Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Introduction

pequenas moléculas bioactivas fundamentalmente trabalhar por interagir com e alterar a função de uma ou mais moléculas de "alvo", mais comumente proteínas, na célula. Na descoberta de medicamentos, quando um composto activo é descoberto por meio de triagem fenotípica, a identificação do alvo molecular (s) de que o composto é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de acção e os potenciais efeitos colaterais do composto, mas também para potencialmente descobrir nova biologia subjacente ao modelo de doença e preparando o caminho para o desenvolvimento de novas classes mecanicistas de terapêutica ^1. Embora a identificação do alvo não é necessária para um medicamento para ser usado terapeuticamente, nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento de que os novos candidatos a fármacos são mais propensos a ter sucesso em ensaios clínicos, e, portanto, produzir melhores retornos sobre o investimento, se um alvo validado é conhecida ^2. Assim, tem havido um crescente interesse em métodos para a identificação de pequenasproteínas alvo molécula.

Um experimento identificação do alvo clássica tipicamente depende de purificação por afinidade, em que a pequena molécula de interesse é imobilizada sobre uma resina e incubada com lisados ​​de células inteiras, após o que as proteínas não ligadas são lavadas e as proteínas restantes são eluídas e identificados ^3. Embora esta técnica tenha sido utilizada para identificar os alvos de muitas moléculas pequenas ^4, não é adequado como um método de identificação de destino universal para várias razões. Em primeiro lugar, a proteína alvo deve manter a sua conformação nativa após a lise celular, a fim de manter a sua capacidade de se ligar à molécula pequena. Isto pode ser particularmente problemático para proteínas de membrana, o que muitas vezes sofrem alterações conformacionais depois de ser removido do seu ambiente nativo, ou simplesmente agregado e precipitar para fora da solução. Em segundo lugar, a pequena molécula deve ser quimicamente modificado de tal forma que ele pode ser imobilizada na resina enquanto se mantéma sua capacidade de se ligar a proteína alvo. bolsas de ligação profundas podem, por conseguinte, tornam-se inacessíveis a uma molécula pequena, uma vez que é fixado à resina. Em terceiro lugar, a afinidade de ligação deve ser suficientemente elevada para que a interacção é mantido durante os passos de lavagem, tornando a identificação de interacções de afinidade inferiores desafiantes. Em quarto lugar, as condições ambientais tais como pH, concentração iónica ou a presença de outras moléculas endógenas pode variar espacialmente dentro da célula e são, por vezes, os pré-requisitos para a interacções fármaco-alvo. Assim, encontrar as condições correctas para permitir e manter do lado de fora da célula de ligação pode necessitar de uma quantidade significativa de tentativa e erro.

a marcação por fotoafinidade evita estes problemas, permitindo a ligação de uma pequena molécula e o seu alvo no contexto nativo de uma célula covalente. Em vez de imobilizar a molécula pequena a uma grande resina volumosa, em vez da molécula é quimicamente modificados para instalar duas pequenas g funcionalrupos: uma porção fotoactivável que permite a reticulação covalente à proteína alvo quando irradiado com um comprimento de onda particular de luz, e um grupo repórter que permite que a proteína alvo a ser detectada e subsequentemente isolado. As células vivas são tratados com a sonda de fotoafinidade, a sonda liga-se e reticula covalentemente à proteína alvo, e o complexo sonda-proteína é em seguida isolada intacta. A especificidade de ligação ao alvo da sonda é demonstrada através da realização de uma experiência de competição em paralelo, em que um excesso do composto de origem é usada para competir distância de ligação da sonda para a proteína alvo.

O design e síntese de sondas de fotoafinidade varia muito de uma pequena molécula para outra, e não será coberto neste protocolo; no entanto, vários excelentes discussões sobre o assunto foram publicados ^5-9. A consideração principal é que a sonda retém a bioactividade do composto-mãe, por conseguinte presumabLY de ligação para o mesmo alvo (s). relação estrutura-actividade (SAR) estudos devem ser realizados para determinar que partes da molécula podem ser modificados sem perda de bioactividade. Uma variedade de diferentes grupos químicos têm sido utilizados como agentes de ligação cruzada foto-activáveis, incluindo diazirina, benzofenona, e azida de arilo, que cada um tem vantagens e desvantagens ^10. Da mesma forma, existem várias marcações repórter que foram utilizadas para isolar proteínas de ligação à sonda. Os grupos repórter podem ser funcionais por si sós, tais como a biotina utilizada ou etiquetas fluorescentes, ou podem ser precursores que requerem maior funcionalização subsequente ao passo de foto-reticulação, que tem a vantagem de ser mais pequeno e, assim, menos susceptíveis de comprometer bioactividade ^11.

Neste protocolo, utilizou-se uma sonda de fotoafinidade contendo um grupo diazirina fotorreticulação, e um alcino terminal para a ligação de um grupo descritor através de um Cu (I) -catalyzed Azide-Alcino Sharpless-Huisgen cicloadição (ou clique) reacção de ^12-15. Os estudos de SAR, sondar concepção e síntese, e os resultados destes estudos foram publicados em outros lugares ^16-18.

Protocol

NOTA: Este protocolo foi adaptado do MacKinnon e Taunton ¹⁰ para utilização em células vivas.

1. Preparação de células cultivadas

1. Prepare estéreis 6 cm placas de cultura de células para o número de amostras desejado (ver abaixo).
   NOTA: Uma placa de células é utilizado por condição de tratamento, mas se for necessária mais proteínas 2 ou 3 pratos podem ser preparados por condição e combinadas depois da irradiação UV.
   1. Preparar pelo menos 3 pratos de células; controle negativo com apenas DMSO (D), o tratamento Probe única (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Opcionalmente, preparar um prato 4 ^th como um controlo sem UV, a serem tratados com a sonda, mas não sujeita a luz UV.
      NOTA: Se várias moléculas concorrentes estão a ser testada, tais como diferentes análogos da pequena molécula de interesse, preparar as placas concorrente adicionais conforme necessário.
2. Adicionar células HEK293T para placas de cultura em 4 media ml de cultura. Use 3,5 milhões de cells por placa.
   NOTA: O número de células deve ser determinado para cada tipo de célula de modo a que as células são quase 100% confluentes no início da experiência, de modo a atingir o rendimento máximo de proteína. Para HUVEC, use 0,3 milhões de células por placa. Uma boa aproximação é de 10/01 as células confluentes em um prato de 15 centímetros. células HEK293T devem ser cultivadas em Dulbecco Modified Eagles Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina.
3. Devolver as células na incubadora de cultura (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante a noite.

2. Tratamento de células e fotorreticulação

1. No dia seguinte, pré-aliquota os seguintes medicamentos em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga:
   1. Para o primeiro tratamento, adicionar 4 mL de DMSO para 2 tubos e 4 ul de 10 mM de concorrente (isto é, o composto parental não modificada) para um tubo.
   2. Para o segundo tratamento, adicionar 16 ul de DMSO para um tubo e 16 ul de 50 &# 181; M sonda de fotoafinidade a 2 tubos.
      NOTA: A concentração óptima pode ser diferente para sondas diferentes (ver discussão), mas entre 200-500 nm é um bom ponto de partida (aqui nós usamos 200 nM). A concentração do competidor deve ultrapassar o da sonda, pelo menos, 20 vezes (aqui usamos 10 uM). A concentração final de DMSO deve ser igual em todas as placas e não deve ser superior a 0,5% (volume de 20 ul).
2. Trazer as placas celulares na capa de cultura de células e adicionar as drogas pré-alíquotas do passo 2.1.1 do seguinte modo: Aspirar 1 ml de meio de cultura, ressuspensão a droga pré-alíquota na mídia, e adicionando-o suavemente de volta para a queda de placa sensato. Adicione o DMSO à (D) Placa de DMSO e a sonda (P) placa, e adicionar o concorrente para a competição (C) placa. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 30 min.
3. Com luzes na capa de cultura esmaecido, adicione a sonda pré-alíquota do passo 2.1.2 para sondar (P) e as placas de concorrência (C) e adicione oDMSO para a placa de DMSO (D), como acima. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 1 h.
4. Durante a incubação, preparar os seguintes itens; Uma bandeja de gelo que pode caber todas as chapas; tampão de lise arrefecido com gelo (PBS [pH 8,5] + 1x cocktail inibidor de protease [completo isento de EDTA, diluída a partir da solução estoque 50x feita em água]; 200? l / placa); tubos de microcentrífuga rotulado D, P ou C para cada uma das diferentes condições de tratamento, em gelo.
5. 15 min antes do final da incubação de 1 hora, configurar a lâmpada UV (365 nm) na sala fria e ligá-lo para aquecer a lâmpada.
6. Após 1 horas de incubação com a sonda, coloque pratos no gelo. Lavam-se as células cuidadosamente com 5 ml de PBS arrefecido com gelo (pH 7,4) para remover o excesso de sonda. Re-cobrir as células com 4 PBS ml gelada.
7. Colocar a placa de células centradas 3 cm abaixo da lâmpada de UV no topo de um bloco de gelo para minimizar o aquecimento da lâmpada. Irradiar durante 3 min. Remover o prato para a bandeja de gelo e repetir para todas as amostras.
8. UMAepois irradiação, aspirar o PBS a partir das células e adicionar 200 ul do PBS gelado (pH 8,5) com inibidores de protease para cada placa. Separe as células da placa com um raspador de borracha e transferência para os tubos de microcentrífuga pré-marcado em gelo.
9. Adicionar SDS para uma concentração final de 0,4% (10 ul de SDS a 10% em 250 ul de amostra).
   CUIDADO: SDS pó é perigosa. Evitar a inalação de pó SDS, vestindo uma máscara sobre o nariz ea boca.
10. Lisar as células por sonicação da suspensão para 10 impulsos de saída (1, ciclo de trabalho de 30%) e incubar em gelo durante 1 min antes de um segundo turno de 10 pulsos.
11. Se necessário, retire 2 ul de suspensão e verificar sob um microscópio de luz para assegurar a lise celular completa.
12. Ferver as amostras sobre uma placa quente a 95 ° C durante 5 minutos para completar a lise das células e desnatura todas as proteínas.
13. Medir a concentração de proteína em cada amostra utilizando um ensaio de proteína compatíveis com detergentes espectrofotométrica, tais como thDc e ensaio de proteína de ^19, de acordo com as instruções do fabricante, com um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 750 nm.
14. Normalizar a concentração de proteína de 2,5 mg / ml (ou se as concentrações são mais baixos do que 2,5 mg / ml, normalizar para a amostra com a concentração de proteína mais baixa) por adição de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS, conforme necessário (por exemplo, se as amostras são 5 mg / ml em 250 ul, adicionar 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS para se obter uma concentração final de 2,5 mg / ml).

3. Fixação de Tag fluorescente por Click Química para a visualização de proteínas marcadas

1. Remover 40 pi de lisado celular e transferência para um novo tubo de microcentrifugação. Manter os lisados ​​restantes para a reacção com biotina-azida (passo 4).
2. Adicionar os seguintes reagentes em ordem: 0,2 ul fluor-azida (solução de reserva 1 mM em DMSO), 0,58 mL TCEP (estoque 100 mM em água com 4 equivalentes NaOH adicionado, elaborada fresco), e 3,38 TBTA ul (1.estoque 7 mM em uma proporção de 4: 1 de t-butanol a DMSO). Vortex para misturar.
3. Adicionar 1,14 ul de CuSO ₄ -5H ₂ O (50 mM em água) para iniciar a reacção. Vortex brevemente e incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro.
4. Adicionar 50 ul de tampão de amostra 2x SDS para extinguir a reacção. Neste ponto, executar as amostras directamente sobre um gel de SDS-PAGE ²⁰ para obter os melhores resultados, ou armazenar a -20 ° C durante a noite se necessário.
5. Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes do carregamento para o gel.
   Observação: Uma vez que o peso molecular da proteína alvo tipicamente não é conhecida nesta fase, é aconselhável para executar 2 géis com diferentes concentrações de acrilamida (isto é, 8% e 15%), ou um gel de gradiente molecular gama de peso de largura (isto é, 4-15%), para assegurar a cobertura completa do peso molecular.
6. Quando a frente do corante atingiu a extremidade do gel, continuar a executar o gel durante mais 5 minutos para garantir que todo o excesso de unreacted fluor-azida saiu completamente o gel.
7. Remover o gel para um recipiente com _ddH2O e incubar durante 10 min com agitação suave, para lavar o excesso de fluor-azida.
8. Colocar o gel para uma placa de vidro e digitalização do gel utilizando um scanner de gel Typhoon fluorescente de acordo com as instruções do fabricante.

4. Fixação de Biotina Tag por Click Química por afinidade Purificação de proteínas marcadas

1. Dos lisados ​​restantes do passo 3.1, utilizar a quantidade máxima após a normalização da proteína de tal modo que todas as amostras são o mesmo volume (por exemplo, se após a normalização para 2,5 mg / mL os volumes de amostra resultantes são 500, 550, e 600 ul, utilizar 500 ul de cada).
2. Pré-limpar os lisados ​​pela adição de 50 ul de alta capacidade grânulos de agarose estreptavidina, 2x pré-lavada com PBS (pH 7,4). Incubar 1 h a 4 ° C com rotação.
3. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Retirar tele sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação em gelo e descartar os grânulos.
4. Remover 1-2% da amostra de DMSO para um novo tubo marcado "entrada". Adicionar um volume equivalente de 2x tampão de amostra SDS e armazenar a -20 ° C.
5. Por 500 mL de lisado, adicione os seguintes reagentes: 1,38 mL biotina-azida (estoque 10 mM em DMSO), 5,5 ul TCEP, e 32,5 ul TBTA. Vortex para misturar.
6. Adicionar 11 ul CuSO ₄ 5H ₂ O por 500 mL de lisado e vortex brevemente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
7. Adicionar 4 volumes de amostra de acetona arrefecida a -20 ° C. Agitar as amostras e incubar durante a noite a -80 ° C para precipitar as proteínas e completamente remover a biotina que não reagiu-azida.
8. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as proteínas precipitadas.
9. Aspirar o sobrenadante completamente, e ressolubilizar as proteínas por sonicação em 150 ul de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Adicionar as amostras de 30 ul de pré-lavado com estreptavidina de alta capacidade esferas de agarose e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação.
11. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante contendo proteínas não ligadas e descarte.
12. Adicionar 1 ml de tampão de lavagem (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, SDS a 0,2%, pH 7,4) às pérolas e incubar 5 minutos à temperatura ambiente com rotação.
13. Repita os passos de 4.12 e 4.13 3 vezes.
14. Aspirar o tampão de lavagem completamente a partir dos grânulos, e adicionar 30 ul de tampão de amostra 2x SDS.
15. Incubar durante 5 min num bloco de calor a 95 ° C para libertar as proteínas a partir das esferas.
16. Centrifugar os grânulos durante 1 min a 13.000 x g à temperatura ambiente.
    NOTA: neste momento, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para ser executado por SDS-PAGE. Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes da utilização.
17. Cuidadosamentepipetar o tampão de amostra contendo proteínas fora dos grânulos, e carregar em SDS-PAGE ²⁰ (ver considerações importantes abaixo). Os grânulos podem ser guardadas para fervura do mais tarde, se necessário.
    NOTA: Para a detecção de proteínas por coloração com prata, melhores resultados são obtidos usando um gel espesso de 1 mm. Se uma banda está a ser cortada para fora do gel corado com prata para análise de espectrometria de massa (MS), preparar todos os reagentes frescos a partir de soluções estéreis e deixar um poço vazio entre amostras no gel. Para cada faixa de corte da pista sonda, uma fatia paralelamente devem ser tomadas a partir da pista de DMSO de modo que as proteínas do fundo podem ser subtraídos. Para a validação de identificação de proteínas por transferência de western, é também crítico para carregar a amostra de entrada a partir do passo 4.4 durante a execução do gel de SDS-PAGE.
18. Seguir um protocolo padrão para qualquer coloração com prata ou Western blot, ^{21, 22} para detectar a proteína (s) alvo.

Representative Results

Os resultados aqui apresentados foram obtidos com uma sonda de foto-afinidade do itraconazol droga antifúngica, cuja utilização tem sido publicado anteriormente ^16. Estes resultados demonstram a utilização da técnica de marcação por fotoafinidade-de células vivas para identificar com sucesso uma grande proteína de ligação de itraconazol como a de 35 kDa de proteína de membrana de tensão dependente de aniões Canal 1 (VDAC1).

O protocolo anterior foi realizado em células HEK293T itraconazol usando a sonda para photolabeling itraconazol e não modificada, como a molécula de concorrente. Depois as amostras foram preparadas tal como descrito, que foram sujeitos a SDS-PAGE de modo a separar as proteínas pelo peso molecular. unidades de marcador de peso molecular à esquerda estão em quilodaltons (kDa). A primeira faixa é a amostra de controlo de DMSO (D), a segunda pista é a amostra da sonda (P), e a terceira faixa é o exemplo de competição (C). bandas pressentir-se da única pista de DMSO são considerados fundo. Ao analisar estes dados, notar que proteínas de ligação específica deve estar ausente na amostra de controlo de DMSO, presentes na amostra de sonda e diminuição na amostra competição. Neste caso, a banda de proteína principal detectada apenas na amostra de sonda era uma banda de aproximadamente 35 kDa (Figuras 1 e 3), o qual foi identificado por espectrometria de massa como VDAC1. A identidade desta proteína foi confirmada na Figura 5 por transferência de Western utilizando um anticorpo específico VDAC1. Tomados em conjunto, estes resultados permitem concluir que VDAC1 é uma grande proteína de ligação de itraconazol nestas células.

A Figura 1 demonstra a visualização de proteínas após etiquetagem com um marcador fluorescente (a partir do passo 3 no protocolo); A Figura 3 demonstra a visualização de proteínas por coloração com prata após marcação com marca de biotina e PE rforming purificação por afinidade (da etapa 4 no protocolo); e A Figura 5 demonstra a validação do Código de proteína utilizando um anticorpo específico para VDAC1. As Figuras 2 e 4 exemplificam o que acontece se um determinado percurso no protocolo não são executadas correctamente (observado na Figura lendas).

Figura 1. Um gel de SDS-PAGE digitalizada-representativo de fluorescência (a partir do passo 3 no protocolo) D = apenas DMSO.; P = sonda única (200 nM); C = competição (10 mM). unidades de marcador de peso molecular à esquerda estão em quilodaltons (kDa). A seta aponta para a banda principal de proteína photolabeled a cerca de 35 kDa que está presente especificamente na pista da sonda e é competido por excesso de distância composto parental, indicando que é uma proteína de ligação específica.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Um gel digitalizada-fluorescência. O excesso de fluor-azida não foi completamente removido do gel (passos 3.6 e 3.7), causando grandes manchas pretas que aparecem na parte inferior do gel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Um gel de SDS-PAGE corado com prata representativa após biotina suspenso (a partir do passo 4 no protocolo). A seta aponta para a mesma banda que foi visualizado na Figura 1, que foi subsequentemente excisadoa partir do gel e submetidas a análise por MS para a identificação de proteínas. unidades marcador na esquerda estão em kilodaltons (kDa). Observe o espaço vazio entre cada pista, a fim de evitar a contaminação cruzada de amostras durante o carregamento de gel e banda excisão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A coloração com prata. Um gel corado com prata com fundo muito elevado de coloração, devido à insuficiente pré-limpeza dos lisados ​​(passo 4.2) e / ou a lavagem das pérolas de passo (4.13). Observe também a falta de espaço entre as pistas. Unidades marcador na esquerda estão em kilodaltons (kDa). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Western blot da proteína de 35 kDa photolabeled, identificados por EM como VDAC1 após biotina suspenso (a partir do passo 4 no protocolo). O sinal está presente na pista da sonda e diminuição na pista da competição, como nas Figuras 1 e 3, confirmando a identidade da proteína como VDAC1. É importante que a fracção de entrada (do passo 4.4) é executado juntamente com as amostras de pull-down, para garantir que os trabalhos de anticorpo e a proteína de interesse pode ser detectada no lisado. Um ligeiro aumento no peso molecular pode ser observado nas amostras suspensos devido ao tamanho acrescentado da sonda ligada de forma covalente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Diferentes abordagens para identificar os alvos de pequenas moléculas podem ser agrupadas em duas categorias: de cima para baixo, onde o fenótipo celular da droga é usada para diminuir seus alvos potenciais com base em suas funções conhecidas, ou bottom-up, onde o alvo é identificada directamente por meios químicos ou genéticos ^3. De cima para baixo ou estudos fenotípicos podem identificar certos processos celulares afectados pela droga (por exemplo, a transcrição / tradução / síntese do ADN, bloqueio do ciclo celular, a activação da via de sinalização / inibição, etc) que pode subjacentes ao fenótipo final da molécula pequena, que ajuda a diminuir a lista de potenciais alvos para proteínas envolvidas nesses processos. No entanto, uma grande desvantagem da abordagem de cima para baixo é que ele se baseia no que já se sabe sobre estes processos e, portanto, é tendenciosa contra alvos cujas funções não foram caracterizadas ou não foram previamente descritos para ser envolvidonum dado processo.

A abordagem de baixo para cima contorna este problema ao identificar o alvo directamente de uma maneira imparcial. Isto pode ser conseguido por meios genéticos; por exemplo, por rastreio de uma biblioteca de shRNA para linhas celulares de knockdown, que conferem resistência ou hipersensibilidade à droga, ou através do isolamento de linhas de células resistentes aos medicamentos e utilizando sequenciação genómica para determinar quais os genes contêm mutações ^1. Estes tipos de experiências pode identificar proteínas-chave, ou vias relacionadas com a actividade do fármaco, mas não necessariamente provar a ligação directa à proteína identificada. abordagens químicas, por outro lado, envolvem tipicamente a utilização de uma sonda química para se ligar à proteína alvo directamente e permitir o seu isolamento e identificação. Conceber uma sonda que mantém a sua capacidade para se ligarem à proteína alvo requer o uso de estudos de SAR para identificar uma posição na molécula que pode ser modificado sem perda significativa de actividade. ele alsO requer que a sonda ser capaz de se ligar ao seu alvo, quer covalentemente ou com afinidade suficientemente alta que ele pode ser isolado a partir de outras proteínas celulares (isto é, purificado por afinidade), e de que estas proteínas conservam a sua capacidade de se ligar a molécula pequena fora do seu nativo ambiente celular. Este requisito pode ser problemático para certas metas; por exemplo, proteínas de membrana integrais, muitas vezes necessitam de um ambiente de lípido específico para manter a sua conformação activa, e pode tornar-se agregadas ou impropriamente orientadas para a ligação uma vez que as células são lisadas ligando. O método descrito neste manuscrito evita estes potenciais problemas de purificação por afinidade, permitindo a modificação covalente da proteína alvo dentro do ambiente celular nativo, de modo que as manipulações subsequentes não pode interromper a interacção fármaco-alvo ^10.

A implementação bem sucedida do protocolo descrito depende de vários fatores. É importante que o TAproteína rget da pequena molécula de ser suficientemente abundante no tipo de célula escolhido para photolabeling. O tipo de célula mais potentemente afectado pela molécula pequena pode ser um bom ponto de partida, mas pode ser necessário para testar vários tipos de células diferentes para encontrar uma com rendimentos elevados de proteína alvo. Alternativamente, o enriquecimento de populações diferentes de proteína por fraccionamento sub-celular podem aumentar o rendimento de alvo, enquanto diminui rotulagem fundo. A detecção de proteínas marcadas fluorescentemente é, em geral, muito mais sensível do que a detecção de proteínas por coloração com prata; portanto, as bandas detectadas por fluorescência podem não ser detectáveis ​​por coloração com prata após a biotina suspenso. Ampliando a experiência usando vários pratos de células por condição de tratamento pode ajudar a superar este problema de detecção. O aumento da concentração de sonda também pode ajudar a melhorar o rendimento suspenso. bandas específicas também pode ser obscurecida pela alta fundo, caso em que a lavagem mais rigorosa, pré múltiplalimpar passos, ou o uso de grânulos de uma composição diferente (por exemplo, esferas magnéticas, em vez de agarose) pode ser útil. No entanto, se a proteína alvo é demasiado baixa em abundância pode não ser possível detectar por coloração de prata. Além disso, se a proteína alvo não migra como uma banda bem definida em SDS-PAGE (tais como proteínas altamente glicosiladas) também vai ser mais difícil de visualizar. Outras modificações ao protocolo poderia ser feito para superar esses problemas, tais como a realização de proteômica todo-amostra ou SILAC (Stable Isotope Labeling por Aminoácidos em cultura celular) para identificar proteínas marcadas depois de pull-down, eliminando a necessidade de cortar uma banda de fora de um gel corado com prata.

Outra consideração importante é a concentração da sonda a ser utilizada na experiência. Idealmente, deve ser utilizada a menor quantidade de sonda que produz um sinal detectável. Maiores concentrações dará um sinal maior, mas também mais elevada rotulagem de fundo, e uma vez que todos of os locais de ligação sobre o alvo mais elevada afinidade se tornar saturado pode haver menor afinidade alvos adicionais que começam a ser detectado. A concentração óptima deve, assim, ser determinada empiricamente começando com uma concentração relativamente elevada (1-2 mM) e titulando para trás até que apenas uma ou duas proteínas são marcadas e a competição é óbvia.

A potência da sonda pode ser tida em consideração na escolha da concentração de partida; No entanto, dependendo da abundância alvo e o modo de inibição, pode não haver uma boa correlação entre a actividade de sonda e de detecção de alvo (por exemplo, uma sonda com a inibição nanomolar baixa não será necessariamente puxar para baixo o suficiente proteína a baixas concentrações nanomolares de ser detectável ). Assim, é preferível determinar a concentração mais adequada empiricamente utilizando detecção de proteínas marcadas como uma leitura. A concentração do competidor utilizado deve ultrapassar o da sonda em pelomenos de 20 vezes, mas cuidado também deve ser tomado para não exceder o limite de solubilidade do concorrente.

No caso em que várias proteínas são puxadas para baixo pela sonda, a identificação da proteína funcionalmente relevante torna-se mais complicada. No entanto, existem várias maneiras de ajudar a diminuir as proteínas-alvo potenciais. Como mencionado acima, titulando-se para trás a concentração da sonda pode ajudar a melhorar a especificidade da marcação. À medida que a concentração de sonda de gotas, proteínas de ligação de maior afinidade devem manter a sua intensidade de sinal enquanto que as proteínas de afinidade mais baixos devem desaparecer. Deconvolution de múltiplos alvos potenciais pode também ser ajudada pela utilização de análogos químicos do composto de origem com vários graus de actividade. Em teoria, para um alvo funcionalmente relevante, deve haver uma correlação entre a ligação ao alvo e a actividade do análogo. Por exemplo, a concorrência por análogos inativos do composto original pode ser usado para descartar p vinculativoroteins que não estão envolvidos nos efeitos fenotípicos do composto. Da mesma forma, análogos activos, ou outras pequenas moléculas que induzem o mesmo fenótipo que o composto original, pode ser utilizado para ajudar a regra em proteínas de ligação relevantes. Na mesma linha, o uso de uma sonda de fotoafinidade inativos ou estruturalmente não relacionados podem ajudar a excluir proteínas irrelevantes.

Validação da proteína alvo requer em primeiro lugar a verificação da proteína identificada através de EM. Isto pode ser facilmente realizado por Western blot após a biotina suspenso, assumindo um anticorpo de elevada qualidade para a proteína alvo está disponível. No entanto, quando se trabalha com uma proteína desconhecida é fácil de perder tempo e dinheiro significativo em anticorpos ruins. É, portanto, crucial que o anticorpo ser validadas, e que detecta uma banda específica no lisado das células a ser utilizado para a etiquetagem (isto é, a amostra de entrada). Além disso, porque o rendimento de proteína depois de suspenso pode ser baixa, a formigaibody tem de ser altamente sensível, e dependendo do anticorpo elevadas concentrações pode ser necessário (até diluição 1: 100, em alguns casos). Para evitar estes problemas, uma versão com etiquetas da proteína pode ser expressa nas células antes photolabeling, e a etiqueta pode então ser usado para detectar a proteína depois suspenso.

Uma vez que a identificação de proteínas é confirmada, validação funcional do alvo pode ser conseguida por meio de manipulações genéticas e / ou farmacológicos, ou ensaios funcionais do alvo de interesse, para mostrar que a actividade do alvo é afectada pela ligação molécula pequena. O local de ligação pode ser mapeado por identificação do aminoácido modificado pela sonda, ou a determinação da estrutura 3-dimensional da molécula pequena ligado por cristalografia de raios X ou espectroscopia de RMN. Idealmente, se um mutante pode ser encontrado que perde a sua capacidade de se ligar a molécula pequena, ele deve ser capaz de abolir a actividade da molécula pequena quando expresso em lugar do de tipo selvagem prótein. Também pode ser desejável para mostrar a especificidade da ligação ao alvo ao longo de outras proteínas estruturalmente afins ou "off-alvo".

Este protocolo geral pode ser usado em qualquer aplicação que exija medição directa da pequena molécula de ligação a uma proteína alvo, desde que uma sonda pode ser feita que retém a bioactividade do composto parental. Aplicações potenciais incluem, mas não estão limitados a, a identificação de alvos moleculares dos novos compostos, pesquisar potenciais fora de alvos de drogas existentes, confirmando a ligação directa de uma pequena molécula a uma proteína específica de interesse, determinar a competição da ligação por outras pequenas moléculas em o mesmo sítio de ligação em uma proteína, e descobrindo novos receptores de ligantes de origem natural ou endógenos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676