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Biochemistry

लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54529
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

Introduction

बायोएक्टिव छोटे अणुओं मौलिक सेल में साथ बातचीत और एक या अधिक 'लक्ष्य' के अणुओं, सबसे अधिक प्रोटीन के समारोह में फेरबदल, से काम करते हैं। दवाओं की खोज में, जब एक सक्रिय यौगिक प्ररूपी स्क्रीनिंग के माध्यम से खोज की है, कि परिसर के आणविक लक्ष्य (एस) की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है, सिर्फ कार्रवाई और परिसर के संभावित दुष्प्रभाव के तंत्र को समझने, लेकिन यह भी के लिए के लिए संभावित खोज नहीं नए जीव विज्ञान रोग मॉडल अंतर्निहित चिकित्सा विज्ञान और 1 के नए यंत्रवत वर्गों के विकास के लिए रास्ता साफ हो गया। हालांकि लक्ष्य की पहचान के लिए एक दवा के लिए आवश्यक नहीं है उपचारात्मक इस्तेमाल किया जा रहा है, हाल के वर्षों में वहाँ एक बढ़ती हुई मान्यता रही है कि उपन्यास दवा उम्मीदवारों अधिक क्लिनिकल परीक्षण में सफल होने के लिए, और इसलिए निवेश पर बेहतर रिटर्न उपज है, अगर एक मान्य लक्ष्य ज्ञात है की संभावना है 2। इस प्रकार, वहाँ छोटे पहचान के लिए तरीकों में एक बढ़ती रुचि रही हैअणु लक्ष्य प्रोटीन।

एक शास्त्रीय लक्ष्य की पहचान प्रयोग आम तौर पर आत्मीयता शुद्धि, जहां ब्याज के छोटे अणु एक राल पर स्थिर है और पूरे सेल lysates, जिसके बाद अनबाउंड प्रोटीन धुल जाते हैं और शेष प्रोटीन eluted और 3 पहचान कर रहे हैं के साथ incubated है पर निर्भर करता है। इस तकनीक में कई छोटे अणुओं 4 के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह कई कारणों के लिए एक सार्वभौमिक लक्ष्य आईडी पद्धति के रूप में अनुपयुक्त है। सबसे पहले, लक्ष्य प्रोटीन आदेश छोटे अणु के लिए बाध्य करने की क्षमता बनाए रखने के लिए अपने मूल रचना सेल पर बनाए रखने चाहिए। यह झिल्ली प्रोटीन है, जो अक्सर उनके पैतृक वातावरण से हटाया जा रहा है के बाद गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना है, या बस समग्र और समाधान के बाहर वेग के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है। दूसरा, छोटे अणु रासायनिक इस तरह है कि यह राल पर स्थिर किया जा सकता में संशोधित किया जाना चाहिए, जबकि बनाए रखनेलक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य करने की क्षमता। दीप बाध्यकारी जेब इसलिए एक छोटा सा अणु के लिए पहुंच से बाहर हो सकता है एक बार यह राल के लिए तय हो गई है। तीसरा, बंधन आत्मीयता पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए कि बातचीत वाशिंग चरणों के दौरान बनाए रखा है, कम आत्मीयता के चुनौतीपूर्ण बातचीत की पहचान कर रही है। ऐसे पीएच, आयन एकाग्रता, या अन्य अंतर्जात अणुओं की उपस्थिति के रूप में चौथा, पर्यावरण की स्थिति कोशिका के भीतर स्थानिक भिन्न है और कभी कभी दवा लक्ष्य बातचीत के लिए आवश्यक शर्तें हैं कर सकते हैं। इस प्रकार, सही की स्थिति पाने के लिए अनुमति देते हैं और सेल के बाहर बाध्यकारी परीक्षण और त्रुटि के एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता होती है सकते हैं बनाए रखने के लिए।

Photoaffinity लेबलिंग सहसंयोजक एक छोटा सा अणु और एक सेल के देशी संदर्भ में अपने लक्ष्य के बंधन की अनुमति देकर इन मुद्दों पर गतिरोध उत्पन्न। बल्कि एक बड़े भारी राल के लिए छोटे अणु immobilizing से, अणु के बजाय रासायनिक दो छोटे कार्यात्मक जी स्थापित करने के लिए संशोधित किया गया हैroups: एक photoactivatable आधा भाग जब प्रकाश की एक विशेष तरंगदैर्ध्य के साथ विकिरणित जो लक्ष्य प्रोटीन को सहसंयोजक तिर्यक की अनुमति देता है, और एक पत्रकार समूह लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाया जा करने के लिए और बाद में अलग-थलग अनुमति देता है। जीवित कोशिकाओं, photoaffinity जांच के साथ व्यवहार कर रहे हैं जांच बांध और covalently लक्ष्य प्रोटीन को crosslinks, और जांच-प्रोटीन जटिल तो पृथक बरकरार है। जांच के लक्ष्य के लिए बाध्य की विशिष्टता के समानांतर है, जहां माता पिता के परिसर की एक अतिरिक्त दूर लक्ष्य प्रोटीन के लिए जांच के बंधन प्रतिस्पर्धा करने के लिए प्रयोग किया जाता है में एक प्रतियोगिता प्रयोग प्रदर्शन द्वारा प्रदर्शन किया है।

डिजाइन और photoaffinity जांच के संश्लेषण के एक छोटे अणु से दूसरे को बहुत भिन्न होता है, और इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया जाएगा; हालांकि, इस विषय पर कई उत्कृष्ट विचार विमर्श 5-9 प्रकाशित किया गया है। मुख्य विचार, presumab कि जांच माता पिता के परिसर की bioactivity को बरकरार रखे हुए है इसलिएLy एक ही लक्ष्य (एस) के बंधन। संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) के अध्ययन के लिए निर्धारित है जो अणु के कुछ हिस्सों bioactivity की हानि के बिना संशोधित किया जा सकता प्रदर्शन किया जाना चाहिए। विभिन्न रासायनिक समूहों की एक किस्म diazirine, benzophenone, और aryl azide सहित photoactivatable crosslinkers, प्रत्येक फायदे और नुकसान 10 है जो के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इसी तरह, वहाँ कई रिपोर्टर टैग है कि जांच बाध्यकारी प्रोटीन को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। रिपोर्टर समूहों में इस तरह के अधिक इस्तेमाल किया बायोटिन या फ्लोरोसेंट टैग के रूप में अपने ही, पर कार्यात्मक हो सकता है, या व्यापारियों है कि आगे functionalization photocrosslinking कदम, छोटे और इस तरह कम bioactivity 11 समझौता होने की संभावना होने का फायदा है जो करने के लिए बाद में की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक diazirine photocrosslinking समूह से युक्त एक photoaffinity जांच, और एक घन (आई) के माध्यम से एक पत्रकार समूह की कुर्की के लिए एक टर्मिनल alkyne -catalyz का इस्तेमाल किया हैएड अब्द-alkyne Sharpless-Hüisgen cycloaddition (या क्लिक करें) प्रतिक्रिया 12-15। खोज एवं बचाव के अध्ययन, डिजाइन और संश्लेषण की जांच, और इन अध्ययनों के परिणामों कहीं और 16-18 प्रकाशित किया गया है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में उपयोग के लिए MacKinnon और Taunton 10 से अनुकूलित किया गया था।

1. संवर्धित कोशिकाओं की तैयारी

  1. (देखें नीचे) वांछित नमूनों की संख्या के लिए बाँझ 6 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन तैयार करें।
    नोट: कोशिकाओं की एक डिश उपचार शर्त के अनुसार प्रयोग किया जाता है, लेकिन और अधिक प्रोटीन की आवश्यकता होती है, तो 2 या 3 व्यंजन शर्त के अनुसार तैयार किया जा सकता है और यूवी विकिरण के बाद संयुक्त।
    1. कोशिकाओं के कम से कम 3 व्यंजन तैयार करें; DMSO केवल (डी), जांच उपचार केवल (पी), और जांच + प्रतियोगी (सी) के साथ नकारात्मक नियंत्रण।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक नहीं, यूवी नियंत्रण के रूप में एक 4 वें पकवान, जांच के साथ इलाज किया जा सकता है लेकिन पराबैंगनी प्रकाश के अधीन नहीं तैयार करते हैं।
      नोट: कई प्रतियोगी अणुओं इस तरह के ब्याज के छोटे अणु के विभिन्न analogs के रूप में परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, आवश्यक के रूप में अतिरिक्त प्रतियोगी प्लेटें तैयार।
  2. 4 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में संस्कृति व्यंजन को HEK293T कोशिकाओं जोड़ें। प्रयोग 35 लाख गप्रति प्लेट एल।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं प्रयोग की शुरुआत में लगभग 100% मिला हुआ हैं, ताकि अधिक से अधिक प्रोटीन उपज प्राप्त करने के लिए। HUVEC के लिए, प्रति प्लेट 0.3 मिलियन कोशिकाओं का उपयोग करें। एक अच्छा सन्निकटन मिला हुआ 15 सेमी डिश में कोशिकाओं के 1/10 है। HEK293T कोशिकाओं में सभ्य होना चाहिए Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  3. संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) रात भर।

2. कोशिकाओं और Photocrosslinking का उपचार

  1. अगले दिन, पूर्व विभाज्य 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निम्नलिखित दवाओं:
    1. प्रथम उपचार के लिए, 2 ट्यूब और 1 ट्यूब के लिए 10 मिमी प्रतियोगी (यानी, असंशोधित माता पिता के परिसर) के 4 μl के लिए DMSO के 4 μl जोड़ें।
    2. दूसरी उपचार के लिए, 1 ट्यूब के लिए DMSO के 16 μl और 50 व 16 μl जोड़ने# 181; 2 ट्यूबों के लिए एम photoaffinity जांच।
      नोट: इष्टतम एकाग्रता अलग जांच (चर्चा देखने के लिए) के लिए अलग हो सकता है, लेकिन 200-500 के बीच एनएम एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु (यहाँ हम 200 एनएम का उपयोग) है। प्रतियोगी की एकाग्रता जांच के कम से कम 20 गुना (यहाँ हम 10 माइक्रोन का उपयोग करें) के उस से अधिक होना चाहिए। DMSO के अंतिम एकाग्रता सभी प्लेटों में बराबर होना चाहिए और 0.5% (20 μl मात्रा) से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  2. सेल संस्कृति हुड में सेल प्लेटों ले आओ और इस प्रकार के रूप में कदम 2.1.1 से पूर्व aliquoted दवाओं जोड़ें: संस्कृति मीडिया के महाप्राण 1 मिलीलीटर, मीडिया में पूर्व aliquoted दवा resuspending, और धीरे यह थाली बूंद को जोड़ने वापस बुद्धिमान। DMSO (डी) थाली और जांच (पी) की थाली के लिए DMSO जोड़ें, और प्रतियोगिता (सी) थाली करने के लिए प्रतियोगी जोड़ें। 30 मिनट के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
  3. संस्कृति हुड मंद में रोशनी के साथ, और जांच करने के लिए कदम 2.1.2 से पूर्व aliquoted जांच जोड़ने (पी) प्रतियोगिता (सी) प्लेटें और जोड़नेDMSO (डी) थाली करने के लिए DMSO, जैसा कि ऊपर। 1 घंटे के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
  4. ऊष्मायन के दौरान, निम्नलिखित मदों तैयार; बर्फ की एक ट्रे कि प्लेटों के सभी फिट कर सकते हैं; ठंडा lysis बफर (पीबीएस [पीएच 8.5] + 1x protease अवरोध कॉकटेल [पूरा EDTA मुक्त, 50x शेयर पानी में किए गए समाधान से पतला], 200 μl / प्लेट); microcentrifuge ट्यूबों अलग उपचार शर्तों में से प्रत्येक के लिए लेबल डी, पी, या सी, बर्फ पर।
  5. 1 घंटा ऊष्मायन के अंत से पहले 15 मिनट, ठंडे कमरे में यूवी लैंप (365 एनएम) की स्थापना की और बल्ब गर्म करने के लिए यह मोड़ पर।
  6. जांच के साथ 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, बर्फ पर व्यंजन जगह है। अतिरिक्त जांच दूर करने के लिए धीरे 5 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ कोशिकाओं को धो लें। 4 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से कवर किया।
  7. एक आइस पैक के शीर्ष पर यूवी दीपक के तहत 3 सेमी केंद्रित दीपक से हीटिंग कम करने के लिए कोशिकाओं के पकवान रखें। 3 मिनट के लिए चमकाना। बर्फ की ट्रे के लिए पकवान हटाने और सभी नमूनों के लिए दोहराएँ।
  8. एfter विकिरण, कोशिकाओं से पीबीएस aspirate और ठंडा पीबीएस प्रत्येक थाली करने के लिए प्रोटीज अवरोधकों के साथ (8.5 पीएच) के 200 μl जोड़ें। प्लेट एक रबर खुरचनी और बर्फ पर पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण का उपयोग करने से कोशिकाओं को अलग करें।
  9. (नमूना के 250 μl में 10% एसडीएस के 10 μl) 0.4% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एसडीएस जोड़ें।
    चेतावनी: एसडीएस पाउडर खतरनाक है। नाक और मुंह पर नकाब पहन कर एसडीएस पाउडर inhaling से बचें।
  10. Lyse 10 दालों (उत्पादन 1, कर्तव्य चक्र 30%) के लिए निलंबन sonicating और 10 दालों के दूसरे दौर से पहले 1 मिनट के लिए बर्फ पर सेते द्वारा कोशिकाओं।
  11. यदि आवश्यक हो, निलंबन के 2 μl हटाने और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच पूरी सेल सुनिश्चित करने के लिए।
  12. एक गर्म थाली सेल को पूरा करने और सभी प्रोटीन denature करने के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पर नमूने उबाल लें।
  13. प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता उपाय जैसे वें, एक spectrophotometric डिटर्जेंट-संगत प्रोटीन परख का उपयोगई डीसी प्रोटीन परख 19, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 750 एनएम पर absorbance को मापने के लिए सेट के साथ।
  14. जरूरत के रूप में पीबीएस पीएच 8.5 + 0.4% एसडीएस जोड़कर 2.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर के लिए प्रोटीन एकाग्रता को सामान्य (या की तुलना में कम 2.5 मिलीग्राम / एमएल, सबसे कम प्रोटीन एकाग्रता के साथ नमूना करने के मानक के अनुसार यदि सांद्रता) कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, अगर नमूने 5 हैं 250 μl में मिलीग्राम / एमएल, 2.5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए) पीबीएस पीएच 8.5 + 0.4% एसडीएस के 250 μl जोड़ें।

लेबल प्रोटीन के दृश्य के लिए रसायन विज्ञान के लिए क्लिक करें द्वारा फ्लोरोसेंट टैग की 3. अनुलग्नक

  1. एक नया microcentrifuge ट्यूब सेल lysate और हस्तांतरण के 40 μl निकालें। बायोटिन azide (चरण 4) के साथ प्रतिक्रिया के लिए शेष lysates रखें।
  2. क्रम में निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: 0.2 μl स्त्राव-azide (DMSO में 1 मिमी शेयर समाधान), 0.58 μl TCEP (4 समकक्ष NaOH जोड़ा के साथ पानी में 100 मिमी स्टॉक, नए सिरे से तैयार), और 3.38 μl TBTA (1।एक 4 में 7 मिमी शेयर: DMSO के लिए टी-butanol की 1 के अनुपात)। भंवर मिश्रण करने के लिए।
  3. रिएक्शन शुरू करने के लिए 1.14 μl CuSO 4 -5H 2 ओ (पानी में 50 मिमी) जोड़ें। भंवर संक्षिप्त और अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  4. प्रतिक्रिया बुझाने के लिए 2x एसडीएस नमूना बफर के 50 μl जोड़ें। इस बिंदु पर, सबसे अच्छा परिणाम, या -20 डिग्री सेल्सियस रात भर यदि आवश्यक हो पर दुकान के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल 20 पर सीधे नमूने चलाते हैं।
  5. अगर ठंड के नमूने, जेल पर लोड करने से पहले 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म कर लें।
    नोट: चूंकि लक्ष्य प्रोटीन की आणविक वजन आम तौर पर इस स्तर पर नहीं जाना जाता है, यह अलग एक्रिलामाइड सांद्रता के साथ 2 जैल चलाने के लिए सलाह दी जाती है (यानी, 8% और 15%), या एक विस्तृत आणविक वजन सीमा ढाल जेल (यानी, 4-15%), पूरा आणविक वजन कवरेज सुनिश्चित करने के लिए।
  6. डाई सामने जेल के अंत तक पहुँच गया है जब, अतिरिक्त unreacte के सभी सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए जेल चलना जारीडी स्त्राव-azide पूरी तरह से जेल से बाहर निकल गया गया है।
  7. DDH 2 हे के साथ एक कंटेनर को जेल निकालें और कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए सेते हैं, दूर धोने के लिए सभी अतिरिक्त स्त्राव-azide।
  8. एक गिलास प्लेट पर जेल प्लेस और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक आंधी फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर का उपयोग कर जेल स्कैन।

लेबल प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि के लिए रसायन विज्ञान के लिए क्लिक करें द्वारा बायोटिन टैग की 4. अनुलग्नक

  1. 3.1 कदम से शेष lysates के, प्रोटीन सामान्य बनाने के बाद अधिकतम राशि का उपयोग ऐसी है कि सभी नमूनों ही मात्रा (उदाहरण के लिए, अगर बाद सामान्य बनाने के लिए 2.5 मिलीग्राम / एमएल जिसके परिणामस्वरूप नमूना संस्करणों 500, 550, और 600 μl कर रहे हैं, 500 का उपयोग प्रत्येक की μl)।
  2. पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ उच्च क्षमता streptavidin agarose मोती, पूर्व धोया 2x 50 μl को जोड़कर lysates पूर्व साफ़ करें। रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
  3. 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा मोती गोली। टी हटायेवह बर्फ पर एक नया microcentrifuge ट्यूब सतह पर तैरनेवाला और मोती त्यागें।
  4. लेबल "इनपुट" एक नया ट्यूब DMSO के नमूने की 1-2% निकालें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 2x एसडीएस नमूना बफर और दुकान के एक बराबर मात्रा में जोड़ें।
  5. lysate के 500 μl के अनुसार, निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: 1.38 μl बायोटिन azide (DMSO में 10 मिमी शेयर), 5.5 μl TCEP, और 32.5 μl TBTA। भंवर मिश्रण करने के लिए।
  6. 11 μl CuSO 4 -5H 2 संक्षेप lysate और भंवर के 500 μl प्रति हे जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  7. एसीटोन के 4 नमूना संस्करणों -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा जोड़ें। भंवर नमूने और -80 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते पूरी तरह से प्रोटीन वेग और unreacted बायोटिन azide हटा दें।
  8. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर नमूने उपजी प्रोटीन गोली।
  9. सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से Aspirate, और 150 μl पीबीएस (7.4 पीएच) + 1% एसडीएस में sonication द्वारा प्रोटीन resolubilize।
  10. 30 μl पूर्व धोया उच्च क्षमता streptavidin agarose मोती के लिए नमूने जोड़ें और रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
  11. 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा मोती गोली। अनबाउंड प्रोटीन और त्यागने युक्त सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  12. मोती को धो बफर (400 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris, 0.2% एसडीएस, 7.4 पीएच) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं।
  13. दोहराएँ 4.12 और 4.13 3 बार दोहराएँ।
  14. मोतियों से पूरी तरह से धो बफर Aspirate, और 2x एसडीएस नमूना बफर के 30 μl जोड़ें।
  15. एक 95 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए सेते मोतियों से प्रोटीन जारी करने के लिए।
  16. कमरे के तापमान पर 13,000 XG पर 1 मिनट के लिए मोती अपकेंद्रित्र।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूने एसडीएस पृष्ठ को चलाने के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। अगर ठंड के नमूने, उपयोग करने से पहले 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म कर लें।
  17. सावधानी सेनमूना मोतियों की बंद प्रोटीन युक्त बफर पिपेट, और पर एसडीएस पृष्ठ 20 लोड (नीचे महत्वपूर्ण कारणों में देखें)। मोती यदि आवश्यक हो तो बाद में reboiling के लिए बचाया जा सकता है।
    नोट: चांदी दाग ​​से प्रोटीन का पता लगाने के लिए, एक बेहतर परिणाम 1 मिमी मोटी जेल का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। एक बैंड मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के विश्लेषण के लिए चांदी से सना हुआ जेल से बाहर काटा जा रहा है, सभी अभिकर्मकों बाँझ समाधान से ताजा तैयार करने और जेल पर नमूने के बीच में अच्छी तरह से एक खाली छोड़ दें। जांच लेन से कटौती हर बैंड के लिए, एक समानांतर टुकड़ा DMSO लेन से लिया जाना चाहिए ताकि पृष्ठभूमि प्रोटीन घटाया जा सकता है। पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन आईडी सत्यापन के लिए, यह जब एसडीएस पृष्ठ जेल चल भी कदम 4.4 से इनपुट नमूना लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  18. या तो चांदी धुंधला 21 या पश्चिमी धब्बा 22 लक्ष्य प्रोटीन (ओं) का पता लगाने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

यहाँ दिखाए गए परिणामों रोधी दवा itraconazole, जो का उपयोग पहले से 16 प्रकाशित किया गया है की एक तस्वीर आत्मीयता जांच के साथ प्राप्त किया गया। इन परिणामों के रहते सेल photoaffinity लेबलिंग तकनीक के उपयोग के प्रदर्शन को सफलतापूर्वक 35 केडीए झिल्ली प्रोटीन वोल्टेज पर निर्भर आयनों चैनल 1 (VDAC1) के रूप में एक प्रमुख itraconazole बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान।

ऊपर प्रोटोकॉल photolabeling और प्रतियोगी अणु के रूप में असंशोधित itraconazole के लिए itraconazole जांच का उपयोग HEK293T कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया था। बाद नमूने के रूप में वर्णित तैयार किए गए थे, वे क्रम में आणविक वजन से प्रोटीन को अलग करने में एसडीएस पृष्ठ के अधीन थे। बाईं तरफ के आण्विक वजन मार्कर इकाइयों kilodaltons (केडीए) में हैं। पहली लेन DMSO नियंत्रण नमूना (डी) है, दूसरी लेन जांच नमूना (पी) है, और तीसरे लेन प्रतियोगिता नमूना (सी) है। बैंड पीDMSO केवल लेन में क्रोध पृष्ठभूमि माना जाता है। इन आंकड़ों का विश्लेषण करने में, ध्यान दें कि विशिष्ट बंधनकारी प्रोटीन DMSO नियंत्रण नमूने में अनुपस्थित, जांच नमूने में मौजूद होना चाहिए और प्रतियोगिता के नमूने में कमी आई है। इस मामले में, मुख्य प्रोटीन का पता लगाया बैंड में ही जांच नमूना लगभग 35 केडीए के एक बैंड था (आंकड़े 1 और 3), जो VDAC1 के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की थी। इस प्रोटीन की पहचान चित्रा 5 पश्चिमी धब्बा एक विशिष्ट VDAC1 एंटीबॉडी का उपयोग करके इस बात की पुष्टि की गई थी। साथ में ले ली, इन परिणामों हमें निष्कर्ष है कि VDAC1 इन कोशिकाओं में itraconazole का एक प्रमुख बाध्यकारी प्रोटीन की अनुमति है।

चित्रा 1 एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबलिंग के बाद प्रोटीन के दृश्य को दर्शाता है (प्रोटोकॉल में 3 कदम से), चित्रा 3 रजत दाग से प्रोटीन के दृश्य बायोटिन टैग और पीई के साथ लेबलिंग के बाद यह दर्शाता है (प्रोटोकॉल में 4 कदम से) आत्मीयता शुद्धि rforming; और चित्रा 5 VDAC1 के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन आईडी सत्यापन को दर्शाता है। आंकड़े 2 और 4 का उदाहरण देना क्या होता प्रोटोकॉल में कुछ कदम सही ढंग से प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं (चित्रा किंवदंतियों में नोट)।

आकृति 1
चित्रा 1. एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति स्कैन एसडीएस पृष्ठ जेल (प्रोटोकॉल में 3 कदम से) डी = DMSO ही। पी = जांच केवल (200 एनएम); सी = प्रतियोगिता (10 माइक्रोन) के। बाईं तरफ के आण्विक वजन मार्कर इकाइयों kilodaltons (केडीए) में हैं। प्रमुख photolabeled प्रोटीन बैंड पर लगभग 35 केडीए कि जांच लेन में विशेष रूप से मौजूद है और दूर अतिरिक्त माता पिता के परिसर से प्रतिस्पर्धा कर रहा है, यह दर्शाता है कि यह एक विशिष्ट बंधनकारी प्रोटीन है करने के लिए तीर अंक।529 / 54529fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एक प्रतिदीप्ति स्कैन जेल। अतिरिक्त स्त्राव-azide पूरी तरह से जेल से नहीं निकाला जा चुका है (कदम 3.6 और 3.7), जेल के तल पर प्रकट करने के लिए बड़े काले स्मीयर के कारण। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

चित्र तीन
चित्रा 3. बायोटिन पुल से नीचे (प्रोटोकॉल में 4 कदम से) के बाद एक प्रतिनिधि चांदी से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ जेल। एक ही बैंड के लिए तीर बताते हैं कि चित्र 1 में कल्पना की गई थी, बाद में excised था जोजेल से और प्रोटीन की पहचान के लिए एमएस विश्लेषण के अधीन है। बाईं तरफ मार्कर इकाइयों kilodaltons (केडीए) में हैं। नोट के बीच में खाली जगह प्रत्येक गली, आदेश जेल लोड हो रहा है और बैंड छांटना दौरान नमूने के पार संक्रमण से बचने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. चांदी धुंधला। बहुत उच्च पृष्ठभूमि धुंधला के साथ एक चांदी से सना हुआ जेल, अपर्याप्त मोती (4.13 कदम) के lysates के पूर्व समाशोधन (4.2 कदम) और / या कपड़े धोने की वजह से। इसके अलावा गलियों के बीच जगह की कमी पर ध्यान दें। बाईं तरफ मार्कर इकाइयों kilodaltons (केडीए) में हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. photolabeled 35 केडीए प्रोटीन, बायोटिन पुल से नीचे (प्रोटोकॉल में 4 कदम से) के बाद VDAC1 के रूप में एमएस द्वारा की पहचान की पश्चिमी धब्बा। संकेत जांच लेन में मौजूद है और प्रतियोगिता लेन में कमी आई आंकड़े 1 के रूप में, और 3, VDAC1 के रूप में प्रोटीन की पहचान की पुष्टि। यह महत्वपूर्ण है कि इनपुट अंश (4.4 कदम से) पुल से नीचे नमूने के साथ चलाया जाता है, यह सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी काम करता है और ब्याज की प्रोटीन lysate में पता लगाया जा सकता है। आणविक वजन में एक मामूली वृद्धि covalently जुड़ी जांच का जोड़ा आकार की वजह से पुल से नीचे नमूने में मनाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ऊपर से नीचे, जहां दवा के सेलुलर phenotype अपने निर्धारित कार्यों के आधार पर उसके संभावित ठिकानों को सटीक बनाने के लिए किया जाता है, या नीचे से ऊपर है, जहां लक्ष्य: छोटे अणुओं के लक्ष्य की पहचान करने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण को मोटे तौर पर दो श्रेणियों में बांटा जा सकता है रासायनिक या आनुवंशिक साधन 3 से सीधे पहचान की है। ऊपर से नीचे या प्ररूपी अध्ययनों कुछ सेलुलर प्रक्रियाओं दवा से प्रभावित पहचान कर सकते हैं (जैसे, प्रतिलेखन / अनुवाद / डीएनए संश्लेषण, सेल चक्र ब्लॉक, संकेतन मार्ग सक्रियण / निषेध, आदि) है कि छोटे अणु का अंतिम phenotype आबाद हो सकता है, जो उन प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन के लिए संभावित ठिकानों की सूची को कम मदद मिलती है। हालांकि, ऊपर से नीचे दृष्टिकोण का एक बड़ा नुकसान यह है कि यह क्या पहले से ही इन प्रक्रियाओं के बारे में जाना जाता है पर निर्भर करता है, और इसलिए लक्ष्यों जिसका कार्य विशेषता नहीं किया गया है या पहले से शामिल होना वर्णित नहीं किया गया है के खिलाफ पक्षपाती है हैएक दिया प्रक्रिया में।

नीचे अप दृष्टिकोण एक निष्पक्ष ढंग से सीधे लक्ष्य की पहचान के द्वारा इस समस्या में गतिरोध उत्पन्न। यह आनुवंशिक माध्यम से पूरा किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, पछाड़ना सेल लाइनों है कि नशीली दवाओं के लिए प्रतिरोध या अतिसंवेदनशीलता प्रदान, या दवा प्रतिरोधी सेल लाइनों को अलग-थलग और जीनोमिक अनुक्रमण का उपयोग निर्धारित करने के लिए जो जीन म्यूटेशन 1 शामिल द्वारा लिए एक shRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग द्वारा। प्रयोगों के इन प्रकार के मादक पदार्थों की गतिविधि से संबंधित महत्वपूर्ण प्रोटीन या रास्ते की पहचान कर सकते हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि पहचान प्रोटीन के लिए बाध्य प्रत्यक्ष साबित नहीं करते। रासायनिक दृष्टिकोण, दूसरे हाथ पर, आम तौर पर एक रासायनिक जांच के उपयोग सीधे लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य और उसके अलगाव और पहचान की अनुमति शामिल है। एक जांच है कि लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य करने के लिए अपनी क्षमता को बरकरार रखे हुए डिजाइनिंग खोज एवं बचाव के अध्ययन के उपयोग अणु है कि गतिविधि के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना संशोधित किया जा सकता है पर एक स्थिति की पहचान करने की आवश्यकता है। यह aLSओ की आवश्यकता है कि जांच के अपने लक्ष्य को बाध्य करने के लिए या तो covalently या उच्च पर्याप्त समानता है कि यह अन्य सेलुलर प्रोटीन (यानी, आत्मीयता शुद्ध) से अलग किया जा सकता है के साथ में सक्षम हो, और है कि इन प्रोटीनों को उनके मूल के बाहर छोटे अणु बाध्य करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने सेलुलर पर्यावरण। इस आवश्यकता को निश्चित लक्ष्य के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है; उदाहरण के लिए, अभिन्न झिल्ली प्रोटीन अक्सर उनके सक्रिय रचना बनाए रखने के लिए एक विशिष्ट लिपिड पर्यावरण की आवश्यकता होती है, और एकत्रित या अनुचित तरीके से ligand एक बार कोशिकाओं lysed रहे हैं बाइंडिंग के लिए उन्मुख हो सकता है। विधि इस पांडुलिपि में वर्णित, देशी सेलुलर पर्यावरण के भीतर लक्ष्य प्रोटीन के सहसंयोजक संशोधन की अनुमति देकर आत्मीयता शुद्धि के इन संभावित नुकसान से बचा जाता है ताकि बाद में जोड़तोड़ दवा लक्ष्य बातचीत 10 को बाधित नहीं कर सकते हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के कई कारकों पर निर्भर करता है। ऐसा नहीं है कि टीए महत्वपूर्ण हैछोटे अणु की rget प्रोटीन photolabeling के लिए चुना सेल प्रकार में पर्याप्त रूप से प्रचुर मात्रा में हो। सेल प्रकार सबसे potently छोटे अणु से प्रभावित एक अच्छा प्रारंभिक जगह हो सकती है, लेकिन यह उच्च लक्ष्य प्रोटीन पैदावार के साथ एक खोजने के लिए कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है। जबकि पृष्ठभूमि लेबलिंग को कम वैकल्पिक रूप से, subcellular विभाजन करके विभिन्न प्रोटीन आबादी के संवर्धन के लक्ष्य उपज में वृद्धि हो सकती है। पता लगाने के fluorescently टैग प्रोटीन सामान्य और अधिक चांदी दाग ​​से प्रोटीन का पता लगाने से संवेदनशील है; इसलिए, प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया बैंड बायोटिन पुल से नीचे के बाद चांदी धुंधला द्वारा detectible नहीं हो सकता। उपचार हालत प्रति कोशिकाओं के कई व्यंजन का उपयोग करके प्रयोग स्केलिंग यह पता लगाने की समस्या को दूर करने में मदद कर सकते हैं। जांच की एकाग्रता बढ़ाने से भी पुल से नीचे पैदावार में सुधार करने में मदद कर सकते हैं। विशिष्ट बैंड भी उच्च पृष्ठभूमि से छिप जा सकता है जो मामले को और अधिक कड़े धोने, कई पूर्व मेंसमाशोधन कदम, या एक अलग संरचना के मोती (जैसे agarose की बजाय चुंबकीय मोती के रूप में) का उपयोग करने के लिए सहायक हो सकता है। हालांकि, अगर लक्ष्य प्रोटीन बहुतायत में बहुत कम है कि यह संभव नहीं है चांदी दाग ​​से पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि लक्ष्य प्रोटीन (जैसे भारी ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के रूप में) एसडीएस पृष्ठ पर एक तेज बैंड के रूप में पलायन नहीं है कि यह भी कल्पना करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा। प्रोटोकॉल के लिए आगे संशोधन एक बैंड को काटने के लिए नष्ट करने की जरूरत है, जैसे (सेल संस्कृति में एमिनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग) पूरे नमूना प्रोटिओमिक्स या SILAC प्रदर्शन के रूप में इन समस्याओं को दूर करने के लिए पुल से नीचे के बाद लेबल प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है एक चांदी दाग ​​जेल की।

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार जांच की एकाग्रता प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है। आदर्श रूप में, जांच की न्यूनतम राशि है कि एक detectable संकेत पैदा किया जाना चाहिए। उच्च सांद्रता उच्च संकेत लेकिन यह भी उच्च पृष्ठभूमि लेबलिंग, और एक बार सभी दे देंगे ओएफ उच्चतम आत्मीयता के लक्ष्य बन गया पर बाध्यकारी साइटों संतृप्त वहाँ अतिरिक्त कम समानता लक्ष्य है कि पता लगाया जा करने के लिए शुरू हो सकता है। इष्टतम एकाग्रता इसलिए अनुभव से एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता (1-2 माइक्रोन) के साथ शुरू करने और जब तक केवल एक या दो प्रोटीन चिह्नित कर रहे हैं और प्रतियोगिता स्पष्ट है वापस titrating द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।

जांच की शक्ति शुरू एकाग्रता को चुनने के लिए ध्यान में रखा जा सकता है; हालांकि, लक्ष्य बहुतायत और निषेध के मोड पर निर्भर करता है, वहाँ नहीं जांच गतिविधि और लक्ष्य का पता लगाने के बीच एक अच्छा संबंध हो सकता है (उदाहरण के लिए, कम nanomolar निषेध के साथ एक जांच जरूरी नीचे पर्याप्त प्रोटीन कम nanomolar सांद्रता में खींच नहीं होगा पता लगाने योग्य होने के लिए )। इस प्रकार, यह सबसे उपयुक्त एकाग्रता अनुभव से एक readout के रूप में लेबल प्रोटीन का पता लगाने का उपयोग निर्धारित करने के लिए बेहतर है। प्रतियोगी की एकाग्रता का इस्तेमाल किया है कि जांच के अधिक होना चाहिए में सेकम से कम 20 गुना, लेकिन देखभाल भी प्रतियोगी की घुलनशीलता सीमा से अधिक नहीं लिया जाना चाहिए।

मामला यह है कि कई प्रोटीन जांच से नीचे खींच लिया जाता है, कार्यात्मक प्रासंगिक प्रोटीन की पहचान के और अधिक जटिल हो जाता है। हालांकि, वहाँ मदद करने के लिए संभावित लक्ष्य प्रोटीन नीचे संकीर्ण कई तरीके हैं। जैसा कि ऊपर कहा, जांच एकाग्रता वापस titrating लेबलिंग की विशिष्टता को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं। जांच की एकाग्रता बूंदों के रूप में, उच्च आत्मीयता बंधनकारी प्रोटीन उनके संकेत तीव्रता को बनाए रखने, जबकि कम समानता प्रोटीन गायब हो जाना चाहिए चाहिए। कई संभावित ठिकानों की Deconvolution भी गतिविधि की डिग्री बदलती के साथ माता पिता के परिसर के रासायनिक analogs के उपयोग के द्वारा सहायता प्राप्त की जा सकती है। सिद्धांत रूप में, एक कार्यात्मक प्रासंगिक लक्ष्य के लिए, वहाँ लक्ष्य और एनालॉग की गतिविधि के लिए बाध्य के बीच एक संबंध होना चाहिए। उदाहरण के लिए, माता पिता के परिसर के निष्क्रिय analogs द्वारा प्रतियोगिता बाध्यकारी पी बाहर शासन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताroteins कि परिसर के प्ररूपी प्रभाव में शामिल नहीं हैं। इसी तरह, सक्रिय analogs, या अन्य छोटे अणुओं है कि माता पिता के परिसर के रूप में ही phenotype के लिए प्रेरित, प्रासंगिक बंधनकारी प्रोटीन में शासन करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उसी तर्ज पर, एक निष्क्रिय या संरचनात्मक रूप से असंबंधित photoaffinity जांच के उपयोग अप्रासंगिक प्रोटीन शासन से बाहर कर सकते हैं।

लक्ष्य प्रोटीन के मान्यकरण पहले प्रोटीन एमएस द्वारा की पहचान के सत्यापन की आवश्यकता है। यह आसानी से, बायोटिन पुल से नीचे के बाद पश्चिमी धब्बा द्वारा पूरा किया जा सकता है कि एक उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी संभालने लक्ष्य प्रोटीन के लिए उपलब्ध है। हालांकि, जब एक अपरिचित प्रोटीन के साथ काम कर रहा है कि यह बुरा एंटीबॉडी पर महत्वपूर्ण समय और पैसा बर्बाद करने के लिए आसान है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि एंटीबॉडी मान्य किया, और कहा कि यह कोशिकाओं के lysate में एक विशिष्ट बैंड का पता लगाता है लेबलिंग (यानी, इनपुट नमूना) के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। इसके अलावा, क्योंकि पुल से नीचे के बाद प्रोटीन उपज कम हो सकता है, चींटीibody अत्यधिक संवेदनशील हो गया है, और एंटीबॉडी के आधार पर उच्च सांद्रता आवश्यक हो सकता है (अप करने के लिए 1: 100 कुछ मामलों में कमजोर पड़ने)। इन समस्याओं से बचने, प्रोटीन की एक टैग किया गया संस्करण photolabeling पहले कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, और टैग तो पुल से नीचे के बाद प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक बार प्रोटीन आईडी की पुष्टि की है, लक्ष्य के कार्यात्मक सत्यापन दिखाने के लिए कि लक्ष्य की गतिविधि छोटे अणु बंधन से प्रभावित होता है, आनुवंशिक और / या pharmacologic जोड़तोड़, या ब्याज के लक्ष्य के कार्यात्मक assays के द्वारा पूरा किया जा सकता है। बाध्यकारी साइट एमिनो एसिड जांच द्वारा संशोधित की पहचान है, या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी से बंधे छोटे अणु के 3-आयामी संरचना के निर्धारण से मैप किया जा सकता है। आदर्श रूप में, एक उत्परिवर्ती पाया जा सकता है कि छोटे अणु बाध्य करने की क्षमता खो देता है, यह छोटे अणु की गतिविधि को समाप्त करने में सक्षम जब जंगली प्रकार के समर्थक के स्थान पर व्यक्त किया जाना चाहिएTein। यह भी अन्य संरचनात्मक रूप से संबंधित या "बंद लक्ष्य" प्रोटीन पर लक्ष्य के लिए बाध्य की विशिष्टता दिखाने के लिए वांछनीय हो सकता है।

यह सामान्य प्रोटोकॉल, छोटे अणु-बाध्यकारी एक प्रोटीन लक्ष्य के प्रत्यक्ष माप की आवश्यकता होती है किसी भी आवेदन में इस्तेमाल किया जा सकता जब तक कि इस मामले की जांच के लिए किया जा सकता है कि माता पिता के परिसर की bioactivity बरकरार रखती है। संभावित अनुप्रयोगों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, नए यौगिकों के आणविक लक्ष्य की पहचान ऑफ लक्ष्यों को मौजूदा दवाओं की क्षमता का सर्वेक्षण, ब्याज की एक विशेष प्रोटीन के लिए एक छोटा सा अणु के प्रत्यक्ष बाध्यकारी की पुष्टि, पर अन्य छोटे अणुओं से बाध्यकारी की प्रतियोगिता का निर्धारण एक प्रोटीन पर ही बाध्यकारी साइट, और स्वाभाविक रूप से प्राप्त या अंतर्जात ligands के नए रिसेप्टर्स की खोज।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Life Technologies 20490 Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) AnaSpec 63360-50  Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) LabChem, Inc. LC13440-1 Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide Click Chemistry Tools AZ104-100 Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide  Life Technologies A10277 Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp Spectroline FC100 UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free Roche Life Science 11873580001 Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator Branson Sonifier 250 Set to output 1, duty 30%. 
Fluorescent gel scanner GE Healthcare Life Sciences FLA 9500 Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit Bio-Rad 5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads  Life Technologies 20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose ThermoFisher Scientific 11885092
Fetal Bovine Serum, qualified ThermoFisher Scientific 26140079
Penicillin/Streptomycin solution ThermoFisher Scientific 15140122
SDS Sample Buffer (2x) ThermoFisher Scientific LC2676

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Head, S. A., Liu, J. O. Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling. J. Vis. Exp. (115), e54529, doi:10.3791/54529 (2016).

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