Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54529

Introduction

מולקולות קטנות ביו ביסודו לעבוד על ידי אינטראקציה עם ושינוי הפונקציה של אחד או יותר מולקולות "יעד", רוב החלבונים בדרך כלל, בתא. גילוי סמים, כאשר תרכובת פעילה מתגלה באמצעות הקרנת פנוטיפי, הזהות של הנפגע המולקולרי (ים) של המתחם כי הוא חיוני, לא רק להבנת מנגנון פעולה ואת תופעות לוואי אפשריות של המתחם, אלא גם עבור פוטנציאל גילוי ביולוגיה חדשה שבבסיס מודל המחלה ולסלול את הדרך לפיתוח של כיתות מכניסטית חדשות של הרפוי 1. למרות זיהוי המטרה אינו נדרש עבור תרופת לשמש טיפולית, בשנים האחרונות חלה הכרה גוברת כי מועמדי תרופה חדשניים סיכויים טובים יותר להצליח בניסויים קליניים, ולכן להניב תשואות טובות יותר על השקעה, אם יעד תוקף הוא ידוע 2. לפיכך, חלה התעניינות גוברת שיטות לזיהוי קטןחלבוני יעד מולקולה.

ניסוי זיהוי מטרות קלסי בדרך כלל מסתמך על טיהור זיקה, שבו המולקולה הקטנה של העניין היא משותקת על שרף וטופחה עם lysates התא כולו, שלאחריו חלבונים מאוגדים נשטפים והחלבונים הנותרים הם eluted וזיהו 3. בעוד טכניקה זו נעשה שימוש כדי לזהות את המטרות של מולקולות קטנות רבות 4, הוא אינו מתאים כשיטה מזהה היעד אוניברסלי מכמה סיבות. ראשית, חלבון המטרה חייב לשמור קונפורמציה המקורית שלו על תמוגה תא על מנת לשמר את יכולתה להיקשר המולקולה הקטנה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד עבור חלבונים בממברנה, אשר לעתים קרובות לעבור שינויים מרחביים לאחר הוצאתו מסביבת מולדתם, או פשוט המצרפי משקע מתוך פתרון. שנית, המולקולה הקטנה חייבת להיות שינוי כימי בצורה כזו כי זה יכול להיות משותק על השרף תוך שמירהיכולתה לקשור את חלבון המטרה. כיסים מחייבים עמוקים עשויים אפוא להיות נגישים מולקולה קטנה ברגע שהוא מקובע השרף. שלישית, זיקת המחייב חייבת להיות גבוהה מספיק שהאינטראקציה נשמרת במהלך שלבי הכביסה, מה שהופך זיהוי של אינטראקציות זיקה נמוכות מאתגרות. תנאים רביעיים, סביבתיים כגון pH, ריכוז יון, או הנוכחות של מולקולות אנדוגני אחרות יכולים להשתנות מרחבית בתוך התא הם לפעמים תנאים מוקדמים תרופתי-יעד. לכן, מציאת התנאים הנכונים כדי לאפשר ולשמור המחייב החיצוני של התא יכול דורש כמות משמעותית של ניסוי וטעייה.

תיוג Photoaffinity עוקף בעיות אלה בכך שהוא מאפשר הקשר הקוולנטי של מולקולה קטנה היעד שלה בהקשר יליד תא. במקום לשתק המולקולה הקטנה כדי שרף מגושם גדול המולקולה במקום שינוי כימי להתקין שני גרם פונקציונלי קטןroups: א מחצית photoactivatable המאפשר crosslinking קוולנטיים חלבון המטרה כאשר מוקרנים עם אורך גל מסוים של אור, וקבוצת כתב המאפשרת חלבון המטרה כדי להתגלות ובהמשך מבודד. תאי חי מטופלים עם חללית photoaffinity, החללית נקשרה ו Crosslinks קוולנטית חלבון המטרה, והמתחם-החלבון החללי הוא אז מבודד ללא פגע. הספציפי של חללית מחייבת את היעד מודגם על ידי ביצוע ניסוי תחרות במקביל, שבו עודף של תרכובת האב משמש להתחרות במרחק מחייב של חללית חלבון המטרה.

העיצוב וסינתזה של בדיקות photoaffinity משתנה מאוד בין מולקולה קטנה אחת לאחרת, ולא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה; עם זאת, מספר דיונים מעולים בנושא פורסמו 5-9. השיקול העיקרי הוא כי החללית שומרת לעצמה את הפעילות הביולוגית של תרכובת האב, ולכן presumably מחייב לאותו היעד (ים). מבנה-פעילות יחסים (SAR) מחקרים חייבים להתבצע כדי לקבוע אילו חלקים של המולקולה ניתן לשנות ללא הפסד של פעילות ביולוגית. מגוון של קבוצות כימיות שונות שמש crosslinkers photoactivatable, כולל diazirine, benzophenone, ו תזיד aryl, אשר לכל אחד מאתנו יש יתרונות וחסרונות 10. כמו כן, ישנם תגי הכתב מרובים שנוצלו לבודד חלבונים קושרי החללית. קבוצות Reporter עשויות להיות פונקציונליות בכוחות עצמם, כגון ביוטין נפוץ או תגי פלורסנט, או עשוי להיות מבשרים הדורשים functionalization נוסף לאחר צעד photocrosslinking, אשר יש את היתרון של להיות קטן יותר ולכן פחות סביר להתפשר פעילות ביולוגית 11.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בדיקת photoaffinity המכילה קבוצת diazirine photocrosslinking, וכן אלקין מסוף הקובץ המצורף של קבוצת כתב באמצעות Cu (I) -catalyzed אזיד-אלקין cycloaddition שארפלס-Hüisgen (או לחץ) התגובה 12-15. מחקרי SAR, לחקור תכנון וסינתזה, ותוצאות המחקרים הללו פורסמו במקומות אחרים 16-18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה הותאם מ מקינון טאונטון 10 לשימוש בתאים חיים.

1. הכנת תאים בתרבית

  1. הכן מאכלי תרבית תאי 6 סנטימטר סטרילי עבור מספר הדגימות הרצויות (ראה להלן).
    הערה: צלחת אחת של תאים משמשת לכל מצב טיפול, אבל אם יותר חלבון נדרש 2 או 3 מנות אפשר להכין לכל מצב ומשולב לאחר קרינת UV.
    1. הכן לפחות 3 מנות של תאים; בקרה שלילית עם DMSO בלבד (D), טיפול Probe בלבד (P), ואת החללית + מתחרה (C).
    2. לחלופין, להכין צלחת 4 th כמו אין שליטת UV, כדי להיות מטופלים עם חללית אבל לא חשוף לאור UV.
      הערה: אם מולקולות מתחרה מרובות הן להיבדק, כגון אנלוגים שונים של המולקולה הקטנה של עניין, להכין צלחות מתחרה נוספות לפי צורך.
  2. הוספת תאים HEK293T מנות תרבות בתקשורת תרבות 4 מ"ל. השתמש 3.5 מיליון גאמות לכל צלחת.
    הערה: מספר תאים צריך להיקבע עבור כל סוג תא כך תאים הם כמעט 100% ומחוברות בתחילת הניסוי, על מנת להשיג את תשואת החלבון מקסימלית. לקבלת HUVEC, להשתמש 0.3 מיליון תאים לכל צלחת. קירוב טוב הוא 1/10 של תאים בצלחת ס"מ 15 ומחוברות. תאי HEK293T צריכים להיות מתורבתים ב Modified של Dulbecco נשרים בתוספת בינונית עם 10% עובריים שור סרום (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
  3. מחזיר את תאי חממת התרבות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) הלילה.

2. טיפול תאי Photocrosslinking

  1. למחרת, מראש aliquot התרופות הבאות לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge:
    1. עבור הטיפול הראשון, להוסיף 4 μl של DMSO ל -2 צינורות 4 μl של 10 מתחרה מ"מ (כלומר, במתחם ההורה ללא שינוי) עד 1 צינור.
    2. לטיפול השני, להוסיף 16 μl של DMSO עד 1 צינור 16 μl של 50 &# 181; M photoaffinity חללי 2 צינורות.
      ההערה: הריכוז האופטימלי עשויה להיות שונה עבור בדיקות שונות (ראה דיון), אבל בין 200-500 ננומטר היא נקודת התחלה טובה (כאן אנו משתמשים 200 ננומטר). ריכוז המתחרה צריך יעלה על זה של החללית לפחות פי 20 (כאן אנו משתמשים 10 מיקרומטר). הריכוז הסופי של DMSO צריך להיות שווה בכל הצלחות לא יעלה על 0.5% (20 נפחי μl).
  2. תביאו את צלחות התא לתוך מכסה המנוע תרבית תאים ולהוסיף התרופות מראש aliquoted משלב 2.1.1 כדלקמן: לשאוב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות, resuspending התרופה טרום aliquoted בתקשורת, בעדינות הוספתו בחזרה עד טיפת צלחת חכם. מוסיפים את DMSO לצלחת DMSO (D) ואת החללית (P) צלחת, ולהוסיף המתחרה לצלחת התחרות (C). החזר את הצלחות אל האינקובטור התרבות למשך 30 דקות.
  3. עם אורות בשכונת התרבות המעומעמת, מוסיף את החללית מראש aliquoted משלב 2.1.2 לחקור (P) וצלחות תחרות (C) ולהוסיף אתDMSO לצלחת DMSO (D), כאמור לעיל. החזר את הצלחות אל האינקובטור התרבות עבור שעה 1.
  4. במהלך הדגירה, להכין את הפריטים הבאים: מגש של קרח שיכול להתאים כל הלוחות; קר כקרח חיץ תמוגה (PBS [pH 8.5] + מעכבי פרוטאז 1x קוקטייל [EDTA-שלמה וחופשית, בדילול מפתרון המניות 50x עשה במים]; 200 μl / צלחת); צינורות microcentrifuge שכותרתו D, P, או C עבור כל אחד מתנאי הטיפול השונים, על קרח.
  5. 15 דקות לפני סוף דגירת hr 1, להגדיר את מנורת UV (365 ננומטר) בחדר הקר להפעיל אותה כדי לחמם את הנורה.
  6. לאחר 1 דגירת שעה עם החללית, למקם מנות על קרח. שוטפים את התאים בעדינות עם 5 מ"ל קר כקרח PBS (pH 7.4) כדי להסיר בדיקה עודף. Re-לכסות את התאים עם 4 מ"ל קר כקרח PBS.
  7. מניח את הצלחת של תאים מרוכזים 3 סנטימטרים תחת מנורת UV על גבי שקית קרח כדי למזער חימום מהמנורה. מקרין במשך 3 דקות. מוציאים את המאפה למגש של קרח וחזור עבור כל הדגימות.
  8. אהקרנת חרה, לשאוב את PBS מתאי ולהוסיף 200 μl של (pH 8.5) PBS קר כקרח עם מעכבי פרוטאז על כל צלחת. לנתק את התאים מן הצלחת באמצעות גומי מגרד ולהעביר את הצינורות microcentrifuge מראש שכותרתו על הקרח.
  9. הוספת SDS לריכוז סופי של 0.4% (10 μl של 10% SDS לתוך 250 μl של המדגם).
    זהירות: אבקת SDS מהווה סכנה. הימנע משאיפת אבקת SDS ידי לובש מסכה על האף והפה.
  10. Lyse את התאים על ידי sonicating ההשעיה עבור 10 פעימות (פלט 1, מחזור עבודה 30%) ו דגירה על קרח למשך 1 דקה לפני סיבוב שני של 10 פעימות.
  11. במידת הצורך, סר 2 μl של השעיה ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור על מנת להבטיח תמוגה תא שלמה.
  12. מרתיח את הדגימות על פלטה חשמלית להגדיר עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשלים תמוגה תא לפגל כל החלבונים.
  13. למדוד את ריכוז החלבון מדגם באמצעות assay חלבון spectrophotometric תואם-חומרי ניקוי, כגון הדואר חלבון בירת assay 19, על פי הוראות היצרן, עם ספקטרופוטומטר להגדיר למדוד ספיגה ב 750 ננומטר.
  14. לנרמל את ריכוז החלבון ל -2.5 מ"ג / מ"ל ​​(או אם ריכוזים נמוכים מ -2.5 מ"ג / מ"ל, לנרמל את המדגם עם ריכוז החלבון הנמוכה ביותר) על ידי הוספת PBS pH 8.5 + 0.4% SDS לפי הצורך (למשל, אם הדגימות הן 5 מ"ג / מ"ל ​​ב 250 μl, להוסיף 250 μl של pH PBS 8.5 + 0.4% SDS כדי לקבל ריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מ"ל).

3. צירוף תג פלורסנט ידי לכימיה לחץ על ויזואליזציה של חלבונים שכותרתו

  1. הסר 40 μl של lysate התא והעברת צינור microcentrifuge חדש. שמור את lysates הנותר עבור תגובה עם ביוטין-תזיד (שלב 4).
  2. מוסיפים את ריאגנטים הבאים לפי הסדר: 0.2 μl-אזיד פלואור (פתרון המניות 1 מ"מ DMSO), 0.58 TCEP μl (מלאי 100 מ"מ במים עם 4 ושווי NaOH הוסיף, מוכן טרי), ו 3.38 TBTA μl (1.7 מניות מ"מ בתוך 4: יחס 1 של t-butanol כדי DMSO). וורטקס לערבב.
  3. להוסיף 1.14 μl CuSO 4 -5H 2 O (50 מ"מ במים) כדי להתחיל את התגובה. וורטקס בקצרה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
  4. הוסף 50 μl של חיץ מדגם 2x SDS כדי להרוות את התגובה. בנקודה זו, הפעל את דגימות ישירות על ג'ל SDS-PAGE 20 לקבלת התוצאות הטובות ביותר, או בחנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
  5. אם הקפאת דגימות, לחמם במשך 5 דקות ב 95 ° C לפני הטעינה על הג'ל.
    הערה: מאז המשקל המולקולרי של חלבון המטרה בדרך כלל אינו ידוע בשלב זה, רצוי לרוץ 2 ג'לים עם ריכוזי acrylamide שונים (כלומר, 8% ו -15%), או מגוון משקל מולקולרי רחב ג'ל שיפוע (כלומר, 4-15%), כדי להבטיח כיסוי משקל מולקולרי מוחלט.
  6. כאשר החזית לצבוע הגיעה לסוף של הג'ל, להמשיך להפעיל את ג'ל למשך 5 דקות נוספות כדי להבטיח את כל unreacte העודףפלואוריד-אזיד ד כבר יצא הג'ל לחלוטין.
  7. הסר את הג'ל למכל עם DDH 2 O ו דגירה של 10 דקות עם תסיסה עדינה, כדי לשטוף את כל-יזיד פלואור העודף.
  8. מניחים את הג'ל על צלחת זכוכית לסרוק את הג'ל באמצעות סורק ג'ל ניאון טייפון פי הוראות היצרן.

4. צירוף תג ביוטין על ידי כימיה לחץ עבור טיהור זיקה של חלבונים שכותרתו

  1. של lysates הנותרים משלב 3.1, השתמש הסכום המקסימלי לאחר נורמליזציה חלבון כזה שכל הדגימות הן באותו נפח (למשל, אם לאחר נורמליזציה 2.5 מ"ג / מ"ל ​​הכרכים מדגם וכתוצאה מכך הם 500, 550, ו -600 μl, השתמש 500 μl של כל אחד).
  2. טרום לנקות את lysates על ידי הוספת 50 μl קיבולת גבוהה חרוזים agarose streptavidin, 2x מראש שטף עם PBS (pH 7.4). דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
  3. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. הסר tהוא supernatant לצינור microcentrifuge חדש על קרח וזורק את החרוזים.
  4. הסר 1-2% מהמדגם DMSO לצינור חדש שכותרתו "קלט". הוסף נפח שווה של חיץ ולאחסן מדגם 2x SDS ב -20 ° C.
  5. לפי 500 μl של lysate, מוסיפים את ריאגנטים הבאים: 1.38 μl-אזיד ביוטין (המניה 10 מ"מ DMSO), 5.5 μl TCEP, ובמרחק של כ -32.5 TBTA μl. וורטקס לערבב.
  6. להוסיף 11 μl CuSO 4 -5H 2 O לכל 500 μl של lysate ו מערבולת בקצרה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  7. הוסף 4 כרכים מדגם של אצטון מקורר ל -20 מעלות צלזיוס. וורטקס דגימות דגירת הלילה ב -80 ° C כדי לזרז את החלבונים לחלוטין ולהסיר ביוטין-יזיד unreacted.
  8. צנטריפוגה הדגימות ב 17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולת החלבונים זרזו.
  9. לשאוב supernatant לחלוטין, resolubilize החלבונים על ידי sonication ב 150 μl PBS (pH 7.4) + 1% SDS.
  10. מוסיפים את דגימות עד 30 μl מראש שטף חרוזים agarose streptavidin בקיבולת גבוהה דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
  11. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant המכיל חלבונים שנזרקו מאוגד.
  12. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף (400 mM NaCl, 50 מ"מ טריס, 0.2% SDS, pH 7.4) על חרוזים דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
  13. חזור על שלבים 4.12 ו 4.13 3 פעמים.
  14. לשאוב חיץ לשטוף לחלוטין מן החרוזים, ולהוסיף 30 μl של חיץ מדגם 2x SDS.
  15. דגירה במשך 5 דקות על גוש חום 95 ° C כדי לשחרר את החלבונים מן החרוזים.
  16. צנטריפוגה חרוזים דקות 1 ב 13,000 XG בטמפרטורת החדר.
    הערה: בשלב זה, הדגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן לרוץ SDS-PAGE. אם הקפאת דגימות, לחמם במשך 5 דקות ב 95 מעלות לפני השימוש.
  17. בקפידהפיפטה למאגר מדגם המכיל חלבונים הנחה של חרוזים, ולטעון על SDS-PAGE 20 (ראה שיקולים חשובים להלן). החרוזים ניתן לשמור על reboiling מאוחר יותר במידת הצורך.
    הערה: לקבלת זיהוי חלבון על ידי כתם כסף, תוצאות טובות יותר מתקבלות באמצעות ג'ל 1 מ"מ עובי. אם להקה היא שיש להוציא מתוך הג'ל כסף מוכתם עבור ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח, להכין את כל ריאגנטים טריים מפתרונות סטרילית להשאיר ריק היטב בין דגימות על הג'ל. עבור כל להקה לחתוך מהנתיב החללי, פרוסה במקביל יש לנקוט מנתיב DMSO כך חלבוני רקע שיכולים להיגרע. עבור אימות של חלבון מזהה על ידי כתם המערבי, זה קריטי גם לטעון את המדגם קלט משלב 4.4 בעת הפעלת ג'ל SDS-PAGE.
  18. עקוב פרוטוקול סטנדרטי או צביעת כסף 21 או מערביים כתם 22 לזהות חלבון המטרה (ים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המוצגות כאן התקבלו עם חללית צילום זיקה של itraconazole התרופה נגד הפטריות, השימוש אשר פורסם בעבר 16. תוצאות אלו מראות את השימוש בטכניקת תיוג לחיות תאי photoaffinity לזהות חלבון מחייב itraconazole גדול בהצלחה כמו חלבון הממברנה 35 kDa מתח-Dependent ערוץ 1 אניון (VDAC1).

בפרוטוקול לעיל בוצע בתאי HEK293T באמצעות החללית itraconazole עבור photolabeling ו itraconazole ללא שינוי כמו מולקולה המתחרה. לאחר הדגימות נערכו כמתואר, הם היו נתונים SDS-PAGE כדי להפריד בין חלבונים לפי משקל מולקולרי. יחידות סמן משקל מולקולרי משמאל נמצאים kilodaltons (KDA). הנתיב הראשון הוא המדגם מלא DMSO (D), הנתיב השני הוא המדגם החללי (P), ו בנתיב השלישי הוא מדגם התחרות (C). p להקותלהתרעם השביל רק DMSO נחשבים ברקע. בניתוח נתונים אלה, לב ספציפית כי חלבונים מחייבים צריכים להיעדר במדגם מלא DMSO, נוכחי במדגם החללית וירידה במדגם התחרות. במקרה זה, להקת החלבון העיקרית לאבחון רק במדגם החללית היה להקה של כ 35 kDa (איורים 1 ו 3), אשר זוהה על ידי ספקטרומטריית מסה כמו VDAC1. זהותו של חלבון זה אושר באיור 5 על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן ספציפי VDAC1. יחדיו, תוצאות אלה מאפשרות לנו להסיק כי VDAC1 הוא חלבון מחייב גדול של itraconazole בתאים אלה.

איור 1 מדגים את להדמיה של חלבונים לאחר תיוג עם תג פלורסנט (משלב 3 בפרוטוקול); איור 3 מדגים הדמיה של חלבונים על ידי כתם כסוף אחרי תיוג עם תג ביוטין ו PE rforming טיהור זיקה (משלב 4 בפרוטוקול); ואיור 5 מדגים את האימות של זהות החלבון באמצעות נוגדן ספציפי עבור VDAC1. איורים 2 ו -4 מדגימים מה קורים אם צעדים מסוימים בפרוטוקול לא מבוצעים כהלכה (ציין באגדות דמות).

איור 1
איור 1. ג'ל SDS-PAGE נציג-סרק קרינה (משלב 3 בפרוטוקול) D = DMSO בלבד.; P = בדיקה בלבד (200 ננומטר); C = תחרות (10 מיקרומטר). יחידות סמן משקל מולקולרי משמאל נמצאים kilodaltons (KDA). נקודות החצים כדי להקת החלבון העיקרית photolabeled בכ 35 kDa כי קיים במיוחד בנתיב החללי והוא התחרה משם על ידי תרכובת אב עודפת, המציין כי זהו חלבון מחייב ספציפית.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ג'ל לסריקת קרינה. יזיד-פלואוריד העודף לא הוסר לחלוטין מן הג'ל (שלבי 3.6 ו -3.7), גרימת כתמים שחורים גדולים להופיע בתחתית של הג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3. ג'ל כסף מוכתם SDS-PAGE נציג לאחר ביוטין הנפתח (משלב 4 בפרוטוקול). נקודות החץ לאותו הלהקה כי היה דמיינו באיור 1, אשר היה נכרת לאחר מכןמן ג'ל נתון ניתוח MS לזיהוי חלבונים. יחידות מרקר מהשמאל נמצאות kilodaltons (KDA). הערה בחלל הריק שביניהם בנתיב אחד, על מנת למנוע זיהום צולב של דגימות במהלך כריתת העמסת להקת ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. מכתים כסף. ג'ל מוכתם כסף עם מכתים רקע גבוה מאוד, עקב ביצוע סליקה מראש מספקת של lysates (שלב 4.2) ו / או שטיפה של חרוזים (שלב 4.13). שים לב גם חוסר המקום בין הנתיבים. יחידות מרקר מהשמאל נמצאות kilodaltons (KDA). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
כתם המערבי איור 5. של חלבון 35-kDa photolabeled, שזוהו על ידי MS כמו VDAC1 לאחר הנפתח ביוטין (משלב 4 בפרוטוקול). האות נמצא בנתיב החללית וירידה בנתיב התחרות, כמו איורים 1 ו -3, המאשר את זהותו של חלבון כמו VDAC1. חשוב כי שבר הקלט (משלב 4.4) מנוהל לצד הדגימות הנפתחים, כדי להבטיח כי עבודות הנוגדן לחלבון של עניין ניתן לאתר את lysate. עלייה קלה במשקל מולקולרי אפשר לראות בדגימות הנפתחות בשל הגודל המוסף של החללית המחוברת קוולנטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גישות שונות לזיהוי המטרות של מולקולות קטנות ניתן לקבץ באופן כללי לשתי קטגוריות: מלמעלה למטה, שם פנוטיפ הסלולר של התרופה משמש כדי לצמצם את המטרות הפוטנציאליות שלה המבוסס על הפונקציות הידועות שלהם, או מלמטה למעלה, כאשר היעד מזוהה ישירות באמצעים כימיים או גנטיים 3. מלמעלה למטה או מחקרים פנוטיפי יכול לזהות תהליכים תאיים מסוימים מושפעים התרופה (למשל, תעתיק / תרגום / סינתזה של DNA, בלוק מחזור התא, מאותת את הפעלת מסלול / עיכוב, וכו ') שעשוי ביסוד פנוטיפ האולטימטיבי של המולקולה הקטנה, אשר עוזר לצמצם את הרשימה של מטרות פוטנציאליות לחלבונים המעורבים בתהליכים אלה. עם זאת, החיסרון העיקרי של הגישה מלמעלה למטה היא כי הוא מסתמך על מה שכבר ידוע על תהליכים אלה, ולכן מוטה נגד מטרות שתפקידיה טרם אופיינו או לא תוארו בעבר להיות מעורבבתהליך נתון.

הגישה מלמטה למעלה עוקף בעיה זו על ידי זיהוי היעד ישירות משוא פנים. ניתן להשיג זאת באמצעות גנטי; למשל, על ידי הקרנת ספריית shRNA עבור שורות תאים מציאה המקנים עמידות או רגישות יתר לתרופה, או על ידי בידוד שורות תאים עמידים לתרופות ושימוש מיפוי גנומי כדי לקבוע אילו גנים המכילים מוטציות 1. סוגים של ניסויים אלה יכולים לזהות חלבוני מפתח או מסלולים הקשורים לפעילות של התרופה, אך לא בהכרח להוכיח ישיר מחייבים חלבון המזוהה. גישות כימיות, מצד השני, בדרך כלל כרוך בשימוש בדיקה כימית לאגד את חלבון המטרה ישירות ולאפשר הבידוד וזיהוי שלה. תכנון חללית אשר שומרת יכולתה לאגד את חלבון המטרה מחייבת שימוש מחקרי SAR לזהות עמדה על המולקולה שיכולה להיות שונה ללא הפסד של פעילות משמעותי. זה also דורש כי החללית להיות מסוגלת להיקשר היעד שלה או קוולנטית או עם זיקה גבוהה מספיק כי זה יכול להיות מבודד חלבונים תאיים אחרים (כלומר, זיקה מטוהרת), וכי חלבונים עוזרים להם לשמור על יכלו להיקשר המולקולה הקטנה מחוץ מולדתם סביבה תאית. דרישה זו עלולה להיות בעייתית עבור מטרות מסוימות; למשל, חלבונים בממברנה אינטגרליים דורשים לעתים קרובות בסביבת שומנים ספציפית לשמור קונפורמציה הפעילה שלהם, ועשויים להיות מצטבר או בעלי אורינטציה כראוי עבור ליגנד מחייב פעם תאי lysed. השיטה המתוארת בכתב היד הזה תמנע בעיות פוטנציאליות אלה של טיהור זיקה בכך שהוא מאפשר את השינוי קוולנטי של חלבון המטרה בתוך הסביבה התאית הילידים, כך המניפולציות הבאות לא יכולות להפסיק את אינטראקצית סמי יעד 10.

יישום מוצלח של הפרוטוקול המתואר תלוי במספר גורמים. חשוב כי taחלבון r קבל של המולקולה הקטנה להיות שופע מספיק בסוג התא שנבחר photolabeling. סוג התא המושפע ביותר בעצמה על ידי המולקולה הקטנה יכול להיות נקודת זינוק טובה, אבל זה עשוי להיות נחוץ כדי לבדוק תאים מסוגים שונים מרובים כדי למצוא אחד עם תשואות חלבון המטרה גבוהה. לחלופין, העשרה של אוכלוסיות חלבון שונות על ידי חלוקת subcellular עשוי להגדיל את תשואת היעד תוך הפחתת תיוג רקע. איתור של חלבונים מתויגים fluorescently הוא בדרך כלל הרבה יותר רגיש לגילוי חלבון ידי כתם כסף; ולכן, להקות זוהו על ידי קרינה עשויות לא להיות detectible ידי צביעת כסף לאחר הנפתח ביוטין. הדרוג את הניסוי באמצעות מנות מרובות של תאים לכל מצב טיפול יכול לעזור להתגבר על בעית הגילוי הזה. הגדלת הריכוז של חללית גם יכולה לעזור לשפר את התשואות נפתחות. להקות ספציפיות עשויות להיות מוסתרות גם על ידי רקע גבוה, ובמקרה כביסה מחמירה יותר, מראש מרובותניקוי מדרגות, או השימוש אגלי בהרכב שונה (כגון חרוזים מגנטיים במקום agarose) עשוי להיות מועיל. עם זאת, אם חלבון המטרה הוא נמוך מדי בשפע זה לא יכול להיות ניתן לזהות על ידי כתם כסף. בנוסף, אם חלבון המטרה אינו מעביר כלהקה חדה על SDS-PAGE (כגון חלבוני glycosylated בכבדות) זה גם יהיה קשה יותר לדמיין. שינויים בהמשך הפרוטוקול יכול להיעשות כדי להתגבר על בעיות אלה, כגון ביצוע פרוטאומיקה מחיטה מדגם או SILAC (תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים) כדי לזהות חלבונים שכותרתו לאחר הנפתח, ומבטל את הצורך לחתוך להקה החוצה של ג'ל כסף מוכתם.

שיקול חשוב נוסף הוא הריכוז של החללית כדי לשמש בניסוי. באופן אידיאלי, את הסכום הנמוך ביותר של חללית שמייצר אות לגילוי אמור לשמש. ריכוזים גבוהים יותר ינתנו אות גבוהה אלא גם תיוג רקע גבוה יותר, ופעם כל Of אתרי הקישור על יעד הזיקה הגבוה ביותר להיות רוויים ייתכנו מטרות זיקה תחתונה נוספות שמתחילות כדי להתגלות. הריכוז האופטימלי ולכן יש לקבוע באופן אמפירי על ידי מתחיל עם ריכוז גבוה יחסית (1-2 מיקרומטר) titrating בחזרה עד שרק אחד או שניים חלבונים מסומנים וההתחרות ברורה.

עוצמתה של החללית עשויה להילקח בחשבון בבחירת ריכוז ההתחלה; עם זאת, תלוי שפע היעד ומצב של עיכוב, שם לא יכול להיות קורלציה טובה בין הפעילות בדיקה וזיהוי היעד (למשל, בדיקה עם עיכוב nanomolar נמוכה לא בהכרח לנתץ מספיק חלבונים בריכוזים nanomolar נמוך כדי להתגלות ). לכן, עדיף לקבוע את הריכוז המתאים ביותר באמצעות זיהוי אמפירי של חלבונים שכותרתו כמו הודעה. הריכוז מתחרה בשימוש צריך יעלה על זה של החללית על ידי בפי 20, אך טיפול לפחות צריך גם לקחת לא נחרוג מהגבול המסיס של המתחרה.

במקרה שחלבונים מרובים הם משכו מטה על ידי החללית, זיהוי של החלבון הפונקציונלי הרלוונטי הופך מסובך יותר. עם זאת, קיימות מספר דרכים כדי לעזור לצמצם את חלבוני היעד הפוטנציאליים. כאמור, titrating בחזרה ריכוז החללית יכול לעזור לשפר את הספציפיות של תיוג. ככל הריכוז של חללית טיפות, חלבונים מחייבים זיקה חזקה יותר צריכים לשמור על עוצמת האות שלהם בעוד חלבוני זיקה תחתונים צריכים להיעלם. Deconvolution של יעדים פוטנציאליים רבים יכול גם להסתייע שימוש תחליף כימי של תרכובת האב בדרגות שונות של פעילות. בתאוריה, עבור מטרה רלוונטית מבחינה תפקודית, לא אמור להיות קורלציה בין מחייב את היעד והפעילות של אנלוגי. לדוגמה, התחרות על ידי אנלוגים פעיל של תרכובת האב יכול לשמש כדי לשלול p מחייבroteins כי אינם מעורבים ההשפעות פנוטיפי של המתחם. כמו כן, תחליף פעיל, או מולקולות קטנות אחרות המשרים אותו פנוטיפ כמו תרכובת האב, שניתן להשתמש בם כדי לעזור כלל חלבונים מחייבים רלוונטיים. בנוסח הזהה, שימוש תחקיר photoaffinity פעיל או מבנית שאינה קשור יכול לסייע לשלול חלבונים רלוונטיים.

אימות של חלבון המטרה ראשונה דורשת אימות של החלבון המזוהה על ידי MS. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי כתם המערבי בעקבות הנפתח ביוטין, בהנחה נוגדן באיכות גבוהה עבור חלבון המטרה זמין. עם זאת, כאשר עובדים עם חלבון מוכר קל לבזבז זמן משמעותי וכסף על נוגדנים רעים. לכן זה קריטי כי הנוגדן לקבל אישור, וכי הוא מזהה להקה ספציפית lysate של התאים בשימוש עבור תיוג (כלומר, מדגם הקלט). בנוסף, בגלל תשואת החלבון לאחר הנפתח יכולה להיות נמוכה, הנמלהיש ibody להיות רגיש מאוד, תלוי הנוגדן בריכוזים גבוהים עשויים להיות נחוצים (עד 1: 100 דילול בחלק מהמקרים). כדי למנוע בעיות אלה, גרסה מתויגת של החלבון יכול לבוא לידי הביטוי בתאים לפני photolabeling, ואת התג לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לזהות את החלבון לאחר הנפתח.

לאחר שמזהה החלבון הוא אשר, אימות פונקציונלית של היעד יכולה להתבצע על ידי מניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות, או מבחנים תפקודיים של היעד של עניין, כדי להראות שהפעילות של היעד מושפעת מולקולה קטנה מחייבת. האתר מחייב יכול להיות ממופה על ידי זיהוי חומצת אמינו שונה על ידי החללית, או בקביעת מבנה 3-ממדי של מולקולות קטנות מחויב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR. באופן אידיאלי, אם מוטציה ניתן למצוא כי מאבד את יכולתו לקשור מולקולה קטנה, זה אמור להיות מסוגל לבטל את הפעילות של מולקולה קטנה כאשר הביע במקום של פרו wild-typeחלבון. זה יכול להיות גם רצוי להראות ספציפי של מחייב את היעד על קשורים או חלבונים מבניים אחרים "מחוץ היעד".

פרוטוקול כללי זה יכול לשמש בכל יישום מחייב מדידה ישירה של מולקולת מחייב קטנה יעד חלבון, כל עוד בדיקה יכולה להתבצע אשר שומרת על הפעילות הביולוגית של תרכובת האב. יישומים אפשריים כוללים, אך אינם מוגבלים, זיהוי מטרות מולקולריות של תרכובות חדשות, מדידות פוטנציאל מחוץ מטרות של תרופות קיימות, המאשר את המחייב הישיר של מולקולה קטנה לחלבון מסוים של עניין, קביעת תחרות מחייבת ידי מולקולות קטנות אחרות ב באותו אתר קישור על חלבון, ומגלה קולטנים חדשים של הליגנדים נגזרו או אנדוגני טבעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Life Technologies 20490 Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) AnaSpec 63360-50  Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) LabChem, Inc. LC13440-1 Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide Click Chemistry Tools AZ104-100 Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide  Life Technologies A10277 Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp Spectroline FC100 UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free Roche Life Science 11873580001 Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator Branson Sonifier 250 Set to output 1, duty 30%. 
Fluorescent gel scanner GE Healthcare Life Sciences FLA 9500 Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit Bio-Rad 5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads  Life Technologies 20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose ThermoFisher Scientific 11885092
Fetal Bovine Serum, qualified ThermoFisher Scientific 26140079
Penicillin/Streptomycin solution ThermoFisher Scientific 15140122
SDS Sample Buffer (2x) ThermoFisher Scientific LC2676

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
  3. Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
  4. Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
  5. Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
  6. Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
  7. Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
  8. Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
  9. Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
  10. Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
  11. Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
  12. Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
  13. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  14. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  15. Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
  16. Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
  17. Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
  18. Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
  19. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  20. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
  21. Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
  22. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).

Tags

ביוכימיה גיליון 115 ביוכימיה גיליון פרמקולוגיה וביולוגיה כימית גילוי תרופות זיהוי מטרות photoaffinity לחץ כימיה
זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Head, S. A., Liu, J. O.More

Head, S. A., Liu, J. O. Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling. J. Vis. Exp. (115), e54529, doi:10.3791/54529 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter