Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Levering av nukleinsyrer gjennom Embryo Mikroinjeksjon i Worldwide Agricultural Pest Insect, Published: October 1, 2016 doi: 10.3791/54528
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Abstract

Middelhavet bananflue (medfly) appelsinflue (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) er en pest arter med ekstremt høy landbruks relevans. Dette er på grunn av sin reproduktive atferden: hunner skade den ytre overflaten av frukt og grønnsaker når de legger egg og klekket larver lever på sin masse. Wild C. Capitata populasjoner er tradisjonelt kontrolleres gjennom insektmiddel sprøyting og / eller miljøvennlige tilnærminger, den mest vellykkede være Sterile Insect Teknikk (SIT). SIT er avhengig av masseoppdragelse, stråling basert sterilisering og felt utgivelsen av menn som beholder sin evne til å parre seg, men er ikke i stand til å generere fruktbar avkom. Advent og den påfølgende raske utviklingen av bioteknologiske verktøy, sammen med tilgjengeligheten av medfly genomsekvens, har i stor grad styrket vår forståelse av biologi av denne arten. Dette favoriserte spredning av nye strategier for genom manipulasjon, som can brukes til befolkningskontroll.

I denne sammenheng spiller embryo mikroinjeksjon en dobbel rolle i å utvide verktøykassen for medfly kontroll. Evnen til å forstyrre funksjonen av gener som regulerer viktige biologiske prosesser, ja, utvider vår forståelse av det molekylære maskineri underliggende medfly invasivitet. Videre er evnen til å oppnå bakterie-linje transformasjon letter produksjon av flere transgene stammer som kan testes for fremtidige feltapplikasjoner i nye SIT innstillinger. Faktisk kan genetisk manipulasjon benyttes for å gi ønskelige egenskaper som kan, for eksempel, kan brukes til å overvåke sterile hannytelse i felten, eller som kan resultere i tidlig i livet stadium letalitet. Her beskriver vi en metode for å microinject nukleinsyrer inn medfly embryo for å oppnå disse to hovedmålene.

Introduction

Middelhavet bananflue (medfly) appelsinflue er en kosmopolitisk art som i stor utstrekning skader frukt og dyrket avlinger. Det hører til Tephritidae familien, som inkluderer flere skadedyr, for eksempel de som tilhører slektene Bactrocera og Anastrepha. Den medfly er de mest studerte arter av denne familien, og det har blitt en modell ikke bare for studiet av insekt invasjoner 1, men også for å optimalisere pest forvaltningstiltak 2.

Den medfly er en multivoltine arter som kan angripe mer enn 300 arter av ville og kultiverte planter 3,4. Den skade er forårsaket av både voksne og larvestadier: parrede hunner stikke hull på overflaten av frukten for egglegging, slik at mikroorganismer for å påvirke deres kommersielle kvalitet, mens larvene lever på fruktkjøtt. Etter tre larvestadier, larver dukke opp fra verten og forpupper seg i jorda. Ceratitiscapitata viser en nesten verdensomspennende distribusjon, inkludert Afrika, Midt-Østen, Western Australia, Mellom- og Sør-Amerika, Europa og deler av USA fem.

De mest vanlige strategier for å begrense medfly infestations innebære bruk av insektmidler (f.eks Malathion, Spinosad) og miljøvennlig Steril Insect Technique (SIT) 6. Sistnevnte tilnærming innebærer utsetting i naturen av hundretusener av menn gjengis steril av eksponering for ioniserende stråling. Paring av slike steriliserte menn å ville hunner resulterer i ingen avkom, forårsaker en reduksjon i bestandsstørrelse, til slutt fører til utrydding. Selv om SIT har vist seg effektiv i flere kampanjer over hele verden, sine store ulemper inkludere de høye kostnadene ved stell og sterilisering millioner av insekter til å bli utgitt. Merking av frigjorte individer er nødvendig å skille steril fra vill insekter fanget i feltet i løpetovervåkingsaktiviteter, og det blir for tiden oppnådd ved bruk av fluorescerende pulver. Disse fremgangsmåter er kostbare og har uønskede bivirkninger 7.

For å optimalisere og / eller for å utvikle mer effektive metoder for kontroll av skadedyr, har medfly biologi og genetikk blitt mye utforsket av mange forskere over hele verden. Tilgjengeligheten av medfly genomsekvens 8,9, vil legge til rette for nye undersøkelser på genet funksjoner. RNA-interferens er et kraftig verktøy for slike undersøkelser, og det kan oppnås gjennom den mikroinjeksjon av dsRNA (dobbelt-trådet RNA) eller siRNA (liten forstyrrende RNA). Denne teknikken har blitt anvendt, for eksempel for å demonstrere at den kjønnsbestemmelse molekyl kaskade i C. capitata er bare delvis konservert med hensyn til den av Drosophila 10.

Utviklingen av protokoller for å microinject medfly embryoer tillatt C. capitata å være den første non-Drosophilid Fluearter som skal genmodifisert. Som dens egg er lik de av Drosophila, både når det gjelder morfologi og resistens overfor uttørking 11, til protokollen som gir plasmid-DNA inn i pre-blastoderm embryoer først utviklet for D. melanogaster 12,13 ble først tilpasset for bruk i C. capitata. Disse første forsøkene tillatt medfly bakterie-line transformasjon basert på transposable element Minos 11. Deretter ble det opprinnelige systemet modifisert 14 ved hjelp av andre transposon-baserte tilnærminger. Dette er tilfellet med piggyBac fra Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Protokollen har siden blitt ytterligere optimalisert og dette har tillatt transformasjon av andre tephritid arter 16-21 og også av mange andre Diptera 22-31. Alle disse systemene er avhengige av bruken av en typisk binær vektor / hjelper plasmid transformasjonssystem: kunstig, defekte transposønner som inneholder ønskede gener er montert inn i plasmid-DNA og integrert i genomet av insekt ved å tilføre den transposase enzymet 32. En rekke av transgene medfly linjene har blitt generert, med flere funksjoner, inkludert stammer som bærer en betinget dominant dødelig gen som forårsaker dødelighet, stammer som produserer kun for menn avkom og dermed ikke er nødvendig med flere sexing strategier, og stammer med fluoriserende sperm, som kan forbedre nøyaktigheten av SIT overvåkingsfasen 33-37. Selv om frigjørings i naturen av transgene organismer har funnet sted i pilottester mot mygg bare 38,39 er i det minste ett firma å vurdere en rekke transgene medfly stammer for deres bruk i felten 40.

Embryo mikroinjeksjon kan også favorisere utvikling av nye genom-redigeringsverktøy som transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR assosiert protein 9 nuklease (Cas9) og homing-endonukleaser gener (HEGs), som vil muliggjøre nye evolusjonære og utviklingsstudier, samt utvide det tilgjengelige bioteknologiske verktøykasse. Genome-redigering tilnærminger lov generering av gene-drivsystemer i mygg 41, og deres overføring til medfly er nært forestående. Her beskriver vi en universal protokoll for microinjecting nukleinsyrer i medfly embryo som kan være nyttig for alle de ovennevnte programmene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentell Set-up

  1. Insectary krav
    1. Opprettholde alle C. capitata livsstadier ved 25 ° C, 65% luftfuktighet og 12/12 timers lys / mørk daglengde.
    2. Plasser om 1,500-2,000 medfly puppe i en 6 L bur. Bruke et bur med en messing mesh på den ene siden med hull som er små nok til å stimulere egglegging 42. Sette inn en svamp strimmel gjennom en liten åpning i buret base for å tilveiebringe fluer med vann ved hjelp av kapillarvirkning. Bruk en blanding av gjær og sukker (1:10) som matkilde for de voksne (Figur 1a). Øke mengden av gjær (opp til 1: 3, gjær: sukker) bør hunnene ikke klarer å legge egg.
    3. Plasser en plate fylt med vann under buret for å samle egg avsatt gjennom nettingen. Som jomfruelige kvinner kan oviposit, vente til fluene er minst 6-7 dager gammel før samle egg for mikroinjeksjon eksperimenter. Dette vil sikre at kvinner vil ha parretog at eggene skal ha blitt befruktet.
    4. Samle eggene ved å filtrere vannet med en fin nett sil. Overfør eggene fra silen i en plastboks med standard larve mat (1,5 LH-2 O, 100 ml HCI 1%, 5 g bredspektret antimikrobielt middel oppløst i 50 ml etanol, 400 g sukker, 175 g demineralisert ølgjær, 1 kg myk hvetekli) ved anvendelse av en Pasteur pipette.
    5. Plasser hver boks i en gjennomsiktig beholder lukket med en netto lokk slik at luftsirkulasjonen og inneholder et lag av kli å favorisere pupation (figur 1B).
    6. Etter ca 10 dager, sjekk for 3. stadium larver som kommer ut av larve mat og hoppe ned i kli lag for pupation.
    7. 24 timer senere, samle puppe i en liten kopp med en myk børste og overføre dem til en ny voksen bur. Voksne normalt dukke opp 10 dager etter pupation. Den nye fly bruker ptilinum, en oppblåsbar lomme plassert på hodet over the base av antennene, for å tvinge utenfor enden av puparium. Etter fremveksten, den ptilinum kollapser permanent tilbake inne i hodet.
  2. Fremstilling av en L mat for mikroinjisert larver
    1. Løs opp 2,5 g agar i 300 ml H 2 O.
    2. Varm 500 ml H2O på en varm plate under omrøring og oppløse 4 g natriumbenzoat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g gjærekstrakt og 115 g dehydratisert gulrot pulver.
    3. Legg til blandingen en oppløsning av 2,86 g bredspektret antimikrobielt middel oppløst i 10 ml absolutt etanol.
    4. Fordel medium i 15 cm rund petriskåler og avkjøl. Om nødvendig, oppbevares ved 4 ° C.
  3. Slide forberedelse
    1. Plasser en 2 cm stripe med dobbeltsidig tape på et objektglass (75 x 26 mm 2) og merk kantene med en Kina markør, for å hindre olje spredning og påfølgende uttørking av de injiserte embryoer.
  5. Isoler plasmid DNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits 34. Utfelling av plasmidet under anvendelse av etanol og re-suspen i injeksjonsbuffer (0,1 mM fosfatbuffer pH 7,4, 5 mM KCl) ved den ønskede konsentrasjon.
  6. Rens in vitro syntetisert lang dsRNA bruker fenol-kloroform, bunnfallet ved hjelp av isopropanol og re-suspendere i injeksjon buffer 43.

2. Embryo Forberedelse

  1. Plasser et brett fylt med vann under et bur som inneholder 6-7 dag gamle voksne.
  2. Tillate kvinner å oviposit i 30 min og deretter samle embryo ved å filtrere vannet med en fin sil. Hold alltid silen i vann for å unngå uttørking av embryoene.
  3. Dechorionate embryoene av immerging silen i 5 sek i en kommersiell 50% blekemiddel.
  4. Vask embryoene nøye ved gjentatte ganger immerging silen i ren ultrarent vann (minst4-5 ganger). Til slutt, legg silen i ren ultrarent vann. Bruk embryoer innenfor maksimalt to timer.
    MERK: Tidspunktet for mikroinjeksjon er knyttet til nødvendigheten av å injisere i pre-blastoderm embryoer, i en fase av kjernefysiske divisjoner før cellularization. Dette gjør det injiserte DNA som skal tas opp i de kjerner, spesielt inn i de opphavelige cellekjernene bakterie som vil stammer kjønnscellene. I Drosophila, cellularization på stang cellene begynner ved ca 90 min etter befruktning (ved 25 ° C), med blastoderm dannelse forekommer omtrent 30 minutter senere 44, mens i medfly cellularization finner sted mellom 9 og 12 timer 45,46.
  5. Embryo orientering i rader
    1. Ved hjelp av en fin pensel, samle ca 50 embryoer og plassere dem på en disk av svart filter papir dynket med vann.
    2. Under en dissekere stereo, ordne embryoene på rad på den øvre overflaten av dobbeltsidig tape påobjektglass med en fin pensel (000) (figur 1C).
      MERK: Juster embryoene alle i samme retning, som injeksjon utføres i bakre pol, hvor bakterie-line vil stamme; bakre pol er motsatt av micropyle regionen.
    3. Dekk embryoene med et lag av chlorotrifluoroethylene olje å sørge for at oljen ikke renner over Kina markør grenser (se 1.3).
      MERK: Før dekker embryoer med olje, et steg videre kan utføres: embryoene kan uttørket i noen minutter for å redusere væskeinnholdet og dermed legge til rette for oppføring av den injiserte DNA løsningen. Dette kan bidra til å unngå embryo sprengning under injeksjon eller for stor lekkasje av den injiserte oppløsning, som en konsekvens av det høye væsketrykk.

3. Embryo Mikroinjeksjon

  1. Fylle en nål (1-2 ul) med plasmid-DNA eller dsRNA-oppløsning (1-2 ug / ul) ved anvendelse av en mikropipette.
  2. Utfører mikroinjeksjon under et stereomikroskop ved hjelp av en mikromanipulator for å styre bevegelsene av nålen (figur 1D). Bruk mikroskop scenen for å flytte lysbildet.
    1. Plasser lysbildet på scenen av omfanget.
    2. Sette inn spissen av nålen inn i den bakre pol av embryoet (figur 1E).
    3. Injiser oppløsningen ved å aktivere mikroinjeksjon system med pedalen. Den injiserte væske induserer en økning i indre trykk, noe som resulterer i en liten bevegelse av embryoet.
    4. Slipp pedalen og umiddelbart, men forsiktig, fjern nålen fra embryo.
    5. Observer litt cytoplasma lekkasje på injeksjonsstedet.
      MERK: For å skille mellom potensielle dødelige effekter av DNA / dsRNA / siRNA og dødelighet på grunn av mikroinjeksjon proprosedyren selv, må kontrollforsøk utføres. Disse omfatter injeksjon av buffer bare, eller, i tilfelle av revers genetikk eksperimenter, av et grønt fluorescerende protein (GFP)-avledede dobbelt-trådet RNA (dsRNA-GFP), eller siRNA.
  3. Etter injeksjon ruge embryoene ved 25 ° C.

4. Post-injeksjon prosedyrer

  1. To dager etter injeksjon, sjekk lysbilder for klekket larver (figur 1F) under et stereomikroskop. Larvene kan bevege seg i olje, men må overføres til larve mat så snart som mulig. På grunn av dette, kontrollerer lysbildene flere ganger om dagen.
  2. Ved hjelp av en fin pensel (000), forsiktig overføre klekket larvene til gulrot-baserte larve mat. Overfør opp til et maksimum på 200 larver pr hver petriskål.
  3. Inkuber larvene ved 65% fuktighet (25 ° C). Pass på at lokket ikke holde seg til parabolen, svekke luftgjennomgang.
  4. Hold petriskåler med lokkfor det meste lukket, slik at det fremdeles er luftstrømmen til larver. For å unngå overdreven tørking, sjekk retter daglig, og, om nødvendig, tilsett vann for å kompensere for fordampning.
  5. Plasser petriskåler i en klar beholder lukket av en nett-lokk og inneholdende et lag av kli å favorisere forpupping. Som for rutinemessig insectary stell, 3. stadium larver hoppe ut av larve mat og forpupper seg i kli.
  6. Samle puppe og plassere dem i et lite bur for voksne oppdra og screening (dette er Generation 0, G0). Bakre avkom på standard larve mat.
  7. I tilfelle av bakterie-linjetransformasjonseksperimenter, etter mulige transformerte individer i den neste generasjon (G1), som injiseres individer vanligvis er kimærer. Transponering hendelser, ja, kan det ha oppstått i noen av kjerner av embryonale syncytium, som vil danne enten bakterie-linjen eller soma.
    1. Like etter fremveksten, bedøve G1 individer ved hjelp av CO 2 og se etter transformasjon hendelser under en epifluorescence stereomikroskop. Til undersøkelse for forekomst av rød fluorescens, bruke en DsRedwide filter (Ext 546/12,.. Emm 605/75), mens på skjermen for grønn fluorescens bruke EYFP filter (Ext 500/20,.. Emm 535/30) .
    2. Plasser forvandlet individer i et lite bur med villtype voksne av det motsatte kjønn, og kommer en ny, først heterozygot, press.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her kan vi rapportere to anvendelser av embryo mikroinjeksjon rettet mot den funksjonelle karakterisering av et gen av interesse (case 1), og ved generering av transgene stammer (Tilfelle 2), henholdsvis.

Levering av dsRNA i embryoer å rakne gen-funksjon.

Den innexin-5-genet koder for et gap-knutepunkt som, i insekter, uttrykkes spesifikt i de mannlige og kvinnelige gonader 43,47,48. Basert på tilgjengelig informasjon for nært beslektede arter, ble dsRNA-induserte genet Slå forventes å resultere i ablasjon av medfly kvinnelige og mannlige bakterie-linje. Et totalt antall på 2400 embryoer ble injisert med en 2 mikrogram / mikroliter dsRNA-blanding, hvorfra 548 larver klekket og 216 voksne overlevde (upubliserte data). I ca 75% av de voksne, testikler og eggstokker syntes å være enten under-utvikledeped eller fullstendig fraværende (figur 2). Kvantifisering av innexin-5 transkripsjon overflod i underlivet av individer av begge kjønn bekreftet betydelig lavere ekspresjon av genet, sammenlignet med kontrollene.

Generering av transgene stammer med fluorescerende sædceller.

Medfly transgene stammer med fluorescensmerkede sperm ble generert av Scolari og kolleger 34 ved å injisere embryoer med plasmid DNA. Blandingen inneholdt to plasmider blandet i faste relative prosenter: en, de "Helper plasmid", kodet piggyBac transposase; den andre, den "Donor plasmid", inneholdt den kunstige transposonet og båret to fluorescerende markører, en uttrykt i soma av hanner og hunner, den andre spesifikt i testiklene. Arrangøren av beta 2-tubulin genet, som er ansvarlig for testes-spesifikk ekspresjon, ble smeltet ved ATG med de kodende sekvensene til de fluorescerende proteiner turboGFP (konstruere # 1260) eller DsRedExpress (konstruere # 1261), respektivt. Et totalt antall av 821 embryoer ble injisert, fra hvilken 205 larver klekket og 37 voksne overlevde. 9 kvinner og 8 menn overganger ble satt opp, seks av dem ga fluorescerende avkom 34 (lisens til å bruke disse data innhentet fra Elsevier - Lisensnummer 3796240759880). Den vellykkede transformasjonen førte til utviklingen av stammer med grønne og røde fluorescerende testikler, henholdsvis (figur 3).

Figur 1
Figur 1. Insectary utstyr og embryoer. (A) Standard oppdragelse bur inneholder 1,500-2,000 voksne. Hunnene legger egg gjennom messing mesh foran buret. Egg er samlet i vann. Til venstresiden av buret, silen som brukes til å filtrere eggene er synlig. (B) To esker med standard som inneholder larver larve mat. Boksene er plassert i en større klar plastboks som inneholder kli å lette forpupping; nettet dekker boksen er fjernet. (C) Embryoet ordnet i rader. Kantene på dobbel-belagt tape på lysbildet er merket med en hvit porselen markør. Egg justert på båndet vil bli dekket med chlorotrifluoroethylene olje. (D) Mikroinjeksjon anordning (venstre) koblet til et stereomikroskop utstyrt med en mikromanipulator (høyre). (E) Embryo poler; den røde pilen indikerer bakre pol (injeksjonsstedet), mens den svarte pilen indikerer fremre polen (der micropyle ligger). Scale bar = 500 mikrometer. (F) klekket larve beveger seg i oljen. Scale bar = 500 mikrometer. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Mann og kvinne med under-utviklede gonadene. Kvinne (til venstre) og mannlige (til høyre) dissekert reproduktive traktater. Over: villtype personer med normal gonadene. Under: forstyrret personer med under-utviklede gonader. Mags: Mann Accessory kjertlene Sp: spermathecae. Scale bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Transgene hanner med fluorescerende testikler og sperm. Voksne hanner transformert med konstruksjon # 1260 og # 1261, henholdsvis. Pilene viser fluofluorescerende testiklene. # 1260 hannene røde kropp og grønne testikler, mens # 1261 hannene røde testikler og grønne organer. Scale bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjeksjon av nukleinsyrer i insekt embryoer er en universell teknikk som muliggjør både analysen av genfunksjon og bioteknologiske anvendelser.

Den nylige publisering av genomsekvenser fra et økende antall insektarter fører til et stort behov for verktøy for funksjonell karakterisering av gener ennå ukjent funksjon. RNA-interferens har vist seg å være en av de mest verdifulle metoder for å antyde molekyl funksjoner 49 og embryo mikroinjeksjon letter disse studiene.

Injeksjon av plasmid DNA kan brukes til å endre insekt genomer bruker transposase-mediert genet innsetting, og nå nylig, genom-redigeringsverktøy (f.eks TALEN, CRISPR / Cas9, HEGs). Disse teknikkene har allerede tillot utvikling av stammer av flere arter insekter som kan brukes for skadedyrkontrollprogrammer, med sikte på både å utrydde eller ved erstatning av vill befolkning with insekter med endrede biologiske funksjoner. I denne protokollen beskriver vi en optimalisert metode for medfly embryo mikroinjeksjon med enten plasmid DNA eller dsRNA.

Tilgjengeligheten av veletablerte og kostnadseffektiv halvtørr larve medium for medfly oppdragelse, samt omfattende molekylær informasjon oppnådd gjennom årene av forskere som studerer kjønnsbestemmelse og cellularization prosess i denne arten, i stor grad til rette for etablering av en pålitelig embryo mikroinjeksjon protokollen. Spesielt har oppdrett protokollen er optimalisert for å sikre at den maksimale fruktbarhet og vitalitet av embryoene. Dette er viktig for å maksimalisere sannsynligheten for å få levedyktige voksne med det minste antall injiserte embryoer mulige. Ulike protokoller er tilgjengelige for medfly oppdragelse, for eksempel gulrot-baserte larve mat som vi beskriver til bak den injiserte larver. Imidlertid er denne fremgangsmåten dyrere og dets fremstilling er mer tidkrevende ennandre medier som brukes for rutinemessig stell.

En viktig hindring for bruk av mikroinjeksjon er ikke-spesifikk skade forårsaket av mekanisk manipulering av embryoene. Dette omfatter flere variabler som påvirker overlevelse av embryoene, slik som å lage hull i embryo membraner med pensel som brukes til å orientere embryoene, injiserte volumer, injeksjonsstedet og buffer, og typen av nålen som brukes 50. Noen av disse parameterne er optimert, slik som de injiserte volum og buffer. I tilfelle av nåler kan de også fremstilles i huset ved hjelp av en avtrekker, og dette krever en optimaliseringstrinn for å bestemme den ideelle protokollen.

Blant de store ulempene i mikroinjeksjon prosedyren er også dechorionation: selv om dette trinnet er viktig å gjøre eggene lettere å håndterer (dvs. mindre glatt) og legge til rette for injeksjon, kan langvarig eksponering for bleike tungt påvirke foster vitalitet. for denne grunn protokollen vi beskrive her rapporterer anvendelsen av en meget kort tid dechorionation (5 sek), som har blitt etablert som et godt kompromiss mellom fjerning av chorion og overlevelse.

Protokollene som brukes til bak den påfølgende livsfase er også relevant. Larver klekket fra embryoer injisert må fjernes fra oljen så tidlig som mulig. Olje er faktisk viktig for å hindre uttørking av embryoene, men kan være skadelig for larvene. Metoden som brukes til å fjerne larvene, tidsbruk i oljen, og den type mat som brukes er alle viktige variabler som må vurderes, siden de kan kompromittere den endelige overlevelse.

Når screening voksne og larver, kan immobilisering metoder også være kritisk. Medfly voksne kan immobiliseres ved hjelp av enten is eller CO 2, men langvarig eksponering kan være skadelig for voksenoverlevelse. Som et alternativ til embryo mikroinjeksjon, har oral levering vist segvære en mindre invasiv og potensielt high-throughput metode for å utføre RNAi analyser. Det kan være spesielt effektiv i arter som ikke er mottagelig for mikroinjeksjon, samt for RNAi-mediert skadedyrbekjempelse i feltpopulasjoner.

I denne artikkelen har to tilfeller blitt rapportert som eksempler på mulige anvendelser av protokollen beskrevet: For det første, en vellykket transformasjon gjennom transposase-mediert genet innsetting av medfly genom, noe som førte til etableringen av flere stammer med fluorescerende testiklene. Ved hjelp av en lignende fremgangsmåte mikroinjeksjon, er det også mulig å injisere dsRNA, med effekten av knockdown være synlig til det voksne stadium.

Etableringen av en pålitelig mikroinjeksjon protokoll for medfly embryoer åpnet veien til å vurdere genmodifiserte stammer som et verktøy for å kontrollere fluer i naturen, som alternative eller komplementære strategier til klassiske tilnærminger, inkludert Sterile InsectTeknikk. Til slutt kan nylige fremskritt i teknologien for automatisert mikroinjeksjon i sebra fisk embryoer potensielt bidra til utvikling av høy gjennomstrømning leveringssystemer med viktig betydning for å skape transgene stammer av medfly og andre relevante skadedyr 51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. , Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. , Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. , Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. , CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Tags

Genetikk , Medfly embryo mikroinjeksjon bakterie-line transformasjon RNA interferens skadedyrkontroll omvendt genetikk
Levering av nukleinsyrer gjennom Embryo Mikroinjeksjon i Worldwide Agricultural Pest Insect,<em&gt; Appelsinflue</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery… More

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter