Introduction
Bioaktive kleine Moleküle funktionieren grundlegend durch die Interaktion mit und die Änderung der Funktion von einer oder mehreren "Ziel" Moleküle, am häufigsten Proteine in der Zelle. Bei der Wirkstofffindung, wenn eine aktive Verbindung durch phänotypische Screening entdeckt wird, die Identifizierung der molekularen Ziel (en) dieser Verbindung ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur für das Verständnis des Mechanismus der Wirkung und mögliche Nebenwirkungen der Verbindung, sondern auch für potenziell entdecken neue Biologie der Krankheitsmodell zugrunde liegen und den Weg für die Entwicklung neuer mechanistische Klassen von Therapeutika 1 geebnet. Obwohl Zielidentifizierung nicht für ein Medikament erforderlich ist, um therapeutisch verwendet werden, in den letzten Jahren hat es eine zunehmende Anerkennung gewesen, dass neuartigen Arzneimittelkandidaten eher in klinischen Studien erfolgreich zu sein, und damit eine bessere Rendite erzielen, wenn ein validiertes Ziel bekannt ist 2. Somit besteht für die Identifizierung kleiner ein wachsendes Interesse an Verfahren gewesenMolekül Zielproteine.
Eine klassische Zielidentifizierung Experiment beruht typischerweise auf Affinitätsreinigung, wobei das kleine Molekül von Interesse auf einem Harz immobilisiert ist und mit ganzen Zelllysaten inkubiert, wonach ungebundene Proteine weggewaschen werden , und die verbleibenden Proteine werden eluiert und 3 identifiziert. Während diese Technik die Ziele vieler kleiner Moleküle 4 ist es ungeeignet als universelles Ziel - ID - Verfahren aus mehreren Gründen zu identifizieren , verwendet wurde. Erstens muss das Zielprotein seine native Konformation nach der Zelllyse um behalten ihre Fähigkeit, in das kleine Molekül zu binden, beibehalten. Dies kann für Membranproteine besonders problematisch sein, die oft Konformationsänderungen durchlaufen, nachdem sie von ihrer natürlichen Umgebung entfernt werden, oder einfach zu aggregieren und ausfallen Lösung. Zweitens muss das kleine Molekül chemisch so modifiziert werden, dass sie auf das Harz immobilisiert werden kann unter Beibehaltungseine Fähigkeit, das Zielprotein zu binden. Tiefbindungstaschen kann daher an ein kleines Molekül nicht mehr zugegriffen werden, wenn es zu dem Harz fixiert ist. Drittens muss die Bindungsaffinität ausreichend hoch sein, dass die Wechselwirkung während der Waschschritte aufrecht erhalten wird, die Identifizierung von geringerer Affinität Herstellung Wechselwirkungen schwierig. Viertens Umgebungsbedingungen wie pH, Ionenkonzentration oder der Anwesenheit anderer endogener Moleküle können räumlich innerhalb der Zelle variieren und sind manchmal Voraussetzungen für arzneimittel Target-Wechselwirkungen. Somit finden die richtigen Bedingungen außerhalb der Zelle zu ermöglichen und aufrechtzuerhalten Bindung kann eine erhebliche Menge von Versuch und Irrtum erforderlich.
Photoaffinitätsmarkierung umgeht diese Probleme durch die kovalente wodurch eines kleinen Moleküls und dessen Ziel innerhalb der nativen Kontext einer Zelle binden. Anstatt das kleine Molekül zu einem großen sperrigen Harz Immobilisierung wird das Molekül anstelle chemisch modifiziert zwei kleine funktionelle g installierenroups: eine photoaktivierbare Gruppe, die eine kovalente Vernetzung an das Zielprotein erlaubt, wenn es mit einer bestimmten Wellenlänge von Licht bestrahlt wird, und einer Reportergruppe, die das Zielprotein ermöglicht werden erkannt und anschließend isoliert. Lebende Zellen werden mit dem Photoaffinitäts-Sonde behandelt, wobei die Sonde bindet und kovalent vernetzt an das Zielprotein und die Sonde-Protein-Komplex wird dann isoliert intakt. Die Spezifität der Sonde an die Zielbindungs wird durch Durchführen einer Konkurrenzexperiment parallel gezeigt, wo ein Überschuß der Ausgangsverbindung verwendet wird, entfernt zu konkurrieren der Sonde an das Zielprotein binden.
Das Design und die Synthese von Photoaffinitätssonden variiert stark von einem kleinen Molekül zu einem anderen, und wird nicht in diesem Protokoll abgedeckt werden; jedoch einige sehr gute Gespräche zu diesem Thema wurden 5-9 veröffentlicht. Die Hauptüberlegung ist, dass die Sonde die Bioaktivität der Stammverbindung behält daher presumably Bindung an das gleiche Ziel (s). Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) -Studien durchgeführt werden müssen, um zu bestimmen, welche Teile des Moleküls ohne Verlust der Bioaktivität kann geändert werden. Eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Gruppen wurden als photoaktivierbare Vernetzer, einschließlich Diazirin, Benzophenon und Arylazid, die jeweils Vor- und Nachteile 10 verwendet. Ebenso gibt es mehrere Reporter-Tags, die verwendet wurden Sonde-bindende Proteine zu isolieren. Reporter - Gruppen können allein, wie beispielsweise die üblicherweise verwendeten Biotin oder Fluoreszenzmarker funktionsfähig sein, oder sie können Vorstufen sein , die weitere Funktionalisierung an der photochemischen Vernetzungsschritt im Anschluss erfordern, die den Vorteil haben , kleiner ist und daher weniger wahrscheinlich 11 - Bioaktivität zu kompromittieren.
In diesem Protokoll haben wir eine Photoaffinitäts-Sonde, enthaltend ein Diazirin photochemischen Vernetzungsgruppe und eine endständige Alkin für die Befestigung einer Reportergruppe über eine Cu (I) verwendet -catalyzed Azid-Alkin Sharpless-Huisgen - Cycloaddition (oder klicken) Reaktion 12-15. Die SAR - Studien, die Sonde Design und die Synthese und die Ergebnisse dieser Untersuchungen an anderer Stelle 16-18 veröffentlicht wurden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll von MacKinnon und Taunton 10 für den Einsatz in lebenden Zellen angepasst wurde.
1. Herstellung von kultivierten Zellen
- Bereiten sterile 6-cm Zellkulturschalen für die Anzahl der Proben gewünscht (siehe unten).
HINWEIS: Eine Schüssel Zellen pro Behandlungsbedingung verwendet wird, aber wenn mehr Protein erforderlich ist, 2 oder 3 Gerichte pro Zustand und kombiniert nach UV-Bestrahlung hergestellt werden.- Bereiten Sie mindestens drei Gerichte von Zellen; Negative Kontrolle mit DMSO nur (D), Sondenbehandlung nur (P) und Sonde + Wettbewerber (C).
- Optional vorbereiten, ein 4. Gericht als ohne UV - Kontrolle mit Sonde behandelt werden , aber nicht mit UV - Licht ausgesetzt wird .
HINWEIS: Wenn mehrere Wettbewerber Moleküle getestet werden, wie verschiedene Analoga des kleinen Moleküls von Interesse, bereiten zusätzlichen Konkurrenzplatten als notwendig.
- In HEK293T Zellen zu Kulturschalen in 4 ml Kulturmedien. Verwenden von 3,5 Mio. cells pro Platte.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte für jeden Zelltyp bestimmt werden, so dass die Zellen fast 100% konfluent sind, zu Beginn des Experiments, um die maximale Proteinausbeute zu erzielen. Für HUVEC, 0,3 Millionen Zellen pro Platte verwenden. Eine gute Näherung ist 1/10 der Zellen in einer konfluenten 15 cm-Schale. Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin HEK293T Zellen sollten in Dulbeccos Modified Eagles kultiviert werden. - Zurückkehren , um die Zellen auf den Kulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) über Nacht.
2. Behandlung von Zellen und Photovernetzung
- Am nächsten Tag, pre-aliquoten die folgenden Medikamente in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen:
- Für die erste Behandlung, fügen 4 ul DMSO zu 2 Röhrchen und 4 ul 10 mM Kompetitor (dh die nicht - modifizierten Ausgangsverbindung) bis 1 Rohr.
- Für die zweite Behandlung, fügen Sie 16 ul DMSO zu 1 Röhrchen und 16 & mgr; l von 50 &# 181; M Photoaffinitätssonde 2 Röhren.
HINWEIS: Die optimale Konzentration kann für verschiedene Sonden unterschiedlich sein (siehe Diskussion), aber zwischen 200-500 nm ist ein guter Ausgangspunkt (hier verwenden wir 200 nM). Die Konzentration der Teilnehmer sollte die der Sonde überschreiten mindestens das 20-fache (hier verwenden wir 10 & mgr; M). Die Endkonzentration von DMSO ist in allen Platten gleich sein und sollte nicht mehr als 0,5% (20 ul Volumen) nicht überschreiten.
- Bringen Sie die Zellplatten in die Zellkultur Motorhaube und fügen Sie die pre-aliquotiert Drogen aus Schritt 2.1.1 wie folgt: absaugen 1 ml Kulturmedien, Resuspendieren des Pre-aliquotierten Droge in den Medien, und es sanft Zugabe zurück auf die Platte Tropfen weise. Fügen Sie das DMSO zu dem DMSO (D) Platte und der Sonde (P) Platte, und fügen Sie den Teilnehmer für den Wettbewerb (C) Platte. Rück die Platten zu dem Kulturbrutschrank für 30 min.
- Mit Lichtern in der Kultur Haube gedimmt, fügen Sie den Pre-aliquotierten Sonde von Schritt 2.1.2 Sonde (P) und Wettbewerb (C) Platten und fügen Sie dieDMSO zu dem DMSO (D) Platte, wie oben. Bringen Sie die Platten an den Kultur-Inkubator für 1 Stunde.
- Während der Inkubation bereiten die folgenden Elemente; Ein Tablett mit Eis, das alle Platten passen können; eiskaltem Lysepuffer (PBS [pH 8,5] + 1x Protease-Inhibitor-Cocktail [vollständige EDTA-frei, verdünnt von 50x Stammlösung in Wasser hergestellt]; 200 & mgr; l / Platte); Mikrozentrifugenröhrchen D, P, oder C für jeden der verschiedenen Behandlungsbedingungen, auf Eis markiert.
- 15 Minuten vor dem Ende der 1-stündigen Inkubation der UV-Lampe (365 nm) in einem kalten Raum und schalten Sie es einrichten auf die Glühbirne, um sich aufzuwärmen.
- Nach 1 Stunde Inkubation mit der Sonde, legen Gerichte auf dem Eis. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 5 ml eiskaltem PBS (pH 7,4) überschüssige Sonde zu entfernen. Re-decken die Zellen mit 4 ml eiskaltem PBS.
- Die Schale von Zellen zentriert 3 cm unter der UV-Lampe oben auf einem Eisbeutel Heizung von der Lampe zu minimieren. Bestrahlen 3 min. Entfernen Sie die Schüssel auf das Tablett aus Eis und wiederholen Sie für alle Proben.
- EINfter Bestrahlung absaugen PBS aus den Zellen und mit 200 ul der eiskaltem PBS (pH 8,5) mit Protease-Inhibitoren zu jeder Platte. Lösen Sie die Zellen von der Platte mit einem Gummischaber und Transfer zu den voretikettierten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verwenden.
- Hinzufügen SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,4% (10 ul 10% SDS in 250 ul Probe).
ACHTUNG: SDS-Pulver ist gefährlich. Vermeiden SDS Pulver inhaliert durch eine Maske über Mund und Nase zu tragen. - Lyse der Zellen durch Beschallen der Suspension für 10 Impulse (Ausgabe 1, Einschaltdauer 30%) und Inkubation auf Eis für 1 min vor einer zweiten Runde von 10 Impulsen.
- Bei Bedarf entfernen 2 ul Suspension und überprüfen unter einem Lichtmikroskop vollständige Zelllyse zu gewährleisten.
- Koche die Proben auf einer heißen Platte auf 95 ° C für 5 min Zell-Lyse zu vervollständigen und alle Proteine zu denaturieren.
- Messung der Proteinkonzentration in jeder Probe eine spektrophotometrische Detergens-kompatiblen Protein Assay unter Verwendung von, beispielsweise the Dc - Protein - Assay 19, gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Spektrophotometer eingestellt Extinktion bei 750 nm zu messen.
- Normalisieren der Proteinkonzentration auf 2,5 mg / ml (oder Konzentrationen sind geringer als 2,5 mg / ml, normalisiert mit der geringsten Proteinkonzentration der Probe) durch Zugabe von PBS pH 8,5 + 0,4% SDS bei Bedarf (beispielsweise bei den Proben 5 mg / ml in 250 & mgr; l, fügen 250 ul PBS pH 8,5 + 0,4% SDS auf eine Endkonzentration von 2,5 mg / ml) zu erhalten.
3. Befestigung von Fluoreszenz-Tag durch Klick-Chemie zur Visualisierung von markierten Proteine
- Entfernen 40 & mgr; l des Zelllysats und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die restlichen Lysate für die Reaktion mit Biotin-Azid (Schritt 4).
- Fügen Sie die folgenden Reagenzien in der Reihenfolge: 0,2 ul fluor-Azid (1 mM Stammlösung in DMSO), 0,58 & mgr; l TCEP (100 mM Lager in Wasser mit 4 Äquivalenten NaOH, frisch zubereitet) und 3,38 ul TBTA (1.7 mM Lager in einem 4: 1-Verhältnis von t-Butanol zu DMSO). Vortex mischen.
- Hinzufügen , 1,14 & mgr; l CuSO 4 · 5H 2 O (50 mM in Wasser) , um die Reaktion zu starten. Vortex kurz und für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.
- Je 50 ul 2x SDS-Probenpuffer die Reaktion zu quenchen. An diesem Punkt laufen die Proben direkt auf einem SDS-PAGE - Gel 20 für die besten Ergebnisse, oder bei -20 ° C über Nacht , wenn nötig.
- Wenn Proben Gefrieren, bei 95 ° C für 5 min aufwärmen, bevor sie auf das Gel geladen.
Hinweis: Da das Molekulargewicht des Zielproteins wird üblicherweise zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt ist , ist es ratsam, zwei Gelen mit unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen zu laufen (dh, 8% und 15%) oder eine breite Molekulargewichtsbereich Gradientengel (dh 4-15%), vollständig Molekulargewicht Abdeckung zu gewährleisten. - Wenn die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht hat, weiterhin das Gel für weitere 5 min läuft das gesamte überschüssige unreacte um sicherzustellen,d fluor-Azid hat das Gel vollständig zu verlassen.
- Entfernen Sie das Gel in einen Behälter mit ddH 2 O und Inkubation für 10 min unter leichtem Schütteln, weg zu waschen alle überschüssige Fluor-Azid.
- Legen Sie das Gel auf eine Glasplatte und scannen Sie das Gel mit einem Taifun Fluoreszenzgel-Scanner nach den Anweisungen des Herstellers.
4. Befestigung von Biotin-Umbau von der Klick-Chemie zur Affinitätsreinigung von markierten Proteinen
- Von den verbleibenden Lysaten aus Schritt 3.1, um die maximale Menge nach der Protein Normalisierung verwenden, so dass alle Proben das gleiche Volumen sind (zum Beispiel, wenn nach der Normalisierung auf 2,5 mg / ml Die resultierenden Probenvolumen 500 sind, 550, und 600 & mgr; l, verwenden 500 ul jeder).
- Pre-deaktivieren Sie die Lysate durch Hochleistungs-Streptavidin Agarose-Kügelchen, vorgewaschene 2x mit PBS (pH 7,4) auf 50 & mgr; l hinzugefügt wird. Inkubiere 1 h bei 4 ° C unter Rotation.
- Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 3 min. entfernen ter Stand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und entsorgen Sie die Perlen.
- Entfernen 1-2% der DMSO Probe in ein neues Röhrchen mit "Eingang". Fügen Sie ein äquivalentes Volumen von 2x SDS-Probenpuffer und bei -20 ° C.
- Pro 500 ul Lysat, fügen Sie die folgenden Reagenzien: 1,38 ul Biotin-Azid (10 mM Lager in DMSO), 5,5 ul TCEP und 32,5 ul TBTA. Vortex mischen.
- In 11 ul CuSO 4 · 5H 2 O pro 500 ul Lysat und Wirbel kurz. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- 4 hinzufügen Probenvolumina Aceton gekühlt auf -20 ° C. Vortex die Proben und über Nacht bei -80 ° C inkubieren, um vollständig um die Proteine auszufällen und nicht umgesetzten Biotin-Azid zu entfernen.
- Zentrifuge die Proben bei 17.000 xg für 15 min bei 4 ° C, um die gefällten Proteine zu pelletieren.
- Absaugen vollständig Überstand und resolubilisieren die Proteine durch Beschallen in 150 ul PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
- Fügen Sie die Proben auf 30 & mgr; l vorgewaschene hoher Kapazität Streptavidin-Agarose-Perlen und inkubiere 1 h bei 4 ° C unter Rotation.
- Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 3 min. Den Überstand aspirieren ungebundenen Proteine und Verwerfungs enthält.
- 1 ml Waschpuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) auf die Kügelchen und inkubiere 5 min bei Raumtemperatur unter Rotation.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.12 und 4.13 3 mal.
- Saugen Sie das Waschpuffer vollständig von den Kügelchen und 30 ul Puffer 2x SDS Probe hinzufügen.
- Inkubieren für 5 min auf einem C Heizblock 95 ° um die Proteine von den Kügelchen zu lösen.
- Zentrifugieren Sie die Perlen für 1 min bei 13.000 xg bei Raumtemperatur.
HINWEIS: An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C bis zur fertig gelagert werden SDS-PAGE laufen. Wenn Proben Gefrieren, vor der Verwendung bei 95 ° C für 5 min aufwärmen. - Vorsichtigdie Probenpuffer pipettieren Proteine aus der Perlen enthält, und laden auf SDS-PAGE 20 (siehe wichtige Überlegungen weiter unten). Die Kügelchen können später gespeichert werden, um Aufkochen, wenn nötig.
HINWEIS: Für die Proteinerkennung durch Silberfärbung, werden bessere Ergebnisse erhalten eine 1 mm dicke Gel verwendet wird. Wenn eine Band aus dem silbergefärbten Gel für die Massenspektrometrie (MS) Analyse geschnitten werden soll, bereiten alle Reagenzien frisch aus sterilen Lösungen und lassen einen leeren Brunnen in zwischen den Proben auf dem Gel. Für jedes Band von der Sonde Spur schneiden, eine parallele Scheibe sollte aus der DMSO Spur genommen werden, so dass Hintergrundproteine abgezogen werden können. Für die Validierung von Protein durch Western-Blot-ID, ist es entscheidend, auch die Eingangsabtastung von 4,4 Schritt laden, wenn das SDS-PAGE-Gel läuft. - Folgen einem Standardprotokoll für entweder Silberfärbung oder Western - Blot - 21 22 das Zielprotein (e) zu detektieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit einer Photoaffinitätssonde des Antimykotikum Itraconazol erhalten, deren Verwendung bisher 16 veröffentlicht wurde. Diese Ergebnisse zeigen die Verwendung der Lebendzellphotoaffinitätsmarkierungstechnik, um erfolgreich eine große Itraconazol-bindende Protein als 35 kDa membrane protein Spannungsabhängiger Anionenkanal 1 (VDAC1) identifizieren.
Das obige Protokoll wurde in HEK293T-Zellen unter Verwendung der Itraconazol-Sonde für Photomarkierungs und unmodifizierten Itraconazol als Konkurrent Molekül durchgeführt. Nachdem die Proben wie beschrieben hergestellt wurden, wurden sie einer SDS-PAGE unterworfen, um die Proteine nach dem Molekulargewicht zu trennen. Das Molekulargewicht Marker-Einheiten auf der linken Seite sind in Kilodalton (kDa). Die erste Spur ist die DMSO Kontrollprobe (D), die zweite Spur ist die Sonde Probe (P) und die dritte Spur ist die Konkurrenz Probe (C). Bands pübel in der DMSO nur Fahrspur Hintergrund betrachtet. In dieser Analyse von Daten, beachten Sie, dass spezifische Bindungsproteine sollten in der DMSO Kontrollprobe, in der Sonde Probe und verringert im Wettbewerb Probe fehlen. In diesem Fall erfasst das Hauptproteinband nur in die Sondenprobe eine Bande von etwa 35 kDa war (Figuren 1 und 3), die durch Massenspektrometrie als VDAC1 identifiziert wurde. Die Identität dieses Proteins wurde in 5 durch Western - Blot bestätigt eine spezifische VDAC1 Antikörper verwendet. Zusammengenommen lassen diese Ergebnisse uns, dass VDAC1 zu schließen ist ein wichtiges Bindeprotein von Itraconazol in diesen Zellen.
Abbildung 1 zeigt die Visualisierung von Proteinen nach der Markierung mit einem fluoreszierenden Marker (aus Schritt 3 in Protokoll); Abbildung 3 zeigt die Visualisierung von Proteinen durch Silberfärbung nach der Markierung mit Biotin - Tag und pe rforming Affinitätsreinigung (aus Schritt 4 in Protokoll); und Figur 5 zeigt die Validierung des ID - Protein einen spezifischen Antikörper für VDAC1 verwenden. 2 und 4 veranschaulichen, was passiert , wenn bestimmte Schritte in dem Protokoll sind nicht richtig durchgeführt (in Figurenlegenden angegeben).
Abbildung 1. Eine repräsentative Fluoreszenz-gescannte SDS-PAGE - Gel (aus Schritt 3 in Protokoll) D = nur DMSO. P = Sonde nur (200 nM); C = Wettbewerb (10 & mgr; M). Das Molekulargewicht Marker-Einheiten auf der linken Seite sind in Kilodalton (kDa). Der Pfeil zeigt auf die Hauptphotomarkierten Proteinbande bei ungefähr 35 kDa, die speziell in der Sondenspur ist und konkurrierten entfernt überschüssige Ausgangsverbindung, was darauf hinweist, dass es ein spezifisches Bindungsprotein ist.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Ein Fluoreszenz-Gel gescannt. Das überschüssige Fluor-Azid vollständig aus dem Gel nicht entfernt worden ist (Schritte 3.6 und 3.7), was zu großen schwarzen Abstriche an der Unterseite des Gels zu erscheinen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen dieser Figur.
Abbildung 3. Eine repräsentative silbergefärbten SDS-PAGE - Gel nach Biotin - pull-down (aus Schritt 4 in Protokoll). Der Pfeil zeigt auf die gleiche Band , die in Abbildung 1 sichtbar gemacht wurde, die anschließend ausgeschnittenaus dem Gel und auf MS-Analyse zur Proteinidentifizierung unterzogen. Markierungseinheiten auf der linken Seite in Kilodalton (kDa). Notieren Sie sich den leeren Raum dazwischen jede Spur, um zu vermeiden , eine Kreuzkontamination von Proben während der Gel - Laden und Band Exzision. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Silberfärbung. Ein silbergefärbten Gel mit sehr hohen Hintergrundfärbung, aufgrund unzureichender vorge Clearing der Lysate (Schritt 4.2) und / oder Waschen der Kügelchen (Schritt 4.13). Beachten Sie auch den Mangel an Raum zwischen den Bahnen. Marker - Einheiten auf der linken Seite sind in Kilodalton (kDa). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Western - Blot des photomarkiertem 35-kDa - Protein, identifiziert durch MS als VDAC1 nach Biotin - pull-down (aus Schritt 4 in Protokoll). Das Signal ist in der Sonde Spur und ging im Wettbewerb Spur, wie in den 1 und 3, die Identität des Proteins als VDAC1 bestätigt. Es ist wichtig, dass die Eingangs Fraktion (aus Stufe 4.4) wird neben den Pull-down-Proben durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Antikörper-Werke und das Protein von Interesse kann im Lysat nachweisbar. Ein leichter Anstieg des Molekulargewichts kann in den Pull-Down - Proben aufgrund der zusätzlichen Größe der kovalent gebundenen Sonde. Zu beachten Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschiedene Ansätze, um die Ziele von kleinen Molekülen zu identifizieren können grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: top-down, wo der zelluläre Phänotyp des Medikaments verwendet wird seine potenzielle Ziele zu verengen auf der Grundlage ihrer bekannten Funktionen oder von unten nach oben, wo das Ziel 3 direkt durch chemische oder genetische Mittel identifiziert. Top-down oder phänotypische Studien können bestimmte zelluläre Prozesse identifizieren durch das Medikament beeinflusst (zB Transkription / Translation / DNA - Synthese, Zellzyklusblock - Signalweg - Aktivierung / Hemmung, etc.), die die ultimative Phänotyp des kleinen Moleküls zu Grunde liegen könnte, die hilft, die Liste möglicher Ziele an Proteine in diesen Prozessen beteiligt verengen. Jedoch ist ein großer Nachteil des Top-down-Ansatz ist, dass es auf beruht, was über diese Prozesse ist bereits bekannt und wird daher voreingenommen gegen Ziele, deren Funktionen nicht charakterisiert worden oder wurden bisher nicht beschrieben werden beteiligtin einem gegebenen Verfahren.
Der Bottom-up-Ansatz umgeht dieses Problem, indem sie das Ziel direkt in unvoreingenommen zu identifizieren. Dies kann durch genetische Mittel erreicht werden; beispielsweise durch eine shRNA Bibliothek für Zuschlags Zellinien Screening , die Resistenz oder Überempfindlichkeit gegenüber dem Arzneimittel verleihen, oder arzneimittelresistenten Zelllinien durch Isolieren und unter Verwendung von genomischer Sequenzierung zu bestimmen , welche Gene 1 - Mutationen enthalten. Diese Arten von Experimenten können Schlüsselproteine oder Wege auf die Aktivität des Medikaments im Zusammenhang identifizieren, aber nicht unbedingt direkt nachweisen zu dem identifizierten Proteinbindung. Chemische Ansätze, andererseits beinhalten typischerweise die Verwendung einer chemischen Sonde an das Zielprotein zu binden, direkt und erlauben, seine Isolierung und Identifizierung. Entwerfen einer Sonde, die ihre Fähigkeit, an das Zielprotein zu binden, behält erfordert die Verwendung von SAR-Studien eine Position auf dem Molekül zu identifizieren, die ohne signifikanten Aktivitätsverlust modifiziert werden. Es also erfordert , dass die Sonde der Lage sein , sein Ziel entweder kovalent oder mit einer ausreichend hohen Affinität zu binden , dass es von anderen zellulären Proteinen isoliert werden kann (dh affinitätsgereinigtem), und dass diese Proteine behalten ihre Fähigkeit , das kleine Molekül außerhalb ihres Heimat zu binden Zellumgebung. Diese Anforderung kann für bestimmte Ziele problematisch sein; beispielsweise erfordern integrale Membranproteine oft eine spezifische Lipidumgebung ihre aktive Konformation zu halten und können aggregierte oder falsch ausgerichtet für die Ligandenbindungs werden einmal Zellen lysiert werden. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben vermeidet diese möglichen Gefahren von Affinitätsreinigung durch die kovalente Modifikation des Zielproteins ermöglicht innerhalb der nativen zellulären Umgebung, so dass nachfolgende Manipulationen nicht die Droge-Ziel - Interaktion 10 unterbrechen kann.
Die erfolgreiche Umsetzung des beschriebenen Protokolls, hängt von mehreren Faktoren ab. Es ist wichtig, dass die target Protein des kleinen Moleküls ausreichend in dem Zelltyp für Photomarkierung ausgewählt reichlich sein. Der Zelltyp meisten potent durch das kleine Molekül betroffen ist, kann ein guter Ausgangspunkt sein, aber es können mehrere verschiedene Zelltypen zu testen, notwendig sein, eine mit hoher Zielproteinausbeuten zu finden. Alternativ kann die Anreicherung von verschiedenen Protein-Populationen durch subzellulärer Fraktionierung die Zielrendite erhöhen, während Hintergrundmarkierung zu verringern. Detektion von fluoreszent markierten Proteine ist im allgemeinen viel empfindlicher als Proteindetektion durch Silberfärbung; Daher kann durch Fluoreszenz nachgewiesen Bänder können nicht durch Silberfärbung nach dem Biotin pull-down detectible sein. Scaling-up des Experiments durch die Verwendung mehrerer Gerichte der Zellen pro Behandlungsbedingung kann helfen, dieses Erkennungsproblem zu überwinden. die Konzentration der Sonde Die Erhöhung kann auch pull-down-Ausbeuten zu verbessern. Spezifische Banden können auch durch hohen Hintergrund verdeckt werden, in welchem Falle mehr stringenten Wasch, multiple Pre-Stufen oder die Verwendung von Perlen mit einer unterschiedlichen Zusammensetzung (wie magnetische Kügelchen anstelle von Agarose) Clearing hilfreich sein kann. Wenn jedoch das Zielprotein im Überfluss zu niedrig ist, kann es nicht möglich sein, durch Silberfärbung nachzuweisen. Außerdem, wenn das Zielprotein nicht als scharfe Bande auf SDS-PAGE (wie stark glycosylierte Proteine) wandert es wird auch schwieriger zu visualisieren. Weitere Änderungen an dem Protokoll könnte gemacht werden, diese Probleme zu überwinden, wie beispielsweise Durchführen Voll Probe Proteomik oder SILAC (Silac), um markierte Proteine nach der Pull-down identifizieren, wodurch die Notwendigkeit, eine Band auszuschneiden eines silbergefärbten Gel.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Konzentration der Sonde in dem Experiment verwendet werden. Idealerweise sollte die niedrigste Menge an Sonde, die ein nachweisbares Signal erzeugt, verwendet werden. Höhere Konzentrationen höher Signal geben, sondern auch eine höhere Hintergrundmarkierung und einmal alle of die Bindungsstellen auf dem Ziel höchsten Affinität gesättigt können zusätzliche geringere Affinität Ziele sein, die zu detektierende beginnen. Die optimale Konzentration sollte daher empirisch bestimmt werden, indem sie mit einer relativ hohen Konzentration (1-2 uM) beginnt und zurück, bis nur noch ein oder zwei Proteine werden markiert Titrieren und die Konkurrenz ist offensichtlich.
Die Wirksamkeit der Sonde kann bei der Auswahl der Ausgangskonzentration berücksichtigt werden; jedoch abhängig von der Zielfluss und Wirkungshemmung gibt keine gute Korrelation zwischen der Sondenaktivität und Zielerfassung (beispielsweise eine Sonde mit niedrigen nanomolaren Hemmung ziehen nicht notwendigerweise genug Protein sein kann bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen bis zu detektierbar ). Somit ist es bevorzugt, die am meisten geeignete Konzentration empirisch unter Verwendung von Nachweis markierter Proteine als Auslesung zu bestimmen. Die Konzentration des Kompetitors verwendeten sollte die der Sonde überschreitenmindestens 20-fach, aber Vorsicht sollte auch nicht die Löslichkeitsgrenze des Kompetitors zu überschreiten genommen werden.
In dem Fall, dass die von der Sonde, die Identifizierung des funktionell relevante Protein wird komplizierter werden mehrere Proteine nach unten gezogen. Allerdings gibt es mehrere Möglichkeiten, die potentielle Zielproteine einengen zu helfen. Wie oben erwähnt, können die Sondenkonzentration titriert zurück helfen, die Spezifität der Markierung verbessern. Da die Konzentration der Sonde fällt, höhere Affinität bindende Proteine sollten ihre Signalintensität beibehalten, während eine geringere Affinität Proteine verschwinden sollte. Deconvolution of multiple potentielle Ziele können auch durch die Verwendung von chemischen Analoga der Stammverbindung mit variierenden Aktivitätsgrade unterstützt werden. Theoretisch für eine funktionsrelevanten Ziel, sollte es eine Korrelation sein, zu dem Ziel und Aktivität des analogen zwischen der Bindung. Zum Beispiel, den Wettbewerb durch inaktive Analoga der Ausgangsverbindung kann verwendet werden, die Bindung p auszuschließenroteins, die in den phänotypischen Wirkungen der Verbindung nicht beteiligt sind. Ebenso aktive Analoga oder andere kleine Moleküle, die den gleichen Phänotyp wie die Stammverbindung auslösen können, verwendet werden Regel in den einschlägigen bindenden Proteine zu helfen. In die gleiche Richtung, die Verwendung eines inaktiven oder strukturell nicht verwandt Photoaffinitätssonde kann helfen, irrelevante Proteine auszuschließen.
Validierung des Zielproteins erfordert zunächst die Überprüfung der durch MS identifizierten Proteins. Dies kann leicht durch Western-Blot nach dem Biotin-pull-down erreicht werden, bietet einen hochwertigen Antikörper unter der Annahme, für das Zielprotein zur Verfügung steht. Wenn jedoch mit einem unbekannten Protein arbeiten, ist es einfach viel Zeit und Geld auf schlechte Antikörper zu verschwenden. Es ist daher wichtig , dass der Antikörper validiert werden, und dass sie eine spezifische Bande in dem Lysat der Zellen für die Markierung (dh der Eingangsprobe) verwendet wird detektiert. Darüber hinaus, weil die Proteinausbeute nach Pull-down niedrig sein kann, die Ameiseibody hat sehr empfindlich zu sein, und in Abhängigkeit von dem Antikörper hohe Konzentrationen erforderlich sein können (bis zu 1: 100 Verdünnung in einigen Fällen). Um diese Probleme, eine markierte Version des Proteins zu vermeiden kann in den Zellen vor der Photomarkierungs ausgedrückt werden, und der Tag kann dann verwendet werden, um das Protein nach der Pull-down zu detektieren.
Sobald das Protein ID bestätigt wird, funktionelle Validierung des Targets können durch genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen durchgeführt werden, oder funktionelle Assays der Ziel von Interesse, um zu zeigen, dass die Aktivität des Ziels durch Kleinmolekül-Bindungs beeinflußt wird. Die Bindungsstelle kann von der Sonde, oder zur Bestimmung der 3-dimensionalen Struktur des gebundenen kleinen Molekül durch Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie modifiziert durch Identifizieren der Aminosäure kartiert werden. Idealerweise kann, wenn eine Mutante gefunden werden, dass seine Fähigkeit verliert, das kleine Molekül zu binden, sollte es in der Lage sein, die Aktivität des kleinen Moleküls, wenn anstelle der Wildtyp-Pro exprimiert abzuschaffentein. Es kann auch wünschenswert sein, die Bindung an das Ziel über andere strukturell verwandte oder "off-target" Proteine zeigen Spezifität.
Dieses allgemeine Protokoll kann in jeder Anwendung verwendet werden, erfordert die direkte Messung von kleinen Molekül-Bindung an ein Proteinziel, solange eine Sonde hergestellt werden kann, dass die Bioaktivität der Stammverbindung beibehält. Mögliche Anwendungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, molekulare Ziele neuer Verbindungen zu identifizieren, Vermessungs Potential off-targets vorhandener Arzneimittel, die direkte Bindung eines kleinen Moleküls an ein bestimmtes Protein von Interesse bestätigt, Bestimmen Konkurrenz durch andere kleine Moleküle binden an die gleiche Bindungsstelle auf einem Protein und neue Rezeptoren von natürlich abgeleitet oder endogene Liganden zu entdecken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
