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Biochemistry

Detecção da actividade de dependente do pH Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54527
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

Summary

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Abstract

As bactérias são freqüentemente expostos a mudanças ambientais, tais como alterações no pH, temperatura, estado redox, a exposição à luz ou força mecânica. Muitas destas condições causar proteína se desdobrar na célula e ter um impacto negativo sobre a sobrevivência do organismo. Um grupo de chaperonas moleculares independentes, específicos de stress têm sido mostrados para desempenhar papéis essenciais na sobrevivência destas condições de stress. Enquanto totalmente dobrado e acompanhante-inativo antes de stress, estas proteínas se desdobram rapidamente e se tornar acompanhante-ativa sob condições de estresse específicos. Uma vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenados se ligam a um grande número de proteínas de agregação propensas diferentes, impedir a sua agregação e facilitar, quer directamente ou indirectamente, a proteína de redobragem após o regresso a condições não-tensão. A abordagem principal para ganhar uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo da sua activação e cliente reconhecimento envolve a purificação e subsequent caracterização dessas proteínas chaperonas utilizando ensaios in vitro. Follow-up em ensaios de estresse in vivo são absolutamente essenciais para confirmar independentemente o obtido resultados in vitro.

Este protocolo descreve in vitro e in vivo em métodos para caracterizar a actividade de chaperona E. coli HdeB, uma chaperona activadas por ácido. Medições de dispersão de luz foram utilizados como uma leitura conveniente limite para a capacidade de HdeB para prevenir a agregação induzida por ácido de uma proteína modelo estabelecido cliente, MDH, in vitro. experimentos ultracentrifugação analítica foram aplicados para revelar formação de complexos entre HdeB e sua LDH proteína cliente, para lançar luz sobre o destino de proteínas clientes após o seu regresso a condições não-estresse. ensaios de actividade enzimática das proteínas de cliente foram conduzidos para monitorizar os efeitos da inactivação HdeB no cliente induzida pelo pH e reactivação. Finalmente, os estudos de sobrevivência foram usadas para monitor a influência da função da chaperona HdeB in vivo.

Introduction

Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar 1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, 1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, proteínas da membrana periplasmática e interiores das bactérias Gram-negativas são os componentes celulares mais vulneráveis em condições ácidas com o stress 3. Para proteger sua proteoma periplasmático contra danos mediada pelo ácido rápida, bactérias Gram-negativas utilizar os chaperones peripl�micos ativada por ácido HdeA e HdeB. HdeA é um acompanhante condicionalmente desordenada 6,7. Ativação de HdeA requer profundas mudanças estruturais, incluindo a sua dissociação em monómeros, e a parcial desdobramento dos monômeros 6-8. Uma vez activado, HdeA liga-se a proteínas que se desdobram em condições ácidas. Ele evita eficazmente a sua agregação, tanto durante a incubação a pH baixo, bem como mediante a neutralização do pH. Ao retornar para pH 7,0, HdeA facilita a re-enrolamento de suas proteínas clientes de forma ATP-independente e converte de volta em seu dimérica, conformação acompanhá-inativa 9. Da mesma forma, o HdeB chaperona homóloga também é chaperona inactiva a um pH de 7,0. Ao contrário HdeA, no entanto, a atividade acompanhante de HdeB atinge o seu máximo aparente em pH 4,0, as condições sob as quais HdeB é ainda largamente postas e diméricas 10. Além disso, reduzindo ainda mais os caus pHes a inativação de HdeB. Estes resultados sugerem que apesar da sua extensa homologia, e HdeA HdeB diferem no seu modo de activação funcional que lhes permite cobrir uma ampla gama de pH com a sua função acompanhante de protecção. Um outro chaperona que tem sido implicado na resistência aos ácidos dos E. coli é o Hsp31 citoplasmática, que aparece para estabilizar proteínas desdobradas cliente até que as condições neutras são restaurados. O modo de acção exacto de Hsp31, no entanto, manteve-se enigmática 12. Tendo em conta que outras bactérias enteropatogénicas tais como Salmonella falta o operão hdeAB, é muito provável que outros acompanhantes periplásmicos ainda não identificadas podem existir que estão envolvidos na resistência ao ácido destas bactérias 11.

Os protocolos aqui apresentados permitem monitorizar a actividade de chaperona dependente do pH de HdeB in vitro e in vivo 10 e pode ser aplicado na investigação de outras chaperonastais como Hsp31. Em alternativa, a rede complexa de factores de transcrição que controlam a expressão de hdeAB pode potencialmente ser investigadas pelo ensaio de stress in vivo. Para caracterizar a função de acompanhante de proteínas in vivo, diferentes configurações experimentais podem ser aplicadas. Um caminho é aplicar condições de estresse desdobramento de proteínas e fenotipicamente caracterizar cepas mutantes que ou sobre-expressam o gene de interesse ou carregam uma deleção do gene. Proteomic estudos podem ser conduzidos para identificar quais as proteínas não agregadas sob condições de stress, quando a chaperona está presente, ou a influência de uma chaperona em uma enzima específica pode ser determinada durante condições de stress, utilizando ensaios enzimáticos 14-16. Neste estudo, optou-se sobre-expressar HdeB em uma cepa rpoH exclusão, que não tem o fator sigma de choque térmico 32. rpoH controla a expressão de todos os principais E. chaperones coli e sua eliminação é conhecido por aumentar sensitivity a condições de stress ambientais que causam a proteína se desdobrar 15. A actividade in vivo de chaperona em HdeB foi determinada através da monitorização da sua capacidade para suprimir a sensibilidade da estirpe Δ rpoH pH. Ao todo, os protocolos aqui apresentados fornecem uma abordagem rápida e directa para caracterizar a actividade de uma chaperona activada por ácido in vitro, assim como no contexto in vivo.

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Protocol

1. Expressão e purificação de periplásmico HdeB

NOTA: HdeB foi expressa em E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB 10, e purificado a partir do periplasma de lise mediante polimixina.

  1. Prepara-se uma cultura durante a noite de E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB 10 em 30 ml de LB contendo 200 ug / ml de ampicilina (LB AMP). Inocular quatro culturas 1 L de LB Amp e crescê-las a 37 ° C e 200 rpm até OD 600nm de 0,7 seja alcançado. Em seguida, adicionam-se 300 ^ M de IPTG para induzir a expressão de HdeB e diminuir a temperatura de crescimento para 30 ° C.
  2. Após 5 h de expressão de proteína a 30 ° C, a colheita das células por centrifugação a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  3. Lava-se a pelete de células com 100 ml de tampão A (Tris / HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e centrifuga-se novamente as células a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Subsequentemente, ressuspendero sedimento celular em 80 ml de tampão A, contendo 1 mg / ml de sulfato de polimixina. Para perturbações eficiente da membrana externa, agita-se suavemente a suspensão durante 1 hora a 4 ° C.
  5. Para remover a fracção citoplasmática e os detritos celulares, Centrifugar a suspensão durante 20 min a 15000 xg, a 4 ° C. Isto resulta em ~ 60 ml de sobrenadante contendo o HdeB solúvel.
  6. Dialisar o sobrenadante contendo o extracto periplasmático durante a noite contra o volume 150 vezes de tampão B (Tris 20 mM / HCl, EDTA 0,5 mM, pH 8,0) utilizando uma membrana de diálise com 6 kDa de PM de. Concentram-se as proteínas para 15 mL utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de exclusão de 3 kDa. Filtra-se a solução de proteína através de um filtro de 0,2 um de poro.
  7. Aplicar a proteína numa coluna de cromatografia de permuta aniónica (volume de coluna de 5 ml) que tinha sido equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão B com um caudal de 2,5 ml / min. Uma vez que a proteína é carregada sobre a coluna, lava-se a coluna com tampão B durante 10 min aum caudal de 2,5 ml / min. Eluir HdeB com um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,5 M em tampão B ao longo de um período de tempo de 50 min com um caudal de 2,5 ml / min 6.
  8. Identificar fracções contendo HdeB usando um 15% de SDS-PAGE. Misture 20 mL da amostra com 5 mL de 5x reduzida tampão de carga SDS. Carga de 10 ul sobre o gel e executar em tampão de Tris-glicina (14,4 g / l de glicina, 2,9 g / L de Tris, 1 g / L de sulfato de dodecilo de sódio, pH 8,3). Submeter o gel a 150 V até que a banda tenha migrado bromofenol perto do fundo do gel (~ 45 min).
  9. Piscina todas as fracções HdeB contendo, diálise a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão de armazenamento HdeB (50 mM Tris / HCl, 200 mM de NaCl, pH 8,0), e concentra-se a proteína a aproximadamente 300 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 3 kDa. Determinar a concentração de HdeB a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção ε 280 nm = 15595 M -1 cm -1. Prepare 100 mL alíquotas e sem flashze as alíquotas em nitrogênio líquido.
    NOTA: HdeB pode ser armazenado a -70 ° C durante pelo menos 6 meses.

2. Chaperone Atividade ensaio utilizando termicamente Unfolding malato desidrogenase (MDH)

NOTA: A influência da HdeB purificado sobre a agregação de desdobrar termicamente porcino malato desidrogenase mitocondrial (MDH) a diferentes valores de pH foi monitorizado tal como descrito abaixo. Todas as concentrações de proteína listadas referem-se a concentração de monómero.

  1. Para preparar MDH, dialisar MDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 100 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa.
    NOTA: diálise cuidadosa de MDH é necessária como MDH é entregue como solução de sulfato de amónio.
  2. Para remover os agregados, centrifugar a proteína durante 20 minutos a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração MDH por absorvância a 280 nm (ε <sub> 280 nm = 7950 M -1 cm -1). Prepare 50 mL alíquotas de MDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento.
  3. Coloque 1 ml cuvete de quartzo num espectrofotómetro de fluorescência equipado com suportes de amostras de temperatura controlada e agitador. Definir ex λ / em até 350 nm.
  4. Adicionar volumes adequados de pré-aquecido (43 ° C) de tampão D (fosfato de potássio 150 mM, NaCl 150 mM) com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) para a cuvete e conjunto a temperatura no suporte da cuvete a 43 ° C. O volume total é de 1000 jil.
  5. Adicionar 12,5? M HdeB (ou alternativamente o mesmo volume de tampão de armazenamento HdeB para o controlo tampão) para o tampão, seguido pela adição de 0,5 uM MDH. Começar a monitorar a dispersão da luz. Incubar a mistura reaccional durante 360 ​​segundos para permitir que suficiente desdobramento de MDH.
  6. Elevar o pH para 7 pela adição de 0,16-0,34 volume de 2 M não tamponada K 2 HPO 4 e continuar regundo a dispersão de luz para a outra 440 seg.
  7. Definir a extensão da agregação MDH que é gravado na ausência da chaperona em um ponto de tempo definido depois da neutralização (aqui depois de 500 segundos, quando foi observada dispersão da luz máxima de MDH) a 100%. Normalizar a actividade do HdeB ao sinal de dispersão da luz de MDH na ausência de HdeB a cada valor de pH indicado.

3. Detecção de HdeB-LDH Formação do Complexo pela Analytical Ultracentrifugação (AUC)

NOTA: Sedimentação experiências de velocidade de HdeB isoladamente ou em complexo com termicamente desdobramento da lactato desidrogenase (LDH) foram realizadas usando uma ultracentrífuga analítica.

  1. Para preparar a LDH, dialisar LDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 200 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa.
    NOTA: diálise cuidadosa da LDH é necessária como LDH é entregue como uma solução de sulfato de amónio.
  2. Para remover os agregados, centrífuga de LDH durante 20 min a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração de LDH por absorvância a 280 nm (ε 280 nm = 43680 M -1 cm -1). Prepare 50 mL alíquotas de LDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento.
  3. Incubar 3 LDH uM na presença e ausência de 30 uM HdeB em tampão D (pH 4 e 7, respectivamente) durante 15 min a 41 ° C.
    NOTA: A incubação da LDH a temperaturas mais elevadas resulta em completa a sua agregação, e nenhum efeito de chaperona HdeB pode ser observada.
  4. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras de carga em células contendo sector padrão em forma de peças centrais de 2 canais com comprimento de caminho 1,2 cm. Carregar as células na ultracentrífuga e equilibrar a 22 ° C durante pelo menos 1 h antes de sedimentação.
  5. amostras de rotação a 22 ° C e 167.000 xg no respectivo rotor durante 12 h, e monitorar o sedimentation da proteína continuamente a 280 nm. Como demonstrado anteriormente, a relação sinal-ruído é melhorada quando a intensidade da luz transmitida de cada canal é medido em vez de absorvância. Isto também melhora a qualidade da subsequente ajuste de dados.
  6. Realizar análise de dados com SEDFIT (versão 15.01b, dezembro de 2015), utilizando a contínua c (s) modelo de distribuição 17. Um tutorial descreve como usar SEDFIT podem ser encontrados na referência 18.
    1. Definir o nível de confiança para a regularização ME (Máxima Entropia) a 0,7.
  7. Calcular a densidade de tampão, bem como a viscosidade usando SEDNTERP 19. Para estimar a quantidade de proteína agregada cliente, comparar os integrais de LDH sedimentada em pH 4 a pH 7, como uma referência.
    NOTA: Integração das parcelas de distribuição de sedimentação pode ser feito diretamente no SEDFIT. Software alternativa para analisar dados de velocidade de sedimentação podem ser encontrados em uma revisão recente 20. </ Li>

4. Acompanhamento MDH Inactivação e Reativação na Presença de HdeB

NOTA: A influência da HdeB purificado sobre o re-enrolamento de pH-desdobrado MDH foi determinada pela monitorização da actividade MDH mediante neutralização.

  1. Incubar 1 uM MDH em tampão D, com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) durante 1 h a 37 ° C na ausência ou na presença de 25 uM HdeB. Em seguida, deslocar a temperatura a 20 ° C durante 10 min.
    NOTA: Não MDH redobragem foi observada mesmo na presença de HdeB quando MDH foi incubada a temperaturas superiores a 37 ° C.
  2. Para iniciar o re-enrolamento de ácido MDH desnaturado, neutralizar as amostras a pH 7 pela adição de 0,13-0,42 volume de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0.
  3. Após incubação durante 2 horas a 20 ° C, determinar a actividade MDH através da monitorização da queda de NADH a 340 nm 9.
    NOTA: MDH catalisa a redução dependente de NADH de oxaloacetato em L-malato. Misturar 50 uL da reacção de incubação com 950 ul de tampão de ensaio (fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 1 mM de oxaloacetato, e 150 ^ M de NADH).
    NOTA: A concentração final de MDH no tampão de ensaio deve ser de 44 nM.
  4. Monitorar a variação de absorvância utilizando um espectrofotómetro, equipada com um bloco de controlo de temperatura de Peltier ajustado para 20 ° C.
  5. Relatar a atividade MDH relativa a 44 nM MDH nativa que foi mantida a pH 7.0.

5. Efeito de HdeB A sobre-expressão em E. coli Sobrevivência ao estresse por ácido

NOTA: E. coli MG1655 ADN genómico foi isolado utilizando um protocolo publicado a 21.

  1. Amplificar hdeB de E. MG1655 coli por PCR usando primers hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG ATT CAA GTC e hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT TCA TCA TCT CTC C.
  2. Defina-se a reacção de PCR em 50 ul da seguinte forma: 10 L de 5x tampão de polimerase, 200 uM de dNTP, 0,5 uM de iniciadores JUD2, 0,5 uM de iniciadores JUD5, 150 ng MG1655 de DNA genómico, 0,5 de polimerase de ADN ul, adicionar ddH2O a 50 ul.
  3. Efectue a amplificação de hdeB como se segue: Passo 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; Etapa 2: 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C, 40 ciclos; Passo 3: 10 min a 72 ° C.
  4. O clone resultante fragmento de PCR nos sítios EcoR I e BamH I do plasmídeo pBAD18 usando métodos padrão para o sítio de restrição de clonagem. Purifica-se o plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o plasmídeo resultante por sequenciamento 10.
  5. Transformar o plasmídeo expressando HdeB ou os pBAD18 de controle de vetores vazios em BB7224 tensão (Δ rpoH) (genótipo: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / r [6; (argFlac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (FIMB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) usando células quimicamente competentes.
    NOTA: Esta estirpe é sensível à temperatura.
  6. Depois de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C e antes do plaqueamento, as células incubar a 30 ° C e 200 rpm. Realizar colónias raia-saídas individuais dos clones positivos e incubar durante a noite a 30 ° C. Prepara-se uma cultura durante a noite em 50 ml de LB Amp e cultivar as células a 200 rpm e 30 ° C.
  7. Dilui-se as culturas durante a noite de 40-vezes em 25 ml de LB Amp e as bactérias crescem na presença de 0,5% de arabinose (Ara) a 30 ° C e 200 rpm para um OD 600 nm = 1,0 para induzir a expressão da proteína HdeB.
  8. Para as experiências de deslocamento de pH, utilizar LBAmp Ara + para diluir as células a 600 nm de 0,5 OD e ajustar-se os respectivos valores de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0 e pH 4,0) por adição de quantidades apropriadas de HCl a 5 m.
  9. Após os pontos de tempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), neutralizar as culturas por adição das quantidades apropriadas de NaOH 5 M.
  10. Monitorar o crescimento das culturas neutralizados em cultura líquida durante 12 horas a 30 ° C, utilizando medições de densidade óptica.

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Representative Results

HdeA HdeB e são homólogas de E. proteínas coli, conhecida para proteger proteínas peripl�micos contra condições de estresse ácido 10. O nosso trabalho mostrou que semelhante ao HdeA, HdeB também funciona como um ácido activado de chaperona molecular. No entanto, em contraste com funções HdeA, HdeB a um pH que ainda é potencialmente bactericida, mas significativamente mais elevada do que o óptimo de pH HdeA 6,9,10,22. Para investigar o óptimo de actividade da chaperona HdeB in vitro pH, MDH nativa foi diluído em pré-aquecido (43 ° C) de tampão de pH indicado, na presença ou ausência de HdeB. Após 360 segundos de incubação, a reacção foi neutralizada incubação. Esta neutralização desencadeia agregação de MDH a 43 ° C 9. Os resultados representativos mostram que o sinal de dispersão de luz de MDH na ausência de HdeB aumenta dramaticamente após a neutralização, devido à agregação de MDH (Figura 1, bllinha ack em cada pH). Na presença de HdeB, o sinal de dispersão de luz é significativamente reduzida por neutralização de pH 4 ou 5, indicando que HdeB previne a agregação de MDH (Figura 1, pH 4 e pH 5). Em contraste, no entanto, após a neutralização de pH 2 e pH 3, MDH agrega rapidamente na mesma medida independente da presença ou ausência de HdeB (Figura 1, a pH 2 e pH 3), indicando que o pH óptimo para a actividade de chaperonas da HdeB é entre pH 4 e 5. o tampão de armazenamento HdeB não teve nenhum efeito sobre a agregação MDH (Figura 1, o controlo tampão), o que indica que o sinal de dispersão de luz reduzida de MDH na presença de HdeB a pH 4 é devido à sua função acompanhante. HdeA é chaperone activo na sua forma monomérica e desdobrado, a um pH de 2-3, mas não apresenta qualquer actividade igual ou superior a pH 4 10. Estes resultados sugerem que HdeB tem a sua actividade de chaperona óptima à volta de pH 4 10.

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Figura 1:. Chaperone actividade de HdeB a pH ácido de 0,5 uM MDH foi incubada em tampão pré-aquecido D ao pH indicado na ausência ou na presença de 12,5 pM HdeB para 360 segundos a 43 ° C. O pH das amostras foi então elevada a pH 7 (tal como indicado pelo asterisco) pela adição de 0,16-0,34 volume de 2 M não tamponada de K 2 HPO 4, MDH agregação foi medida por um adicional de 440 seg, monitorando a dispersão de luz a 350 nm a pH neutro (fundo azul). Figura é modificada a partir Dahl et al. 10 pesquisas .Este foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, funções Jakob U. HdeB como um acompanhante de proteção ácido-in bactérias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para endereçar a possibilidade de formas HdeB complexos estáveis ​​também com outras proteínas clientes, LDH 3 uM foi termicamente desdobrou a 41 ° C na presença ou ausência de 30 uM HdeB em diferentes condições de pH. A análise do comportamento de sedimentação destas amostras por ultracentrifugação analítica foi conduzida a 22 ° C. Quando LDH e HdeB foram incubadas em conjunto a pH 7 e 41 ° C, manteve-se LDH (peso molecular de 120 kDa) e exclusivamente tetramérica HdeB permaneceu dimérica. Estes resultados indicaram que as proteínas não formam complexos estáveis com pH 7, e faz LDH não sofrerem alterações irreversíveis na oligomerização mediante uma incubação de 20 min a 41 ° C (Figura 2, linha verde). De modo semelhante, manteve-se HdeB dimérica após incubação a 41 ° C e pH 4,0, o que indica que a incubação de pH baixode HdeB não afeta seu estado de oligomerização, mesmo sob condições de choque térmico (Figura 2, linha vermelha). LDH, quando incubada a pH 4 e 41 ° C na ausência de agregados HdeB rapidamente como indicado pelo facto de 40% da LDH sedimentado antes do primeiro varrimento foi registada (Figura 2, indicado no canto superior direito). A LDH remanescente pareceu sedimentar predominantemente como monómero (Figura 2, linha azul). Em contraste, a incubação de LDH e HdeB a pH 4 e 41 ° C causou uma grande proporção das duas proteínas de co-sedimentos (HdeB-LDH C), formando uma espécie nova, com um peso molecular de 134 kDa. Esta espécie provavelmente representa um complexo entre dímeros HdeB e termicamente desdobramento LDH. Além disso, na presença de HdeB, não foi observada agregação significativa de LDH antes da sedimentação, o que é consistente com as nossas medições in vitro de agregação. Estes resultados mostram que HdeB exibe actividade de chaperona na suaforma dimérica, a pH 4,0. Isto está em contraste gritante com HdeA, que é acompanhante activo na sua forma monomérica. A natureza dinâmica da HdeB que lhe permite ser submetido a rearranjos estruturais entre pH 4 e pH 7 é provavelmente suficiente para a activação da função de chaperona de HdeB 10.

Figura 2
Figura 2:. A detecção da formação de complexo entre HdeB e LDH desdobrada a pH 4 por ultracentrifugação analítica 3 LDH uM foi incubada na presença de um excesso de HdeB 10-molar em tampão D (KHPO 150 mM 4, NaCl 150 mM) durante 15 min a 41 ° C em qualquer pH 7 (linha verde) ou pH 4 (linha preta). Para comparação, LDH sozinho (linha azul) ou HdeB sozinho (linha a vermelho) foram incubadas durante 15 min a 41 ° C, a pH 4. velocidade de sedimentação ultracentrifugação analítica foi utilizada para determinar a estequiometria da HdeB, LDH, e o complexo formado entre HdeB e LDH em difcondições dife- pH. Note-se que ~ 40% da LDH agregados antes da primeira verificação quando incubada a pH 4 e na ausência de HdeB (como observado no canto superior direito). É mostrado um gráfico da distribuição coeficiente de sedimentação (C (s)) analisados ​​utilizando o programa SEDFIT. Letras indicam o respectivo estado oligomérico da LDH ou HdeB, respectivamente: HdeB D, HdeB dímero; LDH H, LDH monómero, LDH t, LDH de tetrâmero; HdeB-LDH C, complexo HdeB-LDH. A Figura é modificada a partir Dahl et ai. 10. Esta pesquisa foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, funções Jakob U. HdeB como um acompanhante de proteção ácido-in bactérias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Para testar se HdeB suporta o reenrolamento de proteínas clientes na sua neutralização, foi analisada a influência da HdeB na redobragem de MDH desnaturado do pH. Termicamente desnaturado MDH foi incubado a diferentes valores de pH, na presença ou ausência de HdeB. Após incubação de baixo pH, o pH foi neutralizado (que inicia a redobragem MDH), e a actividade MDH foi determinada após 2 horas. Como mostrado na Figura 3, a reactivação de MDH significativa foi conseguida mediante neutralização de pH 4 na presença de HdeB. Nenhuma atividade MDH foi determinado quando HdeB estava ausente da baixa de incubação pH.

Figura 3
Figura 3: HdeB facilita a redobragem de ácido desnaturado MDH para um estado enzimaticamente activa 1 uM MDH foi incubada em tampão D no pH indicado durante 1 hora a 37 ° C na ausência ou p.RESENÇA de 25 uM HdeB. Em seguida, a temperatura foi mudada para 20 ° C durante 10 min antes de as amostras foram neutralizadas a pH 7 pela adição de 0,5 M de Na 2 HPO 4. As aliquotas foram retiradas após 2 horas de incubação a 20 ° C e testadas quanto à actividade MDH. MDH actividade mediante neutralização na ausência (barras brancas) ou na presença de HdeB (barras a preto) é mostrado. Desvio padrão derivada de pelo menos 3 medições independentes é mostrado. A Figura é modificada a partir Dahl et ai. 10. Esta pesquisa foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, funções Jakob U. HdeB como um acompanhante de proteção ácido-in bactérias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Os nossos dados in vitro revelaram que se liga a proteínas de cliente HdeB modelo diferentes a pH 4, impede a sua agregação e facilita a redobragem cliente condições de pH neutro uma vez que são restaurados. Para investigar os efeitos da HdeB in vivo, ensaios de sobrevivência dependente de pH foram realizados utilizando a estirpe rpoH supressão sensível à temperatura. Esta estirpe não tem a maioria dos acompanhantes e, portanto, mais suscetíveis a temperatura elevada, baixo pH ou estresse oxidativo 15. A sobre-expressão de HdeB sob condições de pH neutro mostrou nenhum efeito sobre a taxa de crescimento da pressão, a qual cresceu comparativamente bem para a estirpe de controlo que abriga o pBAD18 vector vazio (Figura 4, não tratado). Em contraste, verificou-se diferenças claras na sua capacidade de retomar o crescimento após a pH 3 ou pH 4 tratamento com a estirpe superexpressão HdeB mostrando reprodutível melhor recuperação do baixo pH treatamento do que a estirpe de controlo. Em contraste com os nossos dados in vitro, no entanto, a presença de HdeB teve também um efeito protector significativamente a pH 3. Isto pode ser devido à concentração elevada de HdeB na célula, que pode mudar o estado de oligomerização HdeB direcção dímeros mesmo a pH 3. Note que mudando células para pH 2 ou pH 3, resultou em efeitos muito rápidos e altamente tóxicos, enquanto não matar significativa foi observada quando as células onde incubadas a pH 4 9,10,22.

Figura 4
Figura 4: HdeB protege E. coli contra a pH ácido. HdeB (círculos vermelhos) foi sobre-expresso em BB7224 (Δ rpoH) na presença de 0,5% de arabinose a 30 ° C. células BB7224 abrigando os pBAD18 vetor vazios foram utilizados como controle (círculos pretos). painel superior esquerdo mostra o crescimento de ambos stchuvas a 30 ° C, pH 7. As células foram transferidas para o pH indicado pela adição de HCl 5 M, e incubou-se durante 1 min a pH 2 (painel superior direito), 2,5 min, a pH 3 (painel inferior esquerdo) ou 30 min a pH 4 (painel inferior direito). Posteriormente, as culturas foram neutralizadas através da adição de quantidades adequadas de NaOH 5 M e o crescimento foi monitorizado em meio líquido a 30 ° C. A Figura é modificada a partir Dahl et ai. 10. Esta pesquisa foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Dahl JU, Koldewey P, Salmon L, Horowitz S, Bardwell JC, funções Jakob U. HdeB como um acompanhante de proteção ácido-in bactérias. J Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Copyright da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A fim de estudar o mecanismo de activação e função de chaperona de HdeB, grandes quantidades de HdeB tem que ser expresso e purificado. Um número de sistemas de vector de expressão estão disponíveis para a produção de níveis elevados de uma proteína alvo, incluindo vectores pTrc ou pBAD, ambos os quais foram utilizados neste estudo. Os promotores sejam facilmente acessíveis para E. coli RNA polimerase e expressão, assim, permitir fortemente regulada positivamente de HdeB em qualquer E. coli. Este aspecto é particularmente relevante para o estudo in vivo sobre-expressão de HdeB sob condições de stress ácido, em que a estirpe -deficient rpoH foi utilizada. Esta estirpe não tem a maioria dos acompanhantes e, portanto, é mais sensível para diversos estressores, incluindo temperatura elevada, baixo pH e estresse oxidativo 15. Como alternativa, a sobrevivência estudos semelhantes aos aqui apresentados podem ser realizados em estirpes mutantes que não possuem o gene de interesse.

t "> O desenho experimental para qualquer actividade acompanhante ou ensaio de redobramento tem de ser cuidadosamente considerado, tanto no que diz respeito ao tipo de cliente, a concentração da proteína do cliente e o buffer de condições. Em ensaios de chaperonas típicos, proteínas clientes modelo, tal como citrato sintase, a luciferase, a malato desidrogenase ou são desnaturadas em elevadas concentrações de ureia ou guanidina-HCl, e diluiu-se em tampão isento de desnaturante para induzir agregação de 23,13. as medições na presença de chaperones revelam a extensão em que eles impedem a agregação de proteínas. Alternativamente, os clientes são termicamente desdobrada e agregação de proteínas é monitorizada. em ambos os casos, as medições de dispersão de luz são utilizados como leitura para a agregação de proteínas. chaperonas Activo evitar a agregação de desdobramento proteínas clientes, causando assim uma diminuição do sinal de dispersão de luz 6. ambos destas montagens experimentais podem ser combinadas com baixa de incubação pH. Além de avaliar o molatividade chaperona ecular monitorando sua capacidade de prevenir a agregação de proteínas cliente em particular, a influência dos acompanhantes sobre redobragem cliente após o regresso a condições não-estresse pode ser testado 24. Isto é especialmente simples, quando as proteínas clientes possuem actividade enzimática, que pode ser utilizado como leitura quantitativa para a sua inactivação e reactivação. Enquanto redobragem mediada por chaperona é naturalmente um processo dependente de ATP, acompanhantes periplásmicos tais como HdeA, HdeB e Spy têm sido mostrados para facilitar o re-enrolamento de cliente de uma forma independente de ATP, consistente com a falta de energia no periplasma 9,25.

Estudando o ideal de um acompanhante de proteção ácido tais como HdeB pH é um desafio devido a várias razões: (i) comportamentos de agregação de proteínas chaperone-cliente ainda bem estabelecidos, tais como citrato sintase diferem em pH ácido; e (ii) apenas alguns sistemas tampão trabalhar na gama de pH entre 2-5 e são suitabela tanto para o acompanhante de interesse e a proteína cliente. Decidimos usar o tampão fosfato, embora estejamos conscientes de que este é um sistema tampão não-ideal em condições de pH ácido. No entanto, tampão de fosfato foi encontrado para ser bem adequada para caracterizar HdeA como ácido activado chaperona 9,22. medições de agregação são muito sensíveis às mudanças no conteúdo de temperatura ou tampão. Para eliminar resultados falso-positivos, pelo que recomendamos sempre testar a influência do tampão de armazenamento acompanhante na agregação cliente (Figura 1, controle de buffer). Às vezes agregação da proteína cliente ocorre tão rápido que até mesmo o melhor acompanhante pode não ser capaz de competir com o processo de agregação. Portanto, é essencial para conduzir testes preliminares para encontrar as condições ótimas de ensaio. Um bom exemplo para tal situação é dada em nossos experimentos de ultracentrifugação, onde incubação de LDH a temperaturas de> 42 ° C é tão rápido que até mesmo opresença de um excesso de HdeB não impede que a agregação de LDH. Além disso, a co-chaperonas relação chaperona / ou a razão de chaperona / cliente tem que ser determinada cuidadosamente 23. Começamos a usar um alto HdeB: relação MDH de 50: 1 em experimentos preliminares e que nos ajudou na identificação de pH 4 como o pH óptimo para a actividade acompanhante de HdeB. Em seguida, prosseguiu a análise HdeB: MDH proporções entre 1: 1 e 50: 1, a pH 4, a identificação de 25: 1 a ser a relação mais eficaz. Em contraste, HdeA suprimida agregação MDH como 10: 1 acompanhante: rácios cliente 6,9,10,22. Assim, concluímos que HdeA, em comparação com HdeB, é mais eficaz na supressão da agregação MDH como chaperona inferior: rácios de cliente fosse suficiente para suprimir completamente a agregação MDH. Outra abordagem para investigar a supressão mediada por agregação de proteínas de chaperona envolvem ensaios de spin para baixo, em que os agregados de cliente são removidas por centrifugação e quantificados por SDS-PAGE. Esta abordagem também é adequado para mONITORIZAÇÃO a influência de chaperones em agregação da proteína in vivo. cepas mutantes que ou superexpressam ou a falta do acompanhante de interesse estão expostos a condições de estresse desdobramento de proteínas. Subsequentemente, as células são lisadas e as fracções solúveis e agregados são separados e quantificados 15,16,26.

Para a detecção do complexo de cliente-chaperona, aplicou-se a ultracentrifugação analítica. Deve notar-se aqui que, com base na configuração experimental que não é possível quantificar directamente a quantidade de HdeB e monómeros de HDL ligado neste complexo, como ambas as proteínas absorvem a 280 nm. Se desejado, a estequiometria do complexo chaperona cliente pode ser determinada por marcação separadamente chaperona e proteína cliente com um cromóforo, cujo máximo de excitação se situa dentro da gama do visível. Alternativamente, a estequiometria dos clientes para dentro chaperonas complexos podem ser determinados por PAGE nativa utilizando acoplado com western blot quantitativo. Ao seguir os protocolos apresentados aqui, fomos capazes de caracterizar dois chaperones moleculares, HdeA e HdeB 9,10,22. Em geral, estes ensaios podem ser também usadas para investigar o papel de potenciais inibidores de chaperonas moleculares na redobragem de proteínas in vitro e in vivo, ou podem ser aplicados para testar a chaperonas sintéticas quanto à sua capacidade para prevenir a agregação do cliente sob tensão ácido. Além disso, os protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para análises de mutações de ponto-e / ou variantes truncadas das chaperonas activado com ácido, a fim de lançar luz sobre o mecanismo da sua activação.

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Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Claudia Cremers para ela conselhos úteis sobre ensaios acompanhante. Ken Wan é reconhecido por sua assistência técnica na purificação HdeB. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Howard Hughes Medical (a JCAB) e os Institutos Nacionais de Saúde concessão RO1 GM102829 para JCAB e ujj-UD é apoiado por uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado fornecido pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEB10-beta E. coli cells New England Biolabs C3019I
Ampicillin Gold Biotechnology A-301-3
LB Broth mix, Lennox LAB Express 3003
IPTG Gold Biotechnology I2481C50
Sodium chloride Fisher Scientific S271-10
Tris Amresco 0826-5kg
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Polymyxin B sulfate  ICN Biomedicals Inc. 100565
0.2 µm pore sterile Syringe Filter Corning 431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml) GE Healthcare Life Sciences 17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15% Bio-Rad 4561046
Malate dehydrogenase (MDH) Roche 10127914001
Potassium phosphate (Monobasic) Fisher Scientific BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic) Fisher Scientific BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer Hitachi FL25
Oxaloacetate Sigma O4126-5G
NADH Sigma  N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic Sigma  S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic Sigma  S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH) Roche 10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge Beckman Coulter 392764
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled Beckman Coulter 306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
Wizard Plus Miniprep Kit Promega A1470 used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose Gold Biotechnology A-300-500
Glycine DOT Scientific Inc DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette Hellma Analytics 119004F-10-40
Oligonucleotides Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530S
dNTP set Invitrogen 10297018
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL Millipore UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spectrophotometer Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa Spectrum Laboratories 132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K Millipore UFC803024
SDS Fisher Scientific bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler Thermo Fisher 4375786

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References

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Bioquímica Edição 116 Molecular Chaperone estresse por ácido resposta ao estresse a agregação da proteína proteína se desdobrar bactérias espalhamento de luz redobramento de proteínas Interacção proteína-proteína proteína de Controle de Qualidade.
Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em
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Dahl, J. U., Koldewey, P., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (116), e54527, doi:10.3791/54527 (2016).

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