Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi, Published: October 1, 2016 doi: 10.3791/54528
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Abstract

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) son derece yüksek tarımsal alaka ile bir haşere türüdür. Bu, üreme davranışları nedeniyle: Onlar yumurta ve hamuru üzerinde yumurtadan larva yemi yatıyordu zaman kadın meyve ve sebzelerin dış yüzeyine zarar. Vahşi C. capitata popülasyonları geleneksel püskürtme ve / veya çevre dostu yaklaşımlar, en başarılı Steril Böcek Tekniği (SIT) olmak insektisit ile kontrol edilir. SIT kitle yetiştirme, radyasyon bazlı sterilizasyon ve çiftleşmek için kapasitelerini korumak ama verimli döl üretmek mümkün değildir erkeklerin alan salınımı dayanır. gelişi ve birlikte medfly genom dizisinin durumu ile biyoteknolojik araçlar müteakip hızlı bir gelişme, bu türün biyolojisi anlayışımızı artırdı ölçüde olmuştur. Bu genom manipülasyon, ca için yeni stratejiler çoğalmasını tercihn nüfus kontrolü uygulanabilir.

Bu bağlamda, embriyo mikroenjeksiyon medfly kontrolü için araç kutusunu genişleyen ikili bir rol oynar. Anahtar biyolojik süreçleri düzenleyen genlerin fonksiyonu ile müdahale yeteneği, gerçekten, medfly invaziv altında yatan moleküler makine anlayışımızı genişler. Bundan başka, tohum-hattı dönüşümü gerçekleştirmek için yeteneği, yeni SIT ayarları gelecek alan uygulamalar için test edilebilir çok sayıda transgenik soylarının üretilmesini kolaylaştırır. Gerçekten de, genetik manipülasyon, örneğin, alanda erkek steril performansını izlemek için kullanılabilir istenen özellikleri kazandırmak için kullanılabilir, ya da erken yaşam aşamalı öldürücülüğü neden olabilir. İşte bu iki temel hedeflere ulaşmak için medfly embriyolar içine nükleik asitlerin Microinject için bir yöntem açıklanmaktadır.

Introduction

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata kozmopolit bir tür yaygın zarar meyve ve ekili bitkileri olduğunu. Bu tür genera Bactrocera ve Anastrepha ait olanlar gibi bazı böcek türleri içerir Tephritidae ailesine aittir. Medfly Bu ailenin en çok çalışılan türler olduğunu ve böcek istilaları 1 çalışma için değil, aynı zamanda zararlı yönetimi stratejileri 2 optimize etmek için değil, sadece bir model haline gelmiştir.

Medfly 300'den fazla vahşi türler ve ekili bitkiler 3,4 saldırabilir bir multivoltine türdür. hasar yetişkin ve larva aşamaları hem kaynaklanır: çiftleşen dişiler mikroorganizmalar ticari kalitesini etkileyecek izin yumurtlama için meyve yüzeyini delip, pestil üzerinde larva besleme oysa. Üç larva aşamasından sonra, larvalar konak ortaya ve toprağa pupa. Ceratitiscapitata Afrika, Orta Doğu, Batı Avustralya, Orta ve Güney Amerika, Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri 5 alanlar dahil olmak üzere neredeyse tüm dünyada dağıtımı görüntüler.

En yaygın stratejiler medfly enfestasyonlar insektisit kullanımını içerir sınırlamak için (örneğin, Malathion, Spinosad) ve çevre dostu Steril Böcek Tekniği (SIT) 6. İkinci yaklaşım, radyoterapi iyonizan maruz steril hale erkeklerin yüz binlerce vahşi serbest bırakılmasını gerektirir. Yabani dişilere, sterilize erkeklerin birleşme en sonunda ortadan kaldırılması neden popülasyon boyutu bir azalmaya neden hiçbir döl sonuçlanır. SIT dünya çapında birden fazla kampanya etkili olduğu kanıtlanmıştır rağmen, onun büyük dezavantajları yetiştirme ve tahliye edilecek böcekler milyonlarca sterilizasyon yüksek maliyetleri içerir. serbest bireylerin işaretleme sırasında alanda yakalanan yabani böcekler steril ayırmak gerekirfaaliyetlerinin izlenmesi ve şu anda floresan tozu kullanılarak elde edilir. Bu prosedürler, yüksek maliyetli ve istenmeyen yan etkileri 7 vardır.

sipariş optimize etmek ve / veya bu zararlının kontrolünde daha etkili yaklaşımlar geliştirmek için, medfly biyoloji ve genetik yaygın olarak dünya çapında sayısız araştırmacılar tarafından incelenmiştir. Medfly genom dizisinin 8,9 kullanılabilirliği, gen fonksiyonları üzerinde yeni araştırmalar kolaylaştıracaktır. RNA interferans gibi çalışmalar için güçlü bir araç olup, dsRNA (çift zincirli RNA) veya siRNA'nın (küçük müdahale edici RNA) mikroenjeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bu teknik göstermek için, örneğin, kullanılmış olduğunu C cinsiyet tespiti moleküler kaskad capitata kısmen Drosophila 10'dakine göre muhafaza edilir.

Protokollerin geliştirilmesi C. izin medfly embriyolar Microinject için capitata olmayan ilk olmak-Drosophilid Sinek türleri genetiği değiştirilmiş olması. Bunu yumurta 11 kuruma hem morfolojik ve direnç açısından, Drosophila benzer olduğu için, protokol önce D. geliştirilmiş ön blastoderm embriyolara plazmid DNA teslim melanogaster 12,13 Başlangıçta C. kullanım için uyarlanmıştır capitata. Bu ilk deneyler transpoze edilebilir elemanın Minos 11 göre medfly germ çizgili transformasyon sağladı. Daha sonra, özgün sistem diğer transpozon tabanlı yaklaşımlar kullanılarak 14 modifiye edildi. Bu Lepidoptera Trichoplusia ni 15 den piggyBac durumdur. Protokol beri daha da optimize edilmiştir ve bu diğer birçok Diptera 22-31 de diğer tephritid türlerinin 16-21 dönüşümü ve izin verdi. Bütün bu sistemler tipik bir ikili vektör / yardımcı plazmid dönüşüm sistemi kullanımına dayanmaktadır: Yapay arızalı transpoİstenen genleri içeren oğulları plasmid DNA içine monte transposaz enzimi 32 tedarik böcek genomuna entegre edilir. Transgenik medfly çizgilerin bir dizi doğruluğunu geliştirmek olabilir, floresan sperm ile suşlar erkek sadece döl üreten ve böylece ilave cinsiyet tayini stratejilerini gerektirmeyen ve suşları, ölümcül uyaran bir koşullu dominant letal geni taşıyan suşlar dahil birden çok özellik ile oluşturulan edilmiştir SİT izleme aşamasında 33-37 arasında. Transgenik organizmaların vahşi salma sivrisinekler, sadece 38,39 karşı Pilot testlerinde meydana gelse de, en az bir adet işletme alanı 40 kullanımları için transgenik medfly bir çok suş veya değerlendirmektedir.

Embriyo mikroenjeksiyon ayrıca (CR gibi transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens), kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi yeni genom düzenleme araçları, gelişimini desteklemek içinISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 nükleaz (Cas9) ve yeni evrimsel ve gelişimsel çalışmaları sağlayacak, hem de mevcut biyoteknolojik araç kutusu genişleyen olacak homing endonükleaz genler (HEGs). Genom düzenleme yaklaşımları zaten sivrisinekler 41 gen-sürücü sistemleri nesil izin ve medfly onların transferi yakındır. Burada her şeyden önce bahsedilen uygulamalarda yararlı olabilir medfly embriyolar nükleik asitlerin microinjecting için evrensel bir protokol açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Deney Seti-up

  1. insectary gereksinimler
    1. Tüm C. bakımı capitata ömrü 25 ° C,% 65 nem ve 12/12 saat aydınlık / karanlık fotoperiyot de aşamaları.
    2. Bir 6 L kafes yaklaşık 1,500-2,000 medfly pupa yerleştirin. Ovipozisyon 42 uyarmak için yeterince küçük delikleri olan bir tarafında örgü pirinç ile bir kafes kullanın. kılcal hareket aracılığı ile su ile sinekler sağlamak Cage tabanında küçük bir açıklıktan sünger şerit yerleştirin. Yetişkinler (Şekil 1A) için besin kaynağı olarak maya ve şeker (1:10) bir karışımı kullanın. maya miktarını artırmak (1'e kadar: Şeker: 3, maya) kadın yumurtalarını bırakmak için başarısız gerekir.
    3. ağ üzerinden yatırılan yumurtaları toplamak için kafesinin altında su ile dolu bir tabak koyun. bakire kadın yumurtlamaya gibi sinekler Mikroenjeksiyon deneyleri için yumurta toplama önce en az 6-7 gün eski kadar bekleyin. Bu kadın evlendirilen olacaktır sağlayacaktırve yumurta döllenmiş olacağı.
    4. ince, net süzgeç ile suyun süzülmesi ile yumurta toplamak. Standart Konukçu (1.5 LH 2, O, 100 mi HCI,% 1 ihtiva eden bir plastik kutu içinde süzgeçten yumurta transferi geniş spektrumlu antimikrobiyal madde 50 mi etanol içinde eritildi, 5 g, 400 g şeker, 175 g minerali giderilmiş bira mayası, 1 Pasteur pipeti kullanarak) yumuşak buğday kepeği kg.
    5. Hava sirkülasyonuna izin vermek için net kapakla kapatılmış saydam bir kap içinde her kutuyu yerleştirin ve kepek tabakası içeren pupa devresi (Şekil 1B) lehine.
    6. Yaklaşık 10 gün sonra, larva gıda ortaya ve pupa devresi için kepek tabakası içine aşağı atlamak 3. instar larvaları kontrol edin.
    7. 24 saat sonra, yumuşak bir fırça kullanarak küçük bir fincan pupa toplamak ve yeni bir yetişkin kafesine aktarabilirsiniz. Yetişkinler normalde 10 gün gelmesine sonra ortaya çıkar. Gelişmekte olan sinek ptilinum, th üzerinde kendi kafasına bulunan bir şişme cebi kullanırantenleri e tabanı, puparium sonuna kapalı zorlamak için. Çıkması sonrasında, ptilinum kalıcı geri kafasının içinde çöker.
  2. Microinjected larvalar için 1 L gıda hazırlanması
    1. 300 mi H2O 2.5 g agar çözülür
    2. Sıcak 500 ml H 2 sıcak karıştırma plaka üzerinde Ç ve 4 g Sodyum benzoat çözülür, 4.5 ml% 37 HCI, 42 g maya özütü ve 115 gr kurutulmuş havuç tozu.
    3. karışımına, 10 ml mutlak etanol içinde çözülmüş 2.86 g geniş spektrumlu antimikrobiyal elemanın bir solüsyonunu ilave edin.
    4. Petri yuvarlak 15 cm orta dağıtın ve soğumaya bırakın. Gerekirse, 4 ° C'de saklayın.
  3. slayt hazırlama
    1. Bir mikroskop lamı (75 x 26 mm 2) çift taraflı bant 2 cm şerit yerleştirin ve bir çini işaretleyici ile kenarları işaretleyin, petrol yayılmasını ve enjekte edilen embriyoların sonucu kuruma önlemek için.
  5. Ticari olarak temin edilebilen kitler 34 kullanılarak plazmid DNA izole edin. etanol kullanılarak plazmid çökelti ve arzu edilen konsantrasyonda, enjeksiyon tamponu (0.1 mM fosfat tamponu pH 7.4, 5 mM KCI) 'de yeniden askıya.
  6. Fenol-kloroform kullanılarak uzun dsRNA sentezlenmiş in vitro arındırmak, izopropanol kullanarak çöktürmek ve enjeksiyon tamponu 43 yeniden askıya.

2. Embriyo Hazırlık

  1. 6-7 günlük yetişkin ihtiva eden bir kafes altında su ile dolu bir tepsiye yerleştirin.
  2. kadın 30 dakika boyunca yumurtlamaya ve daha sonra ince bir süzgeç kullanarak suyun filtre embriyolar toplamak için izin verin. Her zaman embriyoların kuruma önlemek için suda süzgeç tutun.
  3. ticari% 50 çamaşır suyu çözeltisi içinde 5 saniye boyunca süzgeç yükselmekte tarafından embriyolar Dechorionate.
  4. art arda en az (temiz ultra saf suda süzgecin yükselmekte dikkatle embriyolar yıkayın4-5 kez). Son olarak, temiz ultra saf suya süzgeç yerleştirin. Maksimum 2 saat içinde embriyolar kullanın.
    NOT: Mikroenjeksiyon zamanlaması önce Hücreselleştirmeden nükleer bölünmelerin bir aşamasında, ön blastoderm embriyolar içine enjekte etmek gerekliliği ile ilgilidir. Bu enjekte DNA alınması-up gereken çekirdeklerin içine özellikle gamet kaynaklı olacak primordial germ hücre çekirdekleri içine sağlar. Medfly Hücreselleştirmeden 9 ve 12 saat 45,46 arasında yer alır, oysa Drosophila, kutup hücre Hücreselleştirmeden, blastoderm oluşumu yaklaşık 30 dakika, daha sonra 44 meydana gelen döllenmeden sonra yaklaşık 90 dakika ile (25 ° C'de), başlar.
  5. Satır Embriyo yönelimi
    1. ince bir fırça kullanarak, yaklaşık 50 embriyo toplamak ve su ile ıslatılmış siyah filtre kağıdı bir disk üzerine koyun.
    2. Diseksiyon stereomikroskop altında, çift taraflı bant üst yüzeyi üzerine üst üste embriyolar düzenlemekince bir fırça (000) kullanılarak mikroskop lamı (Şekil 1C).
      NOT: Enjeksiyon germ-line köken olacak arka kutupta, yapılır gibi tüm aynı yönde embriyolar hizalayın; arka kutup mikropil bölgeye tersidir.
    3. klorotrifloroetilen yağı tabakası yağı çin işaretleyici sınırları (1.3 bakınız) dökmek değil emin olan embriyolar örtün.
      Not: yağ embriyolar kapak, önce bir başka aşama gerçekleştirilebilir: embriyolar sıvı içeriğini azaltmak ve böylece enjekte DNA çözeltisi girişini kolaylaştırmak için bir kaç dakika için kurutulmuş olabilir. Bu yüksek bir sıvı basıncının bir sonucu olarak, enjeksiyon ya da enjekte çözeltinin aşırı sızıntıya sırasında embriyonun patlama önlemeye yardımcı olabilir.

3. Embriyo Mikroenjeksiyon

  1. plazmid DNA ya da bir mikropipet kullanılarak dsRNA çözeltisi (1-2 ug / ul) ile bir iğne (1-2 ul) doldurun.
  2. Iğne (Şekil 1D) hareketlerini kontrol etmek için bir mikro manipülatörün kullanılması, bir stereo mikroskop altında mikroenjeksiyon gerçekleştirin. slayt taşımak için mikroskop sahne kullanın.
    1. kapsam sahnede slayt yerleştirin.
    2. Embriyo (Şekil 1E) arka kutupta içine iğne ucu yerleştirin.
    3. pedalıyla mikroenjeksiyon sistemini aktive ederek çözüm enjekte edilir. püskürtülen sıvı embriyo hafif harekete yol açar, iç basınç bir artışa neden olur.
    4. hemen pedalını ve bırakın, ama nazikçe, embriyo iğne çıkarılır.
    5. Enjeksiyon yerinde biraz sitoplazmik kaçağı gözlemleyin.
      NOT: nedeniyle mikroenjeksiyon pro DNA / dsRNA / siRNA ve mortalite potansiyel öldürücü etkileri arasında ayrım yapmak içinkendisi mıknatıslarından çıkan, kontrol deneyleri gerçekleştirilmelidir. Bu karşıt genetik deneylerde durumunda, sadece tampon enjeksiyon içerir, ya da bir yeşil fluoresan protein (GFP) iki-şeritli RNA (dsRNA GFP) veya siRNA -türevli.
  3. Enjeksiyon, 25 ° C'de inkübe embriyolar sonra.

4. Post-enjeksiyon İşlemleri

  1. İki gün enjeksiyonundan sonra, bir stereo mikroskop altında yumurtadan larva (Şekil 1F) için slaytlar kontrol edin. Larvalar yağda hareket ama en kısa sürede larva gıda transfer edilmesi gerekir olabilir. Bu nedenle, bir gün slaytlar birkaç kez kontrol edin.
  2. ince bir fırça (000) kullanarak, yavaşça havuç tabanlı larva gıda yumurtadan larva transferi. Her bir Petri kabı başına 200 larva en fazla aktarın.
  3. % 65 nem (25 ° C) larvaları kuluçkaya yatmaktadır. Kapak hava değişimi zarar, çanak yapışmaz emin olun.
  4. Kapaklı Petri kapları tutmaklarvalara hava akımı hala böylece çoğunlukla kapattı. Aşırı kurumayı önlemek günlük yemekler kontrol etmek ve gerekirse, buharlaşma telafi etmek için su ekleyin.
  5. net-kapakla kapatılmış bir açık kapta Petri kapları yerleştirin ve kepek tabakası içeren gelmesine lehine. Rutin insectary yetiştiriciliği için olduğu gibi, 3. instar larvaları larva gıda dışında atlama ve kepek pupa.
  6. (Bu Nesil 0, G0 olan) pupa toplamak ve yetişkin yetiştirme ve tarama için küçük bir kafese koyun. Arka standart larva gıda döl.
  7. Enjekte bireyler genellikle kimeralardır olarak germ-line dönüştürme deneylerinde durumunda, bir sonraki nesilde mümkün dönüştürülmüş bireyler (G1) kontrol edin. Transpozisyon olaylar, gerçekten de, mikrop hattı ya da soma da oluşturacak embriyonik Sinsityum çekirdekleri, herhangi meydana gelmiş olabilir.
    1. Kısa bir süre sonra ortaya çıkması, CO 2 kullanılarak G1 bireyleri uyutmak ve transf kontrolBir Epifloresans stereomicroscope altında ormation olaylar. ise yeşil floresan ekranına EYFP filtre kullanmak (.. EMM 535/30 Dahili 500/20); (EMM 605/75.. Dahili 546/12) kırmızı floresan varlığında taranması için, DsRedwide filtre kullanın .
    2. karşı cinsten vahşi tip yetişkin ile küçük bir kafes içinde dönüştürülmüş bireyleri yerleştirin ve yeni, başlangıçta heterozigot, gerginlik kaynaklanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sırasıyla ilgi genin işlevsel karakterizasyonu yönelik embriyo mikroenjeksiyon iki uygulama (Olgu 1) rapor ve transgenik suşlar nesil (Olgu 2) de.

embriyoların içine dsRNA teslim gen fonksiyonunu çözülmeye.

Innexin-5 geninin, böceklerde, erkek ve dişi gonadlar 43,47,48 spesifik olarak ifade edilen bir boşluk kavşak kodlar. yakından ilgili türler için mevcut bilgilere dayanarak, dsRNA indüklenen gen susturma medfly dişi ve erkek germ çizgili ablasyonu ile sonuçlanması bekleniyordu. 2.400 embriyo sayısı 548 larva yumurtadan ve 216 yetişkin (yayınlanmamış veriler) hayatta olan bir 2 ug / ml dsRNA karışımı enjekte edilmiştir. yetişkin, testis ve overler yaklaşık% 75'inde altında develo ya olduğu ortaya çıktıped ya da tamamen yok (Şekil 2). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında her iki cinsiyet bireylerin arka kısmında innexin-5 kopya miktarı miktarının, genin önemli ölçüde daha düşük bir ifade doğruladı.

floresan spermatozoa ile transgenik suşları nesil.

Medfly floresan etiketli sperm ile transjenik suşların plazmid DNA ile embriyolar enjekte Scolari ve arkadaşları 34 ile oluşturulmuştur. , Bir "yardımcı plazmit" piggyBac transposaz kodlanan Karışım, sabit göreli oranlarda karıştırılır iki plazmid ihtiva Diğer, "Donör plazmid", yapay transpozon içeren ve iki floresan belirteçler taşınan bir özel testislerde, kadın ve erkek soma diğer dile getirdi. T sorumlu Beta 2-tübülin geninin promoteri,Estes özgü sentezleme, turboGFP (# 1260 yapı) ya da DsRedExpress sırasıyla (# 1261 yapı) floresan proteinleri kodlama sekansları ile ATG kaynaştırıldı. 821 embriyoların toplam sayısı, enjekte 205 larva yumurtadan hangi ve 37 yetişkin hayatta edildi. (- Lisans Numarası 3796240759880 Elsevier elde edilen bu verileri yeniden Lisans) 9 kadın ve 8 erkek geçitleri floresan Döl 34 verdi 6 olan, set-up bulundu. Başarılı dönüşüm, yeşil ve kırmızı flüoresan testis sırasıyla (Şekil 3) ile suşların gelişmesine yol açmıştır.

Şekil 1
Şekil 1. insectary ekipman ve embriyolar. (A) Standart 1,500-2,000 yetişkin içeren kafes yetiştirme. kadın pirinç ile yumurta kafesin önünde örgü yatıyordu. Yumurta, su toplanır. SoldakiKafesin yan, yumurta filtrelemek için kullanılan süzgeç görülebilir. (B) standart larva içeren gıda larvaların İki kutu. kutuları gelmesine kolaylaştırmak için kepek içeren daha büyük bir şeffaf plastik kutu yerleştirilir; kutusunu kapsayan net kaldırıldı. (C) Embriyolar sıralar halinde düzenlenmiştir. slayt üzerinde çift taraflı bant kenarlarının beyaz Çin markör ile işaretlendi. Kasette hizalanmış Yumurta klorotrifloroetilen yağı ile ele alınacaktır. (D) Mikroenjeksiyon aparatı (solda) bir micromanipulator (sağda) ile donatılmış bir stereomikroskop bağlı. (E) Embriyo direkleri; siyah ok (mikropil bulunur) ön direğe gösterir ise kırmızı ok, arka kutba (enjeksiyon yerinde) gösterir. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Yağda hareket (F) Yumurtadan larva. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Please, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2. Erkek ve az gelişmiş gonadlar kadın. Kadın (solda) ve erkek (sağ) üreme yolları disseke. Yukarıda: Normal gonadlar ile yabani tip bireyler. Aşağıda: az gelişmiş gonadlar bireylere müdahale etti. DERGİLER: Bay Aksesuar Bezler; Sp: spermateka. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Transgenik sırasıyla yapı # 1260 ve # 1261, dönüştürülmüş floresan testis ve sperm. Yetişkin erkeklerde ile erkekler. Oklar fluo işaretrescent testisler. # 1261 erkek kırmızı testisler ve yeşil organları göstermek ise # 1260 erkek, kırmızı gövde ve yeşil testisler göstermektedir. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Böcek embriyolar nükleik asitlerin mikro enjeksiyonu gen fonksiyonu ve biyo teknolojik uygulamalarda analizi hem de kolaylaştırır evrensel bir tekniktir.

böcek türlerinin artan sayıda genom dizilerinin yakın zamanlı henüz bilinmeyen fonksiyonun genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için araçlar için acil bir ihtiyaca yol açar. RNA enterferans moleküler fonksiyonları 49 anlaması için en değerli yöntemlerden biri olduğu kanıtlanmıştır ve embriyo mikroenjeksiyon bu çalışmaları kolaylaştırır gelmiştir.

Plazmid DNA enjeksiyonu transposaz-aracılı gen ekleme kullanılarak böcek genom değiştirmek için kullanılabilir ve, daha da en son, genom düzenleme araçları (ör TALEN CRISPR / Cas9, HEGs). Bu teknikler zaten eradikasyon ya da yabani nüfusun değiştirilmesi w hem amaçlayan haşere kontrol programları için kullanılabilecek çok sayıda böcekler türlerin soylarının gelişimini sağladıi değiştirilmiş biyolojik özelliklere sahip böcekler. Bu protokol, plazmid DNA ya da dsRNA ile ya medfly embriyo mikro enjeksiyon için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.

kullanılabilirliği köklü ve maliyet-etkin medfly yetiştiriciliği yanı sıra bu türlerin cinsiyet tayini ve Hücreselleştirmeden sürecini okuyan araştırmacılar tarafından yılda elde edilen kapsamlı moleküler bilgi için yarı kuru larva orta ölçüde güvenilir kurulmasını kolaylaştırmak embriyo mikroenjeksiyon protokolü. Özellikle, yetiştirme protokolü embriyo maksimum doğurganlık ve canlılık sağlamak için optimize edilmiştir. Bu olası enjekte edilen embriyoların en az sayıda canlı yetişkin elde etme olasılığını arttırmak için önemlidir. Farklı protokolleri, arka 'enjekte larva tarif havuç tabanlı Konukçu olarak medfly yetiştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem daha pahalı ve bunun hazırlanması daha zaman alıcı olanRutin yetiştirme için kullanılan diğer medya.

Mikroenjeksiyon kullanımına önemli bir engel embriyoların mekanik manipülasyonu kaynaklanan spesifik olmayan bir hasardır. Bu tür embriyolar enjekte hacimleri, enjeksiyon yerinde ve tampon yönlendirmek için kullanılan fırça ile embriyo zarının delici olarak embriyolar, hayatta kalma etkileyen birden çok değişken içerir ve iğne tipi 50 kullanılır. Bu parametrelerin bazıları, enjekte hacimleri ve tampon madde olarak, optimize edilmiştir. iğneler halinde, aynı zamanda, bir çekme aleti kullanmak içi üretilebilir, ve bu ideal protokolü belirlemek için bir optimizasyon adım gerektirir.

Mikroenjeksiyon işlemi büyük sakıncaları arasında da dechorionation şudur: Bu adım (yani, daha az kaygan) ve enjeksiyon kolaylaştırmak için, çamaşır suyu uzun süre maruz kalmanın ağır etkileyebilir embriyonik canlılık işleyicisi yumurta kolaylaştırmak için gerekli olmasına rağmen. foBu nedenle r, biz burada açıklamak protokol koryon ve hayatta kalma oranı kaldırılması arasında iyi bir uzlaşma olarak kurulmuştur çok kısa dechorionation süresi (5 sn) kullanımını bildirir.

Arka sonraki hayat sahnesinde kullanılan protokoller de geçerlidir. Enjekte embriyolardan yumurtadan larva en kısa sürede yağ kaldırılması gerekir. Petrol embriyoların kuruma önlemek için, ama larvalara zararlı olabilir gerçekten önemlidir. larvaları, yağa harcanan zamanı ortadan kaldırmak için kullanılan yöntem ve kullanılan gıdaların türü final hayatta kalma oranını tehlikeye düşürebilecek beri dikkat edilmesi gereken tüm önemli değişkenlerdir.

yetişkin ve larva tarama yaparken, immobilizasyon yöntemleri de önemli olabilir. Medfly yetişkin CO2 buz veya kullanılarak immobilize edilebilir, ancak uzun süreli maruz kalma, yetişkin hayatta kalmak için zararlı olabilir. Embriyo mikroenjeksiyon bir alternatif olarak, oral uygulama kanıtlanmıştırRNAi deneyleri gerçekleştirmek için daha az invazif ve potansiyel olarak yüksek verim yöntemi. Bu mikroenjeksiyon için uygun, hem de alan popülasyonlarının RNAi aracılı haşere kontrolü için olmayan türler, özellikle etkili olabilir.

İlk başarılı dönüşümü floresan testis ile birden suşları kurulmasına yol açmıştır medfly genomun, bir transposase aracılı gen ekleme yoluyla: protokolün olası uygulamaları örnekleri açıklandığı gibi bu yazıda, iki olgu bildirilmiştir. Benzer bir prosedür kullanılarak mikroenjeksiyon, demonte etkileri yetişkin aşamaya kadar görünür olmak üzere dsRNA enjekte edilmesi de mümkündür.

medfly embriyolar için güvenilir bir mikroenjeksiyon protokolü kurulması Steril Böcek de dahil olmak üzere, klasik yaklaşımlara alternatif veya tamamlayıcı stratejiler olarak, vahşi sinekleri kontrol etmek için bir araç olarak genetiği değiştirilmiş suşları dikkate yolu açtıTekniği. Son olarak, zebra balığı embriyolarının otomatik mikroenjeksiyon için teknolojinin son gelişmeler potansiyel medfly ve diğer ilgili zararlıların 51 transgenik suşları oluşturmak için önemli alaka ile yüksek verimlilik sağlama sistemlerinin gelişmesine yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. , Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. , Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. , Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. , CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Tags

Genetik Sayı 116, Medfly embriyo mikroenjeksiyon germ-line dönüşüm RNA girişim haşere kontrolü genetik ters
Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery… More

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter