Abstract
De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is een schadelijke soorten met een extreem hoge agrarische relevantie. Dit is te wijten aan het voortplantingsgedrag: vrouwtjes schade aan de buitenkant van groenten en fruit als ze eieren en de larven voeden zich met hun pulp te leggen. Wild C. capitata populaties zijn traditioneel gecontroleerd door middel van insecticide sproeien en / of eco-vriendelijke benadering, de meest succesvolle zijn de Steriele Insect Techniek (SIT). Het SIT is gebaseerd op massa-fokken, straling gebaseerde sterilisatie en veld vrijlating van de mannen die hun vermogen om te paren te behouden, maar zijn niet in staat om vruchtbaar nageslacht te genereren. De komst en de daaropvolgende snelle ontwikkeling van biotechnologische hulpmiddelen, evenals de beschikbaarheid van de medfly genoomsequentie, sterk gestimuleerd ons begrip van de biologie van deze soort. Dit voordeel van de proliferatie van nieuwe strategieën voor genoom manipulatie, die can worden toegepast controlepopulatie.
In deze context, embryo micro-injectie speelt een dubbele rol in de uitbreiding van de toolbox voor medfly controle. Het vermogen om te interfereren met de functie van genen die belangrijke biologische processen reguleren inderdaad vergroot ons begrip van de moleculaire machinerie onderliggende medfly invasiviteit. Bovendien de mogelijkheid om kiemlijn transformatie te bereiken maakt de productie van meerdere transgene stammen die kunnen worden getest voor toekomstige veldtoepassingen in nieuwe SIT instellingen. Inderdaad, kan genetische manipulatie worden gebruikt om gewenste eigenschappen die kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om steriele mannelijke prestaties in het veld te verlenen, of die leiden tot vroege levensfase letaliteit. Hier beschrijven we een methode om nucleïnezuren microinject in medfly embryo's van deze twee belangrijke doelen te bereiken.
Introduction
De Mediterrane fruitvlieg (medfly) Middellandse-Zeevlieg is een kosmopolitische soort die op grote schaal schade fruit en cultuurgewassen. Het behoort tot de familie Tephritidae, die verschillende soorten ongedierte, zoals die welke behoren tot de geslachten Bactrocera en Anastrepha omvat. De medfly is de meest bestudeerde soorten van deze familie, en het heeft een model niet alleen voor de studie van insecten invasies 1, maar ook voor het optimaliseren gewasbeschermingstrategieën 2 geworden.
De medfly is een multivoltine soort die kan aanvallen meer dan 300 soorten wilde en gekweekte planten 3,4. De schade wordt veroorzaakt door zowel de volwassenen als de larvale stadia: bevruchte vrouwtjes doorboren het oppervlak van de vrucht voor het leggen van eitjes, waardoor micro-organismen om hun commerciële kwaliteit beïnvloeden, terwijl de larven voeden zich met het vruchtvlees. Na drie larvale stadia, larven van de gastheer en verpoppen in de bodem. Ceratitiscapitata toont een bijna wereldwijde distributie, met inbegrip van Afrika, het Midden-Oosten, West-Australië, Midden- en Zuid-Amerika, Europa en delen van de Verenigde Staten 5.
De meest voorkomende strategieën te beperken medfly parasitaire aandoeningen gepaard met het gebruik van insecticiden (bijv Malathion, spinosad) en de milieuvriendelijke Steriele Insect Techniek (SIT) 6. De laatste benadering betreft de introductie in het wild van honderdduizenden mannen gemaakt steriel door blootstelling aan ioniserende straling. Het koppelen van dergelijke gesteriliseerde mannetjes wild vrouwtjes resulteert in geen nageslacht, waardoor een verkleining populatie, uiteindelijk leidend tot uitroeiing. Hoewel SIT effectief in meerdere campagnes wereldwijd heeft bewezen, haar belangrijkste nadelen zijn de hoge kosten van het grootbrengen en steriliseren miljoenen insecten worden vrijgegeven. Markering van de vrijgelaten personen is noodzakelijk om onderscheid te maken steriele van wilde insecten gevangen in het gebied tijdenstoezicht op de activiteiten en het wordt momenteel bereikt met behulp van fluorescerende poeders. Deze procedures zijn duur en ongewenste neveneffecten 7.
Om te optimaliseren en / of effectievere aanpak voor de bestrijding van deze plagen te ontwikkelen, hebben medfly biologie en genetica grote schaal onderzocht door vele onderzoekers wereldwijd. De beschikbaarheid van de genoomsequentie 8,9 medfly zullen nieuwe onderzoeken naar genfuncties vergemakkelijken. RNA-interferentie is een krachtig hulpmiddel voor dergelijke studies en kan worden bereikt door de micro-injectie van dsRNA (dubbelstrengs RNA) of siRNA (kleine interfererende RNA). Deze techniek is gebruikt, bijvoorbeeld aantonen dat de geslachtsbepaling moleculaire cascade in C. capitata slechts gedeeltelijk geconserveerd ten opzichte van die van Drosophila 10.
De ontwikkeling van protocollen bij medfly embryo's toegestaan C. microinject capitata de eerste niet zijn-Drosophilid Fly soorten genetisch te modificeren. Zoals de eieren zijn vergelijkbaar met die van Drosophila, zowel qua morfologie en weerstand tegen uitdroging 11 het protocol om plasmide DNA te leveren in pre-embryo blastoderm eerst ontwikkeld D. melanogaster 12,13 werd aanvankelijk aangepast voor gebruik in C. capitata. Deze eerste experimenten toegestaan medfly kiemlijn transformatie op basis van het transponeerbare element Minos 11. Vervolgens werd het oorspronkelijke systeem gemodificeerde 14 op andere transposon gebaseerde benaderingen. Dit is het geval van piggyBac van de Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Het protocol is inmiddels verder geoptimaliseerd en dit heeft de transformatie van andere Tephritid soorten 16-21 en ook van vele andere Diptera 22-31 toegestaan. Al deze systemen zijn gebaseerd op het gebruik van een typische binaire vector / helper plasmide transformatiesysteem: kunstmatige defecte transpozonen die gewenste genen worden samengevoegd in plasmide-DNA en in het genoom van het insect geïntegreerde, door in de transposase enzym 32. Een aantal transgene medfly lijnen werden gegenereerd, met meerdere functies, waaronder stammen die een conditionele dominant letale gen dat letaliteit induceert, stammen die alleen mannen nageslacht en dus zonder eigen extra sexing strategieën en stammen met fluorescerende sperma, die de nauwkeurigheid kunnen versterken van het SIT toezichtsfase 33-37. Hoewel de inbreng in het wild transgene organismen opgetreden in piloottesten tegen muggen slechts 38,39, ten minste één onderneming evalueren van een aantal transgene stammen medfly voor het gebruik in het veld 40.
Embryo micro-injectie kan ook voorstander van de ontwikkeling van nieuwe genoom-editing tools, zoals transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR geassocieerd eiwit 9 nuclease (Cas9) en homing endonucleases genen (HEGS), die nieuwe evolutionaire en ontwikkelingsstudies in staat zal stellen, alsook de uitbreiding van de beschikbare biotechnologische gereedschapskist. Genoom-editing benaderingen al kon de generatie van gen-aandrijfsystemen in muggen 41, en hun overdracht aan de medfly staat voor de deur. Hier beschrijven we een algemeen protocol voor microinjecting nucleïnezuren in medfly embryo's die nuttig kunnen zijn voor alle bovengenoemde toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimental Set-up
- insectary eisen
- Onderhouden van alle C. capitata levensstadia bij 25 ° C, 65% luchtvochtigheid en 12/12 uur licht / donker fotoperiode.
- Plaats ongeveer 1500-2000 medfly poppen in een 6 L kooi. Gebruik een kooi met een koperen gaas aan de ene kant met gaten klein genoeg om ovipositie 42 stimuleren. Plaats een spons strip door een kleine opening in de basis van de kooi om vliegen met water te verschaffen door middel van capillaire werking. Gebruik een mengsel van gist en suiker (01:10) als voedselbron voor volwassenen (Figuur 1A). Verhoog de hoeveelheid gist (tot 1: 3, gist: suiker) moet de vrouwtjes niet om eieren te leggen.
- Plaats een bord gevuld met water onder de kooi om de eieren afgezet door de mazen te verzamelen. Zoals maagdelijke vrouwtjes eieren leggen, wachten tot de vliegen zijn ten minste 6-7 dagen voor het verzamelen van eieren voor de micro-injectie experimenten. Dit zal ervoor zorgen dat de vrouwtjes zullen gepaard hebbenen dat de eieren zijn bevrucht.
- Verzamel de eieren door het filteren van het water met een fijne net zeef. Breng de eitjes uit de zeef in een plastic doos met standaard larven eten (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g breedspectrum antimicrobiële stof opgelost in 50 ml ethanol, 400 g suiker, 175 g gedemineraliseerd biergist, 1 kg zachte tarwezemelen) met een Pasteur pipet.
- Plaats elke doos in een transparante container afgesloten met een netto-deksel om luchtcirculatie mogelijk te maken en met een laag van zemelen te verpoppen (Figuur 1B) te bevorderen.
- Na ongeveer 10 dagen, te controleren op 3 e instar larven die voortkomen uit de larven eten en spring naar beneden in de zemelen laag voor de verpopping.
- 24 uur later, het verzamelen van de poppen in een kleine beker met behulp van een zachte borstel en overbrengen naar een nieuwe volwassen kooi. Volwassenen normaal ontstaan 10 dagen na verpopping. De opkomende fly maakt gebruik van de ptilinum, een opblaasbare zak zich op zijn hoofd boven the basis van de antennes, kracht van het uiteinde van de puparium. Na de opkomst, de ptilinum stort definitief terug in het hoofd.
- Bereiding van 1 L voedsel voor de micro-injectie larven
- Los op 2,5 g agar in 300 ml H2O
- Warm 500 ml H 2 O op een hete plaat roeren en los 4 g natriumbenzoaat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g gistextract en 115 g gedroogde wortel poeder.
- Toevoegen aan het mengsel een oplossing van 2,86 g breedspectrum antimicrobiële stof opgelost in 10 ml absolute ethanol.
- Verdeel het medium in 15 cm rond petrischaaltjes en laat afkoelen. Eventueel, bewaren bij 4 ° C.
- Slide voorbereiding
- Plaats een 2 cm strook dubbelzijdig plakband op een microscoopglaasje (75 x 26 mm 2) en markeer de randen met een porseleinen marker, olie verspreid en de daaruit uitdrogen van de geïnjecteerde embryo's te voorkomen.
- Isoleer plasmide-DNA met behulp van commercieel verkrijgbare kits 34. Precipitaat het plasmide met behulp van ethanol en resuspendeer in injectie buffer (0,1 mM fosfaatbuffer pH 7,4, 5 mM KCl) in de gewenste concentratie.
- Zuiver in vitro gesynthetiseerd lange dsRNA met behulp van fenol-chloroform, neer te slaan met behulp van isopropanol en resuspendeer in injectie buffer 43.
2. Embryo Voorbereiding
- Plaats een bak gevuld met water onder een kooi met 6-7 dagen oude volwassenen.
- Laat de vrouwtjes eieren leggen gedurende 30 min en vervolgens het verzamelen van de embryo's door het filteren van het water met behulp van een fijne zeef. Houd altijd de zeef in water om uitdrogen van de embryo's te vermijden.
- Dechorionate de embryo's door alom tegenwoordige de zeef gedurende 5 sec in een commercial van 50% bleekwater oplossing.
- Was de embryo's zorgvuldig door herhaaldelijk alom tegenwoordige de zeef in een schone ultrapuur water (minstens4-5 keer). Tot slot plaatst u de zeef in een schone ultrapuur water. Gebruik de embryo's binnen maximaal 2 uur.
OPMERKING: De timing van microinjectie is gerelateerd aan de noodzaak te injecteren in vooraf blastoderm embryo, tijdens een fase van nucleaire divisies vóór cellularization. Hierdoor kan de geïnjecteerde DNA te nemen boven in de kernen, in het bijzonder in de primordiale kiemcellen celkernen dat de gameten zal ontstaan. In Drosophila, cellularization op de paal cellen begint ongeveer 90 minuten na de bevruchting (bij 25 ° C), met blastoderm vorming optreedt ongeveer 30 minuten later 44, terwijl in de medfly cellularization plaatsvindt tussen 9 en 12 uur 45,46. - Embryo oriëntatie in rijen
- Met behulp van een fijn penseel, verzamelen ongeveer 50 embryo's en leg ze op een schijf van zwarte filter papier doorweekt met water.
- Onder een dissectie stereomicroscoop, regelen de embryo's in een rij op het bovenoppervlak van de dubbelzijdige tapede microscoop dia met een fijn penseel (000) (figuur 1C).
LET OP: Breng de embryo's allemaal in dezelfde richting, als injectie wordt uitgevoerd in het achterste paal, waar de kiem-lijn zal zijn ontstaan; de achterpool tegengesteld is aan de micropyle regio. - Bedek de embryo's met een laag van chloortrifluorethyleen olie om ervoor te zorgen dat de olie niet overlopen china marker grenzen (zie 1.3).
Opmerking: Voor afdekking van de embryo met olie, een verdere stap kan worden uitgevoerd: het embryo kan worden gedroogd gedurende enkele minuten om de vloeistof te verlagen en daarmee de ingang van de geïnjecteerde DNA-oplossing te vergemakkelijken. Dit kan helpen bij injectie of overmatig lekken van de geïnjecteerde oplossing voorkomen embryo barsten als gevolg van de hoge vloeistofdruk.
3. Embryo Micro-injectie
- Vul een naald (1-2 ul) met plasmide DNA of dsRNA oplossing (1-2 ug / ul) met een micropipet.
- Voer microinjectie onder een stereomicroscoop, met een micromanipulator om de bewegingen van de naald (figuur 1D) regelen. Gebruik de microscoop podium aan de dia te verplaatsen.
- Plaats het preparaat op het stadium van het toepassingsgebied.
- Steek de punt van de naald in de achterste pool van de embryo (figuur 1E).
- Injecteer de oplossing door het activeren van de micro-injectie-systeem met het pedaal. De geïnjecteerde vloeistof induceert een toename van de inwendige druk, resulterend in een lichte beweging van de embryo.
- Laat het pedaal en meteen, maar voorzichtig, verwijder de naald uit het embryo.
- Observeer een beetje cytoplasma lekkage op de injectieplaats.
OPMERKING: Om onderscheid te maken tussen potentiële dodelijke effecten van DNA / dsRNA / siRNA en sterfte als gevolg van de micro-injectie proprocedure zelf, moet controle-experimenten worden uitgevoerd. Deze omvatten de injectie van alleen buffer of, in het geval van omgekeerde genetica experimenten, een groen fluorescerend eiwit (GFP) -afgeleide dubbelstrengs RNA (dsRNA-GFP) of siRNA.
- Na injectie incubeer de embryo's bij 25 ° C.
4. na injectie Procedures
- Twee dagen na de injectie, controleer dan de dia's voor uitgekomen larven (figuur 1F) onder een stereomicroscoop. Larven kunnen bewegen in de olie, maar moeten zo snel mogelijk worden overgedragen aan larven eten. Om deze reden is, controleert u de dia's meerdere keren per dag.
- Met behulp van een fijn penseel (000), zachtjes de uitgekomen larven te dragen aan de wortel-gebaseerde larven eten. Transfer tot maximaal 200 larven per elke petrischaal.
- Incubeer de larven aan 65% vochtigheid (25 ° C). Zorg ervoor dat het deksel kleeft niet aan het gerecht, afbreuk te doen aan de uitwisseling van lucht.
- Houd de Petrischalen met het dekselmeestal gesloten, zodat er nog luchtstroom naar de larven. Om uitdroging te voorkomen, controleert u de gerechten dagelijks en, indien nodig, voeg water toe om te compenseren voor verdamping.
- Leg de Petrischalen in een duidelijke container afgesloten met een netto-deksel en met een laag van zemelen te verpoppen bevoordelen. Zoals voor routine insectary opfok, 3 e instar larven sprong uit de larvale voedsel en verpoppen in de zemelen.
- Verzamel de poppen en leg ze in een kleine kooi voor volwassen opfok en screening (dit is Generation 0, G0). Achter het nageslacht op standaard larvale voedsel.
- In het geval van kiem-lijn transformatie-experimenten, controleren op mogelijke omgevormd individuen in de volgende generatie (G1), zoals geïnjecteerd individuen meestal hersenschimmen. Transposities inderdaad zou kunnen optreden in een van de kernen van de embryonale syncytium, waarbij ofwel de kiemlijn of soma zal vormen.
- Kort na opkomst, verdoven G1 individuen met behulp van CO 2 en controleer transformatie gebeurtenissen onder een epifluorescentie stereomicroscoop. Om te screenen op de aanwezigheid van rode fluorescentie, gebruik dan een DsRedwide filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), terwijl voor het screenen op groene fluorescentie gebruik maken van de EYFP filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
- Plaats veranderd individuen in een kleine kooi met wildtype volwassenen van het andere geslacht en ontstaan nieuwe, aanvankelijk heterozygoot stam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we twee toepassingen van micro-injectie embryo gericht op de functionele karakterisatie van een gen van belang (Geval 1), en bij het genereren van transgene stammen (Geval 2), respectievelijk.
Levering van dsRNA tot embryo's om de functie van genen te ontrafelen.
De innexin 5-gen codeert voor een gap-junction dat in insecten, wordt specifiek tot expressie in de mannelijke en vrouwelijke geslachtsklieren 43,47,48. Op basis van de beschikbare middelen voor nauw verwante soorten informatie, werd de dsRNA-geïnduceerde gene silencing naar verwachting resulteren in de ablatie van de medfly vrouwelijke en mannelijke kiem-lijn. In totaal werden 2400 embryo's werden geïnjecteerd met 2 ug / ul dsRNA mengsel, waaruit uitgekomen larven 548 en 216 volwassenen overleefden (ongepubliceerde gegevens). In ongeveer 75% van de volwassenen, testes en eierstokken bleek ofwel onder-developed of totaal afwezig (figuur 2). Kwantificering van innexin 5-transcript overvloed in de abdomens van individuen van beide geslachten bevestigde de significant lagere expressie van het gen, in vergelijking met de controles.
Genereren van transgene stammen met fluorescerende spermatozoa.
Medfly transgene stammen met fluorescent gelabelde sperma werden gegenereerd door Scolari en collega's 34 door het injecteren van embryo's met plasmide-DNA. Het mengsel bevatte twee plasmiden gemengd in vaste relatieve percentages: één, de "helper plasmide", gecodeerd piggyBac het transposase; anderzijds de "Donor plasmide", bevatte de kunstmatige transposon en droeg twee fluorescente merkers, een uitdrukking in de soma van mannen en vrouwen, de andere specifiek in de testes. De promoter van het beta 2-tubuline gen verantwoordelijk voor de tEstes-specifieke expressie, werd gefuseerd aan de ATG van de coderende sequenties van de fluorescerende eiwitten turboGFP (construct # 1260) of DsRedExpress (construct # 1261), respectievelijk. Een totaal aantal van 821 embryo's werden geïnjecteerd, waarvan 205 larven uitgekomen en 37 volwassenen overleefd. 9 vrouwen en 8 mannen kruisingen werden opgezet, waarvan 6 gaf fluorescerende nageslacht 34 (License om deze gegevens verkregen van Elsevier hergebruiken - licentienummer 3796240759880). De succesvolle transformatie geleid tot de ontwikkeling van stammen met groene en rode fluorescerende testes, respectievelijk (figuur 3).
Figuur 1. insectary apparatuur en embryo's. (A) Standard grootbrengen kooi met 1500-2000 volwassenen. De vrouwtjes leggen eieren via koperen gaas aan de voorzijde van de kooi. Eieren worden verzameld in het water. Aan de linkerzijdekant van de kooi, de gebruikte filter om de eieren te filteren zichtbaar. (B) Twee dozen van de standaard larvale voedsel met larven. De dozen worden geplaatst in een grotere heldere plastic doos die zemelen verpopping vergemakkelijken; het net over de doos is verwijderd. (C) Embryo's in rijen. De randen van de dubbele kleefband op de dia gemarkeerd met een wit marker. Eieren afgestemd op de band zullen worden gedekt met chloortrifluorethyleen olie. (D) Micro-injectie inrichting (links) verbonden met een stereomicroscoop uitgerust met een micromanipulator (rechts). (E) Embryo polen; de rode pijl geeft de achterste paal (de injectieplaats), terwijl de zwarte pijl geeft de voorste paal (waar de micropyle zich bevindt). Schaal bar = 500 pm. (F) Uitgekomen larven bewegen in de olie. Schaal bar = 500 pm. Pleidooise klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Mannelijke en vrouwelijke met onderontwikkelde geslachtsklieren. Vrouw (links) en mannen (rechts) ontleed reproductieve traktaten. Boven: wild-type individuen met een normale geslachtsklieren. Onder: bemoeid personen met onderontwikkelde geslachtsklieren. MAG: Male Accessory Klieren; Sp: spermathecae. Schaal bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Transgene mannetjes met fluorescerende testes en sperma. Volwassen mannetjes getransformeerd met construct # 1260 en # 1261, respectievelijk. Pijlen geven de fluorescent testes. # 1260 mannen laten zien rood lichaam en groene testes, terwijl # 1261 mannen laten zien rood testes en groene lichamen. Schaal bar = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Micro-injectie van nucleïnezuren in insectencellen embryo is een universele techniek die zowel de analyse van genfuncties en biotechnologische toepassingen vergemakkelijkt.
De recente publicatie van de genoomsequenties van steeds insectensoorten leidt tot een dringende behoefte aan instrumenten voor de functionele karakterisering van genen van nog onbekende functie. RNA-interferentie heeft bewezen een van de meest waardevolle methoden om moleculaire functies 49 afleiden en embryo microinjectie ondersteunt deze studies.
Injectie van plasmide-DNA kan worden gebruikt om insecten genomen middels transposase bemiddelde geninsertie wijzigen en, meer recentelijk, genoom-bewerkingsgereedschappen (bv TALEN, CRISPR / Cas9, HEGS). Deze technieken zijn al kon de ontwikkeling van stammen van meerdere soorten insecten die kunnen worden gebruikt voor ongediertebestrijding's, die gericht is op de uitroeiing of de vervanging van wilde populatie wet insecten met gemodificeerde biologische kenmerken. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor medfly embryo micro-injectie met ofwel plasmide DNA of dsRNA.
De beschikbaarheid van gevestigde en kosteneffectieve halfdroog larvale medium voor medfly fokken, evenals de uitgebreide moleculaire informatie verkregen over de jaren door onderzoekers bestuderen de geslachtsbepaling en cellularization proces deze soort sterk de vaststelling van een betrouwbare vergemakkelijken embryo micro-injectie protocol. In het bijzonder heeft de kweek protocol geoptimaliseerd om de maximale vruchtbaarheid en vitaliteit van de embryo's te verzekeren. Dit is belangrijk om de kans op het verkrijgen van levensvatbare volwassenen met het kleinste aantal geïnjecteerde embryo mogelijk te maximaliseren. Verschillende protocollen beschikbaar voor medfly fokken, zoals de wortel-gebaseerde larven eten dat we beschrijven achter de geïnjecteerde larven. Deze methode is duurder en de bereiding meer tijdrovend danandere media gebruikt voor normale opvoeding.
Een belangrijke belemmering voor het gebruik van micro-injectie is de niet-specifieke schade door mechanische manipulatie van het embryo. Dit omvat meerdere variabelen beïnvloeden overleving van embryo's, zoals het doorboren van het embryo membranen met de kwast gebruikt om de embryo, het geïnjecteerde volume, de injectieplaats en buffer oriënteren en het type naald gebruikt 50. Sommige van deze parameters zijn geoptimaliseerd, zoals het geïnjecteerde volume en de buffer. Bij naalden, kunnen ze ook worden geproduceerd in-house met een trekker, en dit vereist een optimalisatie stap het ideale protocol te bepalen.
Onder de belangrijkste nadelen van de micro-injectie procedure eveneens dechorionation: hoewel deze stap is essentieel om de eieren makkelijker handler (dwz minder glad) en injectie te vergemakkelijken, kan langdurige blootstelling aan bleken sterk beïnvloeden embryonale vitaliteit. for daarom het protocol hier beschreven meldt het gebruik van een zeer korte dechorionation tijd (5 seconden), die is ingesteld als een goed compromis tussen het verwijderen van de chorion en overleving.
De protocollen die gebruikt worden om de achterkant van de latere levensfase zijn ook relevant. Larven uitgebroed uit geïnjecteerde embryo's moeten zo snel mogelijk uit de olie te verwijderen. Olie is ook essentieel om ervoor uitdrogen van de embryo's te voorkomen, maar kan schadelijk voor de larven. De methode voor larven, de tijd in de olie te verwijderen en het type gebruikte levensmiddelen zijn belangrijke variabelen die moeten worden beschouwd, aangezien zij de uiteindelijke overleving in gevaar kunnen brengen.
Bij het screenen volwassen en larven, kan de immobilisatie werkwijzen ook kritisch. Medfly volwassenen kunnen worden geïmmobiliseerd met behulp van ijs of CO 2, maar langdurige blootstelling kan schadelijk voor volwassen overleven. Als alternatief voor micro-injectie embryo, is orale afgifte bewezeneen minder invasieve en potentieel high-throughput werkwijze voor RNAi assays. Het kan bijzonder effectief soorten die niet vatbaar zijn voor micro-injectie, alsook voor RNAi-gemedieerde ongediertebestrijding in veld populaties.
In dit document, zijn twee gevallen gemeld als voorbeeld van de mogelijke toepassingen van het protocol beschreven: ten eerste de succesvolle transformatie doorgaande transposase-bemiddelde geninsertie van de medfly genoom, die tot de oprichting van meerdere stammen met fluorescerende testes. Gebruik van een overeenkomstige procedure micro-injectie, kunnen ook dsRNA te injecteren, met de gevolgen van de knockdown zichtbaar tot het volwassen stadium.
De oprichting van een betrouwbare micro-injectie protocol voor de medfly embryo's opende de weg naar genetisch gemodificeerde stammen beschouwen als een instrument om te vliegen in het wild te controleren, als alternatieve of complementaire strategieën om de klassieke aanpak, met inbegrip van de Steriele InsectTechniek. Ten slotte zou de recente vooruitgang in de technologie voor geautomatiseerde micro-injectie in zebravis embryo's die mogelijk helpen bij de ontwikkeling van high throughput systemen voor de overbrenging met belangrijke belang voor het creëren van transgene stammen van het medfly en andere relevante plagen 51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x injection Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl | ||
| Construct Plasmid | |||
| Helper Plasmid | |||
| dsRNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L | ||
| Adult Food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | |
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | |
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | |
| Double slided tape | |||
| Whatman Black circle paper | Sigma-Aldrich | Z695505 | |
| Bleach | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | |||
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | |||
| Chlorotrifluoroethylene oil | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | The strain used is ISPRA |
References
- Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
- Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
- Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
- Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
- Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
- Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , Springer. (2005).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. , Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
- Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. , Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
- Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
- Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , 3rd edn, Academic Press. (2013).
- Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
- Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
- Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
- Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
- Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
- Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
- Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
- Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
- Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
- Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
- Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
- Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
- Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , Springer. Netherlands. (2003).
- Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. 3-26 (2000).
- Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
- Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
- Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
- Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
- Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
- Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
- Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , Academic Press. (2009).
- Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. , Springer. 85-93 (2007).
- Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
- Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. , CABI. 188-207 (2014).
- Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
