyrings og GABA og glycin-responser ble blokkert med 3 uM gabazine og 1 uM stryknin, respektivt. Den innover synaptiske strøm i figur 4B er summen av glutamatergic og nikotin strømninger. 
Figur 3. Motoneuron Responses to Ventralt Root Stimulering
A1: 1 V (rød kurve) og 5 V (svart kurve) stimulering A2:.. 10 V (rød kurve) og 15 V (svart kurve) stimulations B1: 20 V (rød kurve) og 30 V (svart kurve) stimuleringer . B2: 25 V (rød kurve) og 40 V (svart kurve) stimuleringer. Svarte prikker indikerer stimulus timing. Doble pilspisser understreke forskjellen i ventetider mellom orto- og antidromic toppene.m / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 4. Renshaw Cell stimulering fra Ventral Root
A: Bilder av Renshaw celle bassenget anskaffet ved hjelp av en skrå kondensator i samme skive tatt ved to forskjellige forstørrelser (20X og 40X mål). Legg merke til motoneuron axoner fusjonerende inn i ventral root (pil). Antatte Renshaw celler er merket med pilspisser. Skala barer: 100 mikrometer i A1, 50 mikrometer i A2 B:. Voltage-klemme opptak av en Renshaw celle etter stimulering av ventral root (svart prikk). Den røde spor er gjennomsnittet av de grå. Å holde spenningen ble innstilt på -45 mV. QX-314 i den intra-cellulære løsning hindret cellen fra avfyrings og GABA og glycin-responser ble blokkert med 3 uM gabazine og 1 uM stryknin, respektivt. Svart prikk indikerer stimulus timing.com / filer / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skrå kutting av ryggmargen er viktig fordi det gjør det mulig for ensidig stimulering av motoneuron bassenger og Renshaw-celler ved en enkelt ryggvirvel segment i en pålitelig og omfattende og spesifikk måte. Videre gir det mulighet for en rask, elegant og ikke-tvetydig identifikasjon av innspilte motoneurons. Deretter vil vi fremheve fordelene med denne teknikken i forhold til andre skive tilberedningsmetoder, og da vil vi understreke ut de vanligste fallgruvene å unngå mens du utfører denne prosedyren.
De fleste studier ved hjelp av tverrgående skiver baserer sin identifikasjon på iboende elektriske egenskaper 3,14,15,29. Men disse varierer sterkt mellom motoneuron bassenger samt mellom motoneuron subtyper innenfor en gitt basseng (alfa-, beta- og gamma-motoneurons 30). Derfor studier med størrelse parametre er sannsynlig å utelukke mindre gamma motoneurons. På den annen side, Cooper og Sherrington described i 1940 en gruppe av store nerveceller i ventro-lateral grå materie i lumbar ryggmargen hos aper og katter som hadde krysset stigende axoner 31,32. I tillegg til å være nær motoneuron Somas, de bemerket at de syntes histologisk skille fra motoneurons. En nylig artikkel bekreftet eksistensen av slike celler i mus 33. På grunn av den store størrelsen på disse cellene og deres plassering, de kunne ha blitt feilaktig inkludert i tidligere studier. Vår identifikasjon kriteriet utelukker mulige spinal grense celler, siden deres axon ikke rager i ventral rot, samtidig som sikker identifikasjon av alle motoneurons uavhengig av størrelse. Videre analyse av de iboende elektriske egenskaper, (f.eks, inngangsmotstand), er mer tidkrevende enn den enkle observasjon av en antidromic aksjonspotensial.
I tillegg til å bruke iboende elektriske egenskaper, noen studies ved hjelp av tverrgående snitt, bekrefte identifikasjon ved å utføre post hoc-analyse av den molekylære markør for motoneurons (for eksempel Islet-1/2 16), eller ved å visualisere morfologien ved hjelp biocytin labelings 14,17. Slike identifikasjoner er imidlertid kjedelig og gir ikke en direkte identifisering. De er derfor sjelden systematisk utført.
Noen studier forsøkt å gjøre bruk av mus linjer uttrykker en genetisk kodet motoneuron fluoriserende fargestoff (HB9-GFP mus linje 18, chat-EGFP transgene mus som uttrykker EGFP i kolinerge celler inkludert motoneurons 19 eller G85R SOD1-YFP transgene mus som sterkt uttrykke YFP fusjonsprotein i motoneurons 17). Imidlertid, fordi den genetiske markør uttrykket er vanligvis betinget i tid og fordi skivene blir vanligvis tatt fra embryo eller yngel, kan ekspresjonen av markøren ikke være tilstrekkelig i en alder study utføres. Andre studier har brukt retrograd middel injeksjon for å visualisere motoneuron bassenget 34. Vi utførte også koleratoksin beta injeksjoner i soleus eller EDL (personlig observasjon). Slike merkingsteknikker er av stor verdi for å merke en bestemt motoneuron basseng, men krever langtekkelig kirurgi noen dager før forsøket. Videre ung alder hvor de slice forsøk blir gjort, gjør det betydelig vanskeligere å spesifikt rettet mot de musklene. Til slutt er det en reell interesse av å perturbere den motoneuron ved å injisere et eksogent middel.
Under optimale forhold var vi i stand til å skaffe antidromic aksjonspotensialer i nesten alle de registrerte motoneurons. Den 35 ° vinkel som brukes er kritisk for å oppnå ventrale røtter av tilstrekkelig lengde. I konklusjonen, skrå skive forberedelse tilbyr en rask og pålitelig måte å identifisere hver motoneuron, som er overordnet andre identifiseringsteknikker.
Som nevnt i innledningen, bare to studier rapporterte vellykket stimulering av de ventrale røtter i tverrgående snitt. Den første studien registrert livmorhals nevroner i rotte og stimulert hvit substans der ventrale rot spire kommer ut fire. De lykkes indusert antidromic aksjonspotensial i 85% av de registrerte nevroner. Vi tror deres høy suksessrate stolte på det faktum at på livmorhals nivå, aksonene og Somas av motoneurons er på samme plan. Dette er ikke tilfelle i mer kaudale skiver. Selv på livmorhals nivå, deres tverrgående skiver bare beholdt stubber av de ventrale røttene, som er mindre pålitelige å stimulere. Den andre studien stimulert kylling embryo dorso-lumbar segmentet fem. Men, de brukte spenning sensitive fargestoff opptak, som manglet romlig oppløsning for å indikere suksess for å indusere en antidromic aksjonspotensialer på celle-nivå.
Vår skive forberedelse;ion tilbyr også en overlegen måte å stimulere Renshaw celler som nevnt i en nyere artikkel 28. Ved hjelp av de skrå skiver, var de i stand til å ta opp monosynaptiske Renshaw celler svar i 46% av tilfellene, noe som var en stor forbedring fra 10% suksessrate oppstått ved hjelp tverr skiver 35. Selv om vi ikke kunne finne en tilsvarende sammenligning for stimulering av motoneuron bassenger, denne observasjonen i Renshaw celle fører oss til å tro at motoneurons også beholde flere tilkoblingsmuligheter.
Skrå kutting av ryggmargen er en svært krevende teknikk som krever mye trening før pålitelig å berede som man kan spille inn. Ved hjelp av meget fine og skarpe pinsett og mikro saks er avgjørende. Tiden som brukes dissekere kan være ganske lang tid (opp til 1 time), så lenge hele prosedyren blir utført i avkjølt karbogen-boblet disseksjon medium. Mens noen forfattere ikke erkjenner noen nytte av intrakardiell perfusion i utarbeidelsen av skiver 36, bestemte vi oss for å opprettholde dette trinnet i prosedyren. Det er vanskelig å objektivt måle fordel for intrakardiale perfusjon for kvaliteten av opptakene, særlig fordi den varierer med alder.
Den mest kritiske faktoren er musen alder. Vi har med hell tatt opp fra mus mellom P2 og P11 ved hjelp av ovennevnte protokoll. Tidligere denne alderen, blir ryggmargen myelin for tett og de største celler (de motoneurons) dør før slicing, mest sannsynlig på grunn av oksygenmangel. Etter at vinduet, fant vi det stadig vanskeligere å skaffe friske skiver. Nylig har nye teknikker blitt rapportert å oppnå sunne skiver i eldre dyr 17,36. De brukte ekstra tilsetninger til deres dissekere og registreringsmedium slik som supplerende energikilder (etyl-pyruvat), lavere Na + og Cl - konsentrasjoner for å hindre oncosis av cellene 37,38 og polyetylenglykol for å begrense effstp av de omfattende membran transections som oppstår under kutting. Med slike forbedringer, var de i stand til å ta opp fra 6 måneder gamle dyr.
I fremtiden vil det være interessant å forsøke skrå skive preparater i voksne dyr for å kombinere fordelene ved de to teknikker. Ved å kombinere de to protokollene skulle vise seg relativt enkelt og vil gi et pålitelig verktøy for å bekrefte motoneuron identitet og studere befolkningen målrettet av axon collaterals av motoneurons i voksne mus. I tillegg kan man prøve å skaffe skrå skiver i embryo mus. Verdt å merke seg, beholder vår forberedelse også dorsal røtter, som kan stimuleres til å studere aktiverings monosynaptiske jeg en innervasjon til motoneurons, samt aktivering av ryggryggmargs neuronpopulasjoner. I konklusjonen, ventral rot stimulations tilby et pålitelig verktøy for å bekrefte motoneuron identitet og å studere befolkningen målrettet av motoneuron axon collaterals. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Marin Manuel og Olivia Goldman-Szwajkajzer for deres hjelp i å ta bilder. Forfatterne takker også Arjun Masukar og Tobias Bock for korrekturlesing av manuskriptet. Finansielle støtter ble gitt av Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), NIH-ninds (R01NS077863), Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franske foreningen for myopati ( tilskuddet nummer 16026) og Target ALS er takknemlig erkjent. Felix Leroy var mottakeren av en "Contrat Doctoral" fra Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2 |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
